KR102216710B1 - Nk세포배양배지용 첨가조성물, 상기 첨가조성물을 이용한 nk세포배양방법 및 상기 배양방법으로 얻어진 피부트러블개선용 화장료조성물 - Google Patents

Nk세포배양배지용 첨가조성물, 상기 첨가조성물을 이용한 nk세포배양방법 및 상기 배양방법으로 얻어진 피부트러블개선용 화장료조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역요법에 적용되는 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 CD4+T세포를 억제하여 NK세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 NK세포배양배지용 첨가조성물, 상기 첨가조성물을 이용한 NK세포배양방법 및 상기 배양방법으로 얻어진 피부트러블개선용 화장료조성물에 대한 것이다.

Description

NK세포배양배지용 첨가조성물, 상기 첨가조성물을 이용한 NK세포배양방법 및 상기 배양방법으로 얻어진 피부트러블개선용 화장료조성물{NK cell culture medium, NK cell culture method using the above-mentioned additive composition, and cosmetic composition for skin trouble improvement obtained by the above culture method}
본 발명은 면역요법에 적용되는 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 배양방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 조절 T세포(Treg)를 억제하여 NK세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 NK세포배양배지용 첨가조성물, 상기 첨가조성물을 이용한 NK세포배양방법 및 상기 배양방법으로 얻어진 피부트러블개선용 화장료조성물에 대한 것이다.
NK 세포는 초기 생체방어 기구와 인체의 종양면역에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, NK 세포는 주요조직적합유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex : MHC)의 발현에 따른 면역 획득 과정 없이도 특정자기세포, 동종세포, 심지어 이종 암세포도 살상할 수 있으며, 특히 Class1 MHC를 적게 발현하거나 발현하지 않는 표적 세포들을 더 잘 죽일 수 있다. 따라서, NK 세포는 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포를 효과적으로 죽일 수 있으며, 그 외에도 몇몇 바이러스에 감염된 세포와 장티프스균(salmonella typhi)과 같은 세균들을 죽일 수 있다. 그러나, 이와 같이 암세포 살상에 탁월한 작용을 하는 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 말초혈액 림프구의 5 ~ 15 % 만을 차지하고 있으며, 특히 중증 암환자의 경우에는 그 비율이 1 % 미만으로 저하되기 때문에, 면역요법을 통한 별도의 증폭 과정 없이는 암세포를 효과적으로 공격하는 데에 한계가 있다.
면역요법은 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포), 수지상세포(DC), B 세포, T 세포 등 암 치료에 가장 중요한 면역세포를 환자의 혈액에서 추출한 후 여러 종류의 자극제를 이용하여 암에 강하게 작용하는 면역세포로 키운 뒤 다시 환자에게 주입하는 방법으로서, 환자 자신의 혈액을 사용하기 때문에 종래의 화학요법 등에 비해 부작용도 적고 투여법도 간편하여 최근 들어 활발하게 연구되고 있다.
특히, NK 세포 배양에 있어서 T세포 특히 도움 T세포의 역할이 필요한데, 도움 T세포(Helper T cell, 또는 Th cell)는 백혈구들의 분화 및 활성화를 조절함으로써 체액성 및 세포성 면역을 촉진하는 세포를 말한다. 세포 표면에 CD4 단백질을 가지고 있다는 특징 때문에 CD4+T세포라고도 한다. CD4+T세포는 세부 기능에 따라 다시 Th1, Th2, Th17, Treg 등으로 분류된다. Th1 세포는 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ)와 종양괴사인자 베타(Tumor Necrosis Factor beta, TNF-β)를 분비함으로써 대식세포의 내부에서 엔도솜과 리소좀이 융합하여 엔도리소좀을 형성하도록 유도한다. 한편 Th2 세포는 여러 종류의 인터루킨(interleukin, IL)을 분비하여 B 세포가 형질 세포로 분화하도록 한다. Th17 세포는 인터루킨-17(IL-17)을 분비하여 호중성백혈구를 모이게 한다. 조절 T세포라고도 부르는 Treg 세포는 면역 반응을 촉진하는 것이 아니라 오히려 억제함으로써 면역의 항상성을 유지하며 자가면역반응 등을 차단한다. 조절 T세포(Treg)는 면역계의 구성성분으로 다른 세포들의 면역 반응을 억제하는데, 이는 면역계에서 과도한 반응을 막기 위해 만들어진 중요한 '자가-점검' 이다. 조절 T 세포는 침입한 미생물을 성공적으로 없앤 후의 면역반응을 멈추는데 연관되며, 또한 자가면역 세포 질환을 막는데도 관여한다. 면역 체계는 자기(self)와 비(非)-자기를 구별할 수 있어야 한다. 자기/비자기 구별에 실패하면, 면역체계는 체내의 세포와 조직을 파괴하며, 그 결과 자가면역 질병을 일으킨다. 조절 T세포는 활발히 면역체계의 활성을 억제하고 자가면역 질병 같은 병적인 자가반응을 막는다. 조절 T세포가 어떻게 억제/조절 활동을 하는지에 대한 분자단위 작용 원리는 아직 명확히 밝혀지지 않았으며 면역억제 사이토카인 TGF-beta와 인터루킨10(IL-10) 또한 조절 T세포 기능에 연관되어 있음이 보고되고 있다.
한편, 면역세포를 활성화하기 위해서 여러 종류의 항체나 Cytokine 등을 사용하면 조절 T 세포(regulatory T cells (Treg, Tregs))도 같이 활성화 된다. 단지 Treg는 활성화되는데 다른 세포들에 비해서 시간이 좀 걸린다. 따라서 세포 배양 초기에는 세포수가 잘 증가하나 약 8일에서 9일 이상 배양했을 때 활성화 된 Treg에 의해 세포수가 생각만큼 증가하지 않는 경우가 더러 있다. 특히 면역력이 많이 저하되어 있는 암환자 등에서 많이 발견되며 Treg 세포수가 많고 활성화 되어 있는 환자의 경우 이러한 현상이 두드러지는데 바로 Treg에 의한 영향 때문에 그렇다.
따라서, Treg에 의한 영향을 최소화하여 면역세포를 대량으로 증식할 수 있는 NK세포 대량배양방법에 대한 기술이 개발될 필요성이 존재한다.
