CN110438077B - 一种NK与γδT细胞的同时培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种NK与γδT细胞的同时培养方法，步骤如下：S1、制作通用型aAPC；S2、耗竭PBMC中的单核细胞；S3、NK与γδT细胞的混合培养。本发明采用上述一种NK与γδT细胞的同时培养方法，可在同一培养体系内按比例扩增NK和γδT两种细胞，操作简单。

Description

一种NK与γδT细胞的同时培养方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种NK与γδT细胞的同时培养方法。

背景技术

近几十年癌症发病率呈直线上升趋势，癌症发病率升高的最主要原因为人口老龄化。现今我国老龄人口所占比例为13.6％，20-30年后可能达到16％。根据(2012中国肿瘤登记年报》，我国癌症发病率为285.91/10万，城市和农村发病率分别为303.91/10万和249.98/10万。据估计，至2049年，我国癌症发病率可能达到400/10万的水平。

尽管现在手术、化疗、放疗等治疗措施在不断发展，但晚期恶性肿瘤患者的预后仍然很差，5年生存率不到15％。

随着肿瘤生物学、分子生物学和免疫学的发展，免疫治疗已成为继传统肿瘤治疗方法(手术、化疗、放疗)后的第四种肿瘤治疗模式。大量研究表明，过继性细胞免疫治疗对晚期恶性肿瘤患者具有其他治疗方式无法比拟的优越性，是有效的治疗手段之一，具有广阔的临床应用前景。

传统的肿瘤治疗手段靶向性差，副作用大，容易产生比较强的耐药现象，同时还有转移复发的危险，难以根除肿瘤细胞。过继性细胞免疫治疗将体外培养、活化、基因修饰的免疫细胞回输给患者，其目标在于清除肿瘤细胞和阻止肿瘤复发，提高病人的生存率和生活质量。它对于对细胞免疫功能低下的患者，如大剂量化疗、放疗后、骨髓移植后、病毒感染损伤免疫细胞数量及功能的患者极为合适。

随着过继性细胞免疫治疗的不断发展，这一领域也经历了几次重大突破。研究较多的免疫细胞种类有肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocytes，TIL)、LAK、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)、供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion，DLI)、NK-92、EBV特异性CTL细胞系、T细胞受体(T cellreceptor，TCR)或CAR基因修饰的T细胞。

NK细胞是人体免疫系统中的核心细胞，它的抗癌活性最强，是人体第一道屏障、抗癌第一道防线。NK细胞主要通过以下四种途径杀伤病毒感染或者异变的靶细胞：通过释放颗粒酶、穿孔素直接杀伤靶细胞；通过死亡受体配体(如TRAIL或Fasl)介导肿瘤细胞凋亡；通过抗体依赖的细胞因子介导的细胞毒作用(ADCC)杀伤靶细胞；细胞因子介导的杀伤作用。另外，NK细胞不会杀伤正常细胞，因为正常细胞表面的MHC-I类分子与NK细胞表面的抑制性受体相结合可以避免NK细胞的攻击。

γδT细胞不同于通常的αβT细胞，因为它们的TCR由不同的基因片段编码γδT细胞δT细胞在胸腺内发育，主要通过δ亚型来分类。Vδ1+细胞迁移到身体组织，尤其是肠黏膜细胞、阴道和皮肤。V32细胞亚型存在于血液和淋巴结中，其他亚型很少，主要的循环细胞是Vγ2、Vδ2细胞，占血液T细胞的1％～10％，在淋巴结中更少。就像NK和NK-T细胞，这类细胞群具有效应细胞的功能，包括细胞毒性和产生细胞因子。γδ细胞通过TCR与蛋白及其他类型的有机分子(如磷酸异戊二烯基)等抗原结合，抗原识别不依赖MHC分子不需要抗原提呈细胞。在人体内，上皮细胞γδT细胞的Vδ1+亚群受到非经典的MHC-I类分子CD1c的限制性，后者可以呈递微生物的糖脂和脂肽。Vγ2、Vδ2亚型(在替代的命名法中也称为Vγ9、Vδ2)也能识别热休克蛋白60(hsp60)分子，并且能出现在抵抗一些病原体的第一线，尤其是分枝结核杆菌和疟疾病原体。

