KR20110123918A

KR20110123918A - 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 분리를 위한 ＰＡＭ-ｐＣＤ163세포주 및 이를 이용한 백신

Info

Publication number: KR20110123918A
Application number: KR1020100043406A
Authority: KR
Inventors: 박최규; 김성희; 이경기; 송윤경; 이오수; 이창희
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부)
Priority date: 2010-05-10
Filing date: 2010-05-10
Publication date: 2011-11-16
Also published as: KR101201240B1

Abstract

본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 분리를 위한 PAM-pCD163 세포주 및 이를 이용한 백신에 관한 것이다.
본 발명의 PAM-pCD163세포주는 HEK 293세포에 pCD163 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시켜 생성된 레트로바이러스를 PAM에 접종하여 pCD163이 안정적으로 세포에서 발현하여 생성된다.
본 발명에 의해, 미생물의 감염이 없는 살아있는 돼지의 폐장으로부터 수거를 해야 기존의 PRRSV 분리시 단점을 해소해 주면서, 수거한 세포의 계대배양이 어렵고(유효계대수가 짧음), 동결보관 후 해동시 감수성이 떨어지는 기존의 PRRSV 분리시 단점도 해소해 줌과 동시에 북미형 PRRSV, 유럽형 PRRSV 모두 분리 및 배양이 가능한 PAM-pCD163세포주 및 이를 이용한 백신이 제공된다.

Description

돼지생식기호흡기증후군 바이러스 분리를 위한 ＰＡＭ-ｐＣＤ163세포주 및 이를 이용한 백신{PAM-pCD163 CELL LINE FOR ISOLATING PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS AND VACCINE USING THE SAME}

본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 분리를 위한 PAM-pCD163세포주 및 이를 이용한 백신에 관한 것으로써, 특히 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스가 감염 및 증식되는 PAM-pCD163세포주를 제조하여 돼지생식기호흡기증후군의 예방 및 피해를 경감할 수 있는 세포주 및 이를 이용한 백신에 관한 것이다.

돼지생식기호흡기증후군(porcine reproductive and respiratory syndrome; 이하, “PRRS”라 한다)은 1980년대 말 북미에서 최초로 발생 보고 된 이후 현재 국내뿐만 아니라 전 세계 양돈 산업 국가에 만연되어있는 돼지 전염성 질병이다.

이 질병으로 인한 경제적 피해를 수치로 환산하면 미국에서는 연간 약 6억불 정도(약 5,400억원)로 보고되어지고 있으며 우리나라에서는 연간 약 1,000억원의 손실을 입히는 것으로 추정하고 있다.

PRRS의 원인체인 PRRS 바이러스는 항원적 그리고 유전학적 특성들에 따라 유럽형 type 1(European genotype)과 북미형 type 2(North American genotype)로 구분되며 이들은 각각 유전자 수준에서 약 60% 정도의 상동성만을 유지하고 있다.

이 바이러스는 주로 숙주 내 돼지폐포대식세포(porcine alveolar macrophage; 이하, “PAM”이라 한다)에 감염을 유발하며 정상적인 면역 기능을 변화시켜 감염에 대한 숙주 방어 반응을 저하시킨다.

또한, 바이러스에 감염된 돼지는 5 ~ 6 개월까지 지속감염을 일으킬 수 있으며, 이에 바이러스 변이주들이 발생하여 보고되고 있는 상황이다.

현재까지 PRRS 바이러스 분리와 배양을 위해서는 돼지 폐에서 직접 폐포대식세포를 수거하여 이용하는 초대세포배양(primary cell culture) 방법과 기존 원숭이신장세포유래주인 Marc-145세포를 사용해오고 있다.

대부분의 북미형 바이러스는 Marc-145 세포주를 이용하여 배양되고 있는데 반해 유럽형 바이러스는 분리가 잘 되지 않는다.