대한민국특허공개번호 제10-2018-0057359호
본 발명자는 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 연구 노력한 결과, 면역세포 배양시 조절 T세포(Treg)의 활성을 저해할 수 있는 기술을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 NK세포 배양시 특정시기에 CD4+T 세포 특히 조절 T세포(Treg)의 활성을 억제함으로써 NK 세포를 보다 많이 증식시킬 수 있는 NK세포배양배지용 첨가조성물, 상기 첨가조성물을 이용한 NK세포배양방법 및 그 방법으로 얻어진 NK세포를 포함하는 면역세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 IFN-γ와 IL-10 등의 농도가 높은 무혈청 면역세포배양액을 유효성분으로 포함하여 염증제거에 효과적으로 작용하므로 피부트러블 개선 등에 효과가 우수한 화장료조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 IFN-γ와 IL-10 등의 농도가 높은 무혈청 면역세포배양액을 유효성분으로 포함하여 염증제거에 효과적으로 작용하므로 창상이나 화상 등의 상처 치료 및 피부질환치료 등에 효과가 우수한 약학적조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 상세한 설명의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 목적 역시 당연히 포함될 수 있을 것이다.
상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 NK세포배양배지용 첨가조성물을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 유효성분은 스테로이드제로서 NK세포가 증식되게 작용한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 스테로이드제는 글루코코르티코이드(glucocorticoids)이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 글루코코르티코이드는 코티솔(Cortisol), 코르티손(Cortisone), 프레드니솔론(Prednisolone), 프레드니손(prednisone), 메틸프레드니솔론(Methylpredni solone), 덱사메타손(Dexamethasone), 베타메타손(Betamethasone), 트리암시놀론(Triamcinolone), 플루드 코르티손 아세테이트( Fludrocortisone acetate), 데옥시코르티코스테론 아세테이트 (deoxycorticosterone acetate)로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 첨가조성물은 NK세포 배양단계에서 상기 NK세포배양배지의 T세포가 자극된 후 처리된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 스테로이드제는 0.2㎍/ml 이상의 농도로 포함된다.
또한, 본 발명은 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)가 배양되는 배양배지에 NK세포자극용 물질을 처리하는 NK세포자극단계; 상기 NK세포자극단계에서 NK세포가 자극된 후 상기 배양배지에 T세포자극용 물질을 처리하는 T세포자극단계; 및 상기 T세포자극단계에 의해 T세포가 자극된 후 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물 중 하나 이상을 포함하는 NK세포배양배지용 첨가조성물을 상기 배양배지에 처리하는 첨가조성물처리단계;를 포함하는 NK세포배양방법을 제공한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 NK세포자극용 물질은 항CD16 항체, 항CD56 항체 및 IL-2, IL-12, IL-18 로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상이고, 상기 T세포자극용 물질은 항CD3 항체, 항CD4 항체 및 항CD28항체로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상이다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물은 스테로이드제로서 조절 T세포(Treg)의 면역 억제 활성을 억제함으로써 NK세포가 잘 증식되게 작용한다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 T세포자극단계는 배양 2일째에 수행되고, 상기 첨가조성물처리단계는 배양 3일째에 수행된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 첨가조성물처리단계가 배양 5일 이후에 1회 이상 더 수행될 수 있다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 첨가조성물은 상기 스테로이드제를 0.2ug/mL 이상의 농도로 포함하는데, 상기 스테로이드제는 IL-12 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 기본용액에 용해시켜 형성된 사이토카인1-1용액 또는 담체에 용해된다.
바람직한 실시예에 있어서, 상기 첨가조성물처리단계 수행 후 11일 내지 16일 배양한 다음 NK세포를 수확하는 단계;를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 상술된 NK세포배양방법에 의해 얻어진 NK세포를 유효성분으로 포함하는 면역세포치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 NK세포배양방법으로 20일 이상 배양되어 분리되거나 수확되어 동결 후 해동되어 활력이 떨어진 NK세포를 준비하는 단계; 및 상기 준비된 NK세포를 사이토카인1-1용액에서 배양하는 단계;를 포함하는 NK세포 재활성화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 어느 하나의 NK세포배양방법으로 11일 동안 배양한 후 NK세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 NK세포를 사이토카인1-1용액에서 배양하는 단계; 및 상기 NK세포를 수확하고 남은 배지조성물을 얻는 단계;를 포함하는 NK세포 배지조성물 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 NK세포배지조성물 제조방법에 의해 얻어진 NK세포 배지조성물을 유효성분으로 포함하는 피부트러블 개선용 화장료조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상술된 NK세포배지조성물 제조방법에 의해 얻어진 NK세포배지조성물을 유효성분으로 포함하는 피부질환치료용 약학조성물을 제공한다.
상술된 본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물은 NK세포 배양시 특정시기에 CD4+T 세포, 특히 조절 T세포(Treg)의 면역 억제 활성을 억제함으로써 NK세포를 보다 많이 증식시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료조성물 및 약학조성물은 IFN-γ와 IL-10 등의 농도가 높은 무혈청 면역세포배양액을 유효성분으로 포함하여 염증제거에 효과적으로 작용하므로 피부트러블 개선은 물론 창상이나 화상 등의 상처 치료 및 피부질환치료 등에 우수한 효과가 있다.
본 발명의 이러한 기술적 효과들은 이상에서 언급한 범위만으로 제한되지 않으며, 명시적으로 언급되지 않았더라도 후술되는 발명의 실시를 위한 구체적 내용의 기재로부터 통상의 지식을 가진 자가 인식할 수 있는 발명의 효과 역시 당연히 포함된다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 NK세포배양방법에서 시간에 따른 세포 수 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2a 본 발명의 실시예에 따른 NK세포배양방법으로 배양된 배양배지의 FACS data를 나타낸 그래프이고, 도 2b는 비교예에 따라 배양된 배양배지의 FACS data를 나타낸 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는 각각 NK세포비율이 약 50% 정도 되는 세포를 이용하여 NK세포배양배지용 첨가조성물에 포함되는 스테로이드제 농도를 약 2배 높여서 day3, day4, day8에 처리한 것과 처리하지 않은 것을 배양하여 얻어진 FACS data를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 사이토카인과 항 CD3항체만을 이용하여 NK세포배양시 NK세포배양배지용 첨가조성물을 처리한 배양배지의 FACS data를 나타낸 그래프이고, 도 4b는 처리하지 않은 배양배지의 FACS data를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 항 CD3항체를 고정화시키는 방법으로 NK세포배양시 NK세포배양배지용 첨가조성물을 처리한 배양배지의 FACS data를 나타낸 그래프이고, 도 5b는 처리하지 않은 배양배지의 FACS data를 나타낸 그래프이다.
