CN108251369B - 一种免疫细胞培养基、培养方法以及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免疫细胞培养基、培养方法以及用途，免疫细胞培养基包括基础细胞培养基、细胞因子和糖皮质激素；免疫细胞培养方法包括以下步骤，S1、采集待培养的免疫细胞并激活；S2、将激活的免疫细胞接种上述免疫细胞培养基中进行细胞培养；S3、收获免疫细胞。细胞培养刺激液包括基础细胞培养基和细胞因子；细胞因子包括白介素2、白介素15和/或白介素21。本发明提供的免疫细胞培养基和培养方法能够有效地增加培养的NK细胞中CD8+NK细胞的比例。

Description

一种免疫细胞培养基、培养方法以及用途
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种免疫细胞培养基、培养方法以及用途。
背景技术
自然杀伤性细胞(natural killer cell，NK)是机体免疫细胞中非常重要的先天性免疫细胞，是机体抵抗病毒入侵、清除癌变和老化细胞的重要效应细胞，被称作是机体抗病毒、抗肿瘤的第一道屏障。NK细胞发现于上世纪70年代，近40年来随着对NK细胞的研究的不断深入，确定了NK细胞为一群以细胞表面标志物CD56+CD16+CD3-的异质性细胞。研究表明，与T细胞、B细胞相比，NK细胞表面标志物的特异性是相对的。人NK细胞mIg-，部分NK细胞CD2、CD3和CD8阳性，表达IL-2受体β链(P75,CD122)，CD11b/CD18阳性。常用检测NK细胞的表面标志物有CD16、CD56、CD57、CD59、CD11b、CD94和LAK-1。NK细胞可以根据其细胞表面标志的不同分成许多细胞亚群，不同细胞亚群具有不同的生物学功能。
CD8分子是细胞表面表达的糖蛋白分子，是常用的细胞分类的表面标志物之一，完整的CD8分子由α和β两种分子组成，主要存在于T细胞表面，在流式细胞检测中表现为强阳性，是在体内杀伤肿瘤和病毒感染细胞方面非常重要的效应T细胞。这类细胞的免疫学表型为CD8+CD3+(CD8阳性的T细胞)。
NK细胞区别于T细胞的一个重要特征为NK细胞表面标志物CD3大多为阴性，而所有T细胞的表面标志物CD3均为阳性。NK细胞在健康人外周血淋巴细胞(PBMC)中所占比例为10％-15％左右，其中有一个细胞亚群在流式细胞检测中表现为CD8弱阳性，约占NK细胞的30％-40％左右，占外周血淋巴细胞(PBMC)的3％左右。Edward等人在1990年观察到这一细胞亚群在体外的肿瘤杀伤实验中表现出了较CD8阴性的NK细胞具有更强的杀伤活性。随后的研究相继发现这一细胞亚群不仅具有较强的肿瘤细胞杀伤活性，同时在慢性病毒感染的病人中如HIV感染者中，这一细胞亚群的数量与功能都明显下降，显示这一细胞亚群不仅在机体抗肿瘤方面，而且在抗病毒方面可能具有重要的作用。2005年Addison等人研究发现，CD8阳性的NK细胞通过其表面的CD8α分子之间的相互交联，可以有效的抵抗由于激活所造成的NK细胞凋亡，同时可以提高其对肿瘤细胞的杀伤活性。
鉴于NK细胞具有的肿瘤杀伤作用，多年来NK细胞一直是过继性免疫细胞治疗的重要的效应细胞之一。2012年以来NK细胞的体外培养与扩增一直是NK细胞免疫细胞治疗技术研究领域的重要课题，相继建立了NK细胞的体外扩增与培养的方法。但有关CD8阳性的NK细胞的体外培养与扩增的方法，目前尚未见报道，现有的体外扩增方法通常是对整体的NK细胞进行体外培养和扩增，并不能保证其中的CD8阳性的NK细胞亚群能够得到大量的扩增，如中国专利文献CN105754941A公开的一种外周血NK细胞的体外诱导扩增培养方法，通过应用细胞因子白介素-2、白介素-15、4-1BBL和SCGM培养基联合培养外周血单个核细胞，前期使用自体血清和白介素-2以及白介素-15、4-1BBL孵育固定在细胞培养板上诱导激活单个核细胞中的少量NK细胞快速增殖，后期采用含有自体血清的SCGM培养基以及白介素-2、白介素-15、4-1BBL培养细胞诱导NK细胞大量快速增殖。上述方案获得了一定数量和活力的NK细胞，能够对肿瘤细胞起到杀伤作用。然而上述方案仅能扩增NK细胞，并没有针对其中的CD8阳性的NK细胞亚群进行培养和扩增而设计相应的培养基和方法步骤，因此上述方案无法保证对NK细胞扩增的同时对其中的CD8阳性的NK细胞亚群进行扩增，即上述方法无法在体外扩增和培养出大量的CD8阳性的NK细胞。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是现有技术中无法在体外稳定扩增和培养出大量的CD8阳性的NK细胞，进而提供一种能够在体外稳定扩增培养出大量的CD8阳性的NK细胞的免疫细胞培养基、培养方法以及用途。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种免疫细胞培养基，包括基础细胞培养基、细胞因子和糖皮质激素。
优选的，所述糖皮质激素选自甲氢泼尼松琥珀酸钠、可的松、氢化可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松、地塞米松和倍他米松中的至少一种，优选的，所述糖皮质激素选自甲氢泼尼松琥珀酸钠。
优选的，所述免疫细胞培养基中所述糖皮质激素的含量为0.6-1.2μg/mL；优选的，所述糖皮质激素的浓度为0.8μg/mL。
优选的，所述细胞因子选自白介素2、白介素15和白介素21中的至少一种。
优选的，所述免疫细胞培养基中所述细胞因子的含量为50-4000U/mL；优选的，所述细胞因子含量为1000U/mL。
优选的，所述免疫细胞培养基中还包括维生素。
优选的，所述维生素选自维生素B3。
优选的，所述免疫细胞培养基中所述维生素的含量为2-6μg/mL；优选的，所述维生素的含量为4μg/mL。
本发明提供一种培养免疫细胞的方法，包括使用所述的免疫细胞培养基的步骤。
本发明提供一种培养免疫细胞的方法，包括如下步骤：
S1、采集待培养的免疫细胞并激活；
S2、将激活的所述免疫细胞接种至所述的免疫细胞培养基中进行细胞培养；
S3、收获所述免疫细胞。
优选的，在S1步骤中，使用细胞培养刺激液激活所述免疫细胞，所述细胞培养刺激液包括基础细胞培养基和细胞因子。
优选的，所述细胞培养刺激液中所述细胞因子包括白介素2、白介素15和/或白介素21。
优选的，所述细胞培养刺激液中所述细胞因子中包括白介素2、白介素15和白介素21，所述白介素2含量为50U/mL-4000U/mL，所述白介素15含量为5ng/mL-100ng/mL，所述白介素21含量为1ng/mL-50ng/mL；优选的，所述白介素2的浓度为500U/mL，所述白介素15浓度为20ng/mL，所述白介素21浓度为5ng/mL。