비록 북미형 바이러스가 Marc-145세포에서 증식한다 하더라도 실제 PRRS 바이러스의 자연 숙주가 아닌 원숭이 유래 세포주라는 한계로 인하여 바이러스 분리 및 바이러스-숙주 상호작용에 관련된 다양한 연구를 수행하는데 많은 제한이 따르고 있는 실정이다.

경우에 따라 이미 분리된 유럽형 바이러스를 Marc-145 세포에 blind-passage를 통하여 적응시켜 차후 배양은 가능하지만, 유럽형 및 일부 북미형 PRRS 바이러스 분리와 배양은 Marc-145 세포에서는 상당히 제한적인 것으로 알려져 있다.

따라서, 유럽형 바이러스 분리를 위해서는 돼지 폐유래 초대배양대식세포를 이용하는 것이 일반적이다.

하지만 바이러스증식이 가능한 초대배양폐포대식세포의 유효계대수가 1 ~ 2 회로 짧고 초저온 동결 후 해동 시 감수성이 떨어지기 때문에 한번 작성된 초대배양세포의 사용기간이 제한적이므로 사용하려면 매번 PRRS 바이러스 음성 돼지 폐에서 추출해야하는 번거로움이 존재한다.

이런 단점을 극복하고자 최근에 초대배양폐포대식세포를 이용하여 불멸화 유도를 통해 돼지폐포대식세포주를 구축한 바 있다.

하지만 PRRS 바이러스 감수성 테스트 결과, 이 구축되어진 돼지폐포대식세포주에서는 바이러스 감염 및 증식이 불가능하였고 현재까지 원숭이 신장 세포주 외에는 PRRS 바이러스에 감수성 있는 돼지유래세포주가 확립되지 않아 바이러스 분리 및 in vitro 연구에 여전히 많은 제한을 주고 있는 실정이다.

가장 최근에는 PRRS 바이러스에 감수성이 있는 새로운 돼지폐포상피세포주에 대한 확인 보고가 있지만 아직까지 그 이용 가능성에 대한 결과는 불분명한 상황이다.

따라서, 국내에 분포하는 PRRS 바이러스에 대한 특성 연구를 위해서는 기존에 존재하는 원숭이 유래 신장세포를 대체하여 유전자형(genotype)에 상관없이 다양한 바이러스를 분리 및 배양할 수 있는 돼지 유래 세포주의 구축이 필요한 상황이다.

본 발명에서는 상기의 문제점들을 해결하기 위한 것으로, 유럽형 및 북미형 돼지생식기호흡기증후군바이러스가 감염 및 증식되는 PAM-pCD163세포주를 개발하여 국내 발생 PRRSV의 특성 파악 및 이를 통한 PRRS 예방 및 피해를 경감하는데 있다.

본 발명의 PAM-pCD163세포주는 HEK 293세포에 pCD163 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시켜 생성된 레트로바이러스를 PAM에 접종하여 PAM세포에서 pCD163이 발현하여 생성된다.

특히, 상기 플라스미드는 도 2의 pFB-Zeo-pCD163인 것이 특징이다.

또한, 상기 PAM-pCD163세포주는 북미형과 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 분리 및 배양에 용이하게 사용된다.

본 발명의 PAM-pCD163 세포주를 이용한 백신은 HEK 293세포에 pCD163 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시켜 생성된 레트로바이러스를 PAM에 접종하여 PAM세포에서 pCD163이 발현되어 생성된 PAM-pCD163 세포주에 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식한 바이러스를 이용하여 제조된다.

본 발명에 의해, 기존의 PRRSV 분리시 흔히 사용되는 돼지 폐장 유래 초대배양대식세포 및 배양세포(Marc-145 등)의 단점을 모두 극복할 수 있어 유럽형 및 북미형 PRRSV 분리 및 배양은 물론 이를 이용한 백신개발 등 다양한 분야에 활용이 가능하여 국내 발생 PRRSV의 특성 파악 및 이를 통한 PRRS 예방 및 피해를 경감할 수 있게 된다.

