CN113549595A - 基于外周血的nk细胞体外培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于外周血的NK细胞体外培养方法，包括以下步骤：取用外周血和B958细胞备用，利用外周血经分离液处理后获得PBMC细胞，利用B958细胞获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液，将所得PBMC细胞利用EBV上清液转化为永生化EBV‑LCL细胞，利用所得PBMC细胞经磁珠分选分离获得纯化后的NK细胞，将NK细胞经原代培养后置于无血清培养基中进行传代培养，获得增殖后的NK细胞。本发明的有益效果是：利用B958细胞制备含有EB病毒颗粒的EBV上清液，获得永生化EBV‑LCL细胞，使得NK细胞具有无限增殖能力，同时具有较强的杀伤肿瘤细胞的能力，NK细胞的扩增采用无血清培养基，避免血清源性污染以及避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的准确性。

Description

基于外周血的NK细胞体外培养方法
技术领域
本发明涉及外周血细胞培养，具体为基于外周血的NK细胞体外培养方法，属于细胞培养技术领域。
背景技术
人体免疫系统中，自然杀伤细胞(natural killere cell，NK)是机体重要的免疫细胞，大约占人外周血淋巴细胞的10％-15％，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别细胞、杀伤介质。
NK细胞在形态上属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，是除T细胞、B细胞之外的第三大淋巴细胞，和T细胞、B细胞不同的是，它不需要相关抗原刺激，就能识别和杀伤肿瘤细胞以及病毒感染细胞等靶细胞，NK细胞有两方面抗癌作用；一是直接杀伤肿瘤细胞，通过释放后穿孔素和颗粒酶或通过死亡受体杀死肿瘤细胞；二是通过分泌细胞因子和趋化因子扮演免疫系统的调节细胞因子，激活T细胞等的杀伤作用。
NK细胞作为人体免疫的第一道防线，几乎所有的肿瘤细胞都会先受到NK细胞的攻击，并及时将情况迅速上报并启动整个免疫系统的免疫防御和免疫杀伤功能，具有广谱的抗肿瘤作用，不需要肿瘤特异性识别，且不会被细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)抑制活性限制，启动时间最快。
肿瘤细胞表达的针对NK细胞免疫检查点的配体，仍然能够抑制NK细胞介导的肿瘤细胞裂解。于是NK细胞功能缺失，肿瘤逃逸，病情加剧。因此目前有一些新的药物被研发出来，针对肿瘤-NK细胞的抑制性免疫检查点，以限制这种抑制作用。
NK细胞可以通过两种方式克服抑制，一是激活型细胞因子，比如IL-2、IL-15，二是CD16(FcγRIII)介导的NK细胞激活。
IL-2可在短时间内促进NK细胞的存活、激活和提高细胞毒性，但是单独使用效果并不显著，同时尽管IL-2能够激活NK细胞，但它也可以增强Treg的活性，限制NK细胞的响应。IL-15被用于实体瘤的治疗，以及在白血病患者中，维持NK细胞数量和活性。IL-15一方面能够协助越过免疫检查点的一直机制，另一方面能够完善NK细胞上CD16介导的功能，而IL-2和IL-15联合应用可促进NK细胞的增殖和活性，有利于NK细胞的激活，IL-2和IL-15诱导NK细胞火花手提NKG2D、NKp44、NKp30和NKp46的表达，提高其对肿瘤细胞株的细胞毒性。
已有大量研究表明NK细胞与多种癌症相关，其中包括肝癌、晚期结肠癌、急性髓系白血病、急性白血病和霍奇金淋巴瘤等。为获得杀伤肿瘤细胞的效果，需要大量的NK细胞，但难以保证从肿瘤患者中能够获得大量血液，体外培养中多使用血清培养，其中血清组分尚不完全清除，同时不同批次血清的变动为实验研究带来不稳定性，降低实验研究结果的准确性，血清也可能会带来血清源性污染等问题。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供基于外周血的NK细胞体外培养方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的，基于外周血的NK细胞体外培养方法，包括以下步骤：
步骤一：取用外周血和B958细胞备用，利用外周血经分离液处理后获得PBMC细胞，利用B958细胞获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液，将所得PBMC细胞利用EBV上清液转化为永生化EBV-LCL细胞；
步骤二：利用所得PBMC细胞经磁珠分选分离获得纯化后的NK细胞；
步骤三：将NK细胞经原代培养后置于无血清培养基中进行传代培养，获得增殖后的NK细胞。
