CN114921411A - 一种nk细胞的培育方法及应用 - Google Patents

一种nk细胞的培育方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114921411A
CN114921411A CN202210226872.4A CN202210226872A CN114921411A CN 114921411 A CN114921411 A CN 114921411A CN 202210226872 A CN202210226872 A CN 202210226872A CN 114921411 A CN114921411 A CN 114921411A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
culture medium
culturing
cells
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210226872.4A
Other languages
English (en)
Inventor
闫书印
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202210226872.4A priority Critical patent/CN114921411A/zh
Publication of CN114921411A publication Critical patent/CN114921411A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2318—Interleukin-18 (IL-18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种NK细胞的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：制作培养液，在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行包被处理；准备单核细胞，取单核细胞进行接种处理；制作培养基，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、IL‑15、IL‑18、IL‑2和581培养基；培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度。一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。本发明构思新颖设计合理，且设计合理，通过本方法能培养出优质的NK细胞，并产生用于吞噬肿瘤细胞的效果，使用效果良好。

Description

一种NK细胞的培育方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种NK细胞的培育方法及应用。
背景技术
自然杀伤细胞(NK细胞)是机体的一种重要免疫细胞，主要分布于外周血中，占PBMC 5～ 10％。
脐带血中NK细胞含量约为7％左右。
淋巴结和骨髓中也有NK，但水平较外周血低。
自然杀伤细胞对靶细胞的识别无MHC限制性,可直接杀伤癌细胞(无需预先致敏),也 可分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能。
自然杀伤细胞是机体天然免疫的主要承担者,也是获得性细胞免疫的核心调节细胞, 在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。
有研究证明自然杀伤细胞其实不仅是天然免疫系统中的重要作用成分，它同样具有获得 性免疫细胞的一些特征。
在免疫系统的反应中，NK细胞反应的速度比T细胞和B细胞要快，其作用机制主要是识 别靶细胞，通过释放穿孔素、颗粒酶和分泌多种细胞因子，迅速溶解某些癌细胞，发挥调节 免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。
肿瘤是影响人类健康的重大疾病，但由于其特点，一直找不到一种更加深入治疗方法。
由于医疗基数的发展，癌症病患的医治情况均得到了很好的进步，但依然是属于难以彻 底治疗的疾病。
肿瘤免疫治疗方法是被国内外医疗届公认的有效的第四大肿瘤治疗法。
其中，自体免疫细胞治疗技术，比如，NK细胞免疫治疗正成为一种可靠的抗癌疗法，适 用于多种恶性肿瘤的临床治疗，且副作用小，不损伤正常组织。
随着肿瘤免疫学的不断进展，肿瘤免疫治疗已经成为继手术和放、化疗之后第四种肿瘤 治疗的手段，并且有望成为最终攻克肿瘤的方向。
自然杀伤细胞(NK细胞，CD3-CD56+)作为机体固有免疫的重要成员，是抗肿瘤免疫的先 行者，在肿瘤免疫方面发挥着至关重要的作用。
多项研究表明，NK细胞发挥抗肿瘤细胞毒性作用的这一过程依赖于NK细胞表面某些功 能受体，如NKG2和自然杀伤细胞抑制性受体家族等。此外，NK细胞还会产生一系列细胞因 子和趋化因子来调节免疫反应。通过释放CCL5、XCL1和XCL2，NK细胞能促进树突状细胞向 实体瘤聚集，促进CD8+T细胞抗肿瘤免疫作用，延长病人的生存期。NK细胞还可以通过其他 一些机制杀伤肿瘤细胞。
如何提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用NK细胞进行细胞免疫治疗的关键。
基于NK细胞在免疫系统中的作用，因此需要提供一种在体外实现NK细胞的培育方法。
发明内容
鉴于上述NK细胞的特点，本发明的目的在于提供一种NK细胞的培育方法，以培养品质 良好的NK细胞。
本发明通过下述技术方案实现：
一种NK细胞的培育方法，包括如下步骤：
制作培养液，在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行包被处理；
准备单核细胞，取单核细胞进行接种处理；
制作培养基，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、谷氨酰胺、非必需氨基酸、碱性成 纤维细胞生长因子、IL-6、表皮生长因子、胰岛素、Y27632、N2添加剂、B27添加剂、Primocin、 青霉素、链霉素、胎牛血清、IL-15、IL-18、IL-2和581培养基；
培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度。
根据权利要求1所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，在所述步骤培养，将培养器皿 放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度之后，还包括如下步骤：
一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
在一些实施方式中，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体 灭活血浆之后，还包括如下步骤：
