CN114921411A - 一种nk细胞的培育方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：制作培养液，在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行包被处理；准备单核细胞，取单核细胞进行接种处理；制作培养基，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、IL‑15、IL‑18、IL‑2和581培养基；培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度。一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。本发明构思新颖设计合理，且设计合理，通过本方法能培养出优质的NK细胞，并产生用于吞噬肿瘤细胞的效果，使用效果良好。

Description

一种NK细胞的培育方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种NK细胞的培育方法及应用。
背景技术
自然杀伤细胞(NK细胞)是机体的一种重要免疫细胞，主要分布于外周血中，占PBMC 5～ 10％。
脐带血中NK细胞含量约为7％左右。
淋巴结和骨髓中也有NK，但水平较外周血低。
自然杀伤细胞对靶细胞的识别无MHC限制性,可直接杀伤癌细胞(无需预先致敏),也 可分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能。
自然杀伤细胞是机体天然免疫的主要承担者,也是获得性细胞免疫的核心调节细胞, 在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。
有研究证明自然杀伤细胞其实不仅是天然免疫系统中的重要作用成分，它同样具有获得 性免疫细胞的一些特征。
在免疫系统的反应中，NK细胞反应的速度比T细胞和B细胞要快，其作用机制主要是识 别靶细胞，通过释放穿孔素、颗粒酶和分泌多种细胞因子，迅速溶解某些癌细胞，发挥调节 免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。
肿瘤是影响人类健康的重大疾病，但由于其特点，一直找不到一种更加深入治疗方法。
由于医疗基数的发展，癌症病患的医治情况均得到了很好的进步，但依然是属于难以彻 底治疗的疾病。
肿瘤免疫治疗方法是被国内外医疗届公认的有效的第四大肿瘤治疗法。
其中，自体免疫细胞治疗技术，比如，NK细胞免疫治疗正成为一种可靠的抗癌疗法，适 用于多种恶性肿瘤的临床治疗，且副作用小，不损伤正常组织。
随着肿瘤免疫学的不断进展，肿瘤免疫治疗已经成为继手术和放、化疗之后第四种肿瘤 治疗的手段，并且有望成为最终攻克肿瘤的方向。
自然杀伤细胞(NK细胞，CD3-CD56+)作为机体固有免疫的重要成员，是抗肿瘤免疫的先 行者，在肿瘤免疫方面发挥着至关重要的作用。
多项研究表明，NK细胞发挥抗肿瘤细胞毒性作用的这一过程依赖于NK细胞表面某些功 能受体，如NKG2和自然杀伤细胞抑制性受体家族等。此外，NK细胞还会产生一系列细胞因 子和趋化因子来调节免疫反应。通过释放CCL5、XCL1和XCL2，NK细胞能促进树突状细胞向 实体瘤聚集，促进CD8+T细胞抗肿瘤免疫作用，延长病人的生存期。NK细胞还可以通过其他 一些机制杀伤肿瘤细胞。
如何提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用NK细胞进行细胞免疫治疗的关键。
基于NK细胞在免疫系统中的作用，因此需要提供一种在体外实现NK细胞的培育方法。
发明内容
鉴于上述NK细胞的特点，本发明的目的在于提供一种NK细胞的培育方法，以培养品质 良好的NK细胞。
本发明通过下述技术方案实现：
一种NK细胞的培育方法，包括如下步骤：
制作培养液，在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行包被处理；
准备单核细胞，取单核细胞进行接种处理；
制作培养基，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、谷氨酰胺、非必需氨基酸、碱性成 纤维细胞生长因子、IL-6、表皮生长因子、胰岛素、Y27632、N2添加剂、B27添加剂、Primocin、 青霉素、链霉素、胎牛血清、IL-15、IL-18、IL-2和581培养基；
培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度。
根据权利要求1所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，在所述步骤培养，将培养器皿 放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度之后，还包括如下步骤：
一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
在一些实施方式中，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体 灭活血浆之后，还包括如下步骤：
二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
在一些实施方式中，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭 活血浆，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化 碳浓度之后第五天进行。
在一些实施方式中，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭 活血浆步骤中，激活培养基中含有IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。
在一些实施方式中，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭 活血浆，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后第 五天进行。
在一些实施方式中，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭 活血浆步骤中，激活培养基中含有IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。
在一些实施方式中，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷 氨酸、脯氨酸和丝氨酸。
一种NK细胞的应用，采用以上任意一项所述培养方法培养出的NK细胞，且该NK细胞为 CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞为ROBO1CAR-NK细胞，且用于治疗肿瘤。