도 1은 pCD163를 전기영동한 도면.
도 2는 pFB-Zeo-pCD163 벡터 유전자지도 모식도.
도 3은 웨스턴 블랏(Western blot)을 이용한 PAM-pCD163세포주에서의 시간대별 pCD163 발현확인을 나타낸 도면.
도 4는 형광항체법을 이용한 PAM-pCD163세포주에서의 pCD163 발현확인을 나타낸 도면.
도 5는 FACS를 이용한 PAM-pCD163 세포주에서의 pCD163 발현확인을 나타낸 도면.
도 6은 PAM-pCD163세포주의 시간대별 세포수를 나타낸 도면.
도 7은 PAM-pCD163세포주에 유럽형(LV)와 북미형(VR2332) PRRS 바이러스 접종시 세포변성효과(CPE) 및 형광항체법을 이용한 증식 확인을 나타낸 도면.
도 8은 PAM-pCD163세포주에 유럽형(LV)와 북미형(VR2332) PRRS 바이러스 접종 후 PRRSV ORF7 특이 프라이머를 이용한 바이러스 증식 확인을 나타낸 도면.
도 9는 PAM-pCD163세포주에 바이러스 접종 후 웨스턴 블랏(western blot)을 이용한 바이러스단백질 및 pCD163 발현 확인을 나타낸 도면.
도 10은 PAM-pCD163 및 Marc-145세포주의 바이러스 증식율 비교 그래프를 나타낸 도면.

PRRS 바이러스는 골수세포(monocyte-macrophage) 계열 세포들에 상당히 제한적인 세포의 성질(cell tropism)을 가지며 따라서 완전하게 분화되어진 돼지 폐포대식세포(porcine alveolar macrophage; PAM)에서 주로 감염을 유발한다.

이런 이유로 현재까지 PRRS 바이러스 분리와 배양을 위해서 돼지 폐에서 직접 PAM 세포를 수거하여 이용하는 초대세포배양(primary cell culture) 방법이 사용되고 있다.

이와 더불어 또한 원숭이신장세포유래주인 Marc-145 세포를 바이러스 분리 및 배양을 위해 이용해오고 있다.

대부분의 북미형 바이러스는 Marc-145 세포주에서 배양되고 있으나 실제 PRRS 바이러스의 자연 숙주가 아닌 원숭이 유래 세포주라는 한계로 인하여 유럽형 및 일부 북미형 PRRS 바이러스 분리와 배양은 Marc-145 세포에서는 상당히 제한적인 것으로 알려져 있다.

따라서, 효과적인 유럽형 및 북미형 PRRS 바이러스 분리를 위해서는 돼지 폐유래 초대배양대식세포를 이용하는 것이 일반적이다.

하지만 바이러스 증식이 가능한 초대배양폐포대식세포의 유효계대수가 1 ~ 2회로 짧고 초저온 동결 후 해동 시 감수성이 떨어지기 때문에 한번 작성된 초대배양세포의 사용기간이 제한적이기 때문에 사용하려면 매번 PRRS 바이러스 음성 돼지 폐에서 추출해야하는 번거로움이 존재한다.

이런 단점을 극복하고자 최근에 SV40 바이러스 폴리오마바이러스(large T antigen)를 이용하여 초대배양폐포대식세포에 불멸화 유도를 통해 돼지폐포대식세포주(PAM cell line)를 구축한 바 있다.

하지만, 바이러스 감수성 테스트 결과 다양한 돼지 유래 바이러스들이 이 구축되어진 PAM 세포주에 감수성을 보인 반면에 PRRS 바이러스에 대해서 감염 및 증식이 불가능하였다.

현재까지 여러 PRRS 바이러스 세포 수용체들이 PAM 세포에서 보고 되었지만 최근에 확인된 pCD163은 그 발현만으로 PRRS 바이러스에 비감수성인 세포주가 바이러스 감염에 감수성 있는 세포주가 된다는 것이 증명되었으며 이로써 pCD163이 가장 확실한 바이러스의 기능적인 세포 수용체로 알려지고 있다.