二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
在一些实施方式中，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭 活血浆，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化 碳浓度之后第五天进行。
在一些实施方式中，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭 活血浆步骤中，激活培养基中含有IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。
在一些实施方式中，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭 活血浆，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后第 五天进行。
在一些实施方式中，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭 活血浆步骤中，激活培养基中含有IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。
在一些实施方式中，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷 氨酸、脯氨酸和丝氨酸。
一种NK细胞的应用，采用以上任意一项所述培养方法培养出的NK细胞，且该NK细胞为 CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞为ROBO1CAR-NK细胞，且用于治疗肿瘤。
在一些实施方式中，所述肿瘤的肿瘤细胞为胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、 肾细胞癌、头颈部及食管鳞状细胞癌或非小细胞肺癌。
一种NK细胞的应用，将NK细胞通过静脉回输入人体以用于治疗HPV。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明构思新颖设计合理，且设计合理，通过本方法能培养出优质的NK细胞，并产生用 于吞噬肿瘤细胞的效果，使用效果良好。本发明中用NK细胞对HPV细胞进行治疗，效果良好。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一 步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的 限定。
实施例一
一种NK细胞的培育方法，包括制作培养液、准备单核细胞、制作培养基和培养四个步骤。
其中，在制作培养液过程中，需要在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行 包被处理。
其中CD3的重量为5ug，胸腺肽的重量为15ug，PBS溶液的体积为5ml。
还向培养器皿中加入2ml浓度为3μg/μl的Ⅰ型胶原酶。
在准备单核细胞过程中，取单核细胞进行接种处理。
所取的单核细胞数量为1×106-3×106个/ml。
在制作培养基过程中，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、谷氨酰胺、非必需氨基酸、 碱性成纤维细胞生长因子、IL-6、表皮生长因子、胰岛素、Y27632、N2添加剂、B27添加剂、Primocin、青霉素、链霉素、胎牛血清、IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。其中IL-15的10ng/m、IL-18浓度的10ng/ml、IL-2的浓度为500U/ml。再加入20ng/ml浓度的CD16。
在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳 浓度。
培养器皿的环境温度为37℃，且环境气氛为5％CO2。
当细胞增殖至50％融合后，更换为含有质量百分比浓度为20％FBS的α-MEM培养液。
在在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化 碳浓度步骤之后，还包括一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为30ml，,自体灭活血浆的浓度为10v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度10ng/ml的IL-15、浓度10ng/ml的IL-18、浓度500U/ml 的IL-2及581培养基。
在一次补充培养基步骤之后，还包括二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和 自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为20ml，,自体灭活血浆的浓度为20v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度5ng/ml的IL-15、浓度10ng/ml的IL-18、浓度30U/ml 的IL-2及581培养基。
在具体实施时，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓 度之后第五天进行。
在具体实施时，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后第五天 进行。
在具体实施时，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、 脯氨酸和丝氨酸。
实施例二
一种NK细胞的培育方法，包括制作培养液、准备单核细胞、制作培养基和培养四个步骤。
其中，在制作培养液过程中，需要在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行 包被处理。
其中CD3的重量为15ug，胸腺肽的重量为55ug，PBS溶液的体积为30ml。
还向培养器皿中加入2ml浓度为3μg/μl的Ⅰ型胶原酶。
在准备单核细胞过程中，取单核细胞进行接种处理。
所取的单核细胞数量为3×106个/ml。
在制作培养基过程中，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、谷氨酰胺、非必需氨基酸、 碱性成纤维细胞生长因子、IL-6、表皮生长因子、胰岛素、Y27632、N2添加剂、B27添加剂、Primocin、青霉素、链霉素、胎牛血清、IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。其中IL-15的50ng/m、IL-18浓度的50ng/ml、IL-2的浓度为2000U/ml。再加入100ng/ml浓度的CD16。
