JPWO2020045368A1 - 不死化単球細胞および誘導細胞を用いた抗感染症薬,ワクチンなどの評価方法 - Google Patents
不死化単球細胞および誘導細胞を用いた抗感染症薬,ワクチンなどの評価方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(1) 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること、及び
感染した細胞を培養することを含む方法。
(2) 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とを単球に導入すること,
任意前記単球から樹状細胞を分化誘導すること,
得られた単球又は樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること、及び
感染した細胞を培養することを含む方法。
(3) 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症治療薬を同定する方法であって,
被検薬の存在下でBMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること,
前記単球又は前記樹状細胞における前記感染性微生物の感染レベルを測定すること,
測定された前記感染性微生物の感染から,該被検薬が前記感染症治療効果を有するか否かを判定することを含む方法,
ここで,測定された前記感染性微生物の感染レベルが,前記被検薬の非存在下で前記細胞に前記感染性微生物を感染させたコントロールの感染レベルと比較して少ない場合,当該被検薬は前記感染症治療効果を有すると判定される。
(4) 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の変異株を作製する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること,
感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること,
増殖した前記感染性微生物の中から,変異株を単離することを含む方法。
(5) 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物のワクチンを製造する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること,
感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること,
増殖した前記感染性微生物を回収することを含む方法。
(6) 更に,回収された前記感染性微生物を不活化することを含む,(6)に記載の方法。
(7) 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症患者由来血液から該感染微生物を分離する方法であって、
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞と前記患者由来血液とを接触させること,
感染した細胞を培養すること,
培養細胞中の微生物を検出及び/又は同定することにより、感染微生物を特定することを含む方法。
(8) 前記単球が,ヒト多能性幹細胞又はヒト造血幹細胞を分化誘導することにより得られた細胞,又は,ヒト末梢血から単離することにより得られた細胞である,(1)〜(7)のいずれか1項に記載の方法。
(9) 前記ヒト多能性幹細胞がiPS細胞である、(8)に記載の方法。
(10) ヒト多能性幹細胞又はヒト造血幹細胞を分化誘導することにより単球を調製すること,又は,ヒト末梢血から単離することにより単球を調製することをさらに含む,(1〜(7のいずれか1項に記載の方法。
(11) 前記ヒト多能性幹細胞がiPS細胞である、(10)に記載の方法。
(12) 前記感染性微生物がデングウイルスである,(1)〜(11)のいずれか1項に記載の方法。
(13) BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子が,BMI1遺伝子及びBCL2遺伝子若しくはLYL1遺伝子である,(1)〜(12)のいずれか1項に記載の方法。
別の態様において,本発明は,単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とを単球に導入すること,
任意前記単球から樹状細胞を分化誘導すること,及び,
得られた単球又は樹状細胞に前記感染性微生物を感染させることを含む方法に関する。
本明細書において,「単球又は樹状細胞介在型感染性微生物」とは,その生存・増殖過程において単球又は樹状細胞への感染が含まれるウイルス,菌,および原虫などを意味する。このような単球又は樹状細胞介在型感染性微生物としては,デング熱を引き起こすフラビウイルス科のウイルス,例えば,デングウイルス,日本脳炎ウイルス,西ナイルウィルス,黄熱ウイルス,マレー渓谷ウイルス,セントルイス脳炎ウイルス,ジカウィルス,ダニ媒介性脳炎ウイルスなどが含まれる。
