CN105793416A - 永生化的猪肺泡巨噬细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及永生化的猪肺泡巨噬细胞(PAM)，包含此类PAM的细胞培养物，用于永生化PAM的方法，在永生化的PAM上复制PRRS病毒的方法，和用于制备包含PRRSV的疫苗的方法。
Description
本发明涉及永生化的猪肺泡巨噬细胞(PAM)，包含此类PAM的细胞培养物，用于永生化PAM的方法，在永生化的PAM上复制PRRS病毒的方法，和用于制备包含PRRSV的疫苗的方法。
猪呼吸和繁殖综合征病毒(PRRSV)是目前为止经济上最重要的动脉炎病毒，影响全世界的猪养殖产业。该病毒的感染导致断奶至肥育猪的缓慢生长、降低的饲料效率、厌食和发热，妊娠母猪的流产和仔猪的呼吸困难。仅在美国，每年与PRRSV感染相关的损失在2005年估计为5.6亿美元左右，在2011年估计为6.64亿美元左右。PRRSV感染列为养猪业健康的第一挑战。考虑到2006年在东南亚出现PRRSV的高强毒株和亚洲养猪业是世界上最大的事实，可以安全地假定，在世界的这部分的损失甚至相当高于对于欧洲和美国报道的损失。
PRRSV仍然是对养猪业的主要威胁，因为相关疾病已被证明难以控制，尽管可用针对PRRSV的活减毒和灭活疫苗。
对于PRRSV疫苗生产，活减毒或灭活的病毒必须在易感细胞上复制。PRRSV的繁殖中面对的问题之一是病毒的高度受限细胞嗜性。它主要感染原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)。此类PAM难以获得：它们通常通过通常6-12周龄的仔猪的肺灌洗获得(Wensvoort, G.等人, The Veterinary Quarterly 13:121-130 (1991))。该方法是麻烦的，昂贵的，并导致具有高度批次间不一致性的批次。此外，原代PAM只能在细胞培养中保持非常有限的时间。因此，尽管原代PAM非常适合于使PRRSV生长，但它们只用于例如实验感染研究中和用于制备实验疫苗。在原代PAM上生产商业疫苗在经济上是不可行的。
由于该问题，科学家们已经试图寻找易感PRRSV的其他细胞或更好的细胞系。仅已经鉴定了三种细胞系：MA104猴肾细胞系和MA104的两种衍生物：MARC-145和CL2621细胞(Kumar Shanmukhappa等人, Virology Journal 2007, 4: 62)。这些细胞系目前商业上用于繁殖PRRSV。
尽管可能使PRRSV在这些细胞系上生长至相对高滴度，但此类甚至不是猪细胞系的非PAM具有缺点：由于它们不是PRRSV的天然宿主，所以PRRSV必须在可以获得高滴度之前适应这些细胞系。作为结果，MA104或MARC-145或CL2621都不是用于繁殖新发现的野生毒株的第一选择。为了挑取新的PRRSV野生型分离株，天然宿主细胞PAM会合适得多。
已经考虑，永生化的PAM细胞系可以为上述问题提供解决方案。
永生化的PAM细胞系在原则上可以不限于它们的传代水平地生长 ，并且它们是用于PRRSV的最合适的宿主细胞。
已经进行了几种尝试以开发永生化的PAM细胞系。
PCT专利申请WO2008/089094公开了从猪胚胎获得的两种自然的故意未转化的PAM突变体。这些细胞显示永生化的PAM细胞系行为，并且它们能够使PRRSV生长。所述方法的缺点是，它是结果高度不确定的基于试验和误差的方法。具体地，使用该方法分离的任何胎细胞系是否的确以稳定的方式永生化或仅具有稍微延长的寿命或能够相比于原代PAM仅多分裂几次是有问题的。该方法因此对于需要永生化的PAM细胞系的本领域技术人员是有吸引力的。
Jian-Jun Jia的论文(2009年8月, Universite de Montreal,
Montreal, Canada)描述了据称易感PRRSV的猪肺细胞，但该细胞系不是肺泡细胞系，而是上皮细胞系，并后来进一步发现不是猪来源的(D.W.