在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳 浓度。
培养器皿的环境温度为37℃，且环境气氛为5％CO2。
当细胞增殖至60％融合后，更换为含有质量百分比浓度为20％FBS的α-MEM培养液。
在在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化 碳浓度步骤之后，还包括一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为70ml，,自体灭活血浆的浓度为20v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度50ng/ml的IL-15、浓度50ng/ml的IL-18、浓度2000U/ml的IL-2及581培养基。
在一次补充培养基步骤之后，还包括二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和 自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为50ml，,自体灭活血浆的浓度为30v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度40ng/ml的IL-15、浓度30ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基。
在具体实施时，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓 度之后第五天进行。
在具体实施时，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后第五天 进行。
在具体实施时，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、 脯氨酸和丝氨酸。
实施例三
一种NK细胞的培育方法，包括制作培养液、准备单核细胞、制作培养基和培养四个步骤。
其中，在制作培养液过程中，需要在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行 包被处理。
其中CD3的重量为10ug，胸腺肽的重量为35ug，PBS溶液的体积为20ml。
还向培养器皿中加入3ml浓度为3μg/μl的Ⅰ型胶原酶。
在准备单核细胞过程中，取单核细胞进行接种处理。
所取的单核细胞数量为2×106个/ml。
在制作培养基过程中，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、谷氨酰胺、非必需氨基酸、 碱性成纤维细胞生长因子、IL-6、表皮生长因子、胰岛素、Y27632、N2添加剂、B27添加剂、Primocin、青霉素、链霉素、胎牛血清、IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。其中IL-15的40ng/m、IL-18浓度的40ng/ml、IL-2的浓度为1500U/ml。再加入200ng/ml浓度的CD16。
在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳 浓度。
培养器皿的环境温度为37℃，且环境气氛为10％CO2。
当细胞增殖至50％融合后，更换为含有质量百分比浓度为30％FBS的α-MEM培养液。
在在培养培养过程中，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化 碳浓度步骤之后，还包括一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为30ml，,自体灭活血浆的浓度为30v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度40ng/ml的IL-15、浓度40ng/ml的IL-18、浓度4000U/ml的IL-2及581培养基。
在一次补充培养基步骤之后，还包括二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和 自体灭活血浆。
其中，激活培养基的体积为60ml，,自体灭活血浆的浓度为30v/v％。
其中，所述激活培养基中包含浓度40ng/ml的IL-15、浓度30ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基。
在具体实施时，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓 度之后第五天进行。
在具体实施时，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血 浆，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后第五天 进行。
在具体实施时，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、 脯氨酸和丝氨酸。
实施例四
一种NK细胞的应用，采用上述培养方法培养出的NK细胞，且该NK细胞为CAR-NK细胞， 所述CAR-NK细胞为ROBO1CAR-NK细胞。
进一步地，NK细胞用于治疗肿瘤。
进一步地，所述肿瘤的肿瘤细胞为胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肾细胞癌、 头颈部及食管鳞状细胞癌或非小细胞肺癌。
在具体实施过程中，采用以上方案所制作的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果如下表。
Figure BDA0003536035300000071
实施例五
一种NK细胞的应用，用于静脉回输到人体内进行HPV治疗。通过HPV治疗输入后，对病患进行体检，发现HPV病毒转阴。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种NK细胞的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
制作培养液，在培养器皿中加入CD3、胸腺肽和PBS溶液，并进行包被处理；
准备单核细胞，取单核细胞进行接种处理；
制作培养基，在激活培养基里面加入自体灭活血浆、谷氨酰胺、非必需氨基酸、碱性成纤维细胞生长因子、IL-6、表皮生长因子、胰岛素、Y27632、N2添加剂、B27添加剂、Primocin、青霉素、链霉素、胎牛血清、IL-15、IL-18、IL-2和581培养基；
培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度。
2.根据权利要求1所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度之后，还包括如下步骤：