本発明において,原料となる単球は,末梢血から採取する方法,多能性幹細胞から分化誘導させる方法,繊維芽細胞などの他の体細胞から分化誘導させる方法などにより得ることができる。単球を末梢血から採取する場合,ヒトの末梢血中のCD14分子を発現する細胞を分離・調製する方法は公知である。例えば,ヒト末梢血を等量の生理的食塩水,リン酸緩衝生理的食塩水,あるいは,ハンクス緩衝溶液などで穏やかに希釈する。希釈した血液を,遠心管中のフィコール(登録商標)(GE ヘルスケア社)上に静かに積層し,15〜30℃,500〜1000×gで20分間遠心分離する。黄色がかった血漿と透明のフィコールの中間の白い帯状の層をリンパ球・単球から成る末梢血単核細胞(PBMC)画分として回収する。回収された末梢血単核細胞画分は必要に応じて更に洗浄して用いてもよい。回収されたPBMC画分から更にCD14分子を発現する細胞を回収することにより,単球を得ることができる。例えば,抗CD14抗体が結合している固相とPBMCを接触させて当該固相に単球を結合させ,非結合の細胞を洗浄して除去することにより,分離回収することができる。例えば,このような固相として磁気ビーズを用いる方法などが知られている(Dynabeads(登録商標)CD14(Thermo Fisher Scientific Inc.)など)。また,末梢血からPBMCを分離することなく,末梢血を直接抗CD14抗体が結合している固相と接触させることにより単球を得ることもできる。
単球からの樹状細胞の誘導は,既報(Francoise Chapuisら,Eur J Immunol.(1997)27(2):431−41.;Marc Dauerら,J Immunol(2003)170(8):4069−4076.;Figdor CGら,Nat Med.(2004)10(5):475−80;Helmut Jonuleitら,Eur J Immunol.(1997)27(12):3135−42)に従い,例えば,200IU/mlのGM−CSF及び200IU/mlのIL−4の存在下で単球を培養することにより行うことができる。
単球又は樹状細胞への単球および樹状細胞介在型感染性微生物の感染は,単球および樹状細胞介在型感染性微生物含有溶液と細胞とを接触することにより行うことができる。感染を行う際及び/又は感染後の培養に使用する培地としては,例えばIMDM溶液,RPMI溶液,α−MEM溶液,MEM培地,DMEM溶液が挙げられる。また,添加物として,ヒトまたはウシ血漿タンパク質画分,ウシ胎児血清やヒト血清,グルコース,D−マンニトールなど糖類,アミノ酸,アデニンなど核酸塩基,リン酸水素ナトリウム,α−トコフェロール,リノール酸,コレステロール,亜セレン酸ナトリウム,ヒトホロトランスフェリン,ヒトインスリン,エタノールアミン,2−メルカプトエタノール,EPO,TPO,炭酸水素ナトリウム,メチルセルロース等が含まれていてもよい。また,必要に応じて,ゲンタマイシン,アンピシリン,ペニシリン,ストレプロマイシンなどの抗生剤;無機塩類;HEPES,リン酸緩衝剤,酢酸緩衝剤などの緩衝剤を加えてもよい。具体的な例としては,非必須アミノ酸を添加したα−MEM(10% ウシ胎児血清)培地,あるいは,ヒポキサンチン,HEPES(SIGMA社)を含むRPMI1640培地(SIGMA社)に,10%ウシ胎児血清,炭酸水素ナトリウム,100unit/mlペニシリン,100μg/mlのストレプトマイシンを添加した培地を使用して行うことができる。培養時間は、細胞、微生物及び培地の種類などに応じて適宜設定することができるが、例えば、24〜96時間、36〜84時間、72時間とすることができる。変異体取得のために感染細胞を培養する場合、培養回数は少ない回数でよく、例えば、1〜5回、1〜4回、1〜3回、1〜2回又は1回であってもよい。その他の培養条件は、一般的なヒト細胞の培養条件に準じて決定することができ、例えば、37℃,5%CO2条件下とすることができる。
別の態様において,本発明は,単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症治療薬を同定する方法であって,
被検薬の存在下でBMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること,
前記単球又は前記樹状細胞における前記感染性微生物の感染レベルを測定すること,
測定された前記感染性微生物の感染から,該被検薬が前記感染症治療効果を有するか否かを判定することを含む方法に関する。
ここで,測定された前記感染性微生物の感染レベルが,前記被検薬の非存在下で前記細胞に前記感染性微生物を感染させたコントロールの感染レベルと比較して少ない場合,当該被検薬は前記感染症治療効果を有すると判定される。
別の態様において,本発明は,単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の変異株を作製する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること,