본 발명에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성 요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성 요소는 제2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성 요소도 제1 구성 요소로 명명될 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명에서 "면역세포"는 NK세포 및 T세포만을 포함하는 의미로 사용되었다. "NK세포"는 NK cell과 NKT cell을 모두 포함하는 의미로 사용되지만, 경우에 따라서는 NK cell만을 의미하는 것으로 사용될 수도 있다.
시간 관계에 대한 설명일 경우, 예를 들어, '~후에', '~에 이어서', '~다음에', '~전에' 등으로 시간 적 선후관계가 설명되는 경우, '바로' 또는 '직접'이 사용되지 않는 이상 연속적이지 않은 경우도 포함한다.
이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.
그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명의 기술적 특징은 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물의 새로운 용도에 대한 것으로, 특히 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하여 NK세포 배양시 특정시기에 CD4+T 세포, 특히 조절 T세포(Treg)의 면역 억제 활성을 억제함으로써 NK세포를 보다 많이 증식시킬 수 있는 NK세포배양배지용 첨가조성물, 이를 이용한 NK세포배양방법, 그 방법으로 얻어진 면역세포치료제 및 배지조성물에 있다.
즉, NK 세포를 배양할 때 NK세포는 초기뿐만 아니라 배양 중에도 자극이 필요하지만 T 세포의 자극은 초기 자극만으로도 충분하기 때문에 NK세포자극물질로 NK세포를 우선 자극한 후에 T세포자극물질로 T세포를 자극하여 활성화시켜 활성화된 T세포와 NK세포자극물질이 함께 NK세포를 더 자극하게 한 후 바로 활성화된 T세포 중 CD4+T 세포, 특히 조절 T세포(Treg)의 면역 억제 활성을 억제할 수 있는 방법을 찾을 수 있다면 NK세포를 보다 많이 활성화시키거나 증식시킬 수 있음은 자명한 사실이기 때문이다.
이러한 사실을 기반으로 본 발명은 CD4+T세포를 억제하는 것으로 알려져 있으며 그 중에서도 Treg 세포를 더 억제하는 것으로 알려져 있는 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물의 작용을 NK세포배양에 활용할 수 있다는 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물의 새로운 용도를 개발하였다.
보다 구체적으로, 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물로 널리 알려진 스테로이드제는 Th1, Th2, Th17, Treg 등의 CD4+T 세포를 억제하여 염증 및 통증 제거 효과가 있지만 장기간 사용했을 때 면역저하 등 관련 부작용이 심각하게 나타난다고 알려져 있는데, NK세포 배양시에는 면역세포 활성화 후 스테로이드제에 의해 Treg 세포가 억제되면 오히려 NK세포 증식 및 활성화가 억제되지 않고 배양 중 면역세포가 어느 정도 과밀하여도 NK세포 활성화와 세포증식을 방해하지 않는 것을 확인하였기 때문이다.
따라서, 본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물은 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함한다.
여기서, 상기 유효성분은 조절 T세포(Treg)의 활성을 억제할 수 있기만 하면 공지된 모든 약물이 사용될 수 잇는데, 일 구현예로서 스테로이드제를 사용할 수 있다. 스테로이드제는 CD4+T 세포, 특히 조절 T세포(Treg)의 면역 억제 활성을 억제함으로써 NK세포의 증식에 작용하는 것으로, 실험적으로 스테로이드제는 조절 T세포의 면역반응 억제 활성을 제거하여 전체적으로 T세포의 성장을 어느 정도 억제하는 특성도 가진 것으로 나타났다.
본 발명에서 NK세포배양배지용 첨가조성물에 포함되는 스테로이드제는 스테로이드제로 작용할 수 있는 공지된 모든 스테로이드제 약물을 사용할 수 있으나, 글루코코르티코이드(glucocorticoids)계 일 수 있다. 일 구현예로서 코티솔(Cortisol), 코르티손(Cortisone), 프레드니솔론(Prednisolone), 프레드니손(prednisone), 메틸프레드니솔론(Methylpredni solone), 덱사메타손(Dexamethasone), 베타메타손(Betamethasone), 트리암시놀론(Triamcinolone), 플루드 코르티손 아세테이트( Fludrocortisone acetate), 데옥시코르티코스테론 아세테이트 (deoxycorticosterone acetate)로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상일 수 있을 것이다.
본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물에서 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물은 0.1㎍/ml 이상의 농도로 포함될 수 있는데, 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물의 일 예로 사용된 스테로이드 약물류는 후술하는 실험예에서 알 수 있듯이 일단 활성화된 NK 세포 및 Tc 세포 등 세포성 면역세포 증식에는 전혀 영향을 주지 않는 것을 확인하였으며 배양시간이 지날수록 NK세포 비율이 더 올라가는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 스테로이드 약물의 농도가 높아지면 T세포의 증식률이 어느 정도 억제되어 스테로이드 약물 농도에 비례하여 NK세포비율이 상대적으로 많이 높아지는 효과도 있었다. 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물로 사용된 스테로이드제가 0.1㎍/ml 미만으로 처리되면 CD4+T 세포, 특히 조절 T세포(Treg)의 면역 억제 활성을 억제하는 특성이 충분하게 발휘되지 않았고, 후술하는 실험예를 통해 스테로이드제가 높은 농도로 처리되더라도 9㎍/ml을 초과하게 되면 NK세포배양에 미치는 영향이 크게 달라지지 않을 것으로 예측되었다. 따라서, 본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물에 포함되는 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물은 0.1㎍/ml이상의 농도를 갖기만 하면 원하는 효과를 얻을 수 있을 것으로 예측된다.
또한, 공지된 바와 같이 NK세포 배양시 NK세포는 초기에 자극된 후 충분히 활성화되기 위해서는 반드시 자극된 T세포의 도움이 필요하므로, 본 발명의 첨가조성물은 NK세포 배양단계에서 NK세포배양배지의 T세포가 자극된 후 처리될 수 있다. 이와 같이 NK세포배양시 본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물을 NK세포배양배지의 T세포 자극 후 적절한 시기에 사용하면 매우 효과적으로 Tc 및 NK 면역세포 증식률, 특히 NK세포의 증식률을 증가시킬 수 있다.
