KR20120077858A - 불멸화된 돼지 폐포대식세포주 및 이를 이용하여 폐포대식세포 감염 바이러스를 검출 및 증식시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지 폐포대식세포주에 서열번호 1의 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT: human telomerase reverse transcriptase) 유전자 도입을 통해 형질전환시켜 제조한 불멸화된 돼지 폐포대식세포주 및 이를 이용하여 폐포대식세포 감염 바이러스를 검출 및 증식시키는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 돼지 폐포대식세포주에 서열번호 1의 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT: human telomerase reverse transcriptase) 유전자 도입을 통해 형질전환시켜 제조한 불멸화된 돼지 폐포대식세포주 및 이를 이용하여 폐포대식세포 감염 바이러스를 검출 및 증식시키는 방법에 관한 것이다.
돼지 생식기호흡기증후군(PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome)의 원인체인 PRRS 바이러스는 Arteriviridae 과(family)에 속하며 Coronaviridae 과와 함께 Nidovirales 목(order)으로 분류된다. PRRS 바이러스는 항원적 및 유전학적 특성들에 따라 제1형인 유럽형(European genotype)과 제2형인 북미형(North American genotype)으로 구분되며 이들은 각각 유전자 수준에서 약 60% 정도의 상동성만을 유지하고 있다. 이 바이러스는 주로 숙주 내 폐포대식세포(PAM: porcine alveolar macrophage)에 감염되어 정상적인 면역 기능을 변화시켜 숙주의 방어 반응을 저하시킨다.
이러한 PRRS는 1980년대 말 북미에서 최초로 발생 보고된 이후 국내뿐만 아니라 전 세계 양돈 산업 국가에 만연되어 있는 돼지 전염성 질병으로서 현재까지 막대한 경제적 손실을 유발하고 있다. 이전에는 PRRS 바이러스의 각 유전형에 대한 발생보고가 지역(대륙)적으로 제한된 양상을 보여 왔으나, 현재에는 전 세계적으로 유럽형과 북미형 바이러스가 혼합되어 발생하고 있어 PRRS에 대한 예방을 더 어렵게 하는 실정이다. 국내에서는 1993년에 처음 북미형 PRRS 바이러스가 분리 보고된 이후 최근 들어 유럽형 PRRS 바이러스의 국내 유입과 발생이 확인되면서 더욱 복잡해진 질병 양상을 띠고 있어 향후 국내 양돈 산업이 더 심각한 문제를 야기할 것으로 추측된다.
지금까지는 PRRS 바이러스를 분리하고 배양하는 방법으로서 돼지 폐에서 직접 폐포대식세포를 수거하여 이용하는 초대세포배양(primary cell culture)하는 방법 및 기존 원숭이 신장 세포 유래주인 Marc-145 세포를 사용하는 방법이 이용되어 왔다. 대부분의 북미형 바이러스는 Marc-145 세포주를 이용하여 배양되고 있으나, 이러한 방법은 실제 PRRS 바이러스의 자연 숙주가 아닌 원숭이 유래 세포주라는 한계로 인하여 바이러스 분리 및 바이러스-숙주 상호작용에 관련된 다양한 연구를 수행하는데 많은 제한이 따르고 있는 실정이다. 또한 분리된 유럽형 바이러스를 Marc-145 세포에 맹계대접종(blind-passage)하여 적응시킴으로써 차후 배양할 수는 있지만, 유럽형 및 일부 북미형 PRRS 바이러스 분리와 배양은 Marc-145 세포에서는 상당히 제한적인 것으로 알려져 있다. 따라서, 유럽형 바이러스 분리를 위해서는 돼지 폐유래 초대배양대식세포를 이용하는 것이 일반적이다. 하지만 바이러스 증식이 가능한 초대배양 폐포대식세포의 유효계대수가 1?2회로 매우 짧고 초저온 동결보관 후 해동 시 감수성이 떨어지기 때문에 한번 작성된 초대배양세포의 사용기간이 제한적이므로 매번 필요할 때마다 PRRS 바이러스 등 미생물의 감염 없이 살아 있는 돼지의 폐에서 상기 세포를 추출해서 사용하여야 하는 번거로움이 존재한다.
이런 단점을 극복하고자 최근에 SV40 바이러스 거대 T 항원(large T antigen)을 이용하여 초대배양 폐포대식세포에 불멸화 유도를 통해 돼지폐포대식세포주(PAM cell line)를 구축한 바 있다. 하지만 바이러스 감수성 테스트 결과 다양한 돼지 유래 바이러스들이 이 PAM 세포주에 감수성을 보인 반면에 PRRS 바이러스에 대해서는 감염 및 증식이 불가능하였다. 또한 PRRS 바이러스 세포 수용체인 pCD163을 상기 PAM 세포주에서 발현시켜 PRRS 바이러스 비감수성인 세포주를 바이러스 감염에 감수성 있는 세포주로 개발한 사례도 보고되었으나 돼지의 초대배양 폐포대식세포를 불멸화시켜 효과적으로 PRRS 바이러스, 특히 유럽형 PRRS 바이러스에 감수성 있는 세포주로 개발한 예는 없었다.
이에 본 발명자들은 돼지에서 소모성 질환을 유발하는 주요 원인체인 PRRS 바이러스에 감수성을 보유하는 돼지유래 대식세포주를 구축하고, 이를 이용하여 국내에서 유행하고 있는 PRRS 바이러스를 포함하는 폐포대식세포 감염 바이러스를 분리 및 배양하고자 노력한 결과, 돼지의 초대배양 폐포대식세포주에 서열번호 1의 hTERT 유전자를 삽입하여 형질전환시킴으로써 초대배양세포의 불멸화를 유도함으로써 유럽형 및 북미형 PRRS 바이러스를 포함한 폐포대식세포 감염 바이러스에 대한 감수성 세포를 개발할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 폐포대식세포 감염 바이러스에 대한 감수성을 보유하는 불멸화된 돼지 유래 페포대식세포주를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 돼지 유래 폐포대식세포주를 이용하여 폐포대식세포 감염 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 돼지 폐포대식세포주에 서열번호 1의 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT: human telomerase reverse transcriptase) 유전자가