Silversides等人, Journal of virology 84: 5454-5455
(2010))。
H.M. Weingartl等人于J. Virol. Meth. 104:203-216 (2002)中描述了制备真正的永生化PAM细胞系的进一步尝试。Weingartl描述了用携带新霉素抗性和SV40 T抗原的基因的质粒pSV3neo转染原代PAM。这导致三种髓系(单核细胞/巨噬细胞)永生化的细胞系的分离。但是，该实验的结果竟然是谜一样的：在任何这些细胞系中都没有检测到SV40
T抗原，此外，所述细胞系无一支持PRRSV复制。因此，Weingartl得出结论，另一种机制，不是SV40 T抗原的存在，可能是永生化的原因。
该失败后，使用SV40
T抗原的途径被留作替代方法。
Yoo Jin Lee等人发现，Weingartl开发的细胞系不表达可检测水平的130 kDa细胞表面糖蛋白CD163(其已知为PRRSV的细胞受体)(J. Virol. Meth. 163: 410-415 (2010))。因此，Yoo Jin Lee还用逆转录病毒LTR启动子控制下的克隆入逆转录病毒载体的CD163基因转染Weingartl的PAM细胞系之一。这的确导致形成能够使PRRSV生长的永生化的PAM细胞系。
Yoo Jin Lee所属的研究组的Mingeun Sagong
在2012年得出结论，原代细胞如PAM-特异性标志物(例如CD163)的原始特性的损失，可能是由于SV40T抗原的转化(J. of Virological Methods 179:
26-32 (2012))。出于该原因，Sagong根据替代路线以固定化PAM。该途径包括在PAM中使用逆转录病毒载体表达人端粒酶逆转录酶(hTERT)以恢复端粒酶活性。端粒酶活性的恢复避免端粒DNA的损失，因此避免细胞的复制性衰老。
Mingeun Sagong得出结论，它们的数据揭示，与SV40 T抗原转化的PAM细胞相反，hTERT永生能够使细胞可靠代表它们的亲代细胞的表型。
由上述推断，为了以诱导永生化的目的成功地转化PAM，无论为了避免衰老而遵循的途径，应当避免使用SV40
T抗原，并且必须使用逆转录病毒或至少大逆转录病毒序列以便将DNA插入PAM的基因组。使用逆转录病毒或至少大逆转录病毒序列用于转化细胞的严重缺点在于，在所有情况下，大末端重复(LTR)序列存在于用于转化细胞的DNA中。
LTR是包含逆转录病毒基因表达所需的所有信号的逆转录病毒元件：增强子、启动子、转录起始、转录终止和多聚腺苷酸化信号。
这些LTR被怀疑具有致癌作用。这是由于它们已知顺式激活其他细胞基因的事实和它们可与其他逆转录病毒序列重组于细胞基因组中的事实(Mosier,
D.E., Applied Biosafety 9: 68-75 (2004))。
尽管如此，用包含LTR序列的逆转录病毒DNA转化细胞和避免使用SV40 T抗原似乎是获得永生化PAM的唯一途径。
令人惊讶地，现在发现，可能成功地获得永生化且仍易感PRRSV、然而不含逆转录病毒长末端重复DNA 的PAM。
可以出乎意料地通过用包含SV40 T抗原的DNA转染、但现在与使用转座子作为获得细胞基因组中的稳定整合的方式组合而获得此类根据本发明的永久化的PAM。
转座子可以被视为天然的DNA转移媒介物，其与整合性病毒类似，能够有效基因组插入。
出于未知原因，如果使用包含编码SV40 T抗原的基因和转座子的DNA分子转化细胞，则可以出乎意料地避免如上所述有或无逆转录病毒DNA的SV40T抗原的负面影响。
原则上，转座子在整合于基因组中之后保持稳定存在于细胞基因组中。因此，优选地，根据本发明的永生化的PAM包含转座子。
对于本发明的目的，永生化的细胞系是来自多细胞生物体的细胞群体(在本情况下为PAM)，其通常不会无限增殖，但由于突变，已逃避正常细胞衰老并反而可以保持经历分裂。此类细胞已逃避持续只有有限数量的分裂周期的正常生长限制。
用于制备根据本发明的永生化的PAM的方法基本上包括下列步骤：
a)从猪受试者获得含有细胞的支气管肺泡灌洗样品的步骤。一般而言Wensvoort, G等人，1991年(参见上文)、Weingartl,
H.M.等人(参见上文)和其他人已经描述了此类步骤，并且它们仍然是获得PAM的优选方式。
b)从所述样品分离细胞组分的步骤。该步骤也是本领域中公知的，并且也一般而言由Wensvoort和Weingartl描述，并且它通常是通过以低速离心肺灌洗材料而进行，
c)用包含转座子和包含合适启动子控制下的编码SV40T抗原的基因的DNA分子转染所述细胞组分的步骤。
转染可以通过本领域中已知的许多方式进行。用于转染的商业试剂盒目前可通过尤其是 Bio-Rad (Life
Science (Research, Education, Process Separations, Food Science), Life Science
Research, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547, USA)和Invitrogen
(Life Technology, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072, USA)得到。常用的基于试剂的转染方法包括使用脂质、磷酸钙、阳离子聚合物、DEAE-葡聚糖、活化的树枝状聚合物和磁珠。基于仪器的方法包括电穿孔和显微注射。
包含转座子和包含合适启动子控制下的编码SV40T抗原的基因的DNA分子可以例如是包含合适启动子控制下的编码SV40T抗原的基因的的质粒。该质粒，当其用于转染步骤时，可以是环状或线性形式。
转座子作为此的用途是本领域中公知的。Ivics, Z.和Izsvak Z.的论文广泛综述了转座子及其用途，并且提供了转座子的作用机制的见解(Mobile DNA 1:25-39 (2010))。
Deepika Ahuja等人关于SV40 T抗原的综述论文提供了该蛋白的作用机制的见解(Oncogene 24:7729-7745 (2005))。基本上，SV40
T抗原抑制p53和肿瘤抑制基因的Rb-家族。是T抗原的活性被认为引起细胞向其永生化特征的转化。
用于表达SV40T抗原的大量合适的启动子是本领域中已知的，其被公认用于它们的有效水平的表达。它们包括经典启动子如(人)巨细胞病毒立即早期启动子(Seed, B.等人, Nature329, 840-842, 1987; Fynan,
E.F.等人, PNAS90, 11478-11482,1993;
Ulmer, J.B.等人, Science259, 1745-1748, 1993)、用于表达BoHV-1的gD的巨细胞病毒增强子-启动子(Donofrio G.,等人,
Clinical and Vaccine Immunology 13: 1246-1254, (2006))、小鼠巨细胞病毒立即早期(MCMVie1)启动子、小鼠巨细胞病毒早期(MCMVe1)启动子、SV40立即早期启动子(Sprague J.等人, J. Virology45, 773 ,1983)、SV-40启动子(Berman, P.W.等人, Science, 222, 524-527, 1983)、金属硫蛋白启动子(Brinster, R.L.等人, Nature296, 39-42, 1982)、热休克启动子(Voellmy等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4949-53, 1985)、Ad2的主要晚期启动子和β-肌动蛋白启动子(Tang等人, Nature356,
152-154, 1992)。
优选的启动子是CAG启动子。(Miyazaki, J; Takaki, S; Araki, K; Tashiro, F; Tominaga, A; Takatsu, K; Yamamura, K.,Gene 79 (2):
269–77 (1989), and Niwa,
H; Yamamura, K; Miyazaki, J,.Gene 108 (2): 193–9 (1991).)。
d)选择能够持续增殖的细胞的步骤。
能够持续增殖的PAM细胞是已经培养至少5个细胞周期的细胞。细胞周期，或细胞分裂周期，是细胞中发生的导致其分裂和复制(细胞复制)的事件系列。能够持续增殖的细胞的选择由于以下原因是非常简单的过程：原代PAM几乎不能或不能在它们的天然环境(猪肺)之外分裂。如从图2前2柱(未加入M-CSF)可见，肺灌洗和分离后的活原代PAM细胞的数量随着时间减少。在以200000个PAM细胞开始的培养中，只有约一半的细胞在3天后仍然活着。该量进一步随着时间稳定减少。
这意味着，如果细胞数量增加，这必须是由于这样的事实，即一个或多个细胞已被包含转座子的DNA分子成功转染，并且编码SV40T抗原的基因插入细胞基因组。因此，基本上该过程是自我选择：合适的细胞生长培养基中成功转化的PAM的维持将自动导致成功转化的细胞的复制，而非永生化的细胞将停止分裂并死去。合适的细胞生长培养基是本领域中已知的，并且一般而言描述于实施例部分。它们还一般而言由Wensvoort, G.等人, 1991(参见上文)、Weingartl, H.M.等人(参见上文)描述。关于细胞培养条件的进一步指导可见实施例中。
因此，本发明的一个实施方案涉及用于制备永生化的PAM的方法，其中所述方法包括以下步骤
a)从猪受试者获得含有细胞的支气管肺泡灌洗样品，
b)从所述样品分离细胞组分，
c)用包含转座子和包含启动子控制下的编码SV40T抗原的基因的DNA分子转染所述细胞组分，和
d)选择可以培养至少5个细胞周期的细胞。
通常，选择已经培养至少5个细胞周期的细胞。对于此类细胞，可以合理地假设，它们是成功永生化的PAM，因为原代PAM在从肺部分离之后在体外通常不会复制多于一次或两次，特别是多达5次。
在特殊情况下，早期细胞周期可以显示不稳定的行为，例如由于该转座子已经在非常关键的位点整合于细胞基因组中的事实，或由于编码SV40T抗原的基因的不稳定整合。因此，在实践中，选择已经培养至少10、15、20、25、30、40、50或甚至60个细胞周期(以该优先顺序)的细胞。
任何不稳定性变得明显的机会的确随着选择的永生化的PAM的细胞周期的量而减少。
因此，优选地，选择已经培养至少10、15、20、25、30、40、50或甚至60个细胞周期(以该优先顺序)的细胞。
巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的存在不会显著刺激原代PAM复制超过几次细胞分裂。
粒细胞M-CSF (gM-CSF)的存在可以改善原代PAM的条件，甚至到存在持续非常短时段的一定复制的程度。但是，本发明人显示，使用GM-CSF导致CD163表达的减少。并且由于CD163参与PRRSV到PAM的复制，在这方面，GM-CSF的使用可以不具有净有益效果。
M-CSF似乎比GM-CSF在较低程度上改善原代PAM的条件，但它不干扰CD163产生。
但是令人惊讶地发现，通过肺灌洗获得的PAM的生长培养基中的M-CSF的存在，在它们进行转染之前，使细胞稍好地耐受转染的应激过程。因此，在M-CSF存在的情况下，转染效率显著增加。
M-CSF的合适的量是例如5、10、25、50、100或200 ng/ml，以该渐增的优先顺序。
(在图2中可见，确实在M-CSF存在的情况下，肺灌洗和分离后的活原代PAM细胞的数量减少(或最好保持稳定6天)。当与M-CSF不存在的情况下的减少相比时，该减少随着时间不那么显著，但在任何情况下，在统计学概率内没有细胞数量的增加)。
因此，该实施方案的另一个优选形式涉及根据本发明的方法，其中该方法包括在转染步骤之前将至少5 ng/ml的量的M-CSF加入含有细胞的支气管肺泡灌洗样品和/或细胞组分的步骤。
PCT专利申请WO2008/089094公开了使用M-CSF作为强制生长培养基组分以保持永生化、但非转化的胎PAM活着。与此相反，在本发明中，在永生化PAM之前使用M-CSF或gM-CSF。
本发明人显示，出乎意料地，步骤d)期间和/或当培养根据本发明的永生化的PAM即转化和非胎PAM时M-CSF的存在，也改善根据本发明的这些转化和非胎细胞的活力。图4中可见，在M-CSF存在的情况下，根据本发明的永生化的PAM的活力和复制率均显著改善。1、2、3、4或5 ng/ml量级的少量M-CSF已经足以改善活力和复制率两者。M-CSF的优选浓度是6、12、25、50、100、200或甚至400 ng/ml，以该渐增的优先顺序。
因此，再次，该实施方案的另一个优选形式涉及根据本发明的方法，其中该方法还包括在步骤d)期间和/或当培养根据本发明的永生化的PAM时加入至少1 ng/ml的量的M-CSF的步骤。
图5显示，针对CD163和P210(证明对于PAM细胞中的PRRS病毒的进入和复制必需的两种受体)的抗体的确与根据本发明的永生化的PAM反应。这意味着，CD163和P210确实存在于根据本发明的永生化的PAM上。