다음으로, 본 발명의 NK세포배양방법은 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)가 배양되는 배양배지에 NK세포자극용 물질을 처리하는 NK세포자극단계; 상기 NK세포자극단계에서 NK세포가 자극된 후 상기 배양배지에 T세포자극용 물질을 처리하는 T세포자극단계; 및 상기 T세포자극단계에 의해 T세포가 자극된 후 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물 중 하나 이상을 포함하는 NK세포배양배지용 첨가조성물을 상기 배양배지에 처리하는 첨가조성물처리단계;를 포함할 수 있다. 또한 첨가조성물처리단계 수행 후 11일 내지 16일 배양한 다음 NK세포를 포함하는 면역세포를 수확하는 단계를 더 수행할 수 있다.
여기서, NK세포자극용 물질은 IL-2, IL-12 및 IL-18을 포함하는데, 필요한 경우 항CD16 항체 및/또는 항CD56 항체 등을 더 포함할 수 있고, T세포자극용 물질은 항CD3 항체를 포함하는데, 필요한 경우 항CD4 항체 및/또는 항CD28항체 등을 더 포함할 수 있다.
좀 더 구체적으로 살펴보면, 일반적으로 NK면역세포 배양시 IL-2에 의해서 Th1을 자극하여 활성화하는 상태에서 항CD16 항체, 항CD56 항체 등 NK세포자극물질에 의해 NK 세포를 자극하게 된다. 또한 항CD3 항체 등 T세포자극물질에 의해 Th 세포를 자극하여 활성화된 Th1세포에 의해서 NK 세포 및 Tc 세포를 자극하게 되어 NK 및 Tc 세포가 활성화되고 특히, IL-12, IL-18과 항CD16 항체, 항CD56 항체의 자극에 의해 NK 세포가 활성화되고 잘 자라게 된다. 그러나 항CD3 항체 등으로 자극을 하면 모든 T세포를 자극하게 되므로 특히 Th2 등의 체액성 면역세포 및 Treg 도 같이 자극을 하게 되는데 이들 세포는 NK세포가 활성화되고 증식되는데 도움이 되지 않는다. 특히 Treg 세포는 NK 세포의 활성화 및 증식을 방해하므로 Treg 세포를 무력화 하면 NK 세포를 잘 증식시킬 수가 있다.
조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물 중 여러 종류의 스테로이드 약물들은 T세포 특히 Treg를 억제하므로 시기에 맞게 잘 사용하면 자연살해세포 배양에 효과적으로 사용될 수 있는데, 일 구현예로서, T세포자극단계는 배양 2일째에 수행되고, 첨가조성물처리단계는 배양 3일째에 수행될 수 있다. 즉, NK세포배양 0일 및/또는 1일째에 NK세포자극물질을 처리하여 NK세포를 자극한 후 배양 2일째에 항 CD3항체, 항CD4항체 또는 항CD28 등과 같은 T세포자극물질로 T세포를 자극하여 Tc, NK 세포 등을 활성화 한 후 배양 3일 째에 본 발명의 스테로이드제가 포함된 첨가조성물로 처리해 주게 되면 CD4+T 세포, 특히 조절 T세포(Treg)의 면역 억제 활성이 억제되므로, NK 세포 등이 증식 및/또는 활성화되는데 억제활성을 나타내지 못한다. 또한 첨가조성물처리단계가 배양 5일 이후에 1회 이상 더 수행될 수 있다.
이와 같이 본 발명의 NK세포배양방법에 따라 CD4+T 세포, 특히 조절 T세포(Treg)를 억제하면 후술하는 실험예에서 알 수 있듯이 NK세포의 비율을 첨가조성물을 처리하지 않은 경우에 비해 크게 높일 수 있다.
한편, 본 발명의 NK세포배양방법에서 사용되는 첨가조성물은 조절 T세포(Treg)활성 억제용 약물을 0.1ug/mL 이상의 농도로 포함하는데, 일 구현예로서 스테로이드제는 사이토카인1-1용액(IL-12 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 기본용액에 용해시켜 형성) 또는 담체에 용해될 수 있다. 여기서, 기본용액(B용액)은 IL-2, L-글루타민 및 세포배양용 배지를 포함하는 것이다.
다음으로, 본 발명의 면역세포치료제는 상술된 NK세포배양방법으로 얻어진 NK세포를 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 면역세포치료제는 대체로 NK세포를 생리식염수 등 담체에 포함시켜 링거형식으로 환자의 몸속에 투여될 수 있는데, NK세포에 영향을 주지 않지만 환자의 치료에 유효한 공지된 성분을 더 포함할 수 있음은 물론이다. 여기서, 환자는 인간은 물론 포유동물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 NK세포 재활성화방법은 활력이 떨어진 NK세포의 역가를 높이기 위한 방법으로 상술된 NK세포배양방법으로 20일 이상 배양되어 분리되거나, 상술된 NK세포배양방법에서 수확되어 동결 보관된 후 해동되어 활력이 떨어진 NK세포를 포함하는 면역세포를 준비하는 단계; 및 상기 준비된 면역세포를 사이토카인1-1용액에서 배양하는 단계;를 포함한다.
일반적으로 림프구세포 배양 초기 즉, 세포가 젊었을 때(배양 초기)에는 IL-2 등 cytokine의 고농도에서 증식이 잘되나 약 배양 8 ~10일 후에는 증식률이 떨어지고 잘 자라지 않으며 이때 cytokine의 농도를 묽게 해주면 Treg의 면역 억제 활성을 저하시켜 비교적 잘 증식이 된다. 하지만 이 경우 문제는 NK 세포 증식률이 크지 않을 뿐만 아니라 약한 NK세포의 경우 그 활성을 잃어버리기 쉽다. 이 때 IL-2, IL-12, IL-18 등의 Cytokine이 포함된 용액으로 처리해주면 NK 세포의 활성도가 올라가는데 Treg 세포도 같이 활성화 되어 NK세포수가 줄고 일관성 있게 NK 세포를 활성화 하는 것이 쉽지 않다. Treg이 약하면 NK 세포의 활성화가 어느 정도 될 수도 있으나 대부분의 경우 세포수가 급격히 감소하거나 특히 중증 암환자의 경우 NK 세포가 활성화되지 않는 경우가 많다. 그러나 본 발명의 NK세포배양방법과 같이 배양초기에 NK세포와 T세포를 자극한 후 스테로이드제를 포함하는 첨가조성물을 처리하여 Treg를 억제한 상태에서는 배양 8~10일 이후에 Cytokine의 농도를 높여 주면 NK세포 증식에 방해되지 않고 NK세포가 잘 증식되고 활성화된다.