따라서 PRRS 바이러스에 감수성 있는 PAM 세포주를 구축하기 위해 먼저 기존에 확립되어진 SV40-transformed PAM 세포주(ATCC CRL-2843)에서 먼저 돼지 pCD163(porcine pCD163) 발현을 실시하였다.

또한, 본 발명에 따른 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 세포 수용체인 pCD163가 돼지폐포대식세포 표면에 발현하는 PAM-pCD163 세포주에 관련 바이러스를 감염 및 증식시켜 바이러스를 생산할 수 있으며, 생산되는 바이러스로 제조한 생독백신 또는 불활화백신은 보다 안정적으로 바이러스가 생산되어 손쉽게 백신을 생산할 수 있도록 해준다.

그러므로, 본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스 세포 수용체인 pCD163가 돼지폐포대식세포 표면에 발현하는 PAM-pCD163 세포주에 질병 관련 바이러스를 감염시키고, 증식시키는 단계 및 상기 단계에서 증식된 바이러스를 이용하여 생독 백신 또는 불활성화 백신을 제조하는 단계를 포함하는 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법을 제공한다.

상기 단계에서 관련된 질병 관련 바이러스로는 돼지써코바이러스(1과2), 동물 및 사람 인플루엔자바이러스, 돼지싸이토메갈로바이러스, 수포성구내염바이러스, 오제스키바이러스, 돼지열병바이러스, 돼지수포성질병바이러스, 돼지폭스바이러스, 아프리카돼지열병바이러스, 돼지허피스바이러스, 헤르페스 바이러스, 파라인플루엔자바이러스, 소아데노바이러스, 돼지아데노바이러스, 벡시니아바이러스 등이 있다.

상기 단계에서 세포주에 바이러스를 감염 및 증식시키는 과정은 다음과 같다.

본 발명의 PAM-pCD163세포주를 배양용기에서 배양액과 함께 배양하여 50~80%의 세포단층이 형성된 후에 특정 바이러스를 감염시킨다.

감염 소요 시간과 증식 기간은 바이러스 종류에 따라 다양할 수 있으며, 일반적으로 감염소요 시간은 대개 3시간에서 12시간 정도이며, 증식 기간은 3-6일이다.

해당 바이러스에 따른 감염과 증식이 종료되면, 세포와 배양 상층액을 수거한다.

상기 단계로부터 얻은 증식된 바이러스 배양액을 이용하여 생독 백신 또는 불활화 백신을 제조할 수 있으며, 불활화백신인 경우 포르말린 또는 BEI 처리등의 특정한 방법으로 바이러스를 불활화시키고, 불활화된 바이러스를 통상의 방법으로 정제하여, 바이러스 원액의 무균실험 및 바이러스 함량실험 등을 실시하고, 보존제 및 완충액 생리식염수를 가하여 희석 혼합 또는 안정제를 첨가한다.

최종 백신은 동결건조, 액상 등의 상태로 제조될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명에 대해 상세하게 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> PRRS 바이러스 세포 수용체 pCD163 유전자 클로닝

돼지 폐장 유제액으로부터 total RNA를 TRIzol 킷트(Invitrogen)를 이용하여 추출하였으며, pCD163 유전자를 증폭할수 있는 프라이머는 추후 클로닝을 위하여 제한효소를 첨가하여 작성하였다.

pCD163 센스프라이머는 제한효소 BamH사이트를 5‘말단에 연장시켜 설계하였으며 (5’-CGGGATCCATGGACAAACTCAGAATGG-3‘, 안티센스프라이머 또한 3’말단에 제한효소 BamHⅠ사이트를 연장시켜 설계하였다 (5‘-CGGGATCCGGCTGAACTCACCAGGTTAT-3’).

상기 프라이머를 이용한 cDNA합성은 RNA 2, 20pmole의 안티센스프라이머 및 SuperScriptIII 역전사효소를 이용하여 42에서 1시간 반응시켜 합성하였으며, PCR은 94℃ 5분 반응 후 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 3분 조건에서 35사이클을 실시하여 하였으며, 72℃에서 10분간 연장 반응을 실시하였다.