一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
3.根据权利要求2所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后，还包括如下步骤：
二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆。
4.根据权利要求2所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆，在所述步骤培养，将培养器皿放入培养箱中进行培养，并调节环境的温度和二氧化碳浓度之后第五天进行。
5.根据权利要求4所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆步骤中，激活培养基中含有IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。
6.根据权利要求3所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆，在所述步骤一次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆之后第五天进行。
7.根据权利要求6所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，所述步骤二次补充培养基，在培养器皿中加入激活培养基和自体灭活血浆步骤中，激活培养基中含有IL-15、IL-18、IL-2和581培养基。
8.根据权利要求1所述的NK细胞的培育方法，其特征在于，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸。
9.一种NK细胞的应用，其特征在于，采用如权利要求1-8任意一项所述培养方法培养出的NK细胞用于治疗肿瘤。
10.一种NK细胞的应用，其特征在于，将NK细胞通过静脉回输入人体以用于治疗HPV。
CN202210226872.4A 2022-03-08 2022-03-08 一种nk细胞的培育方法及应用 Pending CN114921411A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210226872.4A CN114921411A (zh) 2022-03-08 2022-03-08 一种nk细胞的培育方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210226872.4A CN114921411A (zh) 2022-03-08 2022-03-08 一种nk细胞的培育方法及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114921411A true CN114921411A (zh) 2022-08-19

Family

ID=82804680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210226872.4A Pending CN114921411A (zh) 2022-03-08 2022-03-08 一种nk细胞的培育方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114921411A (zh)

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120016427A (ko) * 2010-08-16 2012-02-24 고려대학교 산학협력단 말초혈액으로부터 자연 살해세포의 증식 방법
WO2016081554A1 (en) * 2014-11-18 2016-05-26 Neostem Oncology, Llc Immunogenic compositions prepared from tumor cells derived from peripheral blood and originating from a solid tumor and their use
CN106148266A (zh) * 2015-04-20 2016-11-23 烟台赛泽生物技术有限公司 一种免疫细胞用培养基及该培养基的添加剂
CN107022524A (zh) * 2017-03-14 2017-08-08 上海莱馥生命科学技术有限公司 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法
CN108977453A (zh) * 2017-06-02 2018-12-11 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种以robo1为靶点的嵌合抗原受体细胞及其制备和应用
CN109810995A (zh) * 2017-12-06 2019-05-28 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 编码car的核苷酸序列、表达该car的robo1 car-nk细胞及其制备和应用
CN110438077A (zh) * 2019-08-26 2019-11-12 北京致仁生物科技有限公司 一种NK与γδT细胞的同时培养方法
CN111269925A (zh) * 2019-03-15 2020-06-12 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 携带自杀基因的robo1 car-nk细胞及其制备方法和应用
AU2018390960A1 (en) * 2017-12-21 2020-07-09 Hub Organoids Ip B.V. Immune cell organoid co-cultures
CN112608895A (zh) * 2020-12-18 2021-04-06 深圳市安棣生物科技有限责任公司 一种人多能干细胞分化的自然杀伤细胞及其制备方法与应用
CN113528439A (zh) * 2021-09-03 2021-10-22 东莞再立健生物科技有限公司 一种nk细胞培养方法
CN113549595A (zh) * 2021-07-27 2021-10-26 江苏蒙彼利生物科技有限公司 基于外周血的nk细胞体外培养方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120016427A (ko) * 2010-08-16 2012-02-24 고려대학교 산학협력단 말초혈액으로부터 자연 살해세포의 증식 방법
WO2016081554A1 (en) * 2014-11-18 2016-05-26 Neostem Oncology, Llc Immunogenic compositions prepared from tumor cells derived from peripheral blood and originating from a solid tumor and their use