感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること,
増殖した前記感染性微生物の中から,変異株を単離することを含む方法に関する。
別の態様において,本発明は,単球又は樹状細胞介在型感染性微生物のワクチンを製造する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること,
感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること,
増殖した前記感染性微生物を回収することを含む方法に関する。
別の態様において,本発明は、単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症患者由来血液から該感染微生物を分離する方法であって、
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞と前記患者由来血液とを接触させること,
感染した細胞を培養すること,
培養細胞中の微生物を検出及び/又は同定することにより、感染微生物を特定することを含む方法に関する。
4つの血清型のデングウイルスを感染評価に用いた。用いた株は,望月株(デング1型ウイルス),NGC株(デング2型ウイルス),H87株(デング3型ウイルス),H241株(デング4型ウイルス)であり,いずれもプロトタイプ株である。公知の方法に基づき,各ウイルスは感染Vero細胞の培養液中に放出された上清を用いた。
評価培地としては,ヒポキサンチン,HEPES(SIGMA社)を含むRPMI1640培地(SIGMA社)に,炭酸水素ナトリウム(最終濃度0.225%),100unit/mlペニシリン,100μg/mlのストレプトマイシンを添加した培地を使用した。
(ヒト末梢血由来不死化単球細胞の作製)
ヒト末梢血由来ヒト不死化単球細胞は,既報(WO2012/043651及び特開2017−131136)を参考に作製した。詳しくは,ヒト末梢血よりCD14陽性画分を取り出し,マウス不死化造血幹細胞として報告されている遺伝子(Myc,Myb,Hob8,TLX1,E2A−pbx1,MLL,Ljx2,RARA,Hoxa9,Notch1,v−raf/v−myc,MYST3−NCOA2,Evi1,HOXB6,HOXB4,β−catenin,Id1)もしくは,ヒト不死化単球細胞報告にある遺伝子を導入し作製した。不死化単球細胞株は,20%FBS,50ng/ml M−CSF,及び50ng/ml GM−CSFを含有するα−MEM培地中で培養し,培養開始から4〜5週間後に,増殖性細胞として獲得し,市販の細胞保存液を用い液体窒素下で保存した。
調製した細胞が単球様細胞であることを確認するために,濃縮による色の評価,表面マーカーの測定,および,ギムザ染色などによる形態観察などを感染評価前に行った。濃縮による色の評価は,遠沈管で細胞を回収した際の目視における細胞の色で測定した。表面マーカー測定は,CD11抗体,CD14抗体(いずれもBiolegend社)を用いて,Sysmex社のフローサイトメーターCyFlowspaceを使用して行った。また染色については,市販の染色液(Sigma社)を用いて,公知の染色法に基づきギムザ染色もしくはメイギムザ染色をし,高倍顕微鏡(400〜1000倍)にて測定した。
保存した不死化単球細胞株を,α−MEM培地(20%FBS,50ng/ml M−CSF,及び50ng/ml GM−CSF含有)中,37℃,5%CO2インキュベータ内で培養し,3日に一度培地交換を行うことで維持し調製した。樹状細胞は,不死化単球細胞を,50ng/ml M−CSF,50ng/ml GM−CSF,及び20ng/ml IL−4の存在下で3日間培養して樹状細胞へと分化させることにより調製し,細胞評価に使用した。
ヒト人工多能性幹(iPS)細胞由来ヒト不死化単球細胞は,既報(WO2012/043651及び特開2017−131136)を参考に作製した。詳しくは,未分化なiPS細胞を,ラミニン511などマトリゲルをあらかじめ基底膜としてコートした上に播種し,α−MEM培地(20%FBS含有)を用いて分化誘導培養を開始した。以降,3日に1度,α−MEM培地(20%FBS含有)を交換しつつ培養を継続した。分化誘導開始から18日後,トリプシン−EDTA(エチレンジアミン四酢酸)−コラゲナーゼ液を使用して細胞を処置(37℃,60分)して解離させて回収し,ピペッティング操作により細胞浮遊液を作製した。続いて,直径10cmのディッシュ1枚に由来する細胞を10mlのDMEM培地(10%FBS含有)に懸濁し,フィーダー細胞なし,ゼラチンコートなしの直径10cmのディッシュ2枚に播種し静置した。3時間後,ディッシュに付着しなかった細胞を回収し,100マイクロメートルのメッシュ(BD Falcon社製 セルストレイナー)を通過させることにより,凝集細胞塊を除いた細胞浮遊液を得た。