PCR 산물은 0.8% 아가로즈겔에서 전기영동하여 확인하였다. 증폭된 유전자는 도1과 같이 약 3.3kb에 해당하는 밴드를 확인할 수 있었으며, 증폭된 유전자는 pGemTeasy vector(Promega)에 클로닝하여 pCD163의 open reading frame(ORF)을 포함하는 plasmid DNA 염기서열을 분석하였다.

이에 해당하는 염기서열은 첨부된 염기서열 목록에 제시되어 있다.

<실시예 2> PRRS 바이러스 세포 수용체 pCD163 유전자 포함 플라스미드 제조

세포수용체 pCD163유전자 포함 플라스미드를 제조하기 위한 벡터로는 pFB-Neo retrovial vector(Stratagene)를 이용하였으며, neomycine 내성 ORF를 zeocin 내성 ORF로 치환하여 추후 플라스미드 작성에 사용하였다 (pFB-Zeo).

pGEM-pCD163와 pFB-Zeo plasmid를 BamHⅠ으로 절단하고 1% 아가로스 겔(agarose gel)에 전기영동하여 밴드를 확인한 후 키트(gel extraction kit)를 이용하여 절편을 분리하였다.

BamHⅠ으로 잘린 pCD163(약 3.3kb)과 pFB-Zeo vector(약 6.3kb)를 결찰(ligation) 시켜 최종적으로 pFB-Zeo-pCD163 플라스미드를 작성하였으며, pFB-Zeo-pCD163 프라스미드생산을 위한 벡터의 유전자지도는 도 2에 나타내었다.

<실시예 3> 플라스미드 'pFB-Zeo-pCD163'를 PAM세포주로의 트렌스펙션 및 세포 선발

고역가의 레트로바이러스를 얻기 위하여 ecotropic packaging 세포주인 HEK(Human Embryonic Kidney)-293T 세포주에 플라스미드 pFB-Zeo-pCD163, 피막을 형성하는 VSV-G 당단백질(vesicular stomatitis virus G glycoprotein, pVPack-VSV-G) 및 MMLV gag/pol 유전자(replication-defective Molony Murine Leukemia virus (MMLV) gag/pol gene)을 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 이용하여 트렌스펙션(transfection)시켰다.

생산된 다클론성 레트로바이러스(polyclonal retrovirus)는 PAM (CRL-2843) 세포주에 접종하고 48시간 이후에 zeocin (Invitrogen)을 100/ml 농도로 첨가하여 선택배양하였다.

항생제(Zeocin) 처리에 의해 선택된 각각의 cell clone(PAM-pCD163)들에서 RT-PCR을 통하여 pCD163 mRNA 발현 검출을 통해 결과적으로 recombinant pCD163 유전자가 성공적으로 세포내에 삽입된 것을 확인하였다.

pCD163의 mRNA발현이 확인된 세포 클론을 PAM-pCD163으로 명명하였다.

<실시예 4> 형광항체법, western blot 및 FACs를 이용한 형질전환 세포주의 pCD163 발현능 분석

먼저 western blot 기법을 이용하여 PAM-pCD163세포에서 pCD163 단백질 검출을 시도하였다. SDS-PAGE에서 세포단백 분획을 통해 얻고, nitrocellulose membrane에 세포분획을 전이시킨 후 1차항체로는 anti-pCD163항체를 사용하고 2차항체로는 goat anti-mouse IgG-HRP를 사용하여 단백의 발현 및 분자량을 확인하였다.

도 3에서 보는 바와 같이 PAM-pCD163 세포 클론에서 130 kDa의 pCD163 단백질 밴드를 세포배양 시간대별로 확인되었다.

또한, pCD163 단백질의 세포 표면 발현을 증명하기 위하여 형광항체법과 FACS 분석을 실시하였다.