图6显示，根据本发明的永生化的PAM的确支持PRRSV复制。可见，当与原代PAM相比时，PRRSV野生分离株在感染后前2-3天内复制甚至更快并达更高的滴度。
图7显示，的确，当与MARC-145细胞上的复制相比时，PRRSV野生分离株在根据本发明的永生化的PAM上复制更快，并达更高的滴度。也可见，当与MARC-145细胞上的复制相比时，野生型分离株的确通常在PAM上复制更好，无论它们是否永生化。
图7还显示，反之亦然，当与PAM上的复制相比时，适于在MARC-145细胞上复制的PRRSV
I型和II型毒株在MARC-145细胞上复制到更高的滴度。
这显示，的确，根据本发明的永生化的PAM与原代PAM一样适合于复制PRRSV野生分离株，并因此比非PAM细胞如MA104、MARC-145或CL2621细胞更适合于该目的。
本发明的第二个实施方案涉及永生化的猪肺泡巨噬细胞(PAM)，其特征在于PAM适于猪呼吸和生殖病毒(PRRSV)，PAM表达SV40T抗原且PAM不包含逆转录病毒长末端重复DNA。
原则上可以进一步提供具有编码人端粒酶逆转录酶(hTERT)的功能基因的根据本发明的永生化的PAM。但是，这决不是必需的，因为该SV40
T抗原能够维持根据本发明的PAM的永生化状态。实际上，如果只出于产生永生化的PAM的技术简单性，优选只有SV40T抗原用于细胞的永生化。
因此，该实施方案的一种优选形式涉及根据本发明的永生化的PAM，其特征在于所述PAM不包含hTERT。
本发明的第三个实施方案涉及复制PRRS病毒的方法，其特征在于此类包括以下步骤
a)培养根据本发明的永生化的PAM，
b)使永生化的PAM与PRRS接触
c)使PRRSV复制和
d)分离子代病毒。
本发明的第四个实施方案涉及包含根据本发明的永生化的PAM的细胞培养物。
在该实施方案的一种优选形式中，包含永生化的PAM的细胞培养物被PRRSV感染。
在该实施方案的另一种优选形式中，包含永生化的PAM的细胞培养物包含M-CSF。
本发明的第五个实施方案涉及用于制备包含PRRSV的疫苗的方法，其特征在于该方法包括复制根据本发明的PRRSV的方法，和随后将病毒与药学上可接受的载体混合的步骤。
在该实施方案的一种优选形式中，PRRSV是活减毒或灭活的形式。
实施例
实施例
1
：
材料和方法。
质粒。
为了构建pPB-CAG-SV40 T Ag，通过PCR使用引物SV40标签5’-BII (5’-GGCGAGATCTACCATGGATAAAGTTTTAAACAG-3’)和SV40标签3’-XI
(5’-GGCGCTCGAGTTATGTTTCAGGTTCAGGGG-3’)将XhoI和BglII位点加入SV40
T Ag。Phusion DNA聚合酶根据制造商的方案(New England Biolabs)用于PCR。将片段克隆入pCR-Blunt
(Life Technologies)并通过测序验证。接着，将SV40 T Ag从pCR-Blunt 切出，并使用BglII-XhoI 位点克隆入pPB-CAG-EBNXN (Yusa 等人, 2009)以生成pPB-CAG-SV40 T Ag(图1)。通过测序验证最终构建体。用Qiagen EndoFree质粒maxi试剂盒(Qiagen)分离用于转染入原代PAM细胞的质粒DNA。
原代细胞和PAM SVh细胞的分离和生长。
从1-2周龄PRRSV阴性、SPF仔猪的肺收获猪肺泡巨噬细胞。该肺用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗涤三至五次。洗涤液在4℃以1000xg离心10分钟以沉淀细胞。将细胞重悬浮并在液氮中保存于含有50%
FCS (Hyclone, Thermo Scientific)、1x非必需氨基酸(Life
Technologies)、2mM谷氨酰胺、抗生素和10%
DMSO的RPMI 1640+HEPES+GlutaMax (Life
Technologies)中。解冻后，将PAM细胞进行培养并在37℃和5% CO2下生长于含有20%
FCS (Hyclone, Thermo Scientific)、1x非必需氨基酸(Life
Technologies)、2mM谷氨酰胺、抗生素的RPMI