CN106148266A (zh) * 2015-04-20 2016-11-23 烟台赛泽生物技术有限公司 一种免疫细胞用培养基及该培养基的添加剂
CN107022524A (zh) * 2017-03-14 2017-08-08 上海莱馥生命科学技术有限公司 一种从外周血单个核细胞中大量扩增nk细胞的方法
CN108977453A (zh) * 2017-06-02 2018-12-11 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种以robo1为靶点的嵌合抗原受体细胞及其制备和应用
CN109810995A (zh) * 2017-12-06 2019-05-28 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 编码car的核苷酸序列、表达该car的robo1 car-nk细胞及其制备和应用
AU2018390960A1 (en) * 2017-12-21 2020-07-09 Hub Organoids Ip B.V. Immune cell organoid co-cultures
CN111269925A (zh) * 2019-03-15 2020-06-12 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 携带自杀基因的robo1 car-nk细胞及其制备方法和应用
CN110438077A (zh) * 2019-08-26 2019-11-12 北京致仁生物科技有限公司 一种NK与γδT细胞的同时培养方法
CN112608895A (zh) * 2020-12-18 2021-04-06 深圳市安棣生物科技有限责任公司 一种人多能干细胞分化的自然杀伤细胞及其制备方法与应用
CN113549595A (zh) * 2021-07-27 2021-10-26 江苏蒙彼利生物科技有限公司 基于外周血的nk细胞体外培养方法
CN113528439A (zh) * 2021-09-03 2021-10-22 东莞再立健生物科技有限公司 一种nk细胞培养方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAITI GP等: "Roychowdhury S, Panda CK. Frequent inactivation of SLIT2 and ROBO1 signaling in head and neck lesions: clinical and prognostic implications", ORAL SURG ORAL MED ORAL PATHOL ORAL RADIOL, vol. 119, no. 02, 2 October 2014 (2014-10-02), pages 202 - 212 *
SUTLU T等: "Clinical-grade, large-scale, feeder-free expansion of highly active human natural killer cells for adoptive immunotherapy using an automated bioreactor", CYTOTHERAPY, vol. 12, no. 08, pages 1044 - 1055 *
刘志广等: "siRNA靶向干扰ROBO1基因表达对食管癌细胞周期、增殖及相关蛋白的影响", 中国老年学杂志, vol. 38, no. 17, 10 September 2018 (2018-09-10), pages 4216 - 4219 *
同立海源: "NK细胞免疫疗法在研企业", pages 1 - 4, Retrieved from the Internet <URL:httpszhuanlan.zhihu.comp434893461> *
汪德海等: "脐血单核细胞体外高效扩增NK细胞方法的研究", 中国输血杂志, vol. 31, no. 07, pages 722 - 726 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109294985B (zh) 一种用于nk细胞体外扩增的培养基体系及nk细胞体外扩增的方法
CN103627672B (zh) Nk细胞体外培养方法
CN110603048A (zh) 细胞因子组合
CN112830974B (zh) 一种嵌合抗原受体、载体、人树突状细胞、细胞系、实体肿瘤治疗药物及制备方法和应用
EP1666589B1 (en) Process for producing cytotoxic lymphocytes
KR20200132722A (ko) 효율적 자연살해세포 배양방법 및 이의 배지첨가 키트
EP3770251A1 (en) Method for producing natural killer cells
CN103710304B (zh) 脂肪干细胞诱导分化为自然杀伤细胞的方法及用途
CN116333986A (zh) 一种外泌体激活nk细胞的培养方法
CN115820645A (zh) 制备沉默nkg2a基因的nk细胞的方法及其用途
JP2024502012A (ja) 腫瘍浸潤リンパ球を調製するための方法
TW201005091A (en) Cell culture method and application thereof
CN114686428B (zh) 细胞-多肽偶联物及其制备方法和应用
CN113817685A (zh) 一种car-t细胞无血清培养基及其培养方法
CN113373113A (zh) 一种增强免疫细胞抗肿瘤效果的方法
CN115698267A (zh) 肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞培养基及其应用
CN114763530A (zh) 一种诱导和制备til细胞的方法
CN114921411A (zh) 一种nk细胞的培育方法及应用
CN111635884A (zh) 一种cxc趋化因子受体4基因激活剂在促进间充质干细胞体外增殖方面的应用
KR102504039B1 (ko) 자연살해세포 증식에 효과적인 배양 방법 및 이의 용도
JPH07102131B2 (ja) ヒトリンパ球の癌細胞に対する傷害活性を高める方法
CN110628717B (zh) 一种浸润性t细胞的培养方法
CN112029730A (zh) 一种基因修饰的间充质干细胞及其应用
KR20240047459A (ko) 지속성 재조합 인간 인터루킨-2 융합 단백질 및 이의 제조 방법과 응용
CN113699117A (zh) 经基因改造的少突胶质祖细胞在多发性硬化症中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination