CN112601815A - 使用永生化单核细胞和诱导细胞的抗感染药物、疫苗等的评价方法 - Google Patents

使用永生化单核细胞和诱导细胞的抗感染药物、疫苗等的评价方法 Download PDF

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Abstract

本发明是鉴于在单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物研究中的稳定性、再现性、经济性以及易操作性有关的问题而作出的，其目的在于提供利用具有增殖能力的单核细胞维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法。本发明基于登革热病毒能够在将基因导入CD14阳性细胞获得的能够增殖的人单核细胞和通过分化诱导该单核细胞获得具有吞噬能力的细胞(例如树突状细胞)中高效率地感染和增殖的发现。由此，对于用于治疗单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物传染病的化合物和疫苗等药物，提供了一种用于评价的新方法。

Description

使用永生化单核细胞和诱导细胞的抗感染药物、疫苗等的评 价方法
技术领域
本发明涉及单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的体外(in vitro)培养方法或该微生物传染病治疗药物的评价方法等。
背景技术
在传染病研究中，目标病原菌通过单核细胞或树突状细胞(Dendritic cells)增殖时，使用已经构建的细胞系进行研究。例如，登革热病毒是被进行了长年研究的引起人感染的病毒，根据经验使用人类慢性髓性白血病来源的K562细胞系、非洲猕猴的肾脏上皮细胞来源的Vero细胞系、叙利亚仓鼠肾脏来源的BHK细胞系等细胞系进行研究。但是，使用这些细胞系的评价虽然具有容易进行的优点，但是存在不一定能反映人体内的感染和增殖的问题。
使用人体来源的单核细胞和树突状细胞，能够进行更近于生物体的机制和抗原的分析，因此期待据此开发新的药物、疫苗。理论上使用人体来源的白细胞样细胞可以进行感染评价，也能使用从个体切除的组织分离出的细胞进行感染评价。例如，据报告，脐带血、骨髓、末梢血来源的造血干细胞可以在体外(in vitro)分化为血细胞，甚至分化为单核细胞和诱导细胞。另外，也有报告称，通过由胚胎干细胞(ES细胞)、诱导性多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞进行分化诱导来制备单核细胞和进一步分化的树突状细胞等的方法(专利文献1、非专利文献1～9)。但是，单核细胞和树突状细胞难于在体外持续地增殖，因此使用切除来源的细胞进行细胞制备时需要从个体内提取和分离，存在操作繁琐费用高昂的问题。另外，这些方法存在在分化诱导中耗时、单核细胞和分化的树突状细胞的供给量少、难于持续地连续提供研究所需的量的问题。另外，细胞来源的个体和制备细胞的条件可能每次都不同，因此，存在再现性的评价困难的问题。
如此，充分反映人体内的感染和增殖状态的同时具有良好再现性且能够评估单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的细胞在此之前是不存在的。
由于这类实验上的限制，虽然弄清楚了单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物为单核细胞和树突状细胞介导的，但是还没有弄清楚关于合适病毒增殖的条件等的全部内容。为此，使用从个体切除的细胞的实验中，也存在成为研究对象的单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物研究不一定是在合适条件下进行的问题。
另一方面，由于在癌症等的免疫疗法中进行细胞治疗时需要制备大量的抗原提呈细胞，因此进行了关于能够增殖的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞的研究。有报告称，向从iPS细胞分化诱导的髓系细胞(iPS-MC)和末梢血来源的单核细胞进行基因导入，从而制造具有自我增殖能力的髓系细胞系(iPS-ML)和单核细胞系(CD14-ML)(专利文献2和专利文献3)。
并且公开了，作为登革热病毒感染模型，单核细胞来源的树突状细胞由于其品质、增殖、供体依赖性的特性而受到限制，对上述的iPS-ML来源的树突状细胞(iPS-ML-DC)感染登革热病毒，使HLA(人类白细胞抗原)匹配的T细胞活化(非专利文献10)。但是，使用iPS细胞时，存在由于iPS细胞的残留而癌化和从iPS稳定且高度可靠地分化诱导髓系细胞存在困难、需要从诱导后的细胞群中可靠地仅分离出髓系细胞等很多问题。另外，已知的，CD4+单核细胞作为抗原提呈细胞的能力出色(非专利文献11)，而iPS来源的髓细胞(iPS-ML)的CD4表达低(非专利文献12)。
另外，从感染患者的病毒分离是为确认感染和检查、研究的重要的操作。病毒分离是通过采集感染患者的血液等，通过使用培养细胞进行操作来实施的。例如，为登革热病毒时，一般使用发病后5～6天以内的血清样品和为白纹伊蚊培养细胞系的C6/36细胞等进行(非专利文献13)。但是，血清样品中的病毒浓度和从样品采集到开始培养的时间等影响病毒分离的效率，存在病毒分离不一定能成功的问题。例如，已知的，当为登革热病毒时，血清样品中病毒的浓度因为患者的恢复而减少，以及采血后存活病毒数量不断减少。因此，已知的，病毒分离的成功率为60％左右，在被认为病毒量减少的发病后第5天以后，该比例会更低(非专利文献14)。
另外，疫苗的开发中需要能够培养使病毒变异的培养细胞。特别是弱毒疫苗的开发，其使用异源培养的细胞等多次重复传代而得到弱毒化的病毒变异体作为疫苗进行利用。但是病毒的变异发生频率很低，需要长时间的研究时间，即需要培养时间。例如，有报告称，为弱毒性疫苗的轮状病毒疫苗(RV1)时，将人病毒使用非洲绿猴肾细胞传代33次后，将3次有限稀释后筛选的株进一步使用Vero细胞传代7次才能获得(非专利文献15)。如此，已知通常未经过多次培养的话是无法获取弱毒化变异株的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2008/056734
专利文献2：WO2012/043651
专利文献3：日本特开2017-131136
非专利文献
非专利文献1：Fairchild P.J等,Curr Biol.(2000)10:1515-1518.
非专利文献2：Lindmark H等,Exp Cell Res(2004)300：335-344.
非专利文献3：Zhan X等,Lancet(2004)364:163-171.
非专利文献4：SluKvin II等,J Immunol(2006)176:2924-2932.
非专利文献5：Odegaard JI等,J Leukoc B iol(2007)81：711-719.
非专利文献6：Su Z等,Clin Cancer Res(2008)14:6207-6217.
