CN115094034A - 一种人nkt细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人NKT细胞系，命名为NKT细胞系617，其保藏号为：CCTCC NO：C2022121，保藏日期为2022年5月9日。本发明的NKT细胞系617来源于一位女性NKTCL患者的外周血，此患者EBV感染呈阴性，建立的细胞系EBV鉴定亦呈阴性。该细胞系EBV阴性能长期在体外连续传代培养，目前已在体外培养两年余，单克隆成功，低剂量IL‑2依赖可以大量扩增的人NKT细胞系，为人NKT相关研究及临床过继免疫治疗提供新的工具实验模型。本发明的NKT细胞系作为一种新型的抗肿瘤细胞免疫治疗具有巨大的前景。

Description

一种人NKT细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及人的细胞系，具体地涉及一种人NKT细胞系。

背景技术

自然杀伤T淋巴细胞(Natural Killer T cells cells，NKT细胞)是T细胞的一个特殊亚群，表达αβTCR受体(αβT细胞受体)以识别抗原并表现典型的NK细胞特征，如CD16、CD56以及颗粒酶。NKT细胞可直接识别靶细胞表面由MHCⅠ类分子CD1d提呈的脂质类抗原，或被IL-2、INF-γ等细胞因子激活，迅速产生应答。活化的NKT细胞可通过分泌穿孔素、颗粒酶或通过Fas/Fas L途径杀伤某种肿瘤和病原体感染的靶细胞；也可通过分泌IL-4或IFN-γ诱导初始T细胞向Th1或Th2细胞分化，参与体液免疫或细胞免疫应答，增强机体抗感染和抗肿瘤作用。NKT细胞也被认为是先天免疫和适应性免疫之间的桥梁。

NKT细胞识别由β2M相关的MHCⅠ类分子CD1d呈递的基于脂质的抗原，并分为两大类：Ⅰ型和Ⅱ型NKT细胞。Ⅰ型NKT细胞识别原型NKT细胞脂质抗原α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)并表达CD1d限制性半不变的αβTCR，包含不变的α-链(小鼠Vα-Jα18，人Vα24-Jα18)耦合到有限的β链序列(小鼠Vβ8，Vβ7和Vβ2，人Vβ11)。Ⅰ型NKT细胞在小鼠中相对丰富，占大多数组织中T细胞的1％～3％，以及在肝脏T细胞中高达50％。人类Ⅰ型NKT细胞占比较低，在血液和肝脏T细胞中不到1％。人类拥有更多数量的Ⅱ型NKT细胞，他们表达不同的TCR，具有更广泛的脂质抗原特异性。

结外自然杀伤T细胞淋巴瘤(Extranodal Natural Killer/T-cell lymphoma，NKTCL)是非霍奇金淋巴瘤的一种高度侵袭性的亚型，通常CD56⁺、胞内CD3⁺，胞内毒性标志物包括granzyme B和TIA1阳性。

2018年Cell Medica公司宣布全球首例儿童神经母细胞瘤患者已经成功接受该公司的在研的CAR-NKT疗法，基于该技术平台，通过对患者自身的NKT细胞进行基因工程改造，使其靶向GD2(一种几乎在所有神经母细胞瘤细胞表面均有表达的分子)，结合基因工程嵌合抗原受体和IL-15的分泌，在免疫抑制肿瘤微环境下维持治疗细胞的活性。临床前研究中已经显示，这种工程化设计可以增加CAR-NKT细胞的持久性并改善它们在免疫抑制性肿瘤微环境中的有效性，为实现对多数实体瘤的有效控制带来希望。NKT细胞作为一种新型的抗癌细胞免疫治疗具有巨大的前景。

国内外少见NKT细胞系建立的报道，且大多转染EBV以获得永生化细胞株或本身已感染EBV。中国专利201711386898公开了一株源自人慢性活动性EBV感染淋巴细胞增殖症病人的人NK/T细胞系；中国专利201210394807.9公开了一株源自鼻部血管中心性NK/T细胞淋巴瘤患者的人NK/T细胞系。该细胞系表现为CD16^-CD56^-CD45^-，非NK样；国外ADarji等人建立了一株来自髓系NK细胞急性白血病的NK/T细胞系。还有来自鼻腔NK/T细胞淋巴瘤患者(Nagata H,Konno A,Kimμra N,Zhang Y,Kimμra M,Demachi A,Sekine T,Yamamoto K,ShimizμN.BLood 2001,97:708–713)及CAEBV患者的外周血单个核细胞所建立的NKT细胞系或T细胞系(HiroshiNagata,1TsμtomμNμmata,1Akiyoshi Konno,PathoLogyInternationaL2001；51:778–785)。它们大多转染EBV以获得永生化细胞株或本身已感染EBV，因此提供一株EBV阴性的永生化细胞株对于各类疾病和筛选诊断分子以及药物具有重要意义和独特价值。