移送先到着後,速やかにヒト末梢血由来不死化単球細胞(CD14−ML)又は樹状様細胞をトリプシンを用いて剥離し,T−25フラスコから遠沈管に移し替え,回収した細胞を評価に使用した。即時使用しない場合においては,100mmディッシュなどに移し替え,3日おきに培地を交換した。
ヒト末梢血由来不死化単球細胞(CD14−ML)及びヒト人工多能性幹細胞由来不死化単球細胞(iPS−ML)は、移送先に到着後,速やかにトリプシンなどを用いて剥離し,T−25フラスコから遠沈管に移し替え,回収し後,100mmディッシュなどに移し替え,3日おきに培地を交換した。
Claims (15)
- 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること、及び
感染した細胞を培養することを含む方法。 - 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物を維持培養する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とを単球に導入すること,
任意前記単球から樹状細胞を分化誘導すること,
得られた単球又は樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること、及び
感染した細胞を培養することを含む方法。 - 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症治療薬を同定する方法であって,
被検薬の存在下でBMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること,
前記単球又は前記樹状細胞における前記感染性微生物の感染レベルを測定すること,
測定された前記感染性微生物の感染から,該被検薬が前記感染症治療効果を有するか否かを判定することを含む方法,
ここで,測定された前記感染性微生物の感染レベルが,前記被検薬の非存在下で前記細胞に前記感染性微生物を感染させたコントロールの感染レベルと比較して少ない場合,当該被検薬は前記感染症治療効果を有すると判定される。 - 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の変異株を作製する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること,
感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること,
増殖した前記感染性微生物の中から,変異株を単離することを含む方法。 - 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物のワクチンを製造する方法であって,
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞に前記感染性微生物を感染させること,
感染した単球又は前記樹状細胞を培養して前記感染性微生物を増殖させること,
増殖した前記感染性微生物を回収することを含む方法。 - 更に,回収された前記感染性微生物を不活化することを含む,請求項6に記載の方法。
- 単球又は樹状細胞介在型感染性微生物の感染症患者由来血液から該感染微生物を分離する方法であって、
BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子と,cMYC遺伝子とが導入された単球,又は,前記単球から分化誘導された樹状細胞と前記患者由来血液とを接触させること,
感染した細胞を培養すること,
培養細胞中の微生物を検出及び/又は同定することにより、感染微生物を特定することを含む方法。 - 前記単球が,ヒト多能性幹細胞又はヒト造血幹細胞を分化誘導することにより得られた細胞,又は,ヒト末梢血から単離することにより得られた細胞である,請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項8に記載の方法。
- ヒト多能性幹細胞又はヒト造血幹細胞を分化誘導することにより単球を調製すること,又は,ヒト末梢血から単離することにより単球を調製することをさらに含む,請求項1〜請求項7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト多能性幹細胞がiPS細胞である、請求項10に記載の方法。
- 前記感染性微生物がデングウイルスである,請求項1〜請求項11のいずれか1項に記載の方法。
- 培養時間が、24〜96時間である、請求項1〜請求項12のいずれか1項に記載の方法。
- 培養回数が1〜5回である、請求項4に記載の方法。
- BMI1遺伝子,EZH2遺伝子,MDM2遺伝子,MDM4遺伝子,HIF1A遺伝子,BCL2遺伝子及びLYL1遺伝子から選択される少なくとも1つの遺伝子が,BMI1遺伝子及びBCL2遺伝子若しくはLYL1遺伝子である,請求項1〜請求項14のいずれか1項に記載の方法。
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