JP2018501779A - Ｔ細胞を利用したナチュラルキラー細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｔ細胞を利用したナチュラルキラー細胞の製造方法に関し、より詳しくはＣＤ４（＋）Ｔ細胞を支持細胞として利用して原料細胞を培養することを特徴とするナチュラルキラー細胞の製造方法に関する。本発明に係るＴ細胞を利用したナチュラルキラー細胞の製造方法は、ナチュラルキラー細胞の高い殺害能を維持しながら少量の原料細胞からナチュラルキラー細胞だけ選択的に増殖させて製造できる方法で、凍結が可能なナチュラルキラー細胞を大量で製造できて、細胞治療剤としての商用化に有用である。

Description

本発明は、Ｔ細胞を利用したナチュラルキラー細胞の製造方法に関するもので、より詳しくはＣＤ４（＋）Ｔ細胞を支持細胞として利用して原料細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）を培養することを特徴とするナチュラルキラー細胞の製造方法に関する。

癌の転移と再発防止および末期癌患者の生存期間を延長させる治療法として患者の免疫機能を利用した免疫治療（ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）法が関心を集めている。近年、抗原に特定のキメラ抗原受容体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＣＡＲｓ）を発現する遺伝子組み換えＴ細胞を利用した免疫治療法は、癌治療の希望的な接近法と認識されている。しかし、Ｔ細胞は他人のものを使用した場合、ＭＨＣ拘束（Ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）を受けて深刻な移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）を誘発することがあるため、細胞治療剤の商業化のためには同種で使用可能で、大量生産および凍結が可能なナチュラルキラー（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ，ＮＫ）細胞の使用がずっと有用である。

ナチュラルキラー細胞は、末梢血リンパ球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の約１０〜１５％程度を占める先天性免疫反応に重要な役割をするリンパ球系細胞として知られている。ナチュラルキラー細胞はＴ、細胞とは異なりＭＨＣ非制限的な方式でターゲット（ｔａｒｇｅｔ）を認知するが、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＣＲ（ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６）のような活性受容体（Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）が、ＫＩＲやＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａのような抑制受容体と競争して活性を示して腫瘍ターゲットを除去する。ナチュラルキラー細胞は、抗ウイルス、抗−ＧｖＨ、坑癌効能を発揮することができるが、特にｓａｒｃｏｍａ、ｍｙｅｌｏｍａ、ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ｌｙｍｐｈｏｍａｓ、ｌｅｕｋｅｍｉａを含む悪性腫瘍を直接的に殺したり樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）活性または腫瘍特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＣＴＬ）を誘導して適応（ａｄａｐｔｉｖｅ）免疫活性に寄与して腫瘍化されたり腫瘍化が進行される異常細胞を除去する役割をする。

ナチュラルキラー細胞の坑癌効能は、同種造血幹細胞移植を介して立証されており、Ｔ細胞除去造血幹細胞移植でもドナーのナチュラルキラー細胞が残存する微細腫瘍を抑制することを確認した。また、ドナーのナチュラルキラー細胞のＧＶＴ（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｔｕｍｏｒ）効果が、ドナーとレシピエントとの間にＫＩＲ（ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）−ＭＨＣ不一致時に有意に増加するため、同種ナチュラルキラー細胞の使用は、癌患者自身の機能が弱まった者がナチュラルキラー細胞を活用するより断然効果的である。このようなナチュラルキラー細胞の癌や感染性疾患の治療剤としての可能性にもかかわらず、健常者の体内に存在する多くのナチュラルキラー細胞は、非活性化状態（ｒｅｓｔｉｎｇ ｓｔａｔｅ）で存在して、癌患者の体内に存在するナチュラルキラー細胞の場合、癌細胞の免疫回避機序によって機能の欠陥が存在する。実際にナチュラルキラー細胞を治療剤として利用するためには、腫瘍を認知して破壊できる活性化したナチュラルキラー細胞が必要であるため、正常血液あるいは患者血液から体外拡張培養を介してナチュラルキラー細胞を活性化させるのは大変重要であり。また、体内に存在するナチュラルキラー細胞数は限定されているため、坑癌効能を十分に発揮できる量のナチュラルキラー細胞を大量生産して凍結する技術の開発が必須となる。

ナチュラルキラー細胞の体外拡張培養には、ＰＢＭＣ、ＣＤ３−細胞、ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞、ＣＤ５６＋細胞などが原料細胞として使用され、ナチュラルキラー細胞増殖因子でＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１などのサイトカインとＬＰＳ（Ｇｏｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（１）：１３９−１４７，２０００）、ＣＤ３を刺激するＯＫＴ−３抗体（Ｃｏｎｄｉｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．２９（１）：１０４−１１３，２００１）を利用している。しかし、前記で言及された増殖因子だけではナチュラルキラー細胞を３〜１０倍程度増殖させることができ、十分な増殖が難しいため、いくつかの研究で様々な形態の支持細胞（Ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）で使用してナチュラルキラー細胞を増幅させようと試みた。白血病細胞株であるＣＴＶ−１の使用では、増殖の改善が殆どなく（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８（１）：８５−９４，２００７）、ＥＢＶ−ＬＣＬを使用して２１日間培養したものは、平均４９０倍程度増殖したと報告された（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１１（３）：３４１−３５５，２００９）。Ｋ５６２細胞株に４−１ ＢＢＬと膜固定された（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ）ＩＬ−１５を発現させた人工抗原提示細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ））を使用して７日〜３週間培養した結果、平均９０〜２０９倍増加した（Ｆｕｊｉｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９（９）：４０１０−４０１７，２００９）。ＭＩＣＡ、４−１ＢＢＬ、そしてＩＬ−１５をＫ５６２細胞株に発現させて３週間培養して平均３５０倍増殖させたとの報告もあって（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：４６７−４７５，２０１０）、Ｋ５６２細胞株に膜固定されたＩＬ−２１を発現させて７日間隔で再刺激して３週間培養して平均２１，０００倍増殖させたとの報告もある（Ｄｅｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏｓＯｎｅ，７（１）：ｅ３０２６４，２０１２）。近年、ＫＬ−１（ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ）とＥＢＶ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｂ細胞を支持細胞として利用してＰＢＭＣを１４日培養して平均７４０倍ナチュラルキラー細胞の増殖を誘導した（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，７３（８）：２５９８−６６０７，２０１３）。