鉴于此，提供一株EBV阴性的永生化细胞株对于NKTCL和筛选诊断分子以及药物具有重要意义和独特价值。

发明内容

发明目的：本针对现有技术的不足，本发明提供一种人NKT细胞系，命名为人NKT细胞系617，其来源于NKTCL患者的外周血，患者EBV感染呈阴性，建立的细胞系EBV鉴定亦呈阴性。

本发明的NKT细胞系617来源一位女性NKTCL患者的外周血，患者无明显诱因出现左侧颈部区域淋巴结肿大，后全身多发淋巴结肿大及大量腹水，肝脾肿大，流式细胞学检测示CD4⁺、CD2⁺、CD5⁺、CD38⁺、HLA-DR⁺、CD56⁺、cCD3⁺、mCD3^-，TCR重排阳性，结合临床诊断为NKTCL。NKTCL是一种与EB病毒阳性高度相关的淋巴瘤，但此患者EBV感染呈阴性，建立的细胞系EBV鉴定亦呈阴性。

本发明的NKT细胞系617保藏于保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO：C2022121，保藏日为2022年5月9日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

该细胞系EBV阴性能长期在体外连续传代培养，目前已在体外培养两年余，单克隆成功，低剂量IL-2依赖可以大量扩增的人NKT细胞系，为人NKT相关研究及临床过继免疫治疗提供新的工具实验模型。

此外，NKT细胞不受高度多态性人类白细胞抗原(HLA)的限制，而是受单态性CD1d的限制，因此与传统的自体CAR-T细胞技术相反，CAR-NKT细胞可以实现同种异体，降低了移植物抗宿主病的风险。消除对困扰当前CAR-T细胞疗法的个性化和患者特异性产品需求。目前用于过继性细胞免疫疗法的NKT细胞多为健康供体的原代细胞。相比于原代NKT细胞，成熟且特征明确的同质细胞系基因改造有许多优势：产生“无限”数量的NKT细胞用于CAR治疗；细胞系的一致性导致CAR转导效率更高等。本发明提供的NKT细胞系617(下述简称为NKT617)消除了作为同种异体细胞疗法临床使用时，潜在感染EBV的可能。NKT细胞系作为一种新型的抗肿瘤细胞免疫治疗具有巨大的前景。

附图说明

图1为100×下NKT617细胞形态；

图2为1000×下NKT617细胞吉姆萨染色图片结果图；

图3为NKT617细胞透射电镜结果(加速电压80kV，2500倍放大)；

图4为NKT617细胞扫描电镜结果(加速电压3kV，13.5mm长度5000倍放大)；

图5为NKT617细胞对IL-2浓度的增殖依赖性的影响；

图6为无IL-2条件下，NKT617随时间发生部分自发凋亡的结果图；

图7为NKT617细胞的增长曲线图；

图8为NKT617染色体核型图；

图9为NKT617TCR基因的克隆性重排图；

图10为NKT617免疫表型分析结果；

图11为NKT617细胞支原体PCR检测结果图；

图12为NKT617细胞Hoechst33342染色结果图；

图13为转染NKT617细胞制备的抗CD-CAR-NKT细胞阳性率检测结果图；

图14为流式细胞术检测CD-CAR-NKT体外杀伤Ramos细胞结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

实施例1 NKT617细胞系的建立和表征。

(1)细胞系的建立

1.1标本来源：

取自一名患有NKTCL女性患者的外周血，肝素抗凝。经患者及家属同意，签订知情同意书。该患者无明显诱因出现左侧颈部区域淋巴结肿大，后全身多发淋巴结肿大及大量腹水，肝脾肿大，流式细胞学检测示CD4⁺、CD2⁺、CD5⁺、CD38⁺、HLA-DR⁺、CD56⁺、cCD3⁺、CD3^-，TCR重排阳性，结合临床诊断为NKTCL。NKTCL是一种与EB病毒阳性高度相关的淋巴瘤，但此患者EBV感染呈阴性，建立的细胞系EBV鉴定亦呈阴性。

1.2外周血单个核细胞分离：

无菌抽取患者外周血2mL，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，2000rpm，室温20℃，离心20min。吸取中界层面的单个核细胞，经PBS液洗2遍，1500rpm，室温20℃，离心10min，加入新鲜完全的1640培养液，后将2mL细胞悬液分装至24孔培养板内，并添加50-100U的重组人IL-2，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养。

1.3细胞的培养建系

细胞培养72小时后，镜下观察可见透亮而生长旺盛的淋巴细胞，每间隔2-3天吸掉500μL上清，加入含有重组人IL-2的1640培养液。一周以后，在镜下观察，可见细胞培养板孔内细胞生长特别旺盛，有细胞成团生长现象，周边有许多透亮、圆形、大小不等的淋巴细胞密集生长，有的凝聚成葡萄串样生长。培养二周后，仔细挑选出几个细胞生长特别旺盛的孔，将孔内细胞轻轻吹打后传代至T25细胞瓶中培养，随后细胞生长状况好，且生长速率快，2-3天可以传代一次。间隔2-3天后显微镜观察细胞形态：取细胞培养板置于倒置显微镜下，目镜10×，物镜10×。图1所示为NKT617细胞形态(100×)，细胞呈透亮圆形，生长旺盛。

该细胞已连续稳定生长2年以上，经液氮冻存后复苏，细胞状态好，存活率达95％以上，将该细胞命名为NKT细胞系617(下文简称为NKT617)。本发明的NKT细胞系617保藏于保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C2022121，保藏日为2022年5月9日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

NKT617细胞培养所用的培养液为：1640培养液(Gibco产品)，内含10％胎牛血清、重组人IL-2(Roche)50-100U/mL，并加适量双抗(LIFE产品)。

(2)细胞学形态的观察

2.1光镜下的细胞形态学观察

2.1.1培养的活细胞形态

取传代培养的细胞，在光学显微镜下(日本OLympus IMT-2倒置显微镜)观察活细胞生长情况。图1为第50代细胞光学形态图片(100×)，可见细胞生长旺盛，背景清晰，杂质少见，以透亮的中等大小的淋巴细胞为主，有的呈单细胞生长，有的细胞相互凝集成大小不等的细胞团样生长，2-3天可以传代。

2.1.2吉姆萨染色法细胞涂片

取对数生长期的细胞100μL，置于细胞离心涂片器上，在Thermo SCIENTIFIC涂片机上以1000rpm，室温离心1min，悬浮细胞离心沉积涂抹在玻片上，形成单层细胞涂片。用苏木精和伊红染色(Richard Allen Scientific)，取玻片置于倒置显微镜下，目镜10×，物镜100×。图2所示为NKT617细胞形态(1000×)，细胞呈类圆形，细胞核染成深紫色。

2.2电镜下的细胞形态学观察

2.2.1透射电镜下细胞形态观察

收集对数生长期的细胞加入2.5％的戊二醛，4℃固定过夜，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；再用1％的锇酸溶液固定样品1-2h；倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用梯度浓度(包括50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100％的乙醇处理一次，每次20min；最后过度到纯丙酮处理20min；纯包埋剂处理样品过夜；

将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，该切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液各染色15min，即可在日本JEOL公司的JEM-1230型透射电镜下观察。

透射电镜下细胞形态观察结果，如图3所示：细胞呈卵圆形，清晰可见较大的线粒体，核染色质有的均匀分布，有的聚集浓密，分布不均。

2.2.2扫描电镜下细胞形态观察

收集对数生长期的细胞，Hank’s液洗二遍，最后一遍1500rpm，离心7min，弃去上清液，加入2.5％的戊二醛，4℃固定过夜，0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用1％的锇酸溶液固定样品1-2h；用梯度浓度(包括50％，70％，80％，90％和95％五种浓度)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，再用乙醇与醋酸异戊酯的混合液(V/V＝1/1)处理样品30min，再用纯醋酸异戊酯处理样品1-2h。

临界点干燥；镀膜，观察。将处理好的样品在荷兰PhiLips公司的XL30型环境扫描电镜中观察。如图4所示：细胞呈类圆形，细胞表面有大小不等的凹陷，有的细胞凝聚在一起生长。