本发明提供一种利用所述的免疫细胞培养基或所述的培养免疫细胞的方法在培养免疫细胞中的用途。
优选的，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、DC细胞、LAK细胞或CIK细胞。
优选的，所述免疫细胞为CD8+CD56+CD3-的NK细胞。
本发明技术方案具有如下优点：
1.本发明提供的免疫细胞培养基，包括基础细胞培养基、细胞因子和糖皮质激素，通过细胞因子和糖皮质激素的协同作用下，有效的提高培养的NK细胞中CD8+NK细胞的比例，实现在体外扩增培养出大量的CD8阳性的NK细胞的目的。
2.本发明提供的免疫细胞培养基，糖皮质激素选自甲氢泼尼松琥珀酸钠、可的松、氢化可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松、地塞米松和倍他米松中的至少一种；细胞因子选自白介素2、白介素15和白介素21中的至少一种。细胞因子能够有效的诱导、刺激特定的NK细胞增殖和促进其分化成熟，本发明使用白介素2、白介素15和白介素21的组合可以有效的提高培养的NK细胞中CD8+NK细胞的比例；特别是添加的白介素21增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。同时，在临床上，糖皮质激素如地塞米松、可的松等是作为抗过敏药物使用，其基本功能是免疫抑制作用，但在低剂量使用时可以与白介素15协同作用，有助于NK细胞的体外增殖，同时也会降低白介素15引发的NK细胞的死亡。
3.本发明提供的免疫细胞培养基，添加了维生素B3，有助于提高NK细胞(CD56+CD3-)在扩增细胞中的比例。
4.本发明提供的培养免疫细胞的方法，包括如下步骤：S1、采集待培养的免疫细胞并激活；S2、将激活的免疫细胞接种至本发明提供的免疫细胞培养基中进行细胞培养；S3、收获免疫细胞；其中细胞培养刺激液包括基础细胞培养基和细胞因子，细胞培养刺激液中细胞因子包括白介素2、白介素15和/或白介素21。使用该方法培养的CD8+NK细胞(CD56+CD8+CD3-)在扩增培养后的比例可以达到38％，可以使CD8阳性的NK细胞随着NK细胞总数的增加而增加。
5.本发明提供的免疫细胞培养基及培养方法，使用不同的基础培养基对于CD8+NK细胞的扩增培养的比例没有影响，可以适配更多不同的基础培养基。
附图说明
图1为本发明实施例1中体外扩增后的CD8+NK细胞的流式分析结果：其中图A为SCCvs FSC，图中线段圈出的部分选取的活细胞进行分析，图B为在图A中选取的活细胞的基础上选取CD3+细胞(图中框内)；图C为CD56+细胞中有一部分细胞为CD8+(右上象限)，包括一部分CD3+的NKT细胞和NK细胞；图D显示的是CD8+NK细胞在NK细胞中所占比例为38％(左上象限)；
图2为本发明实施例2中8例健康人PBMC分别使用实施例1中的免疫细胞培养基和无糖皮质激素的免疫细胞培养基进行体外培养后的CD8+NK细胞的含量比较结果图；
图3为本发明实施例2中8例健康人PBMC和实施例3中3例脐血PBMC分别使用实施例1中的免疫细胞培养基及培养方法进行体外培养后的CD8+NK细胞的含量比例比较结果图。
图4为本发明实施例6中使用不同基础培养基体外扩增后的CD8+NK细胞的流式分析结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术。
实施例1
本实施例提供了一种免疫细胞培养基以及培养方法，从8例健康人PBMC中培养CD8+NK细胞：
1.CD8+NK细胞的培养刺激液以及培养基的配制：
细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素2(IL2)、重组人白介素15(IL15)和重组人白介素21(IL21)；其中重组人白介素2(IL2)浓度为500U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为20ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为5ng/mL。配制方法如下：取上述细胞因子并用无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)配制成相应浓度的CD8+NK细胞体外培养刺激液，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为500U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为20ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为5ng/mL的无血清培养基X-VIVO10。细胞因子充分溶解后，过滤除菌，分装待用。
免疫细胞培养基(试剂B)配方：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、重组人白介素2(IL2)和甲氢泼尼松琥珀酸钠；其中重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.8μg/ml。配制方法如下：取无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)和重组人白介素2(IL2)及甲氢泼尼松琥珀酸钠，配制成用于CD8+NK细胞生长的培养基，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.8μg/mL的无血清培养基X-VIVO10。
2.CD8+NK细胞的体外培养
S1、待培养的免疫细胞的采集，即从健康人外周血单核细胞的分离：
所有健康供血者均进行了知情告知后，从其前臂静脉采用常规方法取血10mL，使用肝素钠抗凝。所取静脉血可在室温下保存24小时以内，抗凝静脉血充分混匀后，以2000转/min(或800g/min)离心10min，无菌条件下取出上清中的血浆，沉淀中的红细胞、白细胞及血小板等血细胞重悬于20mL无钙镁离子的PBS中(或DPBS)，取50mL离心管一只，加入人淋巴细胞分离液12.5mL。然后将重悬的血细胞悬液20mL缓慢加到分离液上层，调整离心机的升降速，将升速调为3，降速调为0，离心，2000rpm，20min；离心后液体分为四层，自上而下，吸取第二层的白膜层至另一支50mL离心管中，并加入一定量的D-PBS进行稀释，至终体积约为45mL/管，然后离心洗涤细胞，离心，2000rpm，5min。然后弃上清，加入10mL的DPBS重悬细胞，混匀后取出一定量细胞进行计数。其余细胞进行离心，2000rpm，5min,得到人外周血单核细胞(PBMC)；