越来越多的研究表明，NK和γδT在体内的单独杀瘤效果有限，可能是跟人体复杂的免疫环境，及肿瘤的免疫抑制能力相关。人体内有多种免疫细胞，应对不同的免疫问题，肿瘤更不是一种细胞免疫能解决的。随着研究的深入，科学家发现NK在体内杀瘤是依赖于γδT的调节作用，同时NK分泌多种因子能上调γδT中CD56分子的表达，从而增强其杀瘤能力和扩增效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种NK与γδT细胞的同时培养方法，可在同一培养体系内按比例扩增NK和γδT两种细胞，操作简单。

为实现上述目的，本发明提供了一种NK与γδT细胞的同时培养方法，步骤如下：

S1、制作通用型aAPC；

S2、耗竭PBMC中的单核细胞；

S3、NK与γδT细胞的混合培养。

优选的，制作通用型aAPC步骤如下：

(1)取实验室构建好的诱导多能干细胞(ips)；

(2)将ips按1∶10的比例接种到脐带间充质干细胞中，添加DC诱导培养基培养，每隔3天换液一次；

(3)连续培养至第14天，去除未贴壁的细胞，用PBS洗3遍；

(4)添加RPMI-1640、200ng/ml唑来膦酸、10％FBS培养液，再培养一周后当所有细胞自动悬浮后，收获aAPC。

优选的，DC诱导培养基为RPMI-1640、10ng/ml GM-CSF、20ng/ml IL-4、5ng/mlIGF-1、1ug/ml SCF、5ug/ml Y27632和10％FBS。

优选的，耗竭PBMC中的单核细胞：

(1)取患者外周血50-100ml，用淋巴细胞分离液分离PBMC；

(2)将PBMC按1*10⁷的细胞量接种到培养瓶中，RPMI-1640，37℃，5％CO₂，培养过夜；

(3)吸取为贴壁的细胞，用PBS洗3遍。

优选的，NK/γδT细胞培养：

(1)在获得的无单核细胞的PBMC中加入aAPC，比例为1∶1；

(2)在AlyS203、10％自体血清、1000ng/ml IL-2的培养基中，37℃，5％CO₂，培养；

(3)每隔3天补液，14天后收获细胞。

因此，本发明采用上述一种NK与γδT细胞的同时培养方法，细胞之间具有协同作用，NK与γδT同时培养的扩增效率是单个细胞培养的1倍以上，其切杀瘤能力比单个细胞强10倍以上。DC-like细胞能同时激活NK及γδT细胞，NK与γδT在体外联合使用的杀伤能力是其单独的10倍以上，发挥1+1＞2的效果。

本发明的一种NK与γδT细胞的同时培养方法的试验原理如下：

1、NK和γδT细胞均能被负载了唑来膦酸的DC细胞激活，同时扩增；

2、PBMC中自身含有的单核细胞会影响传统细胞培养方案中NK及yδT单个细胞的纯度，使得每个病人培养的细胞的个体化差异很大，有些纯度高有些纯度低，所以去除了PBMC本身的单核细胞，利用人工构造的aAPC更能获得稳定的效果；

3、NK与γδT之间有相互作用，NK体内杀伤依赖于γδT细胞，在体外培养中，NK能释放多种因子从而使得γδT能被更好的激活且扩增速度增加了，另外被激活的γδT又能反过来刺激NK细胞，导致NK细胞的增殖速率也高了，最终收获的细胞要比单个细胞多得多。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1是通用型aAPC制作中iPS诱导成DC情况及iPS-DC负载唑来膦酸效率的流式图；