(3)细胞对IL-2增殖依赖性

3.1细胞增殖：

NKT617细胞用不同浓度IL-2从0U/mL到1000U/mL孵育。96孔板每孔加入3000个细胞，加入10ul CCK-8(碧云天Beyotime)孵育2h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

实验结果如图5所示：细胞呈IL-2依赖增殖。

3.2细胞凋亡

将NKT 617细胞接种在含有10％FBS的RPMI-1640的6孔板(2×10⁵细胞/孔)中。加入IL-2(50U/mL)或者不加入IL-2，培养细胞数天。收集细胞，以1000×g离心5分钟，然后重悬于500μL Binding Buffer中，随后加入5μL AnnexinV-FITC，在室温下黑暗中孵育15分钟。上机前补加5μL PI。用流式细胞仪(BECKMAN COΜLTER，，NAVIOMS FLOW CYTOMETER)检测FITC、PI荧光。

实验结果如图6所示：在无IL-2条件下，48h后NKT617的细胞凋亡率(19.8％)高于含50U/mL IL-2培养的NKT617(1.9％)，72h后无IL-2培养的NKT617细胞凋亡率(22.7％)高于含50U/mL IL-2培养的NKT617(2.5％)。表明在无IL-2条件下，NKT617细胞发生部分自发凋亡，呈IL-2依赖生长。

(4)细胞生长曲线

取对数生长期的生长良好传代细胞，采用台盼兰活细胞计数法计数定量，细胞总数为1.1×10⁷个，用培养液加至22mL，制成5.0×10⁵/mL的细胞悬液，取1mL细胞悬液于30mL培养瓶中，再加4mL新鲜培养液，共分装在22个培养瓶中，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。培养24小时以后，每天取2瓶细胞，用台盼兰活细胞计数法计数。

细胞生长曲线如图7所示。测定细胞群体倍增时间约为60h。

(5)细胞遗传学分析

取对数生长期的传代细胞，在试验的前一天传代培养，用10mL 1640培养液(内含IL-2 50U/mL)悬浮培养在37℃5％CO2培养箱中培养24小时。使用秋水仙素、低渗液、甲醇/乙酸固定和Wright染色。在油镜下进行计数，共计数100个分裂象，进行分析。

结果：所分析10个细胞中：

7个为47,XX,add(9)(p24),+11,？der(11)t(11；19)(q23；p13),-13,13p+,add(15)(q26),del(16)(q22),i(17)(q10),-21,22p+c,+M1？13q-,+M2,dmin.

1个为47,idem,1q-.

1个为48,idem,9p-,+？der(11)t(11；19).

1个为63,XX,+1,+1,del(1)(p34),+2,+2,+3,+5,+8,add(9)(p24),+10,+11,+11,？der 11),+？der(11),+12,-13,+14,del(16)(q22),+19,+20,+20,-21,-22,+M1×2？13q-,+M2.

所分析细胞均为伴有多种数目和结构异常的复杂核型。

NKT617染色体核型如图8所示。建系的肿瘤细胞大多为复杂核型，疾病易于复发，耐药难治，此细胞系为人NKT相关研究及临床过继免疫治疗提供新的工具实验模型，为筛选诊断分子及药物具有重要意义和独特价值。

(6)细胞TCR基因重排

用DNA抽提试剂盒(上海飞捷，中国)提取生长状态良好的NKT617细胞的DNA，与TCR特异性引物进行第一轮PCR扩增；960μL的Hi-Di溶液与40μL的GeneScanTM-500LIZ混合，短甩，离心后分装入96孔测序板中。每个反应孔中9μL上述溶液，对照用等量去离子水补齐，进行第二轮PCR扩增。使用3730仪器读取样本。

实验结果如图9所示，NKT617细胞呈TCRβ克隆性重排。表明NKT617细胞表达T细胞受体(T cell receptor，TCR)，TCR是T细胞表面，负责特异性识别与MHC(主要组织相容性复合体)结合的抗原肽的蛋白。

(7)细胞免疫表型分析

取约1×10⁶对数生长期的传代细胞，收集于15mL的离心管中，用台盼兰活细胞计数，细胞经PBSA液(PBS加2％FBS)洗2遍后，加入200μL人血清孵育10min，2000rpm离心2min，收集于1.5mL的离心管用100μL PBS，分成5管，2000rpm离心2min去除上清，加入2μL相应的抗体，避光冰上放置30分钟。胞经PBSA液(PBS加2％FBS)洗2遍后，再加400μL PBSA液，经流式细胞仪(BECKMAN COMLTER,NAVIOMS FLOW CYTOMETER)上样检测。