激活待培养的免疫细胞：取4mL试剂A，接种新鲜分离的人PBMC，接种细胞浓度为106个/mL，同时加入7.5％的自体血浆，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；48小时后，加入一倍体积的试剂A，继续培养48小时后，加入半量体积的试剂A和半量体积的无血清培养基X-VIVO10，继续培养24小时。
S2、将激活的所述免疫细胞接种所述的免疫细胞培养基(试剂B)中进行细胞培养，即在S1步骤中24小时培养后，将细胞培养基置换为等体积的试剂B继续培养并调整细胞密度为1×106个/mL；自此，细胞每隔3天加入与细胞培养容器内的同体积的新鲜试剂B，培养至12天收获细胞，并进行相应的检测。
3.体外培养的CD8+NK细胞的鉴定：
体外培养的CD8+NK细胞的鉴定，采用四色流式细胞术进行，使用的抗体为：PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白)标记的鼠抗人CD3、PE(藻红蛋白)标记的鼠抗人CD4、FITC(异硫氰酸荧光素)标记的鼠抗人CD8和APC(藻青蛋白)标记的鼠抗人CD56；具体染色方法如下：用染色缓冲液(含有0.5-1％FBS的PBS)洗收获的CD8+NK细胞1次；离心细胞，用50μL染色缓冲液重悬所述细胞到2个圆底的Ep管中，每种抗体各加2.5μL(0.5mg/ml)，同时设1个同型对照抗体，室温避光孵育30分钟；用1mL所述染色缓冲液洗1次去除未结合的抗体，300g离心5分钟，用适量PBS(如300μL)重悬细胞后上流式细胞仪(BD FACSCalibur)分析。
通过使用流式细胞分析软件对数据分析的结果如图1所示，CD8+NK细胞(CD56+CD8+CD3-)在扩增培养后的比例为38％。
实施例2
本实施例提供的免疫细胞培养基以及培养方法，从8例健康人PBMC中培养CD8+NK细胞。
1.CD8+NK细胞的培养刺激液以及培养基的配制：
细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素2(IL2)、重组人白介素15(IL15)和重组人白介素21(IL21)；其中重组人白介素2(IL2)浓度为500U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为20ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为5ng/mL。配制方法如下：取上述细胞因子并用无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)配制成相应浓度的CD8+NK细胞体外培养刺激液，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为500U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为20ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为5ng/mL的无血清培养基X-VIVO10VIVO 10。。细胞因子充分溶解后，过滤除菌，分装待用。
免疫细胞培养基(试剂B)配方：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、重组人白介素2(IL2)和甲氢泼尼松琥珀酸钠；其中重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.8ug/ml。配制方法如下：取无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)和重组人白介素2(IL2)及甲氢泼尼松琥珀酸钠，配制成用于CD8+NK细胞生长的培养基，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.8μg/mL的无血清培养基X-VIVO10。
试剂B对照培养基：取无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)和重组人白介素2(IL2)，配制成用于CD8+NK细胞生长的对照培养基，其中重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL。
2.CD8+NK细胞的体外培养
S1、待培养的免疫细胞的采集，即从健康人外周血单核细胞的分离：
所有健康供血者均进行了知情告知后，从其前臂静脉采用常规方法取血10mL，使用肝素钠抗凝。所取静脉血可在室温下保存24小时以内，抗凝静脉血充分混匀后，以2000转/min(或800g/min)离心10min，无菌条件下取出上清中的血浆，沉淀中的红细胞、白细胞及血小板等血细胞重悬于20mL无钙镁离子的PBS中(或DPBS)，取50mL离心管一只，加入人淋巴细胞分离液12.5mL。然后将重悬的血细胞悬液20mL缓慢加到分离液上层，调整离心机的升降速，将升速调为3，降速调为0，离心，2000rpm，20min；离心后液体分为四层，自上而下，吸取第二层的白膜层至另一支50mL离心管中，并加入一定量的D-PBS进行稀释，至终体积约为45mL/管，然后离心洗涤细胞，离心，2000rpm，5min。然后弃上清，加入10mL的DPBS重悬细胞，混匀后取出一定量细胞进行计数。其余细胞进行离心，2000rpm，5min,得到人外周血单核细胞(PBMC)；
激活待培养的免疫细胞：取4mL试剂A，接种新鲜分离的人PBMC，接种细胞浓度为106个/mL，同时加入7.5％的自体血浆，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；48小时后，加入一倍体积的试剂A，继续培养48小时后，加入半量体积的试剂A和半量体积的无血清培养基×-VIVO 10，继续培养24小时。
S2、将激活的所述免疫细胞接种所述的免疫细胞培养基(试剂B)中进行细胞培养，即在S1步骤中24小时培养后，将细胞离心后平均分成2份，分别将培养基置换为试剂B和试剂B培养基的对照培养基，继续培养并调整细胞密度为1×106个/mL；自此，两份细胞每隔3天分别加入与细胞培养容器内的同体积的新鲜试剂B或试剂B培养基的对照培养基，培养至12天收获细胞，并进行相应的检测。
3.体外培养的CD8+NK细胞的鉴定：
体外培养的CD8+NK细胞的鉴定，采用四色流式细胞术进行，使用的抗体为：PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白)标记的鼠抗人CD3、PE(藻红蛋白)标记的鼠抗人CD4、FITC(异硫氰酸荧光素)标记的鼠抗人CD8和APC(藻青蛋白)标记的鼠抗人CD56；具体染色方法如下：用染色缓冲液(含有0.5-1％FBS的PBS)洗收获的CD8+NK细胞1次；离心细胞，用50μL染色缓冲液重悬所述细胞到2个圆底的Ep管中，每种抗体各加2.5μL(0.5mg/ml)，同时设1个同型对照抗体，室温避光孵育30分钟；用1mL染色缓冲液洗1次去除未结合的抗体，300g离心5分钟，用适量PBS(如300μL)重悬细胞后上流式细胞仪分析。
结果如图2所示：CD8+NK细胞的比例介于15.1％-43.5％，平均值为27.4％，相较于对照培养基的培养结果(介于5.2％-10.3％，平均8.1％)具有明显差异(P<0.0001)。
实施例3
本实施例提供的免疫细胞培养基以及培养方法，从人脐带血单核细胞中培养CD8+NK细胞，具体步骤如下：
1.CD8+NK细胞的培养刺激液以及培养基的配制：
细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素2(IL2)、重组人白介素15(IL15)和重组人白介素21(IL21)；其中重组人白介素2(IL2)浓度为500U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为20ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为5ng/mL。配制方法如下：取上述细胞因子并用无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)配制成相应浓度的CD8+NK细胞体外培养刺激液，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为500U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为20ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为5ng/mL的无血清培养基X-VIVO10VIVO 10。细胞因子充分溶解后，过滤除菌，分装待用。
免疫细胞培养基(试剂B)配方：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、重组人白介素2(IL2)和甲氢泼尼松琥珀酸钠；其中重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.8μg/ml。配制方法如下：取无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)和重组人白介素2(IL2)及甲氢泼尼松琥珀酸钠，配制成用于CD8+NK细胞生长的培养基，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.8μg/mL的无血清培养基X-VIVO10VIVO10。
2.CD8+NK细胞的体外培养
S1、待培养的免疫细胞的采集，即从健康人脐带血单核细胞的分离：
3例脐带血供血者均进行了知情告知后，从脐静脉采用常规方法取血10mL，肝素钠抗凝。抗凝脐带血充分混匀后，以2000转/min(或800g/min)离心10min，无菌条件下取出上清中的血浆，沉淀中的红细胞、白细胞及血小板等血细胞重悬于20mL无钙镁离子的PBS中(或DPBS)，取50mL离心管一只，加入人淋巴细胞分离液12.5mL。然后将重悬的血细胞悬液20mL缓慢加到分离液上层，调整离心机的升降速，将升速调为3，降速调为0，离心，2000rpm，20min；离心后液体分为四层，自上而下，吸取第二层的白膜层至另一支50mL离心管中，并加入一定量的D-PBS进行稀释，至终体积约为45mL/管，然后离心洗涤细胞，离心，2000rpm，5min。然后弃上清，加入10mL的DPBS重悬细胞，混匀后取出一定量细胞进行计数。其余细胞进行离心，2000rpm，5min,得到人脐带血单核细胞(CBNC)；
激活待培养的免疫细胞：取4mL试剂A，接种新鲜分离的人脐带血单核细胞(CBNC)，接种细胞浓度为106个/mL，同时加入7.5％的自体血浆，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；48小时后，加入一倍体积的试剂A，继续培养48小时后，加入半量体积的试剂A和半量体积的无血清培养基X-VIVO 10，继续培养24小时。
S2、将激活的所述免疫细胞接种所述的免疫细胞培养基(试剂B)中进行细胞培养，即在S1步骤中24小时培养后，将细胞培养基置换为等体积的试剂B继续培养并调整细胞密度为1×106个/mL；自此，细胞每隔3天加入与细胞培养容器内的同体积的新鲜试剂B，培养至12天收获细胞，并进行相应的检测。
3.体外培养的CD8+NK细胞的鉴定：
体外培养的CD8+NK细胞的鉴定，采用四色流式细胞术进行，使用的抗体为：PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白)标记的鼠抗人CD3、PE(藻红蛋白)标记的鼠抗人CD4、FITC(异硫氰酸荧光素)标记的鼠抗人CD8和APC(藻青蛋白)标记的鼠抗人CD56；具体染色方法如下：用染色缓冲液(含有0.5-1％FBS的PBS)洗收获的CD8+NK细胞1次；离心细胞，用50μL染色缓冲液重悬所述细胞到2个圆底的Ep管中，每种抗体各加2.5μL(0.5mg/ml)，同时设1个同型对照抗体，室温避光孵育30分钟；用1mL染色缓冲液洗1次去除未结合的抗体，300g离心5分钟，用适量PBS(如300μL)重悬细胞后上流式细胞仪分析。
将上述分析结果与实施例2中的8例健康人PBMC使用实施例1中的免疫细胞培养基及培养方法进行体外培养后的CD8+NK细胞的含量进行比较，结果如图3所示：3例脐带血TNC中扩增出的NK细胞中CD8+NK细胞所占的平均比例为36.6％±1.618％，高于实施例2中8例健康人使用本发明所披露的方法进行的NK细胞扩增产物中CD8+NK细胞的平均比例27.4％±3.53％的结果，但两者之间无统计学差异(P＝0.1584)。
实施例4
本实施例提供一种免疫细胞培养基及其培养方法，具体步骤如下：
1.CD8+NK细胞的培养刺激液以及培养基的配制：
细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素2(IL2)、重组人白介素15(IL15)和重组人白介素21(IL21)；其中重组人白介素2(IL2)浓度为50U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为5ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为1ng/mL。配制方法如下：取上述细胞因子并用无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)配制成相应浓度的CD8+NK细胞体外培养刺激液，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为50U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为5ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为1ng/mL的无血清培养基X-VIVO10VIVO 10。。细胞因子充分溶解后，过滤除菌，分装待用。
免疫细胞培养基(试剂B)配方：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、维生素B3、重组人白介素2(IL2)和甲氢泼尼松琥珀酸钠；其中维生素B3的浓度为2μg/mL，重组人白介素2(IL2)浓度为50U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.6ug/ml。配制方法如下：取无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)和重组人白介素2(IL2)及甲氢泼尼松琥珀酸钠，配制成用于CD8+NK细胞生长的培养基，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为50U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.6μg/mL的无血清培养基X-VIVO 10。
2.CD8+NK细胞的体外培养
S1、待培养的免疫细胞的采集，即从健康人外周血单核细胞的分离：
所有健康供血者均进行了知情告知后，从其前臂静脉采用常规方法取血10mL，使用肝素钠抗凝。所取静脉血可在室温下保存24小时以内，抗凝静脉血充分混匀后，以2000转/min(或800g/min)离心10min，无菌条件下取出上清中的血浆，沉淀中的红细胞、白细胞及血小板等血细胞重悬于20mL无钙镁离子的PBS中(或DPBS)，取50mL离心管一只，加入人淋巴细胞分离液12.5mL。然后将重悬的血细胞悬液20mL缓慢加到分离液上层，调整离心机的升降速，将升速调为3，降速调为0，离心，2000rpm，20min；离心后液体分为四层，自上而下，吸取第二层的白膜层至另一支50mL离心管中，并加入一定量的D-PBS进行稀释，至终体积约为45mL/管，然后离心洗涤细胞，离心，2000rpm，5min。然后弃上清，加入10mL的DPBS重悬细胞，混匀后取出一定量细胞进行计数。其余细胞进行离心，2000rpm，5min,得到人外周血单核细胞(PBMC)；
激活待培养的免疫细胞：取4mL试剂A，接种新鲜分离的人PBMC，接种细胞浓度为106个/mL，同时加入7.5％的自体血浆，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；48小时后，加入一倍体积的试剂A，继续培养48小时后，加入半量体积的试剂A和半量体积的无血清培养基×-VIVO10，继续培养24小时。
S2、将激活的所述免疫细胞接种所述的免疫细胞培养基(试剂B)中进行细胞培养，即在S1步骤中24小时培养后，将细胞培养基置换为等体积的试剂B继续培养并调整细胞密度为1×106个/mL；自此，细胞每隔3天加入与细胞培养容器内的同体积的新鲜试剂B，培养至12天收获细胞，并进行相应的检测。
实施例5
本实施例提供一种免疫细胞培养基及其培养方法，具体步骤如下：
1.CD8+NK细胞的培养刺激液以及培养基的配制：
细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素2(IL2)、重组人白介素15(IL15)和重组人白介素21(IL21)；其中重组人白介素2(IL2)浓度为4000U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为100ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为50ng/mL。配制方法如下：取上述细胞因子并用无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)配制成相应浓度的CD8+NK细胞体外培养刺激液，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为4000U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为100ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为50ng/mL的无血清培养基X-VIVO 10。细胞因子充分溶解后，过滤除菌，分装待用。
免疫细胞培养基(试剂B)配方：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、维生素B3、重组人白介素2(IL2)和甲氢泼尼松琥珀酸钠；其中维生素B3的浓度为6μg/mL，重组人白介素2(IL2)浓度为4000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为1.2ug/ml。配制方法如下：取无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)和重组人白介素2(IL2)及甲氢泼尼松琥珀酸钠，配制成用于CD8+NK细胞生长的培养基，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为4000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为1.2μg/mL的无血清培养基X-VIVO 10VIVO 10。
2.CD8+NK细胞的体外培养
S1、待培养的免疫细胞的采集，即从健康人外周血单核细胞的分离：
所有健康供血者均进行了知情告知后，从其前臂静脉采用常规方法取血10mL，使用肝素钠抗凝。所取静脉血可在室温下保存24小时以内，抗凝静脉血充分混匀后，以2000转/min(或800g/min)离心10min，无菌条件下取出上清中的血浆，沉淀中的红细胞、白细胞及血小板等血细胞重悬于20mL无钙镁离子的PBS中(或DPBS)，取50mL离心管一只，加入人淋巴细胞分离液12.5mL。然后将重悬的血细胞悬液20mL缓慢加到分离液上层，调整离心机的升降速，将升速调为3，降速调为0，离心，2000rpm，20min；离心后液体分为四层，自上而下，吸取第二层的白膜层至另一支50mL离心管中，并加入一定量的D-PBS进行稀释，至终体积约为45ml/管，然后离心洗涤细胞，离心，2000rpm，5min。然后弃上清，加入10mL的DPBS重悬细胞，混匀后取出一定量细胞进行计数。其余细胞进行离心，2000rpm，5min,得到人外周血单核细胞(PBMC)；
激活待培养的免疫细胞：取4mL试剂A，接种新鲜分离的人PBMC，接种细胞浓度为106个/mL，同时加入7.5％的自体血浆，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；48小时后，加入一倍体积的试剂A，继续培养48小时后，加入半量体积的试剂A和半量体积的无血清培养基×-VIVO 10，继续培养24小时。
S2、将激活的所述免疫细胞接种所述的免疫细胞培养基(试剂B)中进行细胞培养，即在S1步骤中24小时培养后，将细胞培养基置换为等体积的试剂B继续培养并调整细胞密度为1×106个/mL；自此，细胞每隔3天加入与细胞培养容器内的同体积的新鲜试剂B，培养至12天收获细胞，并进行相应的检测。
实施例6
按照实施例1提供的免疫细胞培养基以及培养方法，从健康人外周血单核细胞中培养CD8+NK细胞，与实施例1的区别在于，基础培养基使用GT-551(宝日医)，具体步骤如下：
1.CD8+NK细胞的培养刺激液以及培养基的配制：
细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素2(IL2)、重组人白介素15(IL15)和重组人白介素21(IL21)；其中重组人白介素2(IL2)浓度为500U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为20ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为5ng/mL。配制方法如下：取上述细胞因子并用无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)配制成相应浓度的CD8+NK细胞体外培养刺激液，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为500U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为20ng/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为5ng/mL的无血清培养基X-VIVO10。细胞因子充分溶解后，过滤除菌，分装待用。
免疫细胞培养基(试剂B)配方：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、维生素B3、重组人白介素2(IL2)和甲氢泼尼松琥珀酸钠；其中维生素B3的浓度为4μg/mL，重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.8ug/ml。配制方法如下：取无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)和重组人白介素2(IL2)及甲氢泼尼松琥珀酸钠，配制成用于CD8+NK细胞生长的培养基，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.8μg/mL的无血清培养基X-VIVO 10。
试剂B-1配方：无血清培养基GT551、维生素B3、重组人白介素2(IL2)和甲氢泼尼松琥珀酸钠；其中维生素B3的浓度为4μg/mL，重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.8ug/ml。配制方法如下：取无血清培养基GT551和重组人白介素2(IL2)及甲氢泼尼松琥珀酸钠，配制成用于CD8+NK细胞生长的培养基，即得到含有重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.8μg/mL的无血清培养基GT551。
2.CD8+NK细胞的体外培养
S1、待培养的免疫细胞的采集，即从健康人外周血单核细胞的分离：
所有健康供血者均进行了知情告知后，从其前臂静脉采用常规方法取血10mL，使用肝素钠抗凝。所取静脉血可在室温下保存24小时以内，抗凝静脉血充分混匀后，以2000转/min(或800g/min)离心10min，无菌条件下取出上清中的血浆，沉淀中的红细胞、白细胞及血小板等血细胞重悬于20mL无钙镁离子的PBS中(或DPBS)，取50mL离心管一只，加入人淋巴细胞分离液12.5mL。然后将重悬的血细胞悬液20mL缓慢加到分离液上层，调整离心机的升降速，将升速调为3，降速调为0，离心，2000rpm，20min；离心后液体分为四层，自上而下，吸取第二层的白膜层至另一支50mL离心管中，并加入一定量的D-PBS进行稀释，至终体积约为45mL/管，然后离心洗涤细胞，离心，2000rpm，5min。然后弃上清，加入10mL的DPBS重悬细胞，混匀后取出一定量细胞进行计数。其余细胞进行离心，2000rpm，5min,得到人外周血单核细胞(PBMC)；
激活待培养的免疫细胞：取4mL试剂A，接种新鲜分离的人PBMC，接种细胞浓度为106个/mL，同时加入7.5％的自体血浆，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；48小时后，加入一倍体积的试剂A，继续培养48小时后，加入半量体积的试剂A和半量体积的无血清培养基×-VIVO 10，继续培养24小时。
S2、将激活的免疫细胞接种24小时后，将细胞平均分成2份，并将细胞培养基分别置换为试剂B、试剂B-1中进行细胞培养，即在S1步骤中24小时培养后，将细胞培养基置换为等体积的试剂B或试剂B-1继续培养并调整细胞密度为1×106个/mL；自此，细胞每隔3天加入与细胞培养容器内的同体积的新鲜试剂B或新鲜试剂B-1，培养至12天收获细胞，并进行相应的检测。
3.体外培养的CD8+NK细胞的鉴定：