本発明者等は、大韓民国登録特許第１０−１１３３１８５にＰＢＭＣをＯＫＴ−３で刺激させて支持細胞として使用することを開示して、１４日培養時６９１倍の増殖を誘導する可能性があることを明らかにした（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏｓＯｎｅ，７（１）：ｅ５３６１１，２０１２）。またＰＢＭＣを支持細胞で２回以上再刺激する場合、数千〜数万倍の増殖を誘導する可能性があることを開示した（ＷＯ２０１３０９４９８８ＰＣＴ）。しかし、大量培養の場合、支持細胞として使用されるＰＢＭＣの必要量が増加して、各ドナーの特性によりナチュラルキラー細胞培養結果が異なって商業化のための原料物質の円滑な供給と大量培養およびドナー管理が現実的に難しい。

そこで、本発明者等は、ＰＢＭＣの代わりになる支持細胞を開発しようと鋭意努力した結果、ＰＢＭＣ中Ｔ細胞、中でもヘルパーＴ細胞（Ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ；Ｔｈ細胞）がナチュラルキラー細胞増殖に大変重要であることを明らかにして、Ｔｈ細胞の特性を有しながら増殖が可能なＴ−細胞白血病−リンパ腫細胞株（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ−ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）が選択的にナチュラルキラー細胞の培養を誘導して安定的にナチュラルキラー細胞を増殖させることを確認して本発明を完成に至った。

本発明の目的は、ナチュラルキラー細胞を効率よくかつ安定的に培養、増殖させて製造する方法を提供するところにある。
本発明の他の目的は、前記方法によって製造されたナチュラルキラー細胞および前記ナチュラルキラー細胞を有効成分として含む癌または感染性疾患の予防または治療用組成物を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、ナチュラルキラー細胞を刺激する支持細胞としてＴ細胞、好ましくはＣＤ４（＋）Ｔ細胞を利用することを特徴とするナチュラルキラー細胞の製造方法を提供する。

本発明はまた、前記方法によって製造されたナチュラルキラー細胞を提供する。

本発明はまた、前記ナチュラルキラー細胞を有効成分として含む癌または感染性疾患の予防または治療用組成物を提供する。

種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＰＢＭＣ原料細胞を１４日間培養した総細胞およびナチュラルキラー細胞の増殖率変化を示した結果である（表１の条件１）。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＰＢＭＣ原料細胞を培養後、種々のＴ細胞支持細胞で再刺激して２１日間培養した総細胞およびナチュラルキラー細胞の増殖率変化を示した結果である（表１の条件２）。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＣＤ３（＋）細胞を除去させたＰＢＭＣ原料細胞を１４日間培養した総細胞の増殖率変化を示した結果である（表１の条件３）。 ＰＢＭＣ支持細胞を利用してＣＤ３（＋）細胞を除去させたＰＢＭＣ原料細胞を培養後、種々のＴ細胞支持細胞で再刺激して２１日間培養した総細胞の増殖率変化を示した結果である（表１の条件４）。 表１の条件３で増殖不振ドナーの総細胞の増殖率変化を示した結果である。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用して培養したナチュラルキラー細胞の細胞生存率を示した結果である。（ａ）表１の条件１、（ｂ）表１の条件２、（ｃ）表１の条件３、（ｄ）表１の条件４、（ｅ）表１の条件３で増殖不振ドナーのナチュラルキラー細胞の細胞生存率。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＰＢＭＣ原料細胞を１４日間培養したナチュラルキラー細胞の確認および純度を示した結果である（表１の条件１）。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＰＢＭＣ原料細胞を培養後、種々のＴ細胞支持細胞で再刺激して２１日間培養したナチュラルキラー細胞の確認および純度を示した結果である（表１の条件２）。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＣＤ３（＋）細胞を除去させたＰＢＭＣ原料細胞を１４日間培養したナチュラルキラー細胞の確認および純度を示した結果である（表１の条件３）。 ＰＢＭＣ支持細胞を利用してＣＤ３（＋）細胞を除去させたＰＢＭＣ原料細胞を培養後、種々のＴ細胞支持細胞で再刺激して２１日間培養したナチュラルキラー細胞の確認および純度を示した結果である（表１の条件４）。 表１の条件３で増殖不振ドナーのナチュラルキラー細胞の確認および純度を示した結果である。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＰＢＭＣ原料細胞を１４日間培養したナチュラルキラー細胞の活性マーカーを示した結果である（表１の条件１）。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＣＤ３（＋）細胞を除去させたＰＢＭＣ原料細胞を１４日間培養したナチュラルキラー細胞の活性マーカーを示した結果である（表１の条件３）。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＰＢＭＣ原料細胞を１４日間培養したナチュラルキラー細胞の様々な癌腫に対する細胞殺傷能を示した結果である（表１の条件１）。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＰＢＭＣ原料細胞を培養後、種々のＴ細胞支持細胞で再刺激して２１日間培養したナチュラルキラー細胞の様々な癌腫に対する細胞殺傷能を示した結果である（表１の条件２）。 種々のＴ細胞を支持細胞として利用してＣＤ３（＋）細胞を除去させたＰＢＭＣ原料細胞を１４日間培養したナチュラルキラー細胞の様々な癌腫に対する細胞殺傷能を示した結果である（表１の条件３）。 ＰＢＭＣ支持細胞を利用してＣＤ３（＋）細胞を除去させたＰＢＭＣ原料細胞を培養後、種々のＴ細胞支持細胞で再刺激して２１日間培養したナチュラルキラー細胞のＫ５６２に対する細胞殺傷能を示した結果である（表１の条件４）。 表１の条件３で増殖不振ドナーのナチュラルキラー細胞のＫ５６２に対する細胞殺傷能を示した結果である。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明では、種々のＴ細胞を支持細胞として利用してナチュラルキラー細胞を増殖させて製造するに当たり、Ｔ細胞、特に好ましくはＣＤ４（＋）Ｔ細胞がナチュラルキラー細胞を選択的に増殖させて、ナチュラルキラー細胞の増殖率が増加すると共に、細胞殺傷能も増加することを確認した。

従って、一観点において、本発明は、ナチュラルキラー細胞を刺激する支持細胞としてＣＤ４（＋）Ｔ細胞を利用することを特徴とするナチュラルキラー細胞の製造方法に関する。

本発明は、好ましくは、支持細胞として体外に分離したＣＤ４（＋）Ｔ細胞、体外拡張培養されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞またはＣＤ４（＋）Ｔ細胞株を、原料細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）として末梢血液、末梢血白血球細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核球細胞）、濃縮（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）されたナチュラルキラー細胞および分離したナチュラルキラー細胞で構成された群から選択された一つ以上の細胞、好ましくはＣＤ３（＋）細胞を除去させた細胞を利用することを特徴とするナチュラルキラー細胞の製造方法に関する。