图10所示NKT617表型分析结果:CD4⁺CD8⁺HLA-DR⁺CD45⁺CD56⁺CD16^-CD3^-cCD3⁺CD25⁺CD2⁺CD38⁺CD19^-CD5^-CD7^-CD80^-CD209^-CD83^-CD208^-CD20^-CD22^-CD138^-CD116^-CD163^-CD68^-CD86^-CD34^-CD10^-。CD45高表达表明NKT617细胞是造血来源，其对所检测的大多数B细胞和髓系标记物表达均为阴性，表现典型的NK细胞特征CD56，也表达T细胞表面标志物CD2、CD4、CD8。

结合上述NKT617细胞表现TCRβ克隆性重排，表明NKT617是具有NK细胞表型的T细胞谱系，确定NKT617为NKT细胞系。

(8)细胞支原体检测

8.1PCR检测法

提取NKT617细胞系DNA，配置反应体系，NKT617样本+阴性对照+阳性对照，进行PCR扩增。取5μLPCR扩增产物，使用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。

结果如图11所示，NKT617样品的上清液中未检测到目标条带，表明NKT617样品支原体检测呈阴性。

8.2.荧光染料法(Hoechst33258)检测

加入NKT617样品3倍体积的Hoechst33258染色液，混匀。室温放置3-5分钟。吸除染色液，用生理盐水洗涤2-3次，每次3-5分钟。直接在荧光显微镜下观察或封片后荧光显微镜下观察。

实验结果如图12所示：阳性对照荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒(如图B，改编自Hoechst33258染色说明书，碧云天)。NKT617细胞内未见明显荧光着色颗粒(如图A 200×)。表明NKT617细胞未感染支原体。

(9)细胞系EBV病毒检测

利用RNA抽提试剂盒(上海飞捷，中国)提取NKT617细胞RNA，使用Taqman荧光探针进行实时荧光定量PCR。EBV引物序列(5’-3’)

EBVforward：CACAATGTCGTCTTACACCATTGA，

EBVreverse：AGGTCCTTAATCGCATCCTTCA。

选用EB病毒核酸定量检测试剂盒(北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司)作为阳性质控和阴性质控。实验结果：NKT617细胞系未见明确扩增曲线(未显示图)。

(10)CD19-CAR-NKT的体外构建及对靶细胞的杀伤能力验证

参照文献(中国肿瘤生物治疗杂质，2018,25(4)，P389-393)合成CD19 scFv序列FMC63，利用搭桥PCR技术将CD19-ScFv、铰链区CH2-CH3、CD137穿膜区和信号区以及胞内传递信号的CD3ζ片段依次串联，形成第二代CAR分子结构的CD19-CAR。获得pCDH-CD19-CAR质粒，用于后续慢病毒包装。利用CD19-CAR慢病毒感染NKT617细胞，通过荧光显微镜及流式细胞术检测NKT细胞表达GFP水平确定转染效率。Ramos细胞是表达CD19抗原的人淋巴瘤细胞，因此以Ramos细胞为靶细胞，CD19-CAR-NKT为效应细胞，按效靶比5:1将这两种细胞共培养，体外杀伤4h后，通过7-AAD染色确定死细胞百分比，确定杀伤效果。实验结果如图13所示。转染72h后，约有36.5％的NKT617细胞表达GFP。实验结果如图14所示。说明由NKT617细胞制备的CD19-CAR-NKT细胞能够有效杀伤CD19阳性肿瘤细胞。

序列表

<110> 江苏省中医院

<120> 一种人NKT细胞系及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> EBVforward(Artificial Sequence)

<400> 2

cacaatgtcg tcttacacca ttga 24

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> EBVreverse(Artificial Sequence)

<400> 1

aggtccttaa tcgcatcctt ca 22

Claims (4)

1.一种人NKT细胞系，命名为NKT细胞系617，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C2022121，保藏日为2022年5月9日。

2.根据权利要求1所述的人NKT细胞系，其特征在于，所述人NKT617细胞系来源于NKTCL患者的外周血，患者EBV感染呈阴性。

3.根据权利要求1所述的人NKT细胞系，其特征在于，建立的细胞系EBV鉴定呈阴性。

4.权利要求1所述的人NKT细胞系在制备抗肿瘤细胞免疫治疗的制品上的应用。

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