所述步骤三中更换为无血清培养基的NK细胞处于对数生长中期，所述无血清培养基中加入了葡萄糖、胰岛素、青霉素、链霉素、含锌和铜的无机盐物质、促生长因子及激素、CD3抗体活化剂、吲哚美辛和酶抑制剂、转铁蛋白、必需氨基酸、非必需氨基酸和谷氨酰胺、丙酮酸钠、多聚赖氨酸、昆布氨酸等氨基酸。
所述步骤一中外周血的提供源自健康人体，所述外周血采用RPMI1640培养液，所述RPMI1640培养液中加入15％PBS和细胞因子，所述细胞因子包括IL-2、IL-15和IL-12，所述外周血制备PBMC采用ficoll分离液进行分离，所述分离需经过多次水平离心和清洗。
所述步骤一到三中PBMC的分离、B958细胞的培养和NK细胞的培养均需在37℃、5％CO2条件下进行。
所述步骤一中B958细胞培养于RPMI1640培养液中，所述RPMI1640培养液内加入10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。
所述步骤一中B958正常传代培养后调整为细胞密度为1×106个/ml，置于无血清RPMI1640的培养基中饥饿处理10-15d后获得EB病毒颗粒，经过离心过滤后收集于-80℃的条件下进行储存。
所述步骤一中永生化EBV-LCL细胞的生长方式为悬浮生长，所述永生化EBV-LCL细胞的制备需要在培养瓶内进行培养。
所述步骤二中磁珠分选需在冰上进行，所述磁珠分选需要使用磁珠试剂盒。
所述NK细胞的培养包括以下步骤：
S1：抽取人外周血5-10ml于一个离心管中，然后加入等量的PBS充分混匀稀释，加入ficoll溶液，外周血在ficoll的作用下分层，经过离心、弃上清得到PBMC细胞；
S2：将B958细胞放入RPMI 1640培养液中正常传代培养，然后将培养后的B958细胞的细胞密度调整为1×106个/ml，在无血清RPMI 1640培养基中经饥饿处理7-10d后获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液；
S3：将分离后的PBMC细胞移入EBV上清液中，加入RPMI1640培养液，充分混匀后移入培养瓶中，置于37℃，5％CO2条件下进行培养，获得永生化EBV-LCL细胞；
S4：将上述所得的PBMC细胞移入试管中，依据磁珠试剂盒的说明书进行操作，所得到的即为高度纯化后的NK细胞；
S5：操作者取上述步骤分离纯化后的NK细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640的培养液进行原代培养，使用PBS洗3次，离心，弃上清，置于无血清培养基中进行传代培养，离心、弃上清后得到扩增后的NK细胞。
所述步骤三中体外培养扩增后的NK细胞需要进行性能检测，其中包括免疫表型的检测和NK细胞杀生能力的检测。
本发明的有益效果是：其一、本发明利用了B958细胞培养获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液，PBMC细胞在EBV上清液中培养获得永生化EBV-LCL细胞，永生化EBV-LCL细胞增殖能力强大，保证后续获得的NK细胞的生长能力，同时EB病毒颗粒的作用下，所获得的NK细胞的杀伤肿瘤细胞的能力增强。
其二、本发明在培养液中加入IL-2/IL-15和IL-12，保证所培养的NK细胞具有克服抑制的能力，被激活的能力增强，提高了NK细胞的存活能力。
其三、NK细胞采用无血清培养基，避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，同时可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的准确性。
附图说明
图1为本发明流程结构示意图；
图2为本发明NK细胞特性检测流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2所示，基于外周血的NK细胞体外培养方法，包括以下步骤：
步骤一：取用外周血和B958细胞备用，利用外周血经分离液处理后获得PBMC细胞，利用B958细胞获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液，将所得PBMC细胞利用EBV上清液转化为永生化EBV-LCL细胞；
步骤二：利用所得PBMC细胞经磁珠分选分离获得纯化后的NK细胞；
步骤三：将NK细胞经原代培养后置于无血清培养基中进行传代培养，获得增殖后的NK细胞。
作为本发明的一种技术优化方案，步骤一到三中PBMC的分离、B958细胞的培养和NK细胞的培养均需在37℃、5％CO2条件下进行，本发明的细胞培养均于二氧化碳培养箱中进行，二氧化碳培养箱的用途是为细胞生长提供合适的环境，以模拟细胞所来源的体内条件，培养箱控制在稳定的温度(37℃)、稳定的CO2水平(5％)、较高的相对饱和湿度(95％)，步骤一中外周血的提供源自健康人体，外周血的提供源自健康人体，采用人体外周血更接近模拟体内生理环境，培养出的NK细胞也更易在人体内存活，外周血采用RPMI1640培养液，RPMI1640培养液中加入15％PBS和细胞因子，细胞因子包括IL-2、IL-15和IL-12，外周血制备PBMC采用ficoll分离液进行分离，分离需经过多次水平离心和清洗。