형광항체법으로의 세포표면단백 확인은 세포를 배양한 후 4% paraformaldehyde로 세포를 고정하였으며, 고정된 세포에 anti-pCD163항체를 반응시키고 2차항체로는 형광항체인 goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor를 사용하여 발현단백을 확인한 결과, 도 4에서와 같이 PAM-pCD163 세포 클론에서 강한 세포 표면 염색을 확인할 수 있었다.

또한, FACS 분석을 실시 한 결과 기존의 PAM cell과는 달리 PAM-pCD163 세포 클론들에서 확연한 histogram의 이동을 확인할 수 있었으며 이는 모든 세포들이 pCD163 단백질을 높은 수준으로 발현하고 있음을 증명하였다(도 5).

<실시예 5> 형질전환 세포주(PAM-pCD163)의 성장률 확인

먼저 구축되어진 PAM-pCD163 세포의 성장률을 확인하기 위하여 각 시간대별로 세포수를 측정하여 성장 곡선을 그렸다.

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 기존 PAM 세포주와 비교하였을때 약간 지연된 성장률을 보이고 있으나 전반적인 성장특성에서는 변화를 보이지 않았다.

이 결과는 recombinant pCD163 도입으로 인한 외부 유전자 과발현 유도는 전반적인 세포 성장률에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여 주었다.

<실시예 6> PAM-pCD163세포주를 이용하여 PRRS 바이러스 감수성 및 증식율 확인

확립된 PAM-pCD163 세포를 이용하여 PRRS 바이러스(type 1 Lelystad virus 및 type 2 VR-2332)의 감수성 테스트를 실시하였다.

각 바이러스 접종 후 PAM-pCD163 세포에서 특이적인 세포변성효과(cytopathic effect; CPE)를 확인할 수 있었다(도 7).

또한 PRRS 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 특이 단클론항체(SDOW17)를 이용한 형광항체법에서도 많은 수의 바이러스 감염된 세포 무리(cluster)들을 확인할 수 있었다(도 7).

PRRS 바이러스 게놈복제(genome replication)와 새로운 바이러스 단백질 생성이 성공적으로 이루어지고 있는지 확인하기 위하여 바이러스에 감염된 세포에서 RT-PCR과 western blot를 실시한 결과 PAM cell line과 비교하여 mock-infected (C) 및 PRRS 바이러스 LV (L)와 VR-2332 (V) 주 감염시킨 결과, PAM-pCD163 세포에서 바이러스 ORF7 gene이 성공적으로 증폭됨을 확인하였다(도 8).

또한, 바이러스 단백질 합성을 확인할 수 있었다(도 9).

PAM-pCD163 세포주의 바이러스 증식율을 PRRS 바이러스 감수성 세포인 원숭이 신장세포 유래 Marc-145 세포와 비교한 결과, PRRS 바이러스 LV (type 1, A)와 VR-2332 (type 2, B) strain들을 이용한 일단 증식곡선(one-step growth curve)에서 전반적인 성장동력학(growth kinetics)은 유사하였지만 PAM-pCD163 세포주에서 보다 높은 바이러스 역가를 보여 주었다(도 10).

<110> National Veterinary Research and Quarantine Services <120> PAM-pCD163 CELL LINE FOR ISOLATING PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS AND VACCINE USING THE SAME <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3385 <212> DNA <213> Porcine CD163 <400> 1 atggacaaac tcagaatggt gctacatgaa aactctggat ctgcagactt tagaagatgt 60 tctgcccatt taagttcctt cacttttgct gtagtcgctg ttctcagtgc ctgcttggtc 120 actagttctc ttggaggaaa agacaaggag ctgaggctaa cgggtggtga aaacaagtgc 180 tctggaagag tggaggtgaa agtgcaggag gagtggggaa ctgtgtgtaa taatggctgg 240 gacatggatg tggtctctgt tgtttgtagg cagctgggat gtccaactgc tatcaaagcc 300 actggatggg ctaattttag tgcaggttct ggacgcattt ggatggatca tgtttcttgt 360 cgagggaatg agtcagctct ctgggactgc aaacatgatg gatggggaaa gcataactgt 420 actcaccaac aggatgctgg agtaacctgc tcagatggat ctgatttaga gatggggctg 480 gtgaatggag gaaaccggtg cttaggaaga atagaagtca aatttcaagg acggtgggga 540 acagtgtgtg atgataactt caacataaat catgcttctg tggtttgtaa acaacttgaa 600 tgtggaagtg ctgtcagttt ctctggttca gctaattttg gagaaggttc tggaccaatc 660 tggtttgatg atcttgtatg caatggaaat gagtcagctc tctggaactg caaacatgaa 720 ggatggggaa agcacaattg cgatcatgct gaggatgctg gagtgatttg cttaaatgga 780 gcagacctga aactgagagt ggtagatgga gtcactgaat gttcaggaag attggaagtg 840 aaattccaag gagaatgggg aacaatctgt gatgatggct gggatagtga tgatgccgct 900 gtggcatgta agcaactggg atgtccaact gctgtcactg ccattggtcg agttaacgcc 960 agtgagggaa ctggacacat ttggcttgac agtgtttctt gccatggaca cgagtctgct 1020 ctctggcagt gtagacacca tgaatgggga aagcattatt gcaatcatga tgaagatgct 1080 ggtgtgacat gttctgatgg atcagatctg gaactgagac ttaaaggtgg aggcagccac 1140 tgtgctggga cagtggaggt ggaaattcag aaactggtag gaaaagtgtg tgatagaagc 1200 tggggactga aagaagctga tgtggtttgc aggcagctgg gatgtggatc tgcactcaaa 1260 acatcatatc aagtttattc caaaaccaag gcaacaaaca catggctgtt tgtaagcagc 1320 tgtaatggaa atgaaacttc tctttgggac tgcaagaatt ggcagtgggg tggacttagt 1380 tgtgatcact atgacgaagc caaaattacc tgctcagccc acaggaaacc caggctggtt 1440 ggaggggaca ttccctgctc tggtcgtgtt gaagtacaac atggagacac gtggggcacc 1500 gtctgtgatt ctgacttctc tctggaggcg gccagcgtgc tgtgcaggga actacagtgc 1560 ggcactgtgg tttccctcct ggggggagct cactttggag aaggaagtgg acagatctgg 1620 gctgaagaat tccagtgtga ggggcacgag tcccaccttt cactctgccc agtagcaccc 1680 cgccctgacg ggacatgtag ccacagcagg gacgtcggcg tagtctgctc aagatacaca 1740 caaatccgct tggtgaatgg caagacccca tgtgaaggaa gagtggagct caacattctt 1800 gggtcctggg ggtccctctg caactctcac tgggacatgg aagatgccca tgttttatgc 1860 cagcagctta aatgtggagt tgccctttct atcccgggag gagcaccttt tgggaaagga 1920 agtgagcagg tctggaggca catgtttcac tgcactggga ctgagaagca catgggagat 1980 tgttccgtca ctgctctggg cgcatcactc tgttcttcag ggcaagtggc ctctgtaatc 2040 tgctcaggga accagagtca gacactatct ccgtgcaatt catcatcctc ggacccatca 2100 agctctatta tttcagaaga aaatggtgtt gcctgcatag ggagtggtca acttcgcctg 2160 gtcgatggag gtggtcgttg tgctgggaga gtagaggtct atcatgaggg ctcctggggc 2220 accatctgtg atgacagctg ggacctgaat gatgcccatg tggtgtgcaa acagctgagc 2280 tgtggatggg ccattaatgc cactggttct gctcattttg gggaaggaac agggcccatt 2340 tggctggatg agataaactg taatggaaaa gaatctcata tttggcaatg ccactcacat 2400 ggttgggggc ggcacaattg caggcataag gaggatgcag gagtcatctg ctcagagttc 2460 atgtctctga gactgatcag tgaaaacagc agagagacct gtgcagggcg cctggaagtt 2520 ttttacaacg gagcttgggg cagcgttggc aggaatagca tgtctccagc cacagtgggg 2580 gtggtatgca ggcagctggg ctgtgcagac agaggggaca tcagccctgc atcttcagac 2640 aagacagtgt ccaggcacat gtgggtggac aatgttcagt gtcctaaagg acctgacaca 2700 ctatggcagt gcccatcatc tccatggaag aagagactgg ccagcccctc agaggagaca 2760 tggatcacat gtgccaacaa aataagactt caagaaggaa acactaattg ttctggacgt 2820 gtggagatct ggtacggagg ttcctggggc actgtgtgtg acgactcctg ggaccttgaa 2880 gatgctcagg tggtgtgccg acagctgggc tgtggctcag ctttggaggc aggaaaagag 2940 gccgcatttg gccaggggac tgggcccata tggctcaatg aagtgaagtg caaggggaat 3000 gaaacctcct tgtgggattg tcctgccaga tcctggggcc acagtgactg tggacacaag 3060 gaggatgctg ctgtgacgtg ctcagaaatt gcaaagagcc gagaatccct acatgccaca 3120 ggtcgctcat cttttgttgc acttgcaatc tttggggtca ttctgttggc ctgtctcatc 3180 gcattcctca tttggactca gaagcgaaga cagaggcagc ggctctcagt tttctcagga 3240 ggagagaatt ctgtccatca aattcaatac cgggagatga attcttgcct gaaagcagat 3300 gaaacggata tgctaaatcc ctcaggagac cactctgaag tacaatgaaa aggaaaatgg 3360 gaattataac ctggtgagtt cagcc 3385