图2是分离的PBMC中含有γδT细胞的流式图；

图3是耗竭PBMC中的单核细胞培养15天时γδT细胞含量的流式图；

图4是NK/γδT细胞培养中A组试验组NK、γδT表型的流式图；

图5是NK/γδT细胞培养中B组试验组NK、γδT表型的流式图；

图6是NK/γδT细胞培养中C组试验组NK、γδT表型的流式图；

图7是不同方法培养NK、γδT和NK/γδT的细胞增殖情况曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施方式做进一步的说明。

实施例一

通用型aAPC制作：

1、取已构建好的人源化ips(诱导多能干细胞)；

2、将ips按1∶10的比例接种到灭活的脐带间充质干细胞上层；

3、添加DC诱导培养基，每隔3天换液一次；

DC诱导培养基为RPMI-1640、10ng/ml GM-CSF、20ng/ml IL-4、5ng/ml IGF-1、1ug/ml SCF、5ug/ml Y27632、10％FBS。

4、连续培养至第14天，去除未贴壁的细胞，用PBS洗3遍；

5、将贴壁的细胞分为A、B两组，A组添加RPMI-1640、10％FBS，B组添加RPMI-1640、200ng/ml唑来膦酸、10％FBS；

6、再培养一周，当所有细胞自动悬浮后收获aAPC；

7、用FACs分析A、B两组中iPS诱导成DC的情况及iPS-DC负载唑来膦酸的效率；如图1所示，A、B两组是iPS经过诱导后，A组中有10％的细胞被诱导成了DC细胞；B组中的iPS-DC几乎能百分百负载唑来膦酸，说明本发明可以成功在体外利用iPS构建出了稳定负载唑来膦酸的aAPC。

实施例二

PBMC中单核细胞对γδT细胞的影响

1、用肝素钠抗凝管抽取20ml外周血待用；

2、于超净台内用生理盐水1∶1稀释外周血，混匀放于50ml离心管；

3、于超净台内放2个无菌50ml离心管，向管内分别加入17ml淋巴分离液(1∶1.25)；

4、用移液器吸取稀释后的外周血，并缓缓注入淋巴分离液上层；

注意：流速要缓慢而均匀，避免冲破分离液液面。

5、2200rpm，离心20-30分钟；

6、吸取中间白膜层，用生理盐水(10倍体积)洗三遍；

7、最后一遍离心后，倒掉上层废液，用H3培养基重悬计数，将细胞调整为2～3*10⁶个/ml；一般20ml血可以分离1.5～2*10⁷个PBMC；

8、取20万PBMC做流式细胞分析，CD3与TCRvγ9分析，如图2可见，刚分离的PBMC中含有γδT细胞约为2.7％；

9、将处理好的PBMC分成2组：A组耗竭单核细胞：按1*10⁷的细胞量接种到培养瓶中，RPMI-1640，37℃，5％CO₂，培养过夜，吸取为贴壁的细胞，用PBS洗3遍，添加：AlyS203、10％自体血清、1000ng/ml IL-2、200ng/ml唑来膦酸；B组不用耗竭单核细胞，直接按1*10⁷的细胞量接种到培养瓶中，添加AlyS203、10％自体血清、1000ng/ml IL-2、200ng/ml唑来膦酸。

10、每2-3天补加培养基。

11、第15天用FACs分析两组细胞中γδT细胞的含量：

如图3所示，A组没有耗竭单核细胞，于是能培养出30％的γδT细胞，而B组耗竭了单核细胞，却无法培养出γδT细胞。可见单核细胞在γδT的培养中起到很大的左右，每个患者体内单核细胞的数量，种类和能力都不一样，于是在培养患者的γδT的过程中会有很大的个体差异，有些能培养出纯度很高的γδT细胞，也有些却培养不出γδT细胞。