作为本发明的一种技术优化方案，步骤一中永生化EBV-LCL细胞的生长方式为悬浮生长，永生化EBV-LCL细胞的制备需要在培养瓶内进行培养。步骤一中B958细胞培养于RPMI1640培养液中，RPMI1640培养液内加入10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。
作为本发明的一种技术优化方案，步骤一中B958正常传代培养后调整为细胞密度为1×106个/ml，置于无血清RPMI1640的培养基中饥饿处理10-15d后获得EB病毒颗粒，经过离心过滤后收集于-80℃的条件下进行储存，其中离心机离心3000r，20min，过滤器直径为0.4μm。
作为本发明的一种技术优化方案，步骤三中更换为无血清培养基的NK细胞处于对数生长中期，无血清培养基中加入了葡萄糖、胰岛素、青霉素、链霉素、含锌、铜和铁的无机盐物质、促生长因子及激素、CD3抗体活化剂、吲哚美辛和酶抑制剂、转铁蛋白、必需氨基酸、非必须氨基酸和谷氨酰胺、丙酮酸钠、多聚赖氨酸、昆布氨酸等氨基酸，其中含铁的无机盐物质可以作为为支撑材料，可以扩大NK细胞的生长空间，提高细胞活性和扩增率，含有微量元素锌和铜可以提高抗体表达量，抑制细胞的凋亡；转铁蛋白可以促进细胞生长；必需氨基酸和非必需氨基酸为细胞增殖提供其所需的氨基酸，谷氨酰胺提供细胞增殖所需能源，参与细胞的蛋白质合成和核酸代谢，丙酮酸钠可以为细胞培养提供替代碳源的作用，参与细胞的营养代谢，昆布氨酸和多聚赖氨酸能够促进NK细胞的贴壁生长；加入的胰酶抑制剂可以中止胰酶的消化作用，保护NK细胞，促进NK细胞的增殖；添加的生长因子和CD3抗体能够提高NK细胞的癌细胞杀伤能力。
作为本发明的一种技术优化方案，NK细胞的培养包括以下步骤：
S1：抽取人外周血5-10ml于一个离心管中，然后加入等量的PBS充分混匀稀释，PBS溶液为磷酸盐缓冲液，它具有盐平衡、可调整的适宜PH缓冲作用，使用PBS溶液稀释外周血是避免因红细胞比容高从而导致的淋巴细胞产量低，因为高细胞密度会导致大量淋巴细胞陷入红细胞团块中。
另取两支离心管，加入ficoll溶液，外周血在ficoll的作用下分层，经过离心、弃上清得到PBMC细胞，加入的ficoll溶液大约5ml，然后使用滴管将上述稀释的外周血轻轻加到两支离心管中于ficoll的上层，操作过程中动作轻柔，保证两层液体处于分层状态，避免用力过大混为一体，每支离心管内各10ml。
离心2000rpm，20min，离心完毕后可得到分层，从上至下依次为血浆、血小板、pbmc、ficoll细胞分离液、粒细胞和红细胞，因为pbmc的体积、形状和比重与其它细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，pbmc比重较小，利用ficoll离心后，各种血液成分按照密度梯度重新分布，形成分层，血浆和血小板的密度较低，悬浮于上层，其中血浆和血小板呈红色，pbmc层呈白膜层，操作者使用吸引器将上层的血浆和血小板吸除后更换吸引器吸取中层界面中间的白膜层至新的离心管内。在新的放置有pbmc层的离心管中，加入5倍量的PBS溶液，水平离心1800rpm，10min，可见沉淀，弃上清，重复2次，洗去淋巴细胞分离液和细胞碎片等，最后一次离心后，弃上清，保证操作在尽可能短的时间内完成。
S2：将B958细胞放入RPMI 1640培养液中正常传代培养，该培养液内添加有10％胎牛血清、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素，培养条件为37℃、5％CO2，然后将培养后的B958细胞的细胞密度调整为1×106个/ml，在无血清RPMI 1640培养基中经饥饿处理7-10d后获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液，B958细胞充分释放EB病毒颗粒，离心3000r，20min后获得上清液，该上清液为含有EB病毒的EBV上清液，吸取上清液经0.4μm的微过滤器进行过滤，然后使用EP试管置于-80℃的条件下保存。
S3：操作者取分离后的PBMC细胞移入试管中，将存于-80℃的EBV上清液取出，37℃迅速融化，将分离后的PBMC细胞移入EBV上清液中，加入RPMI1640培养液，充分混匀后移入培养瓶中，因为淋巴细胞的生长为悬浮生长，所以选用培养瓶进行培养，置于37℃，5％CO2条件下进行培养，隔2-3天后加入新鲜配置的培养基，1％的青霉素和链霉素，7-10天后观察可见淋巴细胞明显增大，出现聚集现象，获得永生化EBV-LCL细胞；
S4：将上述实验所得的PBMC细胞移入试管中，置于冰上放置，使用PBS溶液进行稀释，加入血清、BSA和EDTA，EDTA防止细胞成团，使用hanks液清洗血小板，1200r离心7min，台盼蓝染色计数细胞，取10*7个细胞进行分选，依据磁珠试剂盒的说明书进行操作，试剂盒内含有蛋白酶K、PD、PW和洗脱液，在EP管内加入蛋白酶K，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解，蛋白酶K的作用是使膜蛋白降解，使与DNA结合的蛋白酶降解，使DNA充分游离，在56℃的条件下进行孵育10min，使用磁珠分选，然后加入PD液，离心2000r，8min，见沉淀，弃上清，在加入PW液，离心1800r，10min，见沉淀，弃上清，最后加入洗脱液，离心1800r，10min，见沉淀，弃上清，所得到的即为高度纯化后的NK细胞。
S5：操作者取上述步骤分离纯化后的NK细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640的培养液进行原代培养，使用培养瓶悬浮培养，当细胞存活率达到90％时，选取处于对数生长中期的NK细胞，使用PBS洗3次，1800r离心，弃上清，调整细胞密度为1×106—3×106个/ml，置于无血清培养基中进行传代培养，培养4-7天后，细胞密度达到1×106—3×106个/ml，即表示细胞适应了无血清培养基，离心，去上清，每隔3-5天后，细胞密度达到1×106—3×106个/ml，存活率达到90％时，离心、弃上清后得到扩增后的NK细胞。
作为本发明的一种技术优化方案，步骤三中体外培养扩增后的NK细胞需要进行性能检测，其中包括免疫表型的检测和NK细胞杀生能力的检测，操作方法如下：
(1)NK细胞免疫表型的检测
对于扩增后的PBMC进行NK细胞免疫表型的检测，需要选用CD3、CD56抗体，使用流式细胞分析仪，将分离纯化后的NK细胞使用PBS洗2次，调整细胞密度为1×106个/ul，加入2ul的抗体，避光，在4℃的条件下作用30min，然后清洗，1800r离心8min，使用PBS液重新悬浮该细胞，通过流式细胞仪进行检测获得结果。
(2)NK细胞杀伤能力检测
检测NK细胞杀伤能力使用K562作为靶细胞，取分离纯化后的NK细胞于EP管内，选用髓系白血病细胞株K562进行传代培养，使用HANKS洗液分洗3次，1500r，10min，生理盐水稀释后计数及活力测定后，用1640培养液调整细胞数为1×105/ml，调整NK细胞的细胞数为2.5×106/ml，以NK细胞作为效应细胞，K562细胞作为靶细胞，以效靶比为25:1的比例加入96孔圆底板，离心500r，5min使效应细胞和靶细胞密切结合，然后置于37℃，5％CO2培养箱内进行培养，每孔加入10ulMTT，继续孵育4h，3000r，10min，弃上清，每孔加入DMSO150ul，充分混匀后，按照以下公式计算杀伤率：
NK杀伤率(％)＝[1-(实验孔A值－效应细胞孔A值)/靶细胞孔A值]×100％。
本发明在使用时，操作者首先取外周血于试管中，加入等量的PBS充分混匀稀释，另取离心管，加入ficoll溶液，外周血在ficoll的作用下分层，经过离心、弃上清得到PBMC细胞。
取B958细胞放于RPMI1640培养液中进行正常传代培养，然后调整B958细胞的细胞密度为1×106个/ml，在无血清RPMI1640培养基中进行饥饿培养获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液，经离心、弃上清后经0.4μm的微过滤器进行过滤，然后使用EP试管置于-80℃的条件下保存。
操作者取分离后的PBMC细胞移入EBV上清液中，加入RPMI1640培养液，充分混匀后移入培养瓶中，置于37℃，5％CO2条件下进行培养，获得永生化EBV-LCL细胞。
将上述实验所得的PBMC细胞移入试管中，置于冰上放置，使用PBS溶液进行稀释，使用hanks液清洗血小板，1200r离心7min，台盼蓝染色计数细胞，取107个细胞进行分选，依据磁珠试剂盒的说明书进行操作，进行离心、弃上清操作，获得纯化后的NK细胞。
操作者取上述步骤分离纯化后的NK细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640的培养液进行原代培养，使用培养瓶悬浮培养，使用PBS洗3次，离心，弃上清，调整细胞密度为1×106—3×106个/ml，置于无血清培养基中进行传代培养，离心，弃上清，可得到扩增后的MK细胞。
获得的NK细胞可以通过流式细胞分析仪进行NK细胞免疫表型的检测，也可通过选取K562作为靶细胞进行NK细胞杀伤能力检测。
设置实验组(NK细胞扩增培养采用无血清培养基)和对照组(NK细胞扩增培养采用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液)，将两组扩增培养得到的NK进行NK细胞免疫表型的检测和NK细胞的杀伤能力检测，其中实验组免疫表型表达能力及NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力均较对照组强。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：取用外周血和B958细胞备用，利用外周血经分离液处理后获得PBMC细胞，利用B958细胞获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液，将所得PBMC细胞利用EBV上清液转化为永生化EBV-LCL细胞；
步骤二：利用所得PBMC细胞经磁珠分选分离获得纯化后的NK细胞；
步骤三：将NK细胞经原代培养后置于无血清培养基中进行传代培养，获得增殖后的NK细胞。
2.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤三中更换为无血清培养基的NK细胞处于对数生长中期，所述无血清培养基中加入了葡萄糖、胰岛素、青霉素、链霉素、含锌和铜的无机盐物质、促生长因子及激素、CD3抗体活化剂、吲哚美辛和酶抑制剂、转铁蛋白、必需氨基酸、非必需氨基酸和谷氨酰胺、丙酮酸钠、多聚赖氨酸、昆布氨酸等氨基酸。
3.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤一中外周血的提供源自健康人体，所述外周血采用RPMI1640培养液，所述RPMI1640培养液中加入15％PBS和细胞因子，所述细胞因子包括IL-2、IL-15和IL-12，所述外周血制备PBMC采用ficoll分离液进行分离，所述分离需经过多次水平离心和清洗。
4.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤一到三中PBMC的分离、B958细胞的培养和NK细胞的培养均需在37℃、5％CO2条件下进行。
5.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤一中B958细胞培养于RPMI1640培养液中，所述RPMI1640培养液内加入10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素。
6.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤一中B958正常传代培养后调整为细胞密度为1×106个/ml，置于无血清RPMI1640的培养基中饥饿处理10-15d后获得EB病毒颗粒，经过离心过滤后收集于-80℃的条件下进行储存。
7.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤一中永生化EBV-LCL细胞的生长方式为悬浮生长，所述永生化EBV-LCL细胞的制备需要在培养瓶内进行培养。
8.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤二中磁珠分选需在冰上进行，所述磁珠分选需要使用磁珠试剂盒。
9.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于，所述NK细胞的培养包括以下步骤：
S1：抽取人外周血5-10ml于一个离心管中，然后加入等量的PBS充分混匀稀释，加入ficoll溶液，外周血在ficoll的作用下分层，经过离心、弃上清得到PBMC细胞；
S2：将B958细胞放入RPMI 1640培养液中正常传代培养，然后将培养后的B958细胞的细胞密度调整为1×106个/ml，在无血清RPMI 1640培养基中经饥饿处理7-10d后获得含有EB病毒颗粒的EBV上清液；
S3：将分离后的PBMC细胞移入EBV上清液中，加入RPMI1640培养液，充分混匀后移入培养瓶中，置于37℃，5％CO2条件下进行培养，获得永生化EBV-LCL细胞；
S4：将上述所得的PBMC细胞移入试管中，依据磁珠试剂盒的说明书进行操作，所得到的即为高度纯化后的NK细胞；
S5：操作者取上述步骤分离纯化后的NK细胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640的培养液进行原代培养，使用PBS洗3次，离心，弃上清，置于无血清培养基中进行传代培养，离心、弃上清后得到扩增后的NK细胞。
10.根据权利要求1所述的基于外周血的NK细胞体外培养方法，其特征在于：所述步骤三中体外培养扩增后的NK细胞需要进行性能检测，其中包括免疫表型的检测和NK细胞杀生能力的检测。
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