本発明のナチュラルキラー細胞の増殖方法、好ましくは下記の工程を含んで行われるが、これに制限されない：
（ｉ）ヒト末梢血液、末梢血白血球細胞、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）、Ｔ細胞が除去された単核球細胞またはナチュラルキラー細胞を分離する工程；
（ｉｉ）ナチュラルキラー細胞をＴ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体およびインターロイキンタンパク質が含まれた培地で活性化されたり活性化されなかったＴ細胞の存在下に培養する工程；及び
（ｉｉｉ）ナチュラルキラー細胞をＴ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体およびインターロイキンタンパク質が含まれた培地で再刺激して追加培養する工程。

以下、本発明をより詳細に説明する。
ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ，ＮＫ ｃｅｌｌ）は健常者の血液内に約１０〜１５％ほど存在し、非自己（ｎｏｎｓｅｌｆ）と反応する時に高い殺害能を有する。各種ｖｉｒｕｓに感染した細胞や細菌侵入、あるいは異常細胞の生成に当たり、ナチュラルキラー細胞は非特異的に即時に反応して異物を除去する。しかし、体内に存在するナチュラルキラー細胞の数はそれほど多くなく、治療的効果を示すために必要な有効ナチュラルキラー細胞の数は非常に多くなければならないため、現状は効果的なナチュラルキラー細胞増殖および製造方法に対する必要性がある。

ナチュラルキラー細胞を増殖させる方法は、ナチュラルキラー細胞だけを分離した後、支持細胞（Ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）を使用しながら適切な刺激を与えて増幅する方法があって、全末梢血白血球細胞（ＰＢＬ；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）または末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ；ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）でナチュラルキラー細胞を選択的に増幅して相対的に多くのナチュラルキラー細胞を得る方法がある。末梢血液からナチュラルキラー細胞を分離する方法は当業者に公知されている通常の方法を使用することができ、市販されているものを購入して使用してもよい。

ＰＢＭＣは、リンパ球と単核球に分けることができ、リンパ球はＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞に区分される。この中でＴ細胞はヘルパーＴ細胞（Ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ；Ｔｈ細胞）と細胞毒性Ｔ細胞（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ；Ｔｃ細胞）にさらに区分されて、ＰＢＭＣ支持細胞を利用してナチュラルキラー細胞を培養する方法は、Ｔ細胞の大量増殖が誘導されてナチュラルキラー細胞の増殖が制限されて、培養前・後にＴ細胞を除去する高費用の複雑な工程段階が必要であった。そこで、本発明では支持細胞であるＰＢＭＣ中どのような細胞群がナチュラルキラー細胞増殖に寄与するのか調べた結果、Ｔ細胞がナチュラルキラー細胞増殖に寄与して、その中でもＴｈ細胞がナチュラルキラー細胞増殖に大変重要であることを確認して、ＰＢＭＣに代わる支持細胞としてＴｈ細胞の特性を有すると共に、増殖が可能なＴ細胞を対象にナチュラルキラー細胞培養に適用した。

本発明の用語「支持細胞（Ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ、培養補助細胞ともいう）」とは、分裂増殖することができないが、代謝活性があるため、種々の代謝物質を生産して目的細胞の増殖を助ける細胞を意味する。

本発明で使用する支持細胞（Ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）は、体外に分離したＣＤ４（＋）Ｔ細胞、体外拡張培養されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞またはＣＤ４（＋）Ｔ細胞株（Ｔリンパ腫細胞株）であることを特徴とする。本発明のＣＤ４（＋）Ｔ細胞株（Ｔリンパ腫細胞株）は、Ｈ９、ＨｕＴ７８、Ｌｏｕｃｙ、Ｍｏｌｔ３、Ｍｏｌｔ−１３、ＰＥＥＲ、ＲＰＭＩ８４０２、ＴＡＬＬ−０１であることが好ましく、さらに好ましくはＨ９またはＨｕＴ７８であることであるが、これに限定されない。

前記支持細胞として利用されるＴ細胞は、分裂増殖が抑制された不活性化細胞または不活性化させないことを特徴とし、好ましくは不活性化させることによって安全性を確保することができる。不活性化させる方法としては、当業界に公知された通常の方法を使用してもよく、例えばガンマ線（ｇａｍｍａ−ｒａｙ）を照射する方法を使用してもよい。不活性化をさせなかったＴ細胞を使用する場合、ほとんどは腫瘍細胞であるため、活性化したナチュラルキラー細胞によって培養中に死滅され得る。

本発明のようにＴ細胞を支持細胞として使用する増殖方法は、Ｔ細胞を除去せずＰＢＭＣなどの原料細胞で選択的にナチュラルキラー細胞の培養を誘導するため、培養成績がドナーにより大差なく安定的に培養できる長所がある。従って、より多量の治療用ナチュラルキラー細胞治療剤を効率よくかつ安定的に確保することができる。

本発明の用語「原料細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）」とは、適切な培養を介してナチュラルキラー細胞に増殖することができる細胞を意味して、好ましくは末梢血液、末梢血白血球細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核球細胞）、濃縮（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）されたナチュラルキラー細胞および分離したナチュラルキラー細胞で構成された群から選択された一つ以上が使用されるが、これに制限されず、特に好ましくはＣＤ３（＋）細胞を除去させた細胞（ＣＤ３（−）細胞）を使用いてもよい。

また、本発明のナチュラルキラー細胞の製造方法は、Ｔ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体およびインターロイキンタンパク質が含まれた培地でナチュラルキラー細胞を培養することが好ましいが、これに限定されない。Ｔ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有してＴ細胞を刺激する抗体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と会合して抗原認識複合体を形成する分子群であるＣＤ３抗原に特異的に反応するタンパク質であって、ＣＤ３分子はＴＣＲと比較して細胞内領域が長く抗原認識信号を細胞内に伝達する役割をしている。本発明でＴ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有してＴ細胞を刺激する抗体は、好ましくは抗−ＣＤ３抗体、より好ましくはＯＫＴ−３、ＵＣＨＴ１、ＨＩＴ３ａなどを使用することができ、最も好ましくはＯＫＴ−３抗体である。

インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ）タンパク質とは、リンパ球や単球および大食細胞など免疫担当細胞が生産するタンパク質性生物活性物質の総称であり、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）内の一群の分子種を指す。本発明では、インターロイキンタンパク質の例として、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１などを使用することができ、好ましくはＩＬ−１２タンパク質である。

本発明のナチュラルキラー細胞製造方法は、ＡＩＭ−Ｖ ｍｅｄｉａ、ＲＩＭＩ１６４０、ＣｅｌｌＧｒｏ ＳＣＧＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ２０、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭのような通常の動物細胞培養用培地にナチュラルキラー細胞およびＴリンパ腫細胞株を加えて、前記培養物にＴ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有してＴ細胞を刺激する抗体およびインターロイキンタンパク質を添加して培養することが好ましいが、これに限定されない。本発明の一具体例では、ＯＫＴ−３抗体とＩＬ−２を添加して培養した。添加するＯＫＴ−３抗体の濃度は、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌを使用して、ＩＬ−２の濃度は１０〜２０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは約５００Ｕ／ｍｌを使用する。また、それに血清または血しょうとリンパ球の増殖を支持する追加の増殖因子を添加して培養してもよい。培地に添加する血清または血しょうの種類は特に限定されないが、市販の各種動物由来のものが使用できるが、ヒト由来として本人由来のものがより好ましい。

本発明に係るナチュラルキラー細胞の製造方法は、ナチュラルキラー細胞を刺激する支持細胞としてＴ細胞の存在下にＴ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体およびインターロイキンタンパク質が含まれた培地でナチュラルキラー細胞を培養する工程を含む。前記培養は、支持細胞と原料細胞の比率を１以上で混合して培養することが好ましく、支持細胞と原料細胞を２：１〜２０：１の割合で混合して培養することがより好ましく、５：１の比率を使用することが最も好ましいが、これに制限されない。前記「比率」とは、細胞数を基準にしたものをいう。

また、本発明に係るナチュラルキラー細胞の製造方法において、より多くのナチュラルキラー細胞を収得するために、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞を支持細胞として利用したナチュラルキラー細胞の刺激および培養を繰り返し行うことができる。従って、本発明では支持細胞と原料細胞の比率を１以上、好ましくは２：１〜２０：１、最も好ましくは５：１にして、ナチュラルキラー細胞を再刺激する工程をさらに含むことができる。前記「比率」とは、細胞数を基準にしたものをいう。

前記再刺激に利用されるＣＤ４（＋）Ｔ細胞は、Ｈ９またはＨｕＴ７８であることが好ましいが、これに限定されず、分裂増殖が抑制された不活性化細胞または不活性化させないが使用されてもよい。

また、前記再刺激は、Ｔ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体およびインターロイキンタンパク質が含まれた培地で５〜１２日間隔で行うことが好ましく、より好ましくは７日間隔で再刺激できるが、これに制限されず、１回以上繰り返し再刺激することができる。また、Ｔ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体およびインターロイキンタンパク質が含まれた培地で培養した後、前記抗体がない培地で追加培養する工程を含んでもよい。

前記Ｔ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有してＴ細胞を刺激する抗体は、抗−ＣＤ３抗体、好ましくはＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１およびＨＩＴ３ａからなる群から選択される一つ以上、最も好ましくはＯＫＴ３であってもよく、前記インターロイキンタンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１からなる群から選択される一つ以上、好ましくはＩＬ−２であってもよい。

本発明における「刺激」とは、支持細胞などを添加してナチュラルキラー細胞の増殖を誘導することを意味して、Ｔ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有してＴ細胞を刺激する抗体が共に使用されてもよい。本発明における「再刺激」とは、一程培養時間が経過した後、培地に支持細胞および／またはＴ細胞に低親和性（ｌｏｗ ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有してＴ細胞を刺激する抗体を再び添加してナチュラルキラー細胞増殖を再誘導することを意味する。
全体的に本発明で前記ナチュラルキラー細胞は５日以上、好ましくは５〜６０日間、最も好ましくは１４〜２１日間培養が好ましいが、これに限定されない。

刺激期間は、培養０日目に始めて５〜１２日間隔で刺激することを特徴とするが、好ましくは７日間隔で刺激できるが、これに制限されない。細胞の収得は、最後の刺激後５日目収得することを特徴とするが、好ましくは１４日目収得するが、これに制限されない。

前記方法により培養されたナチュラルキラー細胞は、凍結が可能で再び解凍する場合にも細胞の機能が損傷せず、既存のＰＢＭＣを支持細胞として使用して培養した場合よりＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６のような活性化受容体（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現が高くて腫瘍細胞株に対する殺害能およびサイトカイン分泌能が増加するため、優れた坑癌効果を期待することができる。従って、臨床適用が可能な多量の活性化したナチュラルキラー細胞を利用して腫瘍治療に有効な細胞治療剤を製造することができる。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：ＰＢＭＣおよび種々のＴ細胞の準備
１−１：ＰＢＭＣ原料細胞およびＣＤ３（＋）を除去させた原料細胞の準備
健康なドナーから採取した末梢血単核球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）を１回生産する分量に小分けしてバイアル（ｖｉａｌ）に入れて液体窒素に凍結しておく。凍らせておいた一つのＰＢＭＣバイアルを解凍して５０ｍＬチューブに移して、１％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｓｅｒｕｍ ｂｏｖｉｎｅ）または自己血しょう（ａｕｔｏｐｌａｓｍａ）を含む２０ｍＬのＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で懸濁して１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣペレットを１０ｍＬ ＭＡＣＳランニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に懸濁して、Ａｄａｍ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍを使用して細胞数を測定した。

ＰＢＭＣ原料細胞１×１０^７（ｃｅｌｌ）を５０ｍＬチューブに移して、ＰＢＭＣ支持細胞とＣＤ３（＋）細胞を除去させた（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）原料細胞を収得するために、それぞれ５×１０^７（ｃｅｌｌ）ずつ新しい５０ｍＬチューブに移した後、それぞれ１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣ原料細胞の場合、細胞ペレットを１０ｍＬの１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）１０ｍＬに懸濁した。

ＣＤ３（＋）を除去させた原料細胞を得るために５×１０^７（ｃｅｌｌ）のＰＢＭＣ細胞ペレットに４００μＬのＭＡＣＳランニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）と１００μＬのＣＤ３磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ）を入れて４℃で２０分間反応させた。１０〜２０ｍＬのＭＡＣＳランニングバッファーを入れて洗浄した後１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離と再び２ｍＬのＭＡＣＳランニングバッファーに懸濁した。ＶａｒｉｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にＣＳカラム（ｃｏｌｕｍｎ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１３０−０４１−３０５）を装着して細胞を分離して、最終２０ｍＬになる時までカラムを洗浄して細胞を回収した。Ａｄａｍ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍを使用して細胞数を測定して１×１０^７の細胞を新しい５０ｍＬチューブに入れて１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍＬの１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）１０ｍＬに懸濁した。

１−２：ＰＢＭＣ支持細胞および種々のＴ支持細胞の準備
実施例１−１で分離した５×１０^７（ｃｅｌｌ）ＰＢＭＣ支持細胞は、ペレットを１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）１０ｍＬに懸濁した後、ガンマ線照射機で２０００ｃＧｙで照射してＰＢＭＣ支持細胞を準備した。

種々のＴ細胞は、培養フラスコで回収して１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、５×１０^７細胞ずつチューブに移して１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。Ｔ支持細胞は、１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）１０ｍＬに懸濁した後、ガンマ線照射機で１５０００〜３００００ｃＧｙで照射して不活性化させて準備した。

実施例２：種々のＴ細胞を支持細胞として利用したナチュラルキラー細胞の培養
Ｔ細胞を支持細胞として利用してＰＢＭＣ原料細胞およびＣＤ３（＋）を除去させた原料細胞の培養条件を表１に示した。

２−１：１４日培養条件
ナチュラルキラー細胞培養時５００ＩＵのＩＬ−２と１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３を培養容器（プラスチックまたは細胞培養バッグなど）に入れて、培養０日目ＰＢＭＣ原料細胞とＰＢＭＣ支持細胞またはＴ支持細胞を１：５の割合でそれぞれ０．５〜１０ｍＬで入れて１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）を０．５〜１０ｍＬ入れて３７℃インキュベーターで３〜５日間静置培養した（条件１）。また、培養０日目ＣＤ３（−）原料細胞とＰＢＭＣ支持細胞またはＴ支持細胞を１：５の割合でそれぞれ０．５〜１０ｍＬに入れて１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）を０．５〜１０ｍＬ入れて３７℃インキュベーターで３〜５日間静置培養した（条件３）。

表１の条件１および条件３共に、培養３〜５日目に細胞数を測定して約２〜５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるべく５００ＩＵのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）と１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）で希釈して適切な培養容器に入れて再び静置培養した。以後２〜３日間隔で細胞数を測定して５〜１０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるべく５００ＩＵのＩＬ−２と１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）で希釈して１４日まで浮遊培養した。浮遊培養１４日目ナチュラルキラー細胞を収得した。

条件１で培養されたナチュラルキラー細胞の増殖率を比較した結果、総細胞数（Ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ，ＴＮＣ）基準増殖率は、支持細胞の種類によってＰＢＭＣ １４７倍、Ｈ９ ２９８倍、ＨｕＴ７８が４８５倍でＰＢＭＣよりずっと高い増殖率を示した。総細胞のうちナチュラルキラー細胞増殖率は、支持細胞の種類によってＰＢＭＣ ２４７倍、Ｈ９ ２７５２倍、ＨｕＴ７８ ５６４９倍で、ＰＢＭＣよりＨ９は約１０倍、ＨｕＴ７８は約２０倍以上高い増殖率差を示した。その他のＴ細胞は、ＰＢＭＣより低い増殖率を示した（図１Ａ）。また、条件３で培養されたナチュラルキラー細胞の増殖率を比較した結果、総細胞数を基準にＰＢＭＣ １８４倍、Ｈ９ ６２倍、ＨｕＴ７８ ２１７倍の増殖率を示した（図１Ｃ）。残りのＴ支持細胞は、いずれもＨ９より低い増殖率を示した。

２−２：２１日培養の再刺激条件
ナチュラルキラー細胞培養時５００ＩＵのＩＬ−２と１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３を培養容器（プラスチックまたは細胞培養バックなど）に入れて、培養０日目ＰＢＭＣ原料細胞とＰＢＭＣ支持細胞またはＴ支持細胞を１：５の割合でそれぞれ０．５〜１０ｍＬで入れて１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）を０．５〜１０ｍＬ入れて３７℃インキュベーターで培養して刺激した。培養７日目再刺激は、０日目ＰＢＭＣ支持細胞で刺激して培養されたナチュラルキラー細胞は、ＰＢＭＣおよび種々のＴ支持細胞を使用して再刺激して、０日目Ｔ支持細胞で刺激して培養された細胞は、同じ細胞を支持細胞として使用した（条件２）。また、培養０日目ＣＤ３（−）原料細胞とＰＢＭＣ支持細胞を１：５の割合でそれぞれ０．５〜１０ｍＬで入れて１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）を０．５〜１０ｍＬ入れて３７℃インキュベーターで培養して１次刺激した場合には、培養７日目再刺激はＰＢＭＣ支持細胞と種々のＴ支持細胞を使用して２１日培養して再刺激した（条件４）。

培養７日目再刺激は、培養中のナチュラルキラー細胞数を測定して細胞数を基準に２〜５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるべく１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）で希釈して、ＰＢＭＣおよびＴ支持細胞は３〜１０倍数で準備して１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）に懸濁した後、ガンマ線照射機でそれぞれ２０００および１５０００〜３００００ｃＧｙで照射して不活性化させて準備した。５００ＩＵのＩＬ−２と１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３をいれて準備された二つの細胞を３日間共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）した。以後２〜３日間隔で細胞数を測定して５〜１０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるべく５００ＩＵのＩＬ−２と１体積％自己血しょうが含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）で希釈して２１日まで浮遊培養した。浮遊培養２１日目ナチュラルキラー細胞を収得した。

表１の条件２で培養されたナチュラルキラー細胞の増殖率を比較した結果、総細胞数基準に増殖率は支持細胞の種類によってＰＢＭＣ ３３４倍、Ｈ９ ３５８倍、ＨｕＴ７８ ２２８２倍の順に増加した。ナチュラルキラー細胞数基準に増殖率は、ＰＢＭＣ １２５７倍、Ｈ９ ２６７７倍、ＨｕＴ７８ ２９４５５倍であった（図１Ｂ）。

また、１次刺激は共にＰＢＭＣ支持細胞で行って、培養７日目ＰＢＭＣ支持細胞およびそれぞれのＴ支持細胞で２次再刺激を行った、表１の条件４で培養されたナチュラルキラー細胞の増殖率を比較した結果、総細胞数を基準にＰＢＭＣ １４０２倍、Ｈ９ ７２０倍、ＨｕＴ７８ １３９３倍で増殖率が示された（図１Ｄ）。残りのＴ細胞は、約５００倍前後の細胞増殖率を示した。

前記の通り、１４日培養と２１日培養時Ｈ９とＨｕＴ７８はＰＢＭＣより増殖率の側面で非常に優れた支持細胞として使用できる可能性があることを確認することができた。
ＣＤ３（−）細胞を原料細胞として使用して種々のＴ支持細胞で評価した結果は、ＰＢＭＣを支持細胞として使用したものとは多少異なってＰＢＭＣ支持細胞とＨｕＴ７８支持細胞のナチュラルキラー細胞増殖率が似ていて、Ｈ９支持細胞はＰＢＭＣ支持細胞よりナチュラルキラー細胞の減少した増殖率を示した。

２−３：増殖不振ドナー細胞の培養
表１の条件４でＰＢＭＣ支持細胞で培養時増殖が不振したドナーだけを選別してナチュラルキラー細胞の増殖率を比較した。
その結果、ＰＢＭＣ支持細胞で培養時、平均２１倍増殖したが、Ｈ９とＨｕＴ７８ではそれぞれ６４倍、１６１倍増殖した。特に、ＨｕＴ７８の場合、ＰＢＭＣ支持細胞より約８倍以上高い増殖率を示した（図１Ｅ）。従って、Ｔ支持細胞はＰＢＭＣ支持細胞よりナチュラルキラー細胞増殖能においてドナー間の差を克服できる可能性があることを確認することができた。

ＰＢＭＣ支持細胞の場合、原料細胞内Ｔ細胞が存在する場合、ナチュラルキラー細胞よりＴ細胞の増殖を誘導するため、原料細胞内Ｔ細胞を除去する工程が必須である。また、ドナー間の増殖率差が大きいため、予めドナーを選別する事前培養過程を必要とする。しかし、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４を発現するＴ細胞の場合、原料細胞内にＴ細胞の存在の有無に関係なく、ナチュラルキラー細胞を選択的に増殖させてＰＢＭＣ支持細胞で培養時増殖不振ドナーの細胞も増殖を良好に誘導できることを確認した。

実施例３：インビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）細胞生存率
インビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）細胞生存率を比較、評価するために、細胞内核と結合できるＰＩ染色液を使用する細胞計数器（Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ）中一つであるＡＤＡＭ細胞計数器システムを使用した。測定された総細胞数から死滅細胞数を差し引いて生存細胞数を計算した後、次の式を利用して細胞生存率（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を計算した。
細胞生存率（％）＝（生存細胞数／総細胞数）×１００

表１の条件１と条件２（すなわち、ＰＢＭＣ原料細胞を対象に種々の支持細胞を活用した条件の１４日と２１日培養）で培養した後、ナチュラルキラー細胞の生存率を測定した結果、ＰＢＭＣ支持細胞を使用した場合、８０％未満の生存率を示して、Ｈ９とＨｕＴ７８は、８０％以上の生存率を示した（図２Ａ、２Ｂ）。

表１の条件３と条件４（ＣＤ３（＋）Ｔ細胞が除去された原料細胞を対象に種々のＴ支持細胞で１４日と２１日培養）で培養した後、ナチュラルキラー細胞の生存率を測定した結果、いずれの条件で約９０％以上の高い細胞生存率を示した。この中増殖不振ドナーの場合、ＰＢＭＣ支持細胞の時生存率が８２％であり、ＨｕＴ７８の場合、９３％であって１０％以上の生存率差を示した（図２Ｃ、２Ｄ）。

ＰＢＭＣおよび種々のＴ支持細胞を使用して１４日または２１日培養した細胞は、全般的にＰＢＭＣ原料細胞よりＣＤ３（−）原料細胞で生存率が高く示され、支持細胞間の大差はなかった。但し、増殖不振ドナーの場合、ＰＢＭＣ支持細胞よりＨｕＴ７８が約１０％以上高い生存率を示した。

従って、細胞生存率の側面からＨｕＴ７８はＰＢＭＣと比較してナチュラルキラー細胞を培養するための有用な支持細胞であることを確認することができた。

実施例４：インビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）細胞表現型分析
実施例１および２に係る培養方法で培養されたナチュラルキラー細胞の培養前と後の細胞を回収して１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して、培養液を吸引（ｓｕｃｔｉｏｎ）して除去した。１ｍＬのＦＡＣＳバッファー（２．５％ＦＢＳが含まれたＰＢＳ）で希釈して細胞数を測定して、５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるべくＦＡＣＳバッファーで希釈した。５ｍＬ ＦＡＣＳチューブ（Ｆａｌｃｏｎ、３５２０５２）に希釈した細胞溶液を１００Ｌずつ入れて、次のような抗体で表現型を分析した。

チューブ１：抗−ヒト（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ）ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５３３２）、抗−ヒトＣＤ１６−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５４０７）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５５１７）
チューブ２：抗−ヒトＣＤ１４−ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５３９７）、抗−ヒトＣＤ１９−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５４１３）、抗−ヒトＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５３４１）
チューブ３：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＮＫＧ２Ａ−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１０５９Ｐ）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ４：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＮＫＧ２Ｃ−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１３８Ｐ）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ５：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１３９Ｐ）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ６：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＮＫｐ３０−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５８４０７）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ７：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＮＫｐ４４−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５８５６３）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ８：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＮＫｐ４６−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５７９９１）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ９：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＤＮＡＭ−１−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５９７８９）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ１０：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＣＤ２５−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５４３２）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ１１：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＣＤ６２Ｌ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２−０６２９−４２）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ１２：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＣＤ６９−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ２３５９１Ｐ）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ１３：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＣＸＣＲ３−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５７１８５）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ１４：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗−ヒトＣＤ５７−ＰＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５６０８４４）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ１５：抗−ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣ、ＰＥマウスＩｇＧ１ｋアイソトープコントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５７４９）、抗−ヒトＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ５
チューブ１６：ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１ｋアイソトープコントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５７４８）、ＰＥマウスＩｇＧ１ｋアイソトープコントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、５５５７４９）、ＰＥ−Ｃｙ５マウスＩｇＧ１ｋアイソトープコントロール（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）

前記チューブを３０分間冷蔵温度で染色した後、染色が終わった細胞に２ｍＬ ＦＡＣＳバッファーを入れて、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液を除去して再び２ｍＬ ＦＡＣＳバッファーを入れて１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。再び上澄み液を除去して、３００μＬ ＦＡＣＳバッファーを入れて懸濁した後、ＦＡＣＳ ＬＳＲＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を利用して表現型を分析して、細胞の確認および純度を調べた。確認は、ＣＤ３（−）ＣＤ５６（＋）細胞とＣＤ１６（＋）ＣＤ５６（＋）細胞の含有量で表示して、純度測定は、ＣＤ３（＋）はＴ細胞、ＣＤ１４（＋）は単細胞（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、ＣＤ１９（＋）はＢ細胞で測定した。