非专利文献7：Tseng SY等,Regen Med(2009)4:513-526.
非专利文献8：Senju S等,Stem cells(2007)25:2720-2729.
非专利文献9：Choi KD等,J Clin Invest(2009)119:2818-2829.
非专利文献10：Dao Huy Manhra等,J Gen Virol.(2018)doi:10.1099/jgv.0.001119.
非专利文献11：G.Szabo等,J.Leukoc.Biol.(1990)；47(2):111-20.
非专利文献12：Chihiro Koba等,PLoS One.2013；8(6):e67567.
非专利文献13：亀岡，モダンメディア(Modern media)61卷9号2015《臨床検査アップデート(译文：临床检查前沿)》265.
非专利文献14：Richiard G.Jarman等,Am J Trop Med Hyg.2011；84(2):218-223.
非专利文献15：ロタウイルスワクチンに関するファクトシート(译文：关于轮状病毒的情况说明书)(平成24年9月28日)国立感染症研究所
发明内容
即，本发明的课题在于在单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物研究中，发现具有更好的稳定性、再现性、经济性以及易操作性的方法。另外，本发明的目的在于提供一种通过短时间培养能够取得单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的变异体的方法。
本发明的发明人为了探索提供一种适合传染病研究的单核细胞或树突状细胞的方法，进行了使登革热病毒感染通过各种方法制备、制造的单核细胞和树突状细胞的研究。其结果为发现登革热病毒能够在向人脐带血来源、ES细胞来源或者骨髓细胞或末梢血细胞来源的CD14阳性细胞导入基因而得到的能够增殖的人单核细胞，和通过分化诱导该单核细胞得到的具有吞噬能力的细胞(例如树突状细胞)中高效率地感染、增殖，从而完成了本发明。特别是感染了这些细胞的病毒的增殖速度快，且产生更多的子代病毒和病毒样颗粒。由此，本发明的发明人为用于治疗单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物传染病的化合物、疫苗等医药品的评价方法等，提供了进行研究开发的新方法。并且，通过使单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的增殖成为可能，成功发现能够用于疫苗的制造和变异株的构建、开发、制造。
此外，本发明特别地通过使单核细胞永生化后使用，解决了通过使用iPS细胞存在的这些问题。即通过采用使单核细胞永生化的方法，能够稳定、容易地得到仅有单核细胞的群。另外，使单核细胞永生化得到的细胞表达CD4，与iPS来源的树突状细胞比较具有更强的抗原提呈能力，被认为是适于疫苗研究的细胞。因此，本发明提供了一种表达CD4优异的单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物感染模型。
此外，由于受到样品内的病毒浓度等的影响，一直以来的细胞培养存在难于病毒分离的问题，而本发明解决了该问题。根据本发明的发明人的发现，通过利用使iPS细胞来源、人脐带血来源、ES细胞来源或者骨髓细胞或末梢血来源的CD14阳性细胞永生化而得到能够增殖的人单核细胞，和由诱导分化该单核细胞得到的具有吞噬能力的细胞(例如树突状细胞)，即使病毒量稀少，在细胞内也能够充分增殖。其结果，本发明成功提供了提高病毒分离成功率的分离评价体系。因此，在一个方式中，本发明提供一种优异的病毒分离用细胞。
此外，本发明解决了在疫苗开发过程中，为获得弱毒性病毒的病毒变异株而花费时间长的问题。即，通过本发明，对于使iPS细胞来源、人脐带血来源、ES细胞来源或者骨髓细胞或末梢血来源的CD14阳性细胞永生化而得到的能够增殖的人单核细胞，和通过诱导分化该单核细胞而得到的具有吞噬能力的细胞(例如树突状细胞)，即使被低浓度病毒感染时，也不需要长时间的培养就能够获得形成不同形态的噬菌斑的病毒变异株。其结果，能够短时间获得病毒变异体，被认为是适于疫苗研究的细胞。因此，本发明提供益于病毒、疫苗研究中产生变异株的细胞。
具体而言，本发明涉及以下发明。
(1)一种维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法，包括：
使上述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；以及，
培养感染的细胞的步骤。
(2)一种维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法，包括：
将选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因导入单核细胞的步骤；
从任意上述单核细胞分化诱导树突状细胞的步骤；
使上述感染性微生物感染所得到的单核细胞或树突状细胞的步骤；以及，
培养感染的细胞的步骤。
(3)一种鉴定单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的传染病治疗药物的方法，包括：
在被测药物存在的情况下，使上述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；
测定上述单核细胞或上述树突状细胞中的上述感染性微生物的感染水平的步骤；
根据测定的上述感染性微生物的感染情况，判定该被测药物是否具有上述传染病治疗效果的步骤，
在此，测定的上述感染性微生物的感染水平与上述被测药物不存在的情况下使上述感染性微生物感染上述细胞的对照的感染水平比较，前者少时，判定该被测药物具有上述传染病治疗效果。
(4)一种制作单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的变异株的方法，包括：
使上述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；
培养感染的单核细胞或上述树突状细胞来增殖上述感染性微生物的步骤；
从增殖的上述感染性微生物中分离变异株的步骤。
(5)一种制造单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物疫苗的方法，包括：
使上述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；
培养感染的单核细胞或上述树突状细胞来增殖上述感染性微生物的步骤；
回收增殖的上述感染性微生物的步骤。
(6)根据项(5)中记载的方法，其还包括灭活所回收的上述感染性微生物的步骤。
(7)一种从来自单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的传染病患者的血液中分离该感染性微生物的方法，包括：
使导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞与来自上述患者的血液接触的步骤；
培养感染的细胞的步骤；
通过检测和/或鉴定培养细胞中的微生物而确定感染性微生物的步骤。
(8)根据项(1)～(7)中任意一项记载的方法，其中，上述单核细胞是通过分化诱导人多能干细胞或人造血干细胞得到的细胞，或者是通过从人末梢血分离得到的细胞。
(9)根据项(8)记载的方法，上述人多能干细胞是iPS细胞。
(10)根据项(1)～(7)中任意一项记载的方法，其还包括通过分化诱导人多能干细胞或人造血干细胞制备单核细胞，或通过从人末梢血分离制备单核细胞的步骤。
(11)根据项(10)中记载的方法，上述人多能干细胞是iPS细胞。
(12)根据项(1)～(11)中任意一项记载的方法，其中，上述感染性微生物是登革热病毒。
(13)根据项(1)～(12)中任意一项记载的方法，其中，选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因为BMI1基因和EZH2基因或LYL1基因。
发明的效果
通过本发明，能够研究、评价引起单核细胞或树突状细胞介导的传染病的微生物。例如，即使对于由人献血来源的血细胞材料难于培养、评估难以研究的疾病，也能够使用本发明进行培养、评估，能够进行传染病研究、抗感染药物、疫苗的开发。另外，通过本发明的方法，在血液相关的疾病的治疗药物开发中，能够进行误差小的药剂筛选评价。
附图说明
图1是显示使用流式细胞仪分析所制作的永生化人单核细胞的表面标记CD11和CD14的表达的结果的图。使用的抗体：与FITC反应的抗CD11抗体、抗CD14抗体。
图2是通过使用IL4刺激永生化人单核细胞而诱导的树突状细胞样细胞在梅-吉(May Giemsa)染色后的照片。
图3是登革热病毒感染实验的板设计图。在96孔板的左半部分加入评价的人单核细胞或树突状细胞，在右半部分接种对照细胞K562细胞。孔的各行(1-12)中添加不同稀释倍率的病毒液。在孔的每一列(A-H)添加不同种类的登革热病毒(DENV-1:登革热病毒1型,DENV-2:登革热病毒2型,DENV-3:登革热病毒3型,DENV-4:登革热病毒4型)。
图4是表示使用图3的板设计，比较实施例1中制备的人树突样细胞(dendritic-like cell)与阳性对象的K562细胞得到的结果的照片。登革热病毒感染实验后通过染色使病毒感染可视化。
图5是图4的板的一部分孔的放大照片。(A)使用单核细胞样细胞的结果的照片(ML:单核养细胞，K562：K562细胞系)。从左侧开始依次为A1、C1、E1、G1孔(上段),和图4的A7、C7、E7、G7孔(下段)的放大照片。(B)使用树突样细胞的评价结果的照片(DC:树突样细胞，K562：K562细胞系)。从左侧开始依次为图4的A5、C5、E5、G5孔(上段),和图4的A7、C7、E7、G7孔(下段)的放大照片。另外，A1是指图4的板的A行第1列。
图6是表示单核细胞样细胞(A)和树突状细胞样细胞(B)的病毒释放量的测定结果的图表。纵轴表示培养上清液中的病毒释放量(表示log10噬菌斑形成单位(PFU)/mL)。横轴从左侧依次显示:登革热病毒1型(DENV-1)(D1),登革热病毒2型(DENV-2)(D2),登革热病毒3型(DENV-3)(D3),登革热病毒4型(DENV-4)(D4)。
图7是表示为了测定制成的永生化人单核细胞(末梢血来源单核细胞：CD14-ML，iPS细胞来源单核细胞：iPS-ML)的物理纯化和膜强度，使用流式细胞仪分析过滤之后的细胞的结果的图。对没有进行通过过滤的纯化的组(未过滤组(Non filter))和使用网孔为12μm的网式过滤器(mesh filter)纯化后的组(12μm)使用流式细胞仪进行了测定。纵轴显示侧向散射光的面积(SSC-A),横轴显示前向散射光(FSC-H)的检测结果。为了使纯化程度可视化，为了方便进行划分，表示区域1、2及其他的存在比。为了确保评价的再现性，通过使区域2的细胞数量存在比在一定的范围由此实现管理。
图8是进行比图3的登革热病毒感染实验的病毒稀释倍率大、病毒浓度低时的感染评估的孔板设计图。基于使用登革热病毒4型(DENV-4)进行的实验来记载。向各孔中加入1*10^5个A到D中记载的细胞，并且根据感染复数(MOI)添加病毒。例如，A1(条纹箭头)为以1个末梢血来源永生化单核细胞(CD14-ML)比0.39(颗粒)的比例感染登革热病毒4型(DENV-4)。
图9是关于登革热病毒噬菌斑实验，进一步增大病毒稀释倍率的孔板设计图。图8中感染评估后，为了使上清液中所包含的病毒量可视化，向Vero细胞接种上清液并培养后进行免疫染色。数字对应于图8。例如，左上的孔是将图8的A1的上清稀释10倍接种的情况。
图10是表示登革热病毒感染实验结果的图。表示在病毒极低浓度存在的情况下，末梢血来源的树突样细胞(CD14-DC:白色箭头)以及iPS细胞来源的树突样细胞(iPS-DC:黑色箭头)均增殖释放病毒。
图11是表示登革热病毒感染实验结果的图。为使用登革热病毒1型，边进行病毒稀释边感染的图。噬菌斑为浅色斑点状(白色箭头)的病毒以大的斑点(黑色箭头)处的浓度而变化，显示两者间病毒存在变异的可能。
具体实施方式
在一个方式中，本发明涉及一种维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法，包括：使上述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤。
在另一个方式中，本发明涉及一种维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法，其包括：
将选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因导入单核细胞的步骤；
从任意上述单核细胞分化诱导树突状细胞的步骤；以及
使上述感染性微生物感染所得到的单核细胞或树突状细胞的步骤。
<单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物>
本说明书中，“单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物”是指在其生存、增殖过程中包括对单核细胞或树突状细胞的感染的病毒、细菌和原虫等。作为此类单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物，包括引起登革热的黄病毒科的病毒，例如登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病毒、墨瑞谷脑炎(Murray Valley encephalitis)病毒、圣路易斯脑炎病毒、寨卡病毒、蜱媒脑炎病毒等。
<单核细胞的制备方法>
本发明中，成为原材料的单核细胞可以通过从末梢血提取的方法、从多能干细胞分化诱导的方法、从成纤维细胞等的其他的体细胞分化诱导的方法等得到。从末梢血提取单核细胞时，分离、制备人末梢血中表达CD14分子的细胞的方法是公知的。例如，使用与人末梢血等量的生理盐水、磷酸缓冲生理盐水或汉克斯(Hanks)缓冲液等平缓地稀释。将稀释后的血液小心地层叠在离心管中的ficoll(注册商标)(GE Healthcare公司)上，以15～30℃、500～1000×g进行20分钟离心分离。将发黄的血浆与透明的ficoll中间白色带状层作为由淋巴细胞、单核细胞构成的末梢血单核细胞(PBMC)组分回收。所回收的末梢血单核细胞组分也可以根据需要进一步清洗后使用。通过从回收的PBMC组分进一步回收表达CD14分子的细胞，能够得到单核细胞。例如，通过使PBMC与结合有抗CD14抗体的固相接触，使单核细胞与该固相结合，清洗去除不结合的细胞，从而能够进行分离回收。例如，作为此类固相使用磁珠的方法是已知的(Dynabeads(注册商标)CD14(赛默飞世尔科技有限公司(ThermoFisher Scientific Inc.))等)。另外，不从末梢血分离PBMC，而通过使末梢血直接与结合有抗CD14抗体的固相接触也能够得到单核细胞。
从多能细胞分化得到单核细胞时，从多能细胞诱导单核细胞的方法是公知的。本说明书中，“多能干细胞”是指具有多能和自我复制能力的细胞。本说明书中，“多能”与多分化能力同义，是指通过分化能够分化成多种组织的细胞的状态。本说明书中的多能包含能够分化成构成生物体的全部种类细胞的状态(分化全能性(totipotency))、能够分化成除胚外组织之外的全部种类细胞的状态(分化多能性(pluripotency))、能够分化为属于一部分细胞谱系的细胞的状态(分化多潜能性(multipotency))、和能够分化为一种细胞的状态(分化单能性(unipotency))。因此，本说明书中的“多能干细胞”包含干细胞、胚胎干细胞(ES)、通过细胞核移植得到的克隆胚来源的胚胎干细胞(“neES细胞”)、生殖干细胞(“GS细胞”)、胚胎生殖细胞(“EG细胞”)、诱导性多能干(iPS)细胞和造血干细胞。某个细胞是否为多能干系细胞，例如，在被测细胞在体外培养系统中形成胚状体(embryoid body)时，或在分化诱导条件下培养(分化处理)之后分化成所希望的细胞时，该细胞能够判定为多能干细胞。多能干细胞的取得方法是公知的，例如，有报告称iPS细胞为通过将三种以上的重编程基因(Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc,L-Myc,Nanog,Lin28,Esrrb,Glisl,E-cadherin,shp53、UTX和Hlfoo等)导入体细胞而得到。
从多能干细胞到单核细胞的分化诱导，例如能够通过使巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素3(IL-3)(参照Fernadndo O.Martinez,Experimental Hematology(2008)；36；1167-1175)，或者，IFN-γ或PMA(Annabelle Grolleau等，J Immunol 1999；162:3491-3497)接触多能干细胞来进行。被分化诱导的单核细胞根据需要可以通过上述方法回收仅表达CD14的细胞进行纯化。
作为从成纤维细胞等其他的体细胞诱导分化单核细胞的方法，可以列举TakahiroSuzuku等,“Reconstruction of Monocyte Transcriptional Regulatory NetworkAccompanies Monocytic Functions in Human Fibroblasts.”PLoS One(2012)doi：10.1371/journal.pone.0033474中记载的方法。
所得到的单核细胞能够通过导入选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因，从而在维持单核细胞功能的同时增加增殖能力。优选的是选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因和HIF1A基因中的至少一种基因与cMYC基因的组合，或者，BMI1基因和BCL2基因或LYL1基因与cMYC基因的组合。向单核细胞导入这些基因可以参考WO2012/043651和日本特开2017-131136号的记载。例如，可以通过使搭载有这些基因的慢病毒载体感染单核细胞来进行导入。
<树突状细胞的制备方法>
树突状细胞从单核细胞的诱导，根据已经报道的(Francoise Chapuis等，Eur JImmunol.(1997)27(2):431-41.；Marc Dauer等，J Immunil.(2003)170(8):4069-4076.；Figdor CG等，Nat Med.(2004)10(5)：475-80；Helmut Jonuleit等，Eur J Immunol.(1997)27(12)：3135-42)，例如，可以通过在200IU/ml的GM-CSF和200IU/ml的IL-4存在的情况下培养单核细胞来进行。
<单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物的感染和培养>
单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物感染单核细胞或树突状细胞可以通过含有单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物的溶液与细胞接触来进行。作为进行感染时和/或感染后培养使用的培养基，例如可以列举IMDM溶液、RPMI溶液、α-MEM溶液、MEM培养基、DMEM溶液。另外，作为添加物可以包含人或牛血浆蛋白组分、胎牛血清和人血清、葡萄糖、D-甘露醇等糖类、氨基酸、腺嘌呤等核酸碱基、磷酸氢钠、α-生育酚、亚油酸、胆固醇、亚硒酸钠、人全铁转铁蛋白、人胰岛素、乙醇胺、2-巯基乙醇、EPO、TPO、碳酸氢钠、甲基纤维素等。另外，根据需要，也可以添加庆大霉素、氨苄西林、青霉素、链霉素等抗生素；无机盐类；HEPES，磷酸缓冲液，醋酸缓冲液等缓冲液。作为具体的例子，可以使用添加了非必须氨基酸的α-MEM溶液(10％胎牛血清)培养基，或者使用在含有次黄嘌呤、HEPES(SIGMA公司)的RPMI1164培养基(SIGMA公司)中添加10％胎牛血清、碳酸氢钠、100单位/ml青霉素、100μg/mL的链霉素的培养基来进行。培养时间可以根据细胞、微生物和培养基的种类等适当设定，例如，可以为24～96小时、36～84小时、72小时。为取得变异体而培养感染细胞时，培养的次数可以为较少的次数，例如，可以为1～5次、1～4次、1～3次、1～2次或1次。其他的培养条件可以按一般的人细胞培养条件来确定，例如可以在37℃、5％CO2的条件下。
<治疗药物筛选方法>
在另一个方式中，本发明涉及一种鉴定单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的传染病治疗药物的方法，其包括：
在被测药物存在的情况下，使上述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；
测定上述单核细胞或树突状细胞中的上述感染性微生物的感染水平的步骤；
根据所测定的上述感染性微生物的感染情况，判定该被测药物是否具有上述传染病治疗效果的步骤。
其中，测定上述感染性微生物的感染水平与上述被测药物不存在的情况下使上述感染性微生物感染上述细胞的对照的感染水平比较，前者少时，判定该被测药物具有上述传染病治疗效果。
上述感染微生物感染水平的测定可以通过使用Cell-ELISA、免疫染色、噬菌斑形成法或PCR法测定培养结束后的上清液中所包含的上述微生物的感染滴度来进行。或者，通过固定培养结束后的感染细胞并进行免疫染色或Cell ELISA来测定。
通过Cell-ELISA或免疫染色进行检测单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物对单核细胞或树突状细胞的感染水平时，本发明的筛选方法可以包括将感染后的单核细胞或树突状细胞固定化的步骤；以及使对该单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物特异性的抗体接触被固定化的细胞的步骤。例如，本说明书中，Cell-ELISA法可以包括：使特异性结合于该微生物的抗体(初级抗体)和被固定化的细胞接触的步骤；除去(洗涤)未结合的抗体的步骤；使能与该初级抗体结合的标记化抗体(次级抗体)和与初级抗体接触后的固定化的细胞接触的步骤；除去(洗涤)未结合的抗体的步骤；测定结合于固定化的细胞的次级抗体的标记水平(强度、区域、数量等)的步骤；根据测定的标记水平计算出感染细胞的微生物的感染水平的步骤。或者，本说明书中，免疫染色法可以包括：使能够特异性结合该微生物的标记化抗体与固定化的细胞接触的步骤；除去(洗涤)未结合的抗体的步骤；测定结合于固定化的细胞的上述抗体的标记水平(强度、区域、数量等)的步骤；根据测定的标记水平计算出感染细胞的微生物的感染水平的步骤。被用于标记化抗体的标记可以使用放射性标记、酶标记、荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、金属、近红外光标记等能够检测的标记。
通过噬菌斑形成法进行检测单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物对单核细胞或树突状细胞的感染水平时，可以包括：将感染后的单核细胞或树突状细胞的培养上清液或从细胞破碎物回收的含有微生物的液体与已知该微生物能够感染的细胞系(例如K562细胞系、Vero细胞系或BHK细胞系等)混合，在培养基中添加混合后的细胞/微生物液体，培养12小时～10天的步骤；将培养后的感染细胞固定化的步骤；以及使对该单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物特异性的抗体与固定化的细胞接触的步骤。对微生物特异性的抗体对固定化的细胞的接触具体可以通过上述Cell-ELISA法或免疫染色法进行。
通过PCR法进行检测单核细胞和树突状细胞介导的感染性微生物对单核细胞或树突状细胞的感染水平时，例如，可以通过将感染后的单核细胞或树突状细胞的培养上清液或从细胞破碎物回收的含有微生物的液体作为样本实施实时PCR法来进行。
“感染水平”只要是能够反映感染微生物数量的数值则没有特别的限制，例如，可以使用PFU、PFU/mL、感染区域面积、微生物数量(个)或微生物浓度(个/mL)等。“上述被测药物不存在的情况下使上述感染性微生物感染上述细胞的对照的感染水平”可以通过与被测药物存在情况同时地，作为对照实验，在被测药物不存在的情况下，使上述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；以及，测定上述单核细胞或树突状细胞中的上述感染性微生物的感染水平的步骤来得到。或者，也可以从预先或另外进行的对照试验得到对照感染水平。优选被比较的2个水平为通过在相同条件下进行的实验得到的水平。被测药物存在的情况下所测定的感染水平比上述被测药物不存在的情况下所测定的感染水平小时，判定该被测药物具有上述传染病的治疗效果。
<变异株制作方法>
在另一个方式中，本发明涉及一种制作单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物变异株的方法，其包括：
使上述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或者，从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；
培养感染的单核细胞或上述树突状细胞来增殖上述感染性微生物的步骤；
从增殖的上述感染性微生物中分离上述变异株的步骤。
微生物通过增殖被导入一定概率的变异是已知的。由于通过本发明能够在体外使单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物在接近生物体内的环境下有效地增殖，因此能够使在体内发生的变异近似地在体外导入。培养可以进行任意时间直到产生变异株，培养过程中可以根据需要感染新的细胞和/或更换培养基。变异株的分离可以通过感染的微生物的分离和确定其序列来进行。即能够通过适当稀释含有培养任意时间后的微生物的溶液，使其感染已知该微生物会感染的细胞系(例如，Vero细胞系和BHK细胞等)，形成单一噬菌斑，来分离微生物。单一噬菌斑的形成可以采用与上述噬菌斑形成法相同的方法进行。解析分离后的微生物的基因，并且与感染时的原微生物的基因序列比较，原微生物的基因序列与分离后的微生物的基因序列不同时，能够鉴定该分离后的微生物为变异株。基因序列的解析可以使用市售的DNA测序仪和下一代测序仪(NGS)进行。
对变异株没有特别的限定，例如可以列举能够作为致病性弱的活疫苗使用的变异株和耐药变异株。
<疫苗制造方法>
在另一个方式中，本发明涉及一种制造单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的疫苗的方法，其包括：
使上述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；
培养感染的单核细胞或上述树突状细胞使上述感染性微生物增殖的步骤；
回收增殖的上述感染性微生物的步骤。
增殖的上述感染性微生物可以从培养上清液中回收，也可以从细胞破碎后的破碎液中回收。回收的微生物根据需要适当纯化后使用。纯化方法可以使用密度梯度离心分离、超滤、亲和色谱法(affinity chromatography)等。微生物为致病性被减弱化的株时，得到的微生物能够直接作为活体疫苗使用。或者，上述微生物能够作为灭活疫苗(包含类毒素)。作为灭活疫苗使用时，本发明的方法还可以包括裂解所回收的上述感染性微生物的步骤；以及根据需要从裂解物中回收抗原性部分的步骤；或者，提取上述感染性微生物中的毒素并进行灭活的步骤。
此外，本发明包含通过上述方法制造的疫苗。进一步地，本发明还包括：预防上述微生物感染的方法，包括给可能感染单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的对象投予该疫苗的步骤；和，治疗上述微生物传染病的方法，包括给感染单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的对象投予该疫苗的步骤。疫苗制剂的制造方法和投予方法可以使用该技术领域公知的方法适当进行。
<感染微生物分离方法>
在另一个方式中，本发明涉及一种从来自单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的传染病患者血液中分离该感染性微生物的方法，包括：
使导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从上述单核细胞分化诱导的树突状细胞与来自上述患者的血液接触的步骤；
培养感染的细胞的步骤；
通过检测和/或鉴定培养细胞中的微生物而确定感染性微生物的步骤。
感染和培养可以按照上述方法进行。检测和/或鉴定培养细胞中的微生物可以为根据目标微生物而通过在本技术领域中广泛知晓的方法进行，例如可以通过利用PCR的方法和利用抗体的方法进行。
在本说明书全文中，单核细胞或树突状细胞为哺乳动物的单核细胞或树突状细胞，优选为人单核细胞或人树突状状细胞。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于以下实施例。另外，在本申请全文中所引用地全部文件通过参考直接并入本申请。另外，本实施例中使用的登革热病毒、感染实验用培养基和登革热病毒如下所示。
(登革热病毒)
使用4种血清型的登革热病毒进行感染评价。使用的株为望月株(Mochizukistrain)(登革热1型病毒)、NGC株(登革热2型病毒)、H87株(登革热3型病毒)、H241株(登革热4型病毒)，均为原型株。基于公知的方法，各病毒使用感染Vero细胞的培养液中所释放的上清液。
(感染实验用培养基)
作为评价培养基，使用向包含次黄嘌呤、HEPES(SIGMA公司)的RPM1640培养基(SIGMA公司)中添加碳酸氢钠(最终浓度0.225％)、100单位/ml青霉素、100μg/ml的链霉素的培养基。
(实施例1)人末梢血来源永生化单核细胞(CD14-ML)的制作和树突状细胞的制作(人末梢血来源永生化单核细胞的制作)
人末梢血来源永生化单核细胞参考已经报告的(WO2012/043651和日本特开2017-131136)制作。详细而言，从人末梢血取出CD14阳性组分,导入作为小鼠永生化造血干细胞被报告的基因(Myc、Myb、Hob8、TLX1、E2A-pbx1、MLL、Ljx2、RARA、Hoxa9、Notch1、v-raf/v-myc、MYST3-NCOA2、Evi1、HOXB6、HOSB4、β-catenin、Id1)，或人永生化单核细胞报告中的基因来制作。永生化单核细胞在含有20％FBS、50ng/ml M-CSF和50ng/ml GM-CSF的α-MEM培养基中培养，从开始培养4～5周后获得增殖性细胞，使用市售的细胞保存液在液氮下保存。
(制备得到的细胞的确认)
为确认制备得到的细胞为单核细胞样细胞，在感染评价前进行通过浓缩对颜色的评价、表面标志物的测定、通过吉姆萨(Giemsa)染色等的形态观察等。通过浓缩对颜色的评价通过用离心管回收细胞时目视的细胞颜色进行测量。表面标志物测定用CD11抗体、CD14抗体(均为Biolegend公司)使用Sysmex公司的流式细胞仪CyFlowspace进行。另外，关于染色，用市售的染色液(Sigma公司)，进行根据公知的染色法的吉姆萨染色或梅-吉(MayGiemsa)染色，通过高倍显微镜(400～1000倍)进行测量。
(由永生化单核细胞的树突状细胞的制备)
将保存的永生化单核细胞系在α-MEM培养基(含有20％FBS、50ng/ml M-CSF和50ng/ml GM-CSF)中，在37℃、5％CO2的培养箱内培养，每3天更换一次培养基，来维持、制备。将永生化单核细胞在50ng/ml M-CSF、50ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4的存在下培养3天，使其分化成树突状细胞来制备树突状细胞，用于细胞评价。
图1中显示了确认通过实施例1的方法制备的人单核细胞样细胞的性质的结果。此结果表明所得到的人单核细胞样细胞是表达单核细胞系细胞特异性的表面标志物(CD11和CD14)的细胞。由于多种CD14的表达量混在一起，显示了不仅包含经典单核细胞，而且包含中间单核细胞、非经典单核系细胞。
图2中显示了实施例1的人单核细胞样细胞群的吉姆萨(Giemsa)染色图。通过吉姆萨染色图，在细胞膜的形状上确认到突起部分，表明包含通过局部物理刺激等正在进行树突状细胞转化的细胞。
(实施例2)人诱导性多能干细胞来源的永生化单核细胞(iPS-ML)的制作
人诱导性多能干细胞(iPS)细胞来源的人永生化单核细胞参考已经报告的(WO2012/043651和日本特开2017-131136)制作。详细而言，将未分化的iPS细胞在将层粘连蛋白511(Laminin-511)等基底胶(Matrigel)预先作为基底膜涂布后进行接种，使用α-MEM培养基(含有20％FBS)开始分化诱导培养。之后，每3天更换1次α-MEM培养基(含有20％FBS)继续培养。从开始分化诱导18天后，使用胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA(乙二胺四乙酸)-胶原酶(collagenase)液处理(37℃，60分钟)细胞，使其裂解、回收，通过移液(pipetting)操作制作细胞悬浮液。接着，将来自一个直径10cm的培养皿中的细胞悬浮在10ml的DMEM(含有10％FBS)培养基中，并接种在两个没有饲养细胞(Feeder cell)且没有明胶涂层(Gelatincoat)的直径10cm的培养皿中。3小时后，回收没有附着在培养皿上的细胞，使其通过100微米的网孔(BD Falcon公司制造细胞过滤器)，得到了除去细胞凝集块的细胞悬浮液。
将上述得到的细胞悬浮液在α-MEM培养基(含有20％FBS、50ng/ml M-CSF和100ng/ml GM-CSF)中进行悬浮培养。之后，经过3～9天左右出现悬浮性或弱附着性的细胞，可以观察到细胞数量渐渐增加。回收该悬浮细胞(iPS-MC)，并使用流式细胞仪确认了白细胞标记分子CD45和髓(myeloid)系细胞标记CD11b或CD33的表达。
向上述得到的悬浮细胞(iPS-MC)导入作为小鼠永生化造血干细胞报告的基因(Myc、Myb、Hob8、TLX1、E2A-pbx1、MLL、Ljx2、RARA、Hoxa9、Notch1、v-raf/v-myc、MYST3-NCOA2、Evi1、HOXB6、HOSB4、β-catenin、Id1)或人永生化单核细胞报告中的基因从而制作人诱导性多能干细胞来源永生化单核细胞。该永生化单核细胞系在含有20％FBS、50ng/ml M-CSF和50ng/ml GM-CSF的α-MEM培养基中培养，从开始培养4～5周后获得增殖性细胞，使用市售细胞保存液在液氮下保存。
(实施例3)制备的人永生化单核细胞样细胞的过滤纯化
对制备的人末梢血来源永生化单核细胞(CD14-ML)和人多能干细胞来源永生化细胞(iPS-ML)进行制品供给时评价两细胞的物理性质。即，在制品供给时，为用于在传染病研究中一次1000万至1亿个细胞左右的评价，需要培养大量细胞。为了保证评价的再现性，希望将批次之间的误差控制在最小限度。在这种数量的控制上，估计物理的过滤纯化要比流式细胞仪等在成本和操作时间方面具有优势。因此，将制备的人永生化单核细胞样细胞群回收之后，使其在培养液中悬浮，并使其通过预先浸有液体的网式过滤器(mesh filter)(12μm，株式会社村田制作所制作)。回收通过的细胞群并进行离心分离，使其统一到一定的细胞尺寸。
图7中作为通过实施例1和实施例2的方法制备的人永生化单核细胞样细胞群的物理性质，显示了过滤纯化后的使用流式细胞仪的测量结果。表明由实施例1制作的人末梢血来源的单核细胞(CD14-ML)通过过滤纯化等能够进行纯化。另一方面表明，人诱导性多能干(iPS)细胞来源永生化单核细胞(iPS-ML)虽然测定过滤器过滤后的细胞能够以一定的尺寸生成，但是由于细胞的切割等使细胞死亡率增加。由此表明人末梢血来源的永生化单核细胞样细胞(CD14-ML)比人多能干细胞来源永生化单核细胞样细胞(iPS-ML)具有更强的细胞膜或对应激耐受更强。
(实施例4)制备的人单核细胞样细胞的移送
人单核细胞和树突样细胞群的制备设备和感染评价设备最好在同一个设备内，但是有时也需要移送。向感染评价设备移送制备的细胞群时，在以下条件下移送。在要开始移送前，将根据实施例1和实施例2的记载制备的人永生化单核细胞或树突状细胞各1×107个左右移至低吸附涂层的T-25培养瓶，加满培养基。在密闭状态下将容器内包于生物袋后，装入TACPack(能长时间维持一定温度的恒温输送用包装，玉井化成制造)移送。通过该箱的恒温剂在36℃左右进行细胞移送。另外，在不密闭使用滤帽时，将厌氧产气袋(AnaeroPack,三菱瓦斯化学株式会社制造)一起封入生物袋内控制O2和CO2浓度来移送。移送时间为24小时左右。移送后(约24小时后)细胞存活率为70％以上，没有确认到细胞的状态变化。
(实施例5)使用人末梢血来源永生化单核细胞(CD14-ML)和树突状细胞的登革热病毒感染试验
到达移送地点后，快速使用胰蛋白酶剥离人末梢血来源永生化单核细胞(CD14-ML)或树突状细胞，并从T-25培养瓶转移到离心管中，评价中使用所回收的细胞。在不立即使用时，转移到100mm培养皿等中，每隔3天更换一次培养基。
根据图3中显示的板设计，按照最终细胞数量为1×105个/孔，将人末梢血来源永生化单核细胞(CD14-ML)(1×107个)接种到96孔板上。树突状细胞的孔中为含有IL-4的α-MEM培养基(含有20％FBS、50ng/ml M-CSF、50ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4)，单核细胞的孔中为不含IL-4的α-MEM培养基(含有20％FBS、50ng/ml M-CSF和50ng/ml GM-CSF)，在37℃、5％CO2的培养箱内培养3天。评价中使用所得到的细胞。
根据图3中显示的板设计，将制备得到的各血清型的登革热病毒与96孔板中的人末梢血来源永生化单核细胞(CD14-ML)或树突状细胞(1×105个/孔)混合进行感染，在37℃、5％CO2条件下在评价培养基中培养。72小时后，回收培养上清液，根据噬菌斑测定法测量上清液中所含有的子代病毒的感染滴度。具体而言，接种病毒稀释液至Vero细胞，在37℃吸附1小时后，在添加了1％甲基纤维素(Methyl cellulose)的MEM中，37℃培养3天。对培养后的细胞使用丙酮/甲醇固定并进行免疫染色。免疫染色根据公知的方法，将小鼠来源的黄病毒交叉单克隆抗体(D1-4G2-4-15(ATCC(注册商标)HB-112))作为初级抗体(室温30分钟)，依次与次级抗体中的标记生物素的抗小鼠IgG抗体(室温30分钟)、亲和素-生物素复合物(室温30分钟)、VIP底物(室温30分钟)反应。在显微镜下测量成为免疫阳性的感染细胞数量来算出病毒滴度。
另外，用丙酮/甲醇来固定培养72小时后的感染人末梢血来源永生化单核细胞(CD14-ML)细胞并进行免疫染色。免疫染色根据公知的方法，将小鼠来源的黄病毒交叉单克隆抗体(D1-4G2-4-15(ATCC(注册商标)HB-112))作为初级抗体(室温30分钟)，依次与次级抗体中的标记生物素的抗小鼠IgG抗体(室温30分钟)、亲和素-生物素复合物(室温30分钟)、VIP底物(室温30分钟)反应。在显微镜下观察、评价成为免疫阳性的感染细胞。
图4中显示了染色后的各孔的细胞。如果确认到病毒感染则染色较深，判明了人树突样细胞(1～6列：白色箭头)与阳性对照(7～12列：黑色箭头)比较即使是低浓度病毒也能很好地染色。因此表明，从通过本实施例1记载的方法制作的具有增殖能力的单核细胞诱导的树突状细胞受到登革热病毒感染。可以认为在这样的实验条件下通过添加候选药物，能够评价抑制登革热病毒感染能力。如图5(A)中显示的情况可知，关于登革热病毒1型，单核细胞样细胞(A1)与用相同浓度的病毒致敏的对照(A7)相比较确认到更强感染，该结果表明其更适合于药剂的定量评价。
图6显示了因登革热病毒致敏的病毒释放量。可知树突状细胞的病毒释放量比阳性对照的K562细胞多，因此适合于使用更接近人的细胞的病毒增殖和变异株的获得。
(实施例6)使用人单核细胞样细胞和树突状细胞的登革热病毒感染试验2
人末梢血来源永生化单核细胞(CD14-ML)和人多能干细胞来源永生化单核细胞(iPS-ML)到达移送地点后，快速使用胰蛋白酶等剥离，并从T-25培养瓶转移到离心管中，回收后，转移到100mm培养皿等中，每隔3天更换一次培养基。
根据图8所示的板设计，按照最终细胞数量为1×105个/孔的方式，将人单核细胞样细胞(1×107个)接种到96孔板上。以单核细胞样细胞的形态直接评价时，使用α-MEM培养基(20％FBS、50ng/ml M-CSF、50ng/ml GM-CSF)，以树突状细胞的形态评价时，使用含有IL-4的α-MEM培养基(含有20％FBS、50ng/ml M-CSF、50ng/ml GM-CSF和20ng/ml IL-4)，在37℃、5％CO2的培养箱内培养3天。将3天后得到的细胞用于评价。
根据图8所示的板设计，将调整了MOI浓度的各血清型的登革热病毒与96孔板中的人树突样细胞(1×105个/孔)混合使其感染，在37℃、5％CO2条件下在评价培养基中培养。72小时后回收上清液，根据噬菌斑测定法测量上清液中所包含的子代病毒的感染滴度。具体而言，通过图9中所示的板设计根据稀释率接种图8的每个孔的上清液(被认为病毒增殖而被释放)至Vero细胞，在37℃吸附1小时后，在添加1％甲基纤维素(Methyl cellulose)的MEM中，37℃培养3天。对培养后的细胞使用丙酮/甲醇固定并进行免疫染色。免疫染色根据公知的方法，将小鼠来源的黄病毒交叉单克隆抗体(D1-4G2-4-15(ATCC(注册商标)HB-112))作为初级抗体(室温30分钟)，依次与次级抗体中的标记生物素的抗小鼠IgG抗体(室温30分钟)、亲和素-生物素复合物(室温30分钟)、VIP底物(室温30分钟)反应。
图10中显示了使用登革热病毒4型(DENV-4)的人末梢血来源的树突样细胞(CD14-DC)和人诱导性多能干(iPS)细胞来源的树突样细胞(iPS-DC)的噬菌斑测定结果。登革热病毒侵入人树突样细胞内增殖，释放子代病毒，回收时的上清液内含有释放出的子代病毒。为此，在Vero细胞上二次培养后染色。可知与一般所使用的K562细胞和Vero细胞的病毒检测极限比较，人末梢血来源的树突样细胞(CD14-DC)和人诱导性多能干(iPS)细胞来源树突样细胞(iPS-DC)即使为极低浓度(白色箭头和黑色箭头的浓度。灵敏度为现有细胞的100被以上，根据病毒的种类可以为1000倍以上)的病毒也能够增殖、检测。表明通过在如此实验条件下评价，能够高灵敏度地检查和分离病毒，甚至对其他以黄病毒为代表的以前病毒浓度低而难于培养的病毒提供了能够培养的环境，由此能够能评价药剂。
图11中显示了使用登革热病毒1型(DENV-1)的人末梢血来源的树突样细胞(CD14-DC)的噬菌斑测定结果。噬菌斑的形成反应了病毒的状态。本试验中确认到了小斑点(白色箭头)和大斑点(黑色箭头)。本结果显示了病毒状态的变化，显示仅一次感染试验就可能发生病毒变异。表明对于以前难以引起变异而疫苗候选株的构建、开发制作需要长时间的问题，能够提供新的研究开发方法(疫苗株的构建、开发和制作方法)。

Claims (15)

1.一种维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法，其包括：
使所述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从所述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；以及，
培养感染的细胞的步骤。
2.一种维持培养单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的方法，其包括：
将选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因导入单核细胞的步骤；
从任意所述单核细胞分化诱导树突状细胞的步骤；
使所述感染性微生物感染所得到的单核细胞或树突状细胞的步骤；以及，
培养感染的细胞的步骤。
3.一种鉴定单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的传染病治疗药物的方法，其包括：
在被测药物存在的情况下，使所述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从所述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；以及，
测定所述单核细胞或树突状细胞中的所述感染性微生物的感染水平的步骤；
根据测定得到的所述感染性微生物的感染情况，判定该被测药物是否具有所述传染病治疗效果的步骤；
其中，测定得到的所述感染性微生物的感染水平与所述被测药物不存在的情况下使所述感染性微生物感染所述细胞的对照的感染水平比较，前者少时，判定该被测药物具有所述传染病治疗效果。
4.一种制作单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的变异株的方法，其包括：
使所述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从所述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；以及，
培养感染的单核细胞或所述树突状细胞来增殖所述感染性微生物的步骤；
从增殖的所述感染性微生物中分离变异株的步骤。
5.一种制造单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的疫苗的方法，其包括：
使所述感染性微生物感染导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从所述单核细胞分化诱导的树突状细胞的步骤；
培养感染的单核细胞或所述树突状细胞来增殖所述感染性微生物的步骤；
回收增殖的所述感染性微生物的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，还包括灭活所回收的所述感染性微生物的步骤。
7.一种从来自单核细胞或树突状细胞介导的感染性微生物的传染病患者的血液中分离该感染性微生物的方法，其包括：
使导入了选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因与cMYC基因的单核细胞，或从所述单核细胞分化诱导的树突状细胞与来自所述患者的血液接触的步骤；
培养感染的细胞的步骤；
通过检测和/或鉴定培养细胞中的微生物而确定感染性微生物的步骤。
8.根据权利要求1～7中任意一项所述的方法，其中，所述单核细胞是通过分化诱导人多能干细胞或人造血干细胞得到的细胞，或者是通过从人末梢血分离得到的细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述人多能干细胞是iPS细胞。
10.根据权利要求1～7中任意一项所述的方法，其中，还包括通过分化诱导人多能干细胞或人造血干细胞制备单核细胞的步骤，或通过从人末梢血分离来制备单核细胞的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述人多能干细胞是iPS细胞。
12.根据权利要求1～11中任意一项所述的方法，其中，所述感染性微生物是登革热病毒。
13.根据权利要求1～12中任意一项所述的方法，其中，培养时间为24～96小时。
14.根据权利要求4所述的方法，其中，培养次数为1～5次。
15.根据权利要求1～14中任意一项所述的方法，其中，选自BMI1基因、EZH2基因、MDM2基因、MDM4基因、HIF1A基因、BCL2基因以及LYL1基因中的至少一种基因为BMI1基因和EZH2基因或LYL1基因。
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