体外培养的CD8+NK细胞的鉴定，采用四色流式细胞术进行，使用的抗体为：PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白)标记的鼠抗人CD3、PE(藻红蛋白)标记的鼠抗人CD4、FITC(异硫氰酸荧光素)标记的鼠抗人CD8和APC(藻青蛋白)标记的鼠抗人CD56；具体染色方法如下：用染色缓冲液(含有0.5-1％FBS的PBS)洗收获的CD8+NK细胞1次；离心细胞，用50μL染色缓冲液重悬所述细胞到2个圆底的Ep管中，每种抗体各加2.5μL(0.5mg/ml)，同时设1个同型对照抗体，室温避光孵育30分钟；用1mL染色缓冲液洗1次去除未结合的抗体，300g离心5分钟，用适量PBS(如300μL)重悬细胞后上流式细胞仪分析。
结果如图4所示：分别使用两种不同的基础培养基X-VIVO 10和GT551在相同细胞因子和激素添加的基础上，对同一标本进行测试，两种培养基在CD8+NK细胞的扩增培养的比例分别达到42％(A)和41％(B)，两者结果一致，表明不同基础培养基对于CD8+NK细胞的扩增培养的比例没有影响。
实施例7
本实施例提供了一种免疫细胞培养基，免疫细胞培养基(试剂B)的配方为：无血清培养基RPMI1640(Gibco)、维生素B3、重组人白介素2(IL2)和可的松。其中维生素B3的浓度为4μg/mL、重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，可的松浓度为0.8ug/ml。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例8
本实施例提供了一种免疫细胞培养基，免疫细胞培养基(试剂B)的配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、维生素B3、重组人白介素2(IL2)和地塞米松。其中维生素B3的浓度为2μg/mL，重组人白介素2(IL2)浓度为4000U/mL，地塞米松浓度为0.6ug/ml。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例9
本实施例提供了一种免疫细胞培养基，免疫细胞培养基(试剂B)的配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、重组人白介素15(IL15)和甲氢泼尼松琥珀酸钠。其中重组人白介素15(IL15)浓度为50U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为1.2ug/ml。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例10
本实施例提供了一种免疫细胞培养基，免疫细胞培养基(试剂B)的配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、维生素B3、重组人白介素15(IL15)、重组人白介素2(IL2)、甲氢泼尼松琥珀酸钠、强的松和去炎松。其中维生素B3的浓度为6μg/mL，重组人白介素15(IL15)浓度为1000/mL，重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，甲氢泼尼松琥珀酸钠浓度为0.7ug/ml，强的松浓度为0.1ug/ml和去炎松浓度为0.2ug/ml。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例11
本实施例提供了一种免疫细胞培养基，免疫细胞培养基(试剂B)的配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、维生素B3、重组人白介素15(IL15)、重组人白介素2(IL2)、重组人白介素21(IL21)和氢化可的松。其中维生素B3的浓度为4μg/mL，重组人白介素15(IL15)浓度为500U/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为700U/mL，重组人白介素2(IL2)浓度为50U/mL，氢化可的松浓度为0.8ug/ml。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例12
本实施例提供了一种免疫细胞培养基，免疫细胞培养基(试剂B)的配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)、维生素B3、重组人白介素15(IL15)、重组人白介素2(IL2)、重组人白介素21(IL21)和倍他米松。其中维生素B3的浓度为4μg/mL，重组人白介素15(IL15)浓度为20U/mL，重组人白介素21(IL21)浓度为30U/mL，重组人白介素2(IL2)浓度为1000U/mL，倍他米松浓度为0.8ug/ml。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例13
本实施例提供了一种细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基RPMI1640(Gibco)，重组人白介素2(IL2)、重组人白介素15(IL15)；其中重组人白介素2(IL2)浓度为500U/mL、重组人白介素15(IL15)浓度为20ng/mL。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例14
本实施例提供了一种细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素2(IL2)；其中重组人白介素2(IL2)浓度为50U/mL。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例15
本实施例提供了一种细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素2(IL2)；其中重组人白介素2(IL2)浓度为4000U/mL。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例16
本实施例提供了一种细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素21(IL21)；其中重组人白介素21(IL21)浓度为1ng/mL。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例17
本实施例提供了一种细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素21(IL21)；其中重组人白介素21(IL21)浓度为100ng/mL。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例18