1640+HEPES+GlutaMax (Life Technologies)中。重组人M-CSF
(M-CSF)购自R&D Systems。使 PAM SVh在细胞培养基 + 100ng/ml M-CSF (R&D Systems)中生长。
活力测定。
通过在含有不同浓度的M-CSF的培养基中每24孔接种200.000个细胞而观察M-CSF对原代PAM细胞的体外存活的影响。一式两份测试每种条件。接种之后3天和6天从各孔取细胞样品，并用GUAVA Easycyte plus (Guava Millipore)使用Viacount染料(Guava Millipore)根据制备商的方案测定活细胞的数量。每个样品计数两次。
以类似的方式在略微调整的情况下检查M-CSF浓度对PAM SVh增殖的影响。这里，将25000个细胞接种于超低贴壁96孔板，并在接种之后3、4、5和6天收获细胞用于计数。每个样品计数两次。
转染。
培养6天之后，收获原代PAM细胞并计数活细胞。在本实验中，将M-CSF (100ng/ml)加入培养基，以促进原代PAM的体外存活。每次转染，使用Nucleofector 4D (Lonza Cologne AG)的程序DN-100在100µl原代细胞缓冲液P3 +补充剂(Lonza Cologne AG)中转染1.10E6个活细胞。用1,6µg
pPB-CAG-SV40 T Ag和0,4µg pPB-CMV-hyPBase (Yusa等人, 2011)或作为对照的1,6µg pPB-CAG-EBNXN和0,4µg
pPB-CMV-hyPBase转染细胞。施用Nucleofection脉冲之后，将细胞在室温放置10
min。接着，将400µl RPMI 1640(37℃)缓慢加入细胞中，并在37℃下孵育5 min。然后，将细胞小心重悬浮，接种于含有20%
FCS (Hyclone, Thermo Scientific)、1x非必需氨基酸(Life
Technologies)、2mM谷氨酰胺、抗生素和100ng/ml
M-CSF (R&D Systems)的RPMI
1640+HEPES+GlutaMax (Life Technologies)中，并在37℃和5% CO2下孵育。
抗体和流式细胞术。
用针对猪CD163产生的小鼠单克隆抗体(克隆2A10/11, AbD Serotec)、针对猪唾液酸粘附素/p210产生的小鼠单克隆抗体(Duan等人，1998)或FITC-标记的小鼠IgG1同种型对照抗体(AbD Serotec)标记细胞。洗涤之后，用FITC标记的山羊抗小鼠抗体(Lifespan
Biosciences)标记以抗CD163或抗唾液酸粘附素/p210抗体标记的细胞。使用Becton Dickinson FACS Calibur细胞计数器和CellQuest Pro软件分析细胞。
PRRSV复制和滴定。
为了比较原代PAM、PAM SVh或MARC-145细胞作为PRRSV复制的底物，将等量细胞接种于12个孔中。在t=0时用致病的野生分离株、I型疫苗株或II型疫苗株以MOI
0,001或MOI 0,0001感染细胞。感染后几天收获上清液并将其储存于-20℃。通过滴定原代PAM和原代PAM上的PAM SVh上清液和MARC-145细胞上的MARC-145上清液而测定病毒滴度。一式两份进行所有滴定。滴度使用Spearman-Kärber的方法计算，并表示为log10TCID50/ml。
结果：
M-CSF促进原代PAM的体外活力。
原代PAM在含有20％FCS的标准RPMI 1640培养基中具有低体外存活率(图2)。活细胞的数量随着时间下降，三天后只有约50％的细胞仍活着。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)加入培养基对存活具有积极影响，并且与M-CSF不存在的情况下生长的细胞相比在三天或六天后明显增加活细胞的数量。
SV40-永生化的PAM细胞系的建立。
使原代细胞在含有M-CSF的培养基中生长6天，随后用pPB-CAG-SV40 T Ag或pPB-CAG-EBNXN以及编码piggyBac转座酶的pPB-CMV-hyPBase载体转染。转染后，每天小心地监测细胞的增殖，并用新鲜培养基 +
100ng/ml M-CSF定期补充培养基。pPB-CAG-EBNXN转染的对照细胞中看不到细胞增殖，并且在转染后4-5周，所有细胞都死了。相反，转染后3-4周，pPB-CAG-SV40 T Ag转染的细胞的培养物中生长出小集落(图3)。这些集落继续增殖并传代以增加细胞数。所有细胞都是SV40
T Ag阳性的，如免疫荧光所证明(数据未显示)。
这些细胞继续增殖，可以每周传代两次，并且目前已经保持培养超过8个月(50-60代)。在液氮储存之后，该细胞系可容易地在培养中再生长。因此建立的细胞系被命名为PAM SVh。
PAM SVh细胞系的增殖取决于M-CSF浓度。
为了确定PAM SVh细胞系的增殖是否需要M-CSF，使PAM SVh细胞在无M-CSF或不同浓度的M-CSF存在的情况下生长。接种后3天和6天测定活细胞的数量。PAM SVh的增殖是以浓度依赖的方式M-CSF依赖的(图4)。在高浓度(400-100 ng/ml)的M-CSF存在的情况下可见细胞数量的最大增加。较低浓度的M-CSF导致细胞增殖降低，并且在M-CSF不存在的情况下检测到细胞数量较少增加或无增加，表明PAM SVh细胞的增殖取决于培养基中的M-CSF浓度。
PAM SVh细胞表达唾液酸粘附素/p210和CD163标志物。
已证明两种受体对于PAM细胞中的PRRS病毒的进入和复制是必需的，唾液酸粘附素/P210和CD163。尽管发现唾液酸粘附素/p210的表达对于PRRSV结合和进入PAM细胞是必需的，但显示细胞中的PRRSV复制需要CD163(Delputte等人，2005；Van Gorp等人，2008 ；Calvert等人，2007)。我们通过针对这些受体产生的特异性抗体标记细胞并通过流式细胞术分析它们而检查PAM SVh细胞是否表达唾液酸粘附素/P210和CD163。发现超过80%的PAM SVh细胞是CD163+的，且超过70％的PAM SVh细胞是唾液酸粘附素/P210 +的(图5)，表明这些细胞可能适合于PRRSV的感染和复制。
PAM SVh细胞是PRRSV复制的合适基质。
我们通过用致病的野生分离株感染PAM SVh细胞而测试它们是否是PRRSV复制的基质。在感染后不同天数收获上清液，并对其滴定以测定病毒滴度。为了比较，我们还在相同的实验中感染原代PAM细胞。PAM SVh细胞被PRRSV野生分离株感染并明显产生PRRSV病毒(图6)。与原代PAM相比，由PAM SVh细胞产生的病毒滴度在感染后第1天和第2天更高，在第3天和第4天相当，在第5天更低。
MARC-145细胞通常用作用于产生PRRSV疫苗株病毒的基质。我们比较了原代PAM、PAM SVh细胞和MARC-145细胞作为用于复制不同PRRSV毒株的基质。我们用致病的野生分离株、PRRSV I型疫苗株或PRRSV
II型疫苗株感染相等数量的原代PAM、PAM SVh和MARC-145细胞。在感染后不同天数收获上清液，并滴定上清液以测定病毒滴度。再次，PAM SVh细胞比原代PAM产生相等或更高滴度的PRRSV野生分离株(图7A)。PAM SVh也比MARC-145细胞产生更高滴度的PRRSV野生分离株。当我们比较在不同基质上产生的PRRSV
I型和II型毒株的病毒滴度时，我们发现，这两种菌株都在MARC-145细胞上复制最好，所述MARC-145细胞是通常用于产生这些减毒病毒的基质(图7B和C)。但是，PAM SVh细胞在所有时间点对于两种疫苗株都产生比原代PAM更高的滴度，再次表明PAM SVh细胞是比原代PAM更好的PRRSV复制的基质。
图注。
图 1 ：载体图谱pPB-CAG-SV40
T Ag
图 2 ：M-CSF增加原代PAM的体外存活。将200000个细胞原代PAM细胞在t=0(第0天)一式两份接种于不含或含有不同浓度的M-CSF的培养基中。在接种后3天和6天测定活细胞的数量。每孔一式两份测定细胞数。描绘的数据是四次独立的测量的平均值 +
SEM。
图 3 ：pPB-CAG-SV40 T
Ag转染的细胞中的集落形成
集落通过黑箭头表示。
图 4 ：M-CSF刺激PAM SVh细胞的增殖。将25000个细胞PAM SVh细胞在t=0(第0天)接种于不含或含有不同浓度的M-CSF的培养基中。接种后3、4、5和6天测定活细胞的数量。描绘的数据是每孔两个细胞计数的平均值。
图 5 ：PAM SVh细胞表达CD163和唾液酸粘附素。用针对CD163或p210产生的抗体或同种型对照抗体标记PAMSVh细胞。细胞用FITC标记的二抗标记，并通过流式细胞术分析。描绘每种抗体的FITC阳性细胞的百分数。
图 6 ：PAM SVh细胞上的PRRSV复制。在t=0时用致病的PRRSV野生型分离株(MOI 0,001)感染细胞。在感染后不同天数收获上清液，并对其滴定以测定病毒滴度。对于原代PAM(空心柱)和PAM SVh(实心柱)描绘TCID50/ml的10log值。数据是两次独立滴定的平均值。
图 7 ：PAM SVh细胞系上的不同PRRSV毒株的复制。在t=0时用(A)致病的PRRSV野生分离株(MOI 0,0001)、(B)PRRSV I型疫苗株(MOI
0,001)或(C) PRRSV II型疫苗株(MOI 0,001)感染细胞。在感染后不同天数收获上清液，并对其滴定以测定病毒滴度。对于MARC-145(空心柱)、原代PAM(阴影柱)和PAM SVh(实心柱)描绘TCID50/ml的10log值。数据是两次独立滴定的平均值。
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Claims (14)
1.永生化的猪肺泡巨噬细胞(PAM)，其特征在于所述PAM易感猪呼吸和生殖病毒(PRRSV)，表达SV40T抗原且不包含逆转录病毒长末端重复DNA。
2.根据权利要求1所述的永生化的PAM，其特征在于在用于表达SV 40 T抗原的用途中，所述PAM易感猪呼吸和生殖病毒(PRRSV)，表达SV40T抗原且不包含逆转录病毒长末端重复DNA。
3.根据权利要求1或2所述的永生化的PAM，其特征在于所述PAM包含转座子。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的永生化的PAM，其特征在于所述PAM不包含人端粒酶逆转录酶(hTERT)。
5.细胞培养物，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的永生化的PAM。
6.根据权利要求5所述的细胞培养物，其特征在于所述细胞培养物被PRRSV感染。
7.根据权利要求5或6所述的细胞培养物，其特征在于所述细胞培养物包含M-CSF。
8.用于制备根据权利要求1-4中任一项的永生化的PAM的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤
a)从猪受试者获得含有细胞的支气管肺泡灌洗样品，
b)从所述样品分离细胞组分，
c)用包含转座子和包含合适启动子控制下的编码SV40T抗原的基因的DNA分子转染所述细胞组分，
d)选择已经培养至少5个细胞周期的PAM细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于在步骤d)中，选择已经培养至少10个细胞周期的细胞。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述方法包括在转染步骤之前将至少5 ng/ml的量的M-CSF加入所述含有细胞的支气管肺泡灌洗样品和/或细胞组分的步骤。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括在步骤d)期间和/或当培养所述永生化的PAM时加入至少1 ng/ml的量的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的步骤。
12.复制PRRSV的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养根据权利要求1-4中任一项所述的永生化的PAM，
b)使所述永生化的PAM与所述PRRS病毒接触
c)使所述PRRSV复制和
d)分离子代病毒。
13.用于制备包含PRRSV的疫苗的方法，其特征在于所述方法包括根据权利要求12所述的方法，随后为将病毒与药学上可接受的载体混合的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述PRRSV是活减毒或灭活的形式。
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