本发明耗竭患者PBMC中自体的单核细胞，改用通用型的aAPC来代替，从而希望能得到在不同的个体中，获得稳定的培养结果。

实施例三

NK/γδT细胞培养：

1、用肝素钠抗凝管抽取20ml外周血待用；

2、于超净台内用生理盐水1∶1稀释外周血，混匀放于50ml离心管；

3、于超净台内放2个无菌50ml离心管，向管内分别加入17ml淋巴分离液(1∶1.25)；

4、用移液器吸取稀释后的外周血，并缓缓注入淋巴分离液上层；

注意：流速要缓慢而均匀，避免冲破分离液液面。

5、2200rpm，离心20-30分钟；

6、按实例二的方法耗竭单核细胞；

7、将无单个细胞的PBMC分为3组，

A组按2∶1的比例加入制作的aAPC，AlyS203、10％自体血清、1000ng/ml IL-2，37℃，5％CO₂，培养；

B组按1∶1的比例加入制作的aAPC，AlyS203、10％自体血清、1000ng/ml IL-2，37℃，5％CO₂，培养；

C组按1∶2的比例加入制作的aAPC，AlyS203，10％自体血清，1000ng/ml IL-2，37℃，5％CO₂，培养；

8、每隔3天补液，14天后收获细胞，用FACs分析其中NK、γδT的表型和含量：

如图4所示，A组左图为NK细胞比例为43.6％，右图为γδT细胞，比例为38.6％；

如图5所示，B组左图为NK细胞比例为39.8％，右图为γδT细胞，比例为46.4％；

如图6所示，C组左图为NK细胞比例为21％，右图为γδT细胞比例为48％；

可见，随着aAPC的比例升高其中γδT细胞也逐渐升高，NK细胞含量则相对降低，当1∶1(B组)时，NK与γδT的含量约为85％，为最优选择；

增值能力检测试验

1、取捐献者外周血30ml，平均分成3组，A组为传统方法培养NK，B组未传统方法培养γδT，C组为传统方法培养NK/γδT；

2、连续培养14天后，分别收获细胞A组为30亿，B组为20亿，C组为100亿，绘制增值曲线，如图7，发现所扩增的细胞数量远优于传统方法扩增单个细胞的扩增数量。

因此，本发明采用上述一种NK与γδT细胞的同时培养方法，可在同一培养体系内按比例扩增NK和γδT两种细胞，操作简单。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种NK与γδT细胞的同时培养方法，其特征在于，步骤如下：

S1、制作通用型aAPC；

S2、耗竭PBMC中的单核细胞；

S3、NK与γδT细胞的混合培养；

NK/γδT细胞培养：

(1)在获得的无单核细胞的PBMC中加入aAPC，比例为1∶1；

(2)在AlyS203、10％自体血清、1000ng/mlIL-2的培养基中，37℃，5％CO₂，培养；

(3)每隔3天补液，14天后收获细胞。

2.根据权利要求1所述的一种NK与γδT细胞的同时培养方法，其特征在于，制作通用型aAPC步骤如下：

(1)取实验室构建好的诱导多能干细胞(ips)；

(2)将ips按1∶10的比例接种到脐带间充质干细胞中，添加DC诱导培养基培养，每隔3天换液一次；

(3)连续培养至第14天，去除未贴壁的细胞，用PBS洗3遍；

(4)添加RPMI-1640、200ng/ml唑来膦酸、10％FBS培养液，再培养一周后当所有细胞自动悬浮后，收获aAPC。

3.根据权利要求2所述的一种NK与γδT细胞的同时培养方法，其特征在于：DC诱导培养基为RPMI-1640、10ng/mlGM-CSF、20ng/mlIL-4、5ng/mlIGF-1、1ug/mlSCF、5ug/mlY27632和10％FBS。

4.根据权利要求1所述的一种NK与γδT细胞的同时培养方法，其特征在于，耗竭PBMC中的单核细胞：

(1)取患者外周血50-100ml，用淋巴细胞分离液分离PBMC；

(2)将PBMC按1*10⁷的细胞量接种到培养瓶中，RPMI-1640，37℃，5％CO₂，培养过夜；

(3)吸取为贴壁的细胞，用PBS洗3遍。

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