특히, 본 발명의 재활성화방법에 의하면 NK 세포를 포함하는 면역세포가 배양된 지 3~4주되어 세포분열이 거의 마지막에 다다르고 매우 늙어 활성을 잃은 세포일지라도 잘 활성화되는 것을 확인하였다.
다음으로 본 발명의 NK세포 배지조성물 제조방법은 많은 양의 IFN-γ와 IL-10을 포함하는 배지조성물을 얻기 위한 방법으로서, NK세포배양방법으로 11일 동안 배양한 후 NK세포를 포함하는 면역세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 면역세포를 사이토카인1-1용액에서 배양하는 단계; 및 상기 면역세포를 수확하고 남은 배지조성물을 얻는 단계;를 포함한다. 즉, IL-10은 마크로파지를 M2b 형으로 유도하여 염증을 제거하는 역할을 하게 하는 것으로 알려져 있기 때문이다.
다음으로, 본 발명의 화장료조성물 및 약학조성물은 상술된 NK세포 배지조성물 제조방법으로 얻어진 배지조성물을 유효성분으로 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 배지조성물은 후술하는 실험예와 같이 IFN-γ와 IL-10이 많이 포함된 것이 확인되어 피부 트러블 개선은 물론 상처치료 및 피부질환치료에 효과적이다. 또한, NK세포배양시 얻어진 배지조성물의 효과가 기재된 특허공개번호 제10-2018-0057359호에 의하면, 피부 미백, 색소 침착 제거, 주름 개선 중 하나 이상에 유효하며, 알러지 비염, 알러지 피부염, 아토피 피부염, 여드름, 벌레 물려 생긴 염증 등에 염증 개선 효과가 좋았으며 특히 가려움을 신속히 없애 주는 효과가 있고, 화상, 창상 등의 치료를 통한 피부재생효과와 침착 색소의 제거에 효과가 매우 좋은 것으로 나타나므로, 본 발명의 화장료조성물 및 약학조성물에 대한 유효성이 간접적으로 뒷받침되는 것을 알 수 있다.
또한, 후술하는 본 발명의 NK세포배양방법의 일부 실시예에서 사용되는 면역세포배양용 배지첨가키트(NKTM)는 면역세포배양의 각 단계에서 배지에 첨가될 수 있도록 각각 개별적으로 포장되고 내용물 즉 구성성분이 다른 B유닛(기본용액, B용액), C1-1유닛(사이토카인1-1용액), C1-2유닛, C2유닛, A1유닛, A2유닛 및 D유닛을 포함하여 구성되는데, 각 유닛에 대한 상세한 설명 및 상기 유닛을 이용하여 면역세포를 배양하는 배양과정(NKTM 배양과정)에 대한 구체적인 조건에 대한 상세한 설명은 특허공개번호 제10-2018-0057359호(이하 "선행특허")에 개시된 바 있으므로, 하기 실시예에서는 선행특허에 기재된 부분과 다른 부분만을 중점적으로 설명하기로 한다.
실시예 1
1.기본용액(B용액) 준비
IL-2 2.2mg과 500mM L-glutamine 용액 100mL를 부유세포 배양용 기본 배지(기본 배지에 IL-2 또는 L-glutamine이 이미 존재할 경우 최종농도를 맞추기 위해 첨가량을 조정한다)에 넣어 녹이고 최종 10L를 만들어 기본 용액(B용액)을 제조하였다.
2.사이토카인1-1용액 준비
IL-12 20ug과 IL-18 125ug을 증류수에 녹여 10mL로 만들어 사이토카인용액(C용액)을 제조하였다. C용액 1mL를 기본용액(B1용액) 1000mL에 녹여 사이토카인1-1용액(C1-1용액)을 제조하였다.
3. NK세포배양배지용 첨가조성물 제조
사이토카인1-1용액에 Dexamethasone sodium phosphate가 1ug/mL의 농도로 포함되도록 용해시켜 NK세포배양배지용 첨가조성물1을 준비하였다.
실시예 2
prednisolone (소론도정, 5mg/정, 유한양행)을 RPMI 배지에 녹여 167ug/mL의 농도로 만든 후, C1-1용액으로 20배 희석하여 8.3ug/mL농도의 NK세포배양배지용 첨가조성물2를 준비하였다.
실시예 3
methylprednisolone (피디정, 4mg/정, 중외제약)을 RPMI 배지에 녹여 80ug/mL의 농도로 만들었고 C1-1용액으로 10배 희석하여 8ug/mL의 농도의 NK세포배양배지용 첨가조성물3을 준비하였다.
실시예 4
betamethasone sodium phosphate(한올베타메타손주, 5.2mg/1mL ampule, 한올바이오파마)은 한올베타메타손주 1uL를 C1-1용액 10mL에 녹여서 0.4ug/mL의 농도의 NK세포배양배지용 첨가조성물4를 준비하였다.
실시예 5
하기와 같은 방법으로 NK세포를 배양하였다.
1. 배지첨가키트 준비
(1)A용액 : 항CD16 항체 및 항CD56 항체가 각각 0.01 ~ 1.5ug/mL농도로 포함되도록 항CD16 항체 및 항CD56 항체를 B1용액에 녹여 만든 용액
(2)A1용액 : 항CD16 항체가 0.1 ~ 15ug/mL농도로 포함되도록 항CD16을 C1-1 용액에 녹여 만든 용액
(3)A2용액 : 항CD56 항체가 0.1 ~ 15ug/mL농도로 포함되도록 항CD56 항체를 C1-1 용액에 녹여 만든 용액
(4) B1용액 : 부유세포 배양 기본 배지용액에 IL-2를 1000 ~ 4000 IU/mL의 농도가 되도록 만든 용액
(5) B2용액 : B1보다 IL-2의 농도가 2배인 용액
(6) C1-1용액 : IL-12가 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18가 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 IL-12 및 IL-18을 B1 용액에 녹여 만든 용액
(7) C5 용액 : C1-1 용액에서 IL-2, IL-18의 농도가 5배인 용액
(8) D용액 : 항CD3 항체가 1~12 ug/mL농도로 포함되도록 항CD3 항체를 C1-1 용액에 녹여 만든 용액
(9)R용액 : Cytokine이나 항체가 들어있지 않고 L-glutamine이 3~12 mM농도로 들어 있는 부유세포 배양용 기본 배지용액
2. 배양과정
림프구추출 및 자가혈장 준비단계를 선행특허와 동일하게 수행하였다.
Day 0 : 혈액으로부터 분리한 PBMC 1.0 X 10^7 개를 C1-1용액에 풀어 배양을 시작하였다.
Day 1 : 세포 배양 중인 세포에 A2용액 1mL를 추가하였다.
Day2 : 세포 배양 중인 세포에 D용액 1mL를 추가하였다.
Day3 : 세포 배양 중인 세포에 NK세포배양배지용 첨가조성물1을 5mL 추가하였다.
Day4 : 필요하면 보다 큰 배양 용기로 세포를 옮겨 배양한다. 세포 배양 중인 세포에 R용액 3mL를 추가해 주거나, C1-1용액 10mL로 배지를 교체해준다.
Day5 : 세포 배양 중인 세포에 A1용액 20mL를 추가하였다.
Day6 : 세포 배양 중인 세포에 A용액 20mL를 추가하였다.
Day7 : 세포 배양 중인 세포에 B1용액 40mL를 추가하였다
Day8 : 세포 배양 중인 세포에 R용액 300mL를 추가하였다.
Day10 : 세포 배양 중인 세포에 R용액 300mL를 추가하였다.
Day11 : 세포 배양 중인 세포에 B2용액 300mL와 C5용액 50mL를 추가하였다.
Day14~Day19 : 세포를 수확하였다.
실시예 6
Day3에 NK세포배양배지용 첨가조성물2를 4.5mL 추가한 것을 제외하면 실시예 5와 동일한 방법으로 NK세포를 배양하였다.
실시예 7
Day3에 NK세포배양배지용 첨가조성물3을 4.5mL 추가한 것을 제외하면 실시예 5와 동일한 방법으로 NK세포를 배양하였다.
실시예 8
Day3에 NK세포배양배지용 첨가조성물4를 4.5mL 추가한 것을 제외하면 실시예 5와 동일한 방법으로 NK세포를 배양하였다.
비교예 1
Day 3일에 NK세포배양배지용 첨가조성물1을 첨가하지 않은 것으로 제외하면 실시예5와 동일한 방법으로 NK세포를 배양하였다.
실험예 1
조절 T세포(Treg)억제용 약물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 NK세포배양배지용 첨가조성물이 NK세포배양시 미치는 효과를 확인하기 위해, 실시예 5과 같은 방법으로 NK세포배양시 얻어지는 세포증식 결과와 비교예1과 같은 방법으로 얻어지는 세포증식결과를 관찰하고 그 결과를 표 1(단위: ×107개), 표 2, 도 1 내지 도 2b에 나타내었다.
Day 0 4 6 7 8 11 13 14 15 17 19
실시예5 1.0 0.89 4.6 7.0 13.5 178 352 384 447 512 570
비교예1 2.0 1.45 6.4 10.0 19.1 78 175 180 182 175 120
배양 방법 NK cell(%) NK cell activity (%, effector cell/K562)
30:1 10:1
실시예5 97.08 91.4 79.6
비교예1 92.55 83.5 72.3
표 1 및 도 1로부터 알 수 있듯, 면역세포를 배양하는 과정에서 day2에 항CD3 항체로 처리하여 Th세포를 자극한 후 실시예5와 같이 day3에 스테로이드 계열 주사제인 덱사메타손 1uL가 포하된 NK세포배양배지용 첨가조성물을 배지에 넣어 배양하고 day4에 Th2, Treg 등에 의해서 만들어진 cytokine을 제거하기 위해 기존 배지를 제거하고 C1용액으로 교체하여 계속 배양하여 얻어진 세포수와 스테로이드제를 사용하지 않은 비교예1에서 얻어진 세포수를 비교하면, 초기 세포수 차이를 감안하여 그 증식률이 비교예1보다 실시예5의 방법으로 day14까지 배양했을 때 약 4.3배 이상, day17까지 배양했을 때 약 5.9배 이상 더 증식된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 표 2 및 도 2a, 도 2b로부터 알 수 있듯이, 증식 배양배지에서 NK세포가 차지하는 비율은 물론 활성도도 실시예5가 비교예1보다 더 높은 것을 알 수 있다. 한편, 실시예 5에서 Day4에 배지 교체 후에도 스테로이드 약물을 넣어주면 효과가 더 좋을 수도 있으나 day3에 한번만 처리하여도 효과가 매우 잘 나타났음을 알 수 있다.
또한, 이미 공지된 바와 같이, 림프구 배양으로 얻어진 활성화 림프구를 효과기세포(effector cell)로, 혈액암 세포주(K562)를 표적세포(target cell)로 각각 사용하고, 암세포 대비 활성화 림프구의 비율을 10:1로 설정하여 혈액암 세포주에 대한 활성화 림프구의 살해능력을 측정하는 역가 분석을 수행하였을 때, 활성화 림프구 중 NK세포가 차지하는 비율이 높을수록 그 값이 높은 것을 당연하므로 본 발명에 의해 배양된 NK세포 비중이 아주 높은 활성화 림프구의 치료 효과 우수함은 당연히 예측할 수 있을 것이다.
실험예 2
조절 T세포(Treg)억제용 약물로 다양한 스테로이드제를 포함하는 NK세포배양배지용 첨가조성물의 효과를 확인하기 위해 실시예 6 내지 8과 같은 방법으로 NK세포배양시 얻어지는 세포증식 결과를 관찰하고 그 결과를 표 3(단위: ×107개)에 나타내었다.
Day 0 4 6 7 8 11 13 14 15 17 19
실시예6 1.0 0.7 3.1 6.6 13.5 168 312 365 395 462 505
실시예7 1.0 0.6 3.2 6.5 13.2 153 325 374 420 480 520
실시예8 1.0 0.7 3.2 6.9 14.2 172 330 385 452 515 530
표 3으로부터 알 수 있듯이, 덱사메타손을 포함하는 NK세포배양배지용 첨가조성물1과 달리 각각 프레드니솔론을 함유하는 NK세포배양배지용 첨가조성물2, 메틸프레드니솔론을 함유하는 NK세포배양배지용 첨가조성물3 및 베타메타손 소듐 포스페이트를 포함하는 NK세포배양배지용 첨가조성물4가 첨가된 실시예6 내지 8의 경우도 증식이 매우 잘 되는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3
NK세포비율이 약 50% 정도 되는 세포를 사용하고, NK세포배양배지용 첨가조성물에 포함되는 스테로이드제의 농도를 약 2배 높여서 day3, day4, day8에 첨가하여 배양한 것을 제외하면 실시예5와 동일한 방법을 수행하여 얻어진 결과와, NK세포비율이 약 50% 정도 되는 세포를 사용한 것을 제외하면 비교예1과 동일한 방법을 수행하여 얻어진 결과를 비교하고 각각 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.
도 3a 및 도 3b는 본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물이 사용되면 NK세포 비율이 81.35%지만 사용되지 않으면 51.76%인 것을 보여주므로 처음부터 NK세포세포 비율이 높은 상태에서 배양을 시작하여도 본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물이 처리되면 배양과정에서 NK세포의 증식율을 더 높이는 것을 확인할 수 있다.
실험예 4
본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물의 효과를 확인하기 위해 실시예와 같이 별도의 NK세포배양용 첨가키트를 사용하지 않고 일반적으로 사용되는 NK세포 배양 방법을 사용하여 NK세포를 다음과 같이 배양하였다. 림프구(1 X 10^7)를 분리하여 NK면역세포 자극을 위한 IL-2, IL-12, IL-18 등의 Cytokine들을 이용하여 세포 자극 후 배양 2일째에 항CD3 항체를 자극하여 배양하였고 CD16, CD56 항체 등은 전혀 사용하지 않았으며, 배양 3일째에 NK세포배양배지용 조성물1을 처리하였다. 이후 배지는 IL-2가 첨가된 일반 배지를 사용하였으며 세포수 증가에 따라 배지를 첨가해 주며 세포를 배양하였다. 14일 동안 계속 배양한 후 그 결과를 표 4, 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.
하기 표 4, 도 4a 및 도 4b는 별도의 배지첨가키트를 사용하지 않고 사이토카인과 항 CD3항체만을 이용하여 NK세포배양시에도 본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물을 배양 3일째에 처리하게 되면 사용하지 않을 경우보다 14일 배양 후 NK세포가 2배 이상 잘 증식되었고 NK세포 비중이 31.1%로 더 클 뿐만 아니라, NKT세포도 26.2%로 잘 증식되는 것을 알 수 있다.
방법 세포수(X 10^7) 배양 후 FACS data
초기 14일 배양 후 NK cell(%) NKT cell(%) NK+NKT(%)
일반적인 방법 1.0 215 28.4 20.6 49.0
NK세포배양배지용 첨가조성물사용 1.0 510 31.1 26.2 57.3
실험예 5
본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물의 효과를 확인하기 위해 실시예와 같이 별도의 NK세포배양용 첨가키트를 사용하지 않고 일반적으로 사용되는 NK세포 배양 방법 특히 고정화된 항 CD3항체를 사용하여 다음과 같이 NK세포를 배양하였다. 항 CD3 항체를 T25 플라스크에 고정화 한 다음 분리된 림프구(0.8 X 10^7)를 약 1시간 반응시키고 이후 IL-2 및 CD16, CD56 항체를 사용하여 배양하였다. CD16, CD56 항체는 2일, 4일, 6째 자극을 하였고 배양 3일째에 NK세포배양배지용 조성물1을 처리하였다. 이후 배지는 IL-2가 첨가된 일반 배지를 사용하였으며 세포수 증가에 따라 배지를 첨가해 주며 세포를 배양하였다. 14일동안 계속 배양한 후 그 결과를 표 5, 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
하기 표 5, 도 5a 및 도 5b는 별도의 배지첨가키트를 사용하지 않고 항 CD3 항체를 T25 플라스크에 고정화하고, 사이토카인, 항 CD16 및 항 CD56항체를 이용하여 NK세포배양시에도 본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물을 배양 3일째에 처리하게 되면 사용하지 않을 경우보다 14일 배양 후 NK세포가 2배 이상 잘 증식되었고 NK세포 비중이 49.72%로 더 크게 증식된 것을 알 수 있다.
방법 세포수(X 10^7) 배양 후 FACS data
초기 14일 배양 후 NK cell(%) NKT cell(%) NK+NKT(%)
항CD3항체고정화 방법 0.8 195 38.15 13.5 51.65
NK세포배양배지용 첨가조성물사용 0.8 480 49.72 6.67
56.39
실시예 9
본 발명의 NK세포배양배지용 첨가조성물이 활력이 떨어진 세포의 재활성에 미치는 영향력을 실험하기 위해, 실시예5의 방법에 따라 Treg 세포를 억제하면서 배양한지 25일 되고 활성이 떨어진 늙은 세포를 사용하여 재활성화를 다음과 같이 시도하였다. 기존 배지를 제거하기 위해 원심분리하여 상층액을 제거하고 일반 배지(RPMI)에 넣어 약 2시간 배양 후 배지를 C1용액으로 교체하여 3일 배양하였다.
실험예 6
실시예 9에서 재활성하된 NK 세포의 활성도를 측정하고 그 결과를 표 6에 나타내었다.
하기 표 6에 나타난 바와 같이, Treg에 의해 활성이 억제되지 않고 증가하는 것이 관찰되었고 세포수 또한 급격하게 감소하는 것은 관찰되지 않았다. 단, 측정 오차로도 생각이 되지만 세포가 늙어 자연감소하는 정도의 약간의 세포수 감소는 관찰되었다. 이 방법은 매우 단시간 내(1일 ~ 3일)에 NK세포를 활성화할 수 있는 방법으로서 늙은 세포뿐만 아니라 말초혈액으로부터 바로 분리한 PBMC 중의 NK세포 활성화는 물론 동결 후 해동되어 활력이 떨어진 NK세포 재활성화에도 매우 효과적일 것으로 예측된다.
25일 배양한 늙은 면역세포 C1용액 처리하여 3일 배양 후
세포 NK세포(%) 역가 (10:1, K562) NK세포(%) 역가 (10:1, K562)
1 57.74 7.3 69.57 74.51
2 55.52 41.67 58.06 92.22
3 55.89 54.13 57.64 91.75
4 61.41 66.03 63.44 92.86
실시예 10
혈액 내에 IL-10의 농도가 높아 Treg 세포가 많이 활성화 되어있을 것으로 보여지는 사람으로부터 PBMC를 얻은 것을 제외하면 실시예5와 동일한 방법으로 NK세포를 배양한 후 day 12에 세포를 꺼내어 기존 배양액을 제거하고 C1용액을 이용하여 2일간 배양한 후 NK세포를 분리하고 남은 배양배지조성물을 얻었다.
실험예 7
실시예 10에서 얻어진 배양배지조성물의 성분을 확인하고 그 결과를 표 7에 나타내었다.
Cytokines IFN-γ (ng/mL) IL-8 (ng/mL) IL-10 (pg/mL) 비고
A 150.24 0.29 912.21 　 C1용액으로 활성화
B 3.75 0.32 290.57 C1용액으로 활성화 하지 않음　
표 7은 배양 12일에 C1용액으로 자극하여 2일 배양시 세포수가 잘 증가하며 IFN-γ와 IL-10이 많이 증가하는 것은 물론 IL-8은 매우 적은 양만이 만들어지는 것을 보여준다. 반면, C1용액으로 활성화하지 않고 그냥 분리하게 되면 전체적으로 사이토카인의 적게 증가하는 것을 알 수 있다. 이와 같이 Treg 세포가 발달한 사람의 면역세포일지라도 본 발명의 NK세포배양배지용 조성물로 처리한 후 배양 12일에 C1용액으로 자극시 세포수가 줄지 않고 증가하며 많은 양의 IFN-γ와 IL-10을 만드는 것을 확인할 수 있다. 한편, IL-8은 호중구를 불러모으고 염증과 관련이 많은 Cytokine 이고 IL-10은 마크로파지를 M2b 형으로 유도하여 염증을 제거하는 역할을 하게 하는 것으로 알려져 있어 이렇게 얻은 배양배지조성물은 피부 트러블 개선은 물론 염증에서 유발되는 피부질환치료 등에도 효과적이다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims (18)

  1. 삭제
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  7. 혈액에서 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)가 배양되는 배양배지에 NK세포자극용 물질을 처리하는 NK세포자극단계;
    상기 NK세포자극단계에서 NK세포가 자극된 후 상기 배양배지에 T세포자극용 물질을 처리하는 T세포자극단계; 및
    상기 T세포자극단계에 의해 T세포가 자극된 후 상기 NK세포자극용 물질이 남아 있는 상태에서 스테로이드제가 유효성분으로 포함된 NK세포배양배지용 첨가조성물을 상기 배양배지에 처리하는 첨가조성물처리단계;를 포함하는데,
    상기 NK세포자극용 물질은 IL-2, IL-12 및 IL-18을 포함하거나 상기 IL-2, IL-12 및 IL-18과 항CD16 항체 또는 항CD56 항체 중 하나 이상이 더 포함된 것이고,
    상기 T세포자극용 물질은 항CD3 항체를 포함하거나 상기 항CD3 항체와 항CD4 항체 또는 항CD28항체 중 하나 이상이 더 포함된 것이며,
    상기 스테로이드제는 글루코코르티코이드(glucocorticoids)이고,
    상기 첨가조성물처리단계에서 처리되는 첨가조성물에 포함된 스테로이드제는 조절 T세포(Treg)의 면역 억제 활성을 억제함으로써 NK세포가 증식되게 작용하는 것을 특징으로 하는 NK세포배양방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 T세포자극단계는 배양 2일째에 수행되고, 상기 첨가조성물처리단계는 배양 3일째에 수행되는 것을 특징으로 하는 NK세포배양방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 첨가조성물처리단계가 배양 5일 이후에 1회 이상 더 수행되는 것을 특징으로 하는 NK세포배양방법.
  12. 제 7 항에 있어서,
    상기 첨가조성물은 상기 스테로이드제를 0.2ug/mL 이상의 농도로 포함하는데, 상기 스테로이드제는 사이토카인1-1용액 또는 담체에 용해되고,
    상기 사이토카인1-1용액은 IL-12 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 B1용액에 용해시켜 만든 용액으로서, B1용액은 부유세포 배양 기본 배지용액에 IL-2를 1000 ~ 4000 IU/mL의 농도가 되도록 만든 용액인 것을 특징으로 하는 NK세포배양방법.
  13. 제 7 항, 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 첨가조성물처리단계 수행 후 11일 내지 16일 배양한 다음 NK세포를 포함하는 면역세포를 수확하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 NK세포배양방법.
  14. 삭제
  15. 제 7 항, 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 NK세포배양방법으로 20일 이상 배양되어 분리되거나 수확되어 동결 후 해동되어 활력이 떨어진 NK세포를 포함하는 면역세포를 준비하는 단계; 및
    상기 준비된 NK세포를 포함하는 면역세포를 사이토카인1-1용액에서 배양하는 단계;를 포함하는데,
    상기 사이토카인1-1용액은 IL-12 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 B1용액에 용해시켜 만든 용액으로서, B1용액은 부유세포 배양 기본 배지용액에 IL-2를 1000 ~ 4000 IU/mL의 농도가 되도록 만든 용액인 것을 특징으로 하는 NK세포 재활성화방법.
  16. 제 7 항, 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 NK세포배양방법으로 11일 동안 배양한 후 NK세포를 포함하는 면역세포를 분리하는 단계;
    상기 분리된 NK세포를 포함하는 면역세포를 사이토카인1-1용액에서 배양하는 단계; 및
    상기 NK세포를 포함하는 면역세포를 수확하고 남은 배지조성물을 얻는 단계;를 포함하는데,
    상기 사이토카인1-1용액은 IL-12 0.5∼5 ng/mL농도 및 IL-18 2∼50 ng/mL 농도로 포함되도록 상기 IL-12 및 IL-18을 B1용액에 용해시켜 만든 용액으로서, B1용액은 부유세포 배양 기본 배지용액에 IL-2를 1000 ~ 4000 IU/mL의 농도가 되도록 만든 용액인 것을 특징으로 하는 NK세포 배지조성물 제조방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
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