４−１：細胞確認および純度
表１の条件１と２で培養したナチュラルキラー細胞の確認および純度を分析した結果、ＰＢＭＣ原料細胞を種々の支持細胞で１４日間培養後、ナチュラルキラー細胞の含有量を評価した場合には、ＰＢＭＣ １５．９％、Ｈ９ ７３．３％、ＨｕＴ７８ ８３．３％であり、２１日培養後に評価した場合には、ＰＢＭＣ １７．４％、Ｈ９ ６１．１％、ＨｕＴ７８ ８３．５％であった（図３Ａ、３Ｂ）。これにより、Ｔ細胞を含むＰＢＭＣを原料細胞として使用する時、ＰＢＭＣ支持細胞の場合、Ｔ細胞が８０％以上増殖したのに対して、Ｈ９とＨｕＴ７８の場合、Ｔ細胞でないナチュラルキラー細胞が選別的に増殖することを確認することができた。特に、ＨｕＴ７８の場合、８０％以上の高いナチュラルキラー細胞含有量を示した。

表１の条件３と４で培養したナチュラルキラー細胞の確認および純度を分析した結果、二つの条件共にＴ細胞が除去されたＣＤ３（−）原料細胞を使用するため、全種類の支持細胞に対して９５％以上の高いナチュラルキラー細胞含有量を示し、Ｔ細胞、単細胞、Ｂ細胞の含有量が共に１％以下で測定された（図３Ｃ、３Ｄ）。

また、表１の条件３で培養した増殖不振ドナーである場合、ＰＢＭＣ支持細胞で培養時、ＨｕＴ７８に比べてナチュラルキラー細胞純度が約４％程度低下してＣＤ１６の発現も約１６％程度減少することを確認した（図３Ｅ）。従って、ＣＤ４を発現するＴ細胞は、ナチュラルキラー細胞だけを選択的に増殖させることができ、ドナーによるナチュラルキラー細胞培養差も相当改善できる可能性があることを確認することができた。

４−２：細胞発現マーカー
細胞の種類確認および純度以外に支持細胞により差が生じる代表的なナチュラルキラー細胞の受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）発現を分析した。

表１の条件１で培養後、ナチュラルキラー細胞の細胞表現型を分析した結果、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６そしてＣＤ６９に対して培養条件による表現型の差が観察された（図４Ａ）。

また、表１の条件３で培養後、ナチュラルキラー細胞の細胞表現型を分析した結果、ＮＫｐ４４とＮＫｐ４６は、ＰＢＭＣよりもＨ９とＨｕＴ７８で培養時発現が増加して、ＣＤ６９の場合ＰＢＭＣとＨｕＴ７８では類似するように発現するが、Ｈ９で培養時に高まることを確認した（図４Ｂ）。

従って、原料細胞のタイプにより細胞表現型の発現差が生じるが、ＮＫｐ４４とＮＫｐ４６のようなナチュラルキラー細胞活性マーカーがＰＢＭＣ支持細胞よりもＴ支持細胞で培養時発現が顕著に増加する傾向を示した。このマーカーは、ナチュラルキラー細胞の活性において重要な因子でＰＢＭＣ支持細胞で培養するよりＴ支持細胞で培養する場合、高い効能を期待できる可能性があることを示す。

実施例５：様々な腫瘍細胞株に対するインビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）細胞殺傷能
ターゲット腫瘍細胞株（Ｋ５６２、ＨｕＴ７８、ＨｕＨ−７等）１×１０^６個の細胞を１５ｍＬチューブに入れて遠心分離後、細胞ペレットを１ｍＬのＲＰＭＩ１６４０−１０％ ＦＢＳ培地で懸濁した後１ｍＭのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ、Ｃ３４８５２）を３０μＬ入れてから銀ホイル紙で光を遮断して３７℃インキュベーターで一時間染色した。Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ染色が終わった腫瘍細胞株は、１０〜１５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０−１０％ ＦＢＳ培地を入れて洗浄して遠心分離した後、ペレットを１０ｍＬのＲＰＭＩ培地で懸濁して１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度にした。

ナチュラルキラー細胞は、３×１０^６個を１５ｍＬチューブに入れて遠心分離して、ペレットをターゲット腫瘍細胞株に備えて所望の割合でＲＰＭＩ１６４０−１０％ ＦＢＳ培地に懸濁した。準備されたターゲット腫瘍細胞株とナチュラルキラー細胞株を丸底９６−ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に１００μＬずつ混ぜて分注して、各ウェルを３個ずつ（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）準備して平均値を得た。スポン（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）ウェル（ｗｅｌｌ）には染色された腫瘍細胞株を１００μＬずつ入れてＲＰＭＩ１６４０−１０％ ＦＢＳ培地を１００μＬずついれる。マックス（Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）ウェル（ｗｅｌｌ）には染色された腫瘍細胞株を１００μＬずつ入れて２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００溶液を１００μＬずついれる。ＲＰＭＩ１６４０−１０％ ＦＢＳ培地および２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００溶液に存在する自己蛍光値を補正するために、ＲＰＭＩ１６４０−１０％ ＦＢＳ培地２００μＬを入れて培地値を準備して、ＲＰＭＩ１６４０−１０％ ＦＢＳ培地１００μＬに２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００ソリューション１００μＬを入れて二つの溶液の混合液の値を準備する。培地値から混合液の値を差し引いた差（Ａ）をマックス（Ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）値に加えて自己蛍光値を補正した。

光を遮断して３７℃インキュベーターで４時間反応させた後、プレートを２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み液を９６ウェルブラックプレート（９６ ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ）に１００μＬずつ入れて、蛍光プレートリーダー機（ＰＥＲＫＩＮ Ｅｌｍｅｒ，ＶＩＣＴＯＲ Ｘ３）を利用して蛍光値（ＯＤ_{４８０／５３５ｎｍ}）を測定して、ナチュラルキラー細胞の腫瘍細胞殺傷能は次の通り計算した。
％ ｏｆ ｋｉｌｌｉｎｇ＝（Ｓａｍｐｌｅ ｗｅｌｌ平均蛍光値−Ｓｐｏｎ ｗｅｌｌ平均蛍光値）／｛（Ｍａｘ ｗｅｌｌ平均蛍光値＋Ａ）−Ｓｐｏｎ ｗｅｌｌ平均蛍光値｝×１００