Claims

HEK 293세포에 pCD163 유전자가 포함되는 플라스미드로 형질전환시켜 생성된 레트로바이러스를 통해 PAM 세포에 pCD163이 발현하여 생성된 것을 특징으로 하는,
PAM-pCD163 세포주.
제1항에 있어서,
상기 플라스미드는 도 2의 pFB-Zeo-pCD163인 것을 특징으로 하는,
PAM-pCD163 세포주.
제1항 또는 제2항에 있어서,
북미형 및 유럽형 돼지생식기호흡기증후군 바이러스의 분리 및 배양에 용이하게 사용함을 특징으로 하는,
PAM-pCD163 세포주.
HEK293세포에, 도 2의 pCD163 유전자를 포함하는 플라스미드와 피막을 형성하는 VSV-G 당단백질 및 MMLV gag/pol 유전자와 함께 트랜스펙션을 실시하여 레트로바이러스를 생성하는 단계;및
상기 생성된 레트로바이러스를 PAM 세포에 접종한 후 pCD163이 PAM세포에 발현하여 PAM-pCD163 세포주를 생성하는 단계로 구성된,
PAM-pCD163 세포주의 제조방법.
HEK 293세포에 pCD163 유전자가 포함되는 플라스미드로 형질전환시켜 생성된 레트로바이러스를 통해 PAM 세포에 pCD163이 발현하여 생성된 PAM-pCD163 세포주 에 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식시키는 단계;및
상기 증식한 바이러스를 이용하여 백신을 제조하는 단계로 구성된,
PAM-pCD163 세포주를 이용한 백신의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 질병 관련 바이러스는 돼지써코바이러스, 인플루엔자바이러스, 돼지싸이토메갈로바이러스, 수포성구내염바이러스, 오제스키바이러스, 돼지열병바이러스, 돼지수포성질병바이러스, 돼지폭스바이러스, 아프리카돼지열병바이러스, 돼지허피스바이러스, 헤르페스 바이러스, 파라인플루엔자바이러스, 소아데노바이러스, 돼지아데노바이러스, 벡시니아바이러스인 것을 특징으로 하는,
PAM-pCD163 세포주를 이용한 백신의 제조방법.
HEK 293세포에 pCD163 유전자가 포함되는 플라스미드로 형질전환시켜 생성된 레트로바이러스를 통해 PAM 세포에 pCD163이 발현하여 생성된 PAM-pCD163 세포주 에 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식한 바이러스를 이용하여 제조된 것을 특징으로 하는,
PAM-pCD163 세포주를 이용한 백신.