在一些实施方式中，所述肿瘤的肿瘤细胞为胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、 肾细胞癌、头颈部及食管鳞状细胞癌或非小细胞肺癌。
一种NK细胞的应用，将NK细胞通过静脉回输入人体以用于治疗HPV。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明构思新颖设计合理，且设计合理，通过本方法能培养出优质的NK细胞，并产生用 于吞噬肿瘤细胞的效果，使用效果良好。本发明中用NK细胞对HPV细胞进行治疗，效果良好。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一 步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的 限定。
实施例一
一种NK细胞的培育方法，包括制作培养液、准备单核细胞、制作培养基和培养四个步骤。
其中，在制作培养液过程中，需要在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行 包被处理。
其中CD3的重量为5ug，胸腺肽的重量为15ug，PBS溶液的体积为5ml。
还向培养器皿中加入2ml浓度为3μg/μl的Ⅰ型胶原酶。
在准备单核细胞过程中，取单核细胞进行接种处理。
所取的单核细胞数量为1×106-3×106个/ml。
在制作培养基过程中，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、谷氨酰胺、非必需氨基酸、 碱性成纤维细胞生长因子、IL-6、表皮生长因子、胰岛素、Y27632、N2添加剂、B27添加剂、Primocin、青霉素、链霉素、胎牛血清、IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。其中IL-15的10ng/m、IL-18浓度的10ng/ml、IL-2的浓度为500U/ml。再加入20ng/ml浓度的CD16。
在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳 浓度。
培养器皿的环境温度为37℃，且环境气氛为5％CO2。
当细胞增殖至50％融合后，更换为含有质量百分比浓度为20％FBS的α-MEM培养液。
在在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化 碳浓度步骤之后，还包括一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为30ml，,自体灭活血浆的浓度为10v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度10ng/ml的IL-15、浓度10ng/ml的IL-18、浓度500U/ml 的IL-2及581培养基。
在一次补充培养基步骤之后，还包括二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和 自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为20ml，,自体灭活血浆的浓度为20v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度5ng/ml的IL-15、浓度10ng/ml的IL-18、浓度30U/ml 的IL-2及581培养基。
在具体实施时，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓 度之后第五天进行。
在具体实施时，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后第五天 进行。
在具体实施时，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、 脯氨酸和丝氨酸。
实施例二
一种NK细胞的培育方法，包括制作培养液、准备单核细胞、制作培养基和培养四个步骤。
其中，在制作培养液过程中，需要在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行 包被处理。
其中CD3的重量为15ug，胸腺肽的重量为55ug，PBS溶液的体积为30ml。
还向培养器皿中加入2ml浓度为3μg/μl的Ⅰ型胶原酶。
在准备单核细胞过程中，取单核细胞进行接种处理。
所取的单核细胞数量为3×106个/ml。
在制作培养基过程中，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、谷氨酰胺、非必需氨基酸、 碱性成纤维细胞生长因子、IL-6、表皮生长因子、胰岛素、Y27632、N2添加剂、B27添加剂、Primocin、青霉素、链霉素、胎牛血清、IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。其中IL-15的50ng/m、IL-18浓度的50ng/ml、IL-2的浓度为2000U/ml。再加入100ng/ml浓度的CD16。
在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳 浓度。
培养器皿的环境温度为37℃，且环境气氛为5％CO2。
当细胞增殖至60％融合后，更换为含有质量百分比浓度为20％FBS的α-MEM培养液。
在在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化 碳浓度步骤之后，还包括一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为70ml，,自体灭活血浆的浓度为20v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度50ng/ml的IL-15、浓度50ng/ml的IL-18、浓度2000U/ml的IL-2及581培养基。
在一次补充培养基步骤之后，还包括二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和 自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为50ml，,自体灭活血浆的浓度为30v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度40ng/ml的IL-15、浓度30ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基。
在具体实施时，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓 度之后第五天进行。
在具体实施时，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后第五天 进行。
在具体实施时，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、 脯氨酸和丝氨酸。
实施例三
一种NK细胞的培育方法，包括制作培养液、准备单核细胞、制作培养基和培养四个步骤。
其中，在制作培养液过程中，需要在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行 包被处理。
其中CD3的重量为10ug，胸腺肽的重量为35ug，PBS溶液的体积为20ml。
还向培养器皿中加入3ml浓度为3μg/μl的Ⅰ型胶原酶。
在准备单核细胞过程中，取单核细胞进行接种处理。
所取的单核细胞数量为2×106个/ml。
在制作培养基过程中，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、谷氨酰胺、非必需氨基酸、 碱性成纤维细胞生长因子、IL-6、表皮生长因子、胰岛素、Y27632、N2添加剂、B27添加剂、Primocin、青霉素、链霉素、胎牛血清、IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。其中IL-15的40ng/m、IL-18浓度的40ng/ml、IL-2的浓度为1500U/ml。再加入200ng/ml浓度的CD16。
在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳 浓度。
培养器皿的环境温度为37℃，且环境气氛为10％CO2。
当细胞增殖至50％融合后，更换为含有质量百分比浓度为30％FBS的α-MEM培养液。
在在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化 碳浓度步骤之后，还包括一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为30ml，,自体灭活血浆的浓度为30v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度40ng/ml的IL-15、浓度40ng/ml的IL-18、浓度4000U/ml的IL-2及581培养基。
在一次补充培养基步骤之后，还包括二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和 自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为60ml，,自体灭活血浆的浓度为30v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度40ng/ml的IL-15、浓度30ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基。
在具体实施时，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓 度之后第五天进行。
在具体实施时，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后第五天 进行。
在具体实施时，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、 脯氨酸和丝氨酸。
实施例四
一种NK细胞的应用，采用上述培养方法培养出的NK细胞，且该NK细胞为CAR-NK细胞， 所述CAR-NK细胞为ROBO1CAR-NK细胞。
进一步地，NK细胞用于治疗肿瘤。
进一步地，所述肿瘤的肿瘤细胞为胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾细胞癌、 头颈部及食管鳞状细胞癌或非小细胞肺癌。
在具体实施过程中，采用以上方案所制作的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果如下表。
Figure BDA0003536035300000071
实施例五
一种NK细胞的应用，用于静脉回输到人体内进行HPV治疗。通过HPV治疗输入后，对病患进行体检，发现HPV病毒转阴。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种NK细胞的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
制作培养液，在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行包被处理；
准备单核细胞，取单核细胞进行接种处理；
制作培养基，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、谷氨酰胺、非必需氨基酸、碱性成纤维细胞生长因子、IL-6、表皮生长因子、胰岛素、Y27632、N2添加剂、B27添加剂、Primocin、青霉素、链霉素、胎牛血清、IL-15、IL-18、IL-2和581培养基；
培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度。
2.根据权利要求1所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度之后，还包括如下步骤：
一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
3.根据权利要求2所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后，还包括如下步骤：
二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
4.根据权利要求2所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度之后第五天进行。
5.根据权利要求4所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆步骤中，激活培养基中含有IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。
6.根据权利要求3所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后第五天进行。
7.根据权利要求6所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆步骤中，激活培养基中含有IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。
8.根据权利要求1所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸。
9.一种NK细胞的应用，其特征在于，采用如权利要求1-8任意一项所述培养方法培养出的NK细胞用于治疗肿瘤。
10.一种NK细胞的应用，其特征在于，将NK细胞通过静脉回输入人体以用于治疗HPV。
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