種々の支持細胞で培養されたナチュラルキラー細胞を様々な腫瘍細胞株と反応させて直接的な細胞殺害能を測定した。

表１の条件１（ＰＢＭＣ原料細胞に種々の支持細胞で１４日間培養）で培養したナチュラルキラー細胞の細胞殺傷能測定は、血液癌細胞株Ｋ５６２、肝臓癌細胞株ＨｕＨ−７、リンパ腫細胞株ＨｕＴ７８、脳腫瘍細胞株Ｕ８７−ＭＧ、網膜芽細胞腫細胞株ＳＮＵＯＴ−Ｒｂｌ、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３を対象に評価した。その結果、いずれの腫瘍ターゲットに対してＨ９とＨｕＴ７８で培養した場合、ＰＢＭＣ支持細胞で培養した場合より高い細胞殺傷能を示した（図５Ａ）。

表１の条件２（ＰＢＭＣ原料細胞を２１日培養）で培養したナチュラルキラー細胞の細胞殺傷能を測定した結果、Ｋ５６２腫瘍細胞株に対してＨｕＴ７８＞Ｈ９＞ＰＢＭＣ順に細胞殺傷能を示した（図５Ｂ）。

また、表１の条件３（ＣＤ３（−）原料細胞に種々の支持細胞で１４日間培養）で培養したナチュラルキラー細胞の細胞殺傷能測定は、血液癌細胞株Ｋ５６２、肝臓癌細胞株ＨｕＨ−７、リンパ腫細胞株ＨｕＴ７８、脳腫瘍細胞株Ｕ８７−ＭＧ、網膜芽細胞腫細胞株ＳＮＵＯＴ−Ｒｂｌ、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−３を対象に評価した。その結果、Ｋ５６２を除いた多くの腫瘍ターゲットに対してＨ９とＨｕＴ７８で培養した場合、ＰＢＭＣ支持細胞で培養した場合より高い細胞殺傷能を示した。特に、ナチュラルキラー細胞の殺傷能に抵抗性を有する癌細胞であるほどその差が大きく示された（図５Ｃ）。

表１の条件４（ＣＤ３（−）原料細胞を２１日培養）で培養したナチュラルキラー細胞の細胞殺傷能を測定した結果、Ｋ５６２腫瘍細胞株に対する細胞殺傷能が支持細胞の種類と関係なく類似する水準で示された（図５Ｄ）。これは、原料細胞を１次刺激時同様にＰＢＭＣを使用して、２次刺激時にだけＰＢＭＣと種々のＴ細胞を使用することにより支持細胞による特異性が大きく現れなかったと考えられる。

表１の条件３で培養した増殖不振ドナーである場合のナチュラルキラー細胞の細胞殺傷能結果は、Ｋ５６２腫瘍細胞株に対してＨｕＴ７８が最も高い殺傷能を示して、Ｈ９とＰＢＭＣ支持細胞の場合、類似する水準の値を示した（図５Ｅ）。

従って、ＨｕＴ７８の場合、大部分の条件で様々な腫瘍細胞株を対象に最も高い細胞殺傷能を示した。特に、Ｈ９とＨｕＴ７８で培養されたナチュラルキラー細胞は抵抗性を示す腫瘍細胞株でより高い殺害能を示すことによって、ＰＢＭＣよりも効能の側面で優れた細胞であることを確認することができた。
条件１、２、３および４で培養したナチュラルキラー細胞の特性を表でまとめた。

本発明に係るＴ細胞を利用したナチュラルキラー細胞の製造方法は、ナチュラルキラー細胞の高い殺害能を維持しながら少量の原料細胞からナチュラルキラー細胞だけ選択的に増殖させて製造できる方法で、凍結が可能なナチュラルキラー細胞を大量で製造できて、細胞治療剤としての商用化に有用である。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims (23)

1. ＣＤ４（＋）Ｔ細胞を支持細胞として利用して原料細胞（ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）を培養することを特徴とするナチュラルキラー細胞の製造方法。
2. 前記ＣＤ４（＋）Ｔ細胞は、体外に分離したＣＤ４（＋）Ｔ細胞、体外拡張培養されたＣＤ４（＋）Ｔ細胞またはＣＤ４（＋）Ｔ細胞株であることを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
3. 前記ＣＤ４（＋）Ｔ細胞株は、Ｈ９またはＨｕＴ７８であることを特徴とする請求項２に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
4. 前記ＣＤ４（＋）Ｔ細胞は、分裂及び増殖が抑制された不活性化細胞または不活性化させない細胞であることを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
5. 前記原料細胞は、末梢血液細胞、末梢血白血球細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核球細胞）、濃縮されたナチュラルキラー細胞および分離したナチュラルキラー細胞で構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
6. 前記原料細胞は、ＣＤ３（＋）細胞を除去させた細胞であることを特徴とする請求項５に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
7. 支持細胞と原料細胞の比率を１以上で混合して培養することを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
8. 支持細胞と原料細胞の比率は、２：１〜２０：１であることを特徴とする請求項７に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
9. 前記ナチュラルキラー細胞は、５〜６０日培養することを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
10. Ｔ細胞に低親和性を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体およびインターロイキンタンパク質が含まれた培地でナチュラルキラー細胞を培養することを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
11. 前記Ｔ細胞に低親和性を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体は、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１およびＨＩＴ３ａからなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
12. 前記インターロイキンタンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１０に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
13. 原料細胞対比２〜２０倍数のＣＤ４（＋）Ｔ細胞を支持細胞として利用してＣＤ３（＋）細胞を除去させた原料細胞を再刺激する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
14. 前記再刺激は、５〜１２日間隔で行うことを特徴とする請求項１３に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
15. 前記再刺激は、１回以上繰り返し行うことを特徴とする請求項１３に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
16. 前記再刺激する工程で利用されるＣＤ４（＋）Ｔ細胞株は、Ｈ９またはＨｕＴ７８であることを特徴とする請求項１３に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
17. 前記再刺激する工程で利用されるＣＤ４（＋）Ｔ細胞株は、分裂及び増殖が抑制された不活性化細胞または不活性化されてない細胞であることを特徴とする請求項１３に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
18. Ｔ細胞に低親和性を有し、Ｔ細胞を刺激する抗体およびインターロイキンタンパク質が含まれた培地でナチュラルキラー細胞を培養することを特徴とする請求項１３に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
19. 前記Ｔ細胞に低親和性を有してＴ細胞を刺激する抗体は、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１およびＨＩＴ３ａからなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１８に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
20. 前記インターロイキンタンパク質は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１からなる群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１８に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
21. 請求項１〜２０のいずれかに記載の方法によって製造されたナチュラルキラー細胞。
22. 請求項２１に記載のナチュラルキラー細胞を有効成分として含む癌または感染性疾患の予防または治療用組成物。
23. 予防又は治療を必要とする対象者に、請求項２１に記載のナチュラルキラー細胞を有効成分として含む組成物の治療有効量を投与することを含む、癌又は感染症の予防又は治療方法。