本实施例提供了一种细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素15(IL15)；其中重组人白介素15(IL15)浓度为5ng/mL。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例19
本实施例提供了一种细胞培养刺激液(试剂A)配方为：无血清培养基X-VIVO 10(Lonza)，重组人白介素21(IL21)；其中重组人白介素21(IL21)浓度为100ng/mL。其配制方法与实施例1基本相同。
实施例20
本实施例提供了一种免疫细胞培养方法，包括如下步骤：
S1、取实施例1中的人PBMC利用实施例13的细胞培养刺激液进行激活，取4mL试剂A，接种新鲜分离的人PBMC，接种细胞浓度为0.5×106个/mL，同时加入6.5％的自体血浆，置于36.8℃，5％CO2培养箱中培养；32小时后，加入1.2倍体积的试剂A，继续培养32小时后，加入0.4倍体积的试剂A和0.6倍体积的无血清培养基X-VIVO10，继续培养20小时。
S2、将激活的所述免疫细胞接种实施例7的所述的免疫细胞培养基(试剂B)中进行细胞培养，即在S1步骤中20小时培养后，将细胞培养基置换为1.2倍体积的试剂B继续培养并调整细胞密度为1.5×106个/mL；自此，细胞每隔4天加入与细胞培养容器内的同体积的新鲜试剂B，培养至10天收获细胞，并进行相应的检测。
实施例21
本实施例提供了一种免疫细胞培养方法，包括如下步骤：
S1、取实施例1中的人PBMC利用实施例14的细胞培养刺激液进行激活，取4mL试剂A，接种新鲜分离的人PBMC，接种细胞浓度为1.5×106个/mL，同时加入8.5％的自体血浆，置于37.2℃，5％CO2培养箱中培养；52小时后，加入0.8倍体积的试剂A，继续培养52小时后，加入0.7倍体积的试剂A和0.4倍体积的无血清培养基X-VIVO10，继续培养26小时。
S2、将激活的所述免疫细胞接种实施例8的所述的免疫细胞培养基(试剂B)中进行细胞培养，即在S1步骤中26小时培养后，将细胞培养基置换为0.8倍体积的试剂B继续培养并调整细胞密度为0.5×106个/mL；自此，细胞每隔2天加入与细胞培养容器内的同体积的新鲜试剂B，培养至14天收获细胞，并进行相应的检测。
实施例22
本实施例提供了一种免疫细胞培养方法，包括如下步骤：
S1、取实施例3中的脐血PBMC利用实施例15的细胞培养刺激液进行激活，取4mL试剂A，接种新鲜分离的人PBMC，接种细胞浓度为106个/mL，同时加入7.5％的自体血浆，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；48小时后，加入一倍体积的试剂A，继续培养48小时后，加入半量体积的试剂A和半量体积的无血清培养基X-VIVO 10，继续培养24小时。
S2、将激活的所述免疫细胞接种实施例10的所述的免疫细胞培养基(试剂B)中进行细胞培养，即在S1步骤中24小时培养后，将细胞培养基置换为等体积的试剂B继续培养并调整细胞密度为1×106个/mL；自此，细胞每隔3天加入与细胞培养容器内的同体积的新鲜试剂B，培养至12天收获细胞，并进行相应的检测。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞的方法，其特征在于，
包括如下步骤：
S1、采集待培养的免疫细胞并激活；使用细胞培养刺激液激活所述免疫细胞，所述细胞培养刺激液包括基础细胞培养基和细胞因子；所述细胞因子中包括白介素2、白介素15和白介素21；所述待培养的免疫细胞为外周血或脐带血单个核细胞；
S2、将激活的所述免疫细胞接种至免疫细胞培养基中进行细胞培养；所述免疫细胞培养基包括基础细胞培养基、细胞因子和糖皮质激素;所述细胞因子为白介素2；所述免疫细胞培养基中还包括维生素B3；所述维生素B3的含量为2-6μg/mL；
S3、收获所述CD8+CD56+CD3-的NK细胞；
所述免疫细胞培养基中所述糖皮质激素的含量为0.6-1.2μg/mL。
2.根据权利要求1所述培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞的方法，其特征在于，所述糖皮质激素选自甲氢泼尼松琥珀酸钠、可的松、氢化可的松、强的松、强的松龙、甲基强的松龙、去炎松、地塞米松和倍他米松中的至少一种。
3.根据权利要求1所述培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞的方法，其特征在于，所述糖皮质激素为甲氢泼尼松琥珀酸钠。
4.根据权利要求1或2所述培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞的方法，其特征在于，所述糖皮质激素的浓度为0.8μg/mL。
5.根据权利要求1或2所述的培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞的方法，其特征在于，所述免疫细胞培养基中所述细胞因子的含量为50-4000U/mL。
6.根据权利要求5所述的培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞的方法，其特征在于，所述细胞因子含量为1000U/mL。
7.根据权利要求1或2所述培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞的方法，其特征在于，所述维生素的含量为4μg/mL。
8.根据权利要求1或2所述培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞的方法，其特征在于，细胞培养刺激液中所述白介素2含量为50U/mL-4000U/mL，所述白介素15含量为5ng/mL-100ng/mL，所述白介素21含量为1ng/mL-50ng/mL。
9.根据权利要8所述培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞的方法，其特征在于，所述白介素2的浓度为500U/mL，所述白介素15浓度为20ng/mL，所述白介素21浓度为5ng/mL。
10.权利要求1-9任一项所述培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞的方法在培养CD8+CD56+CD3-的NK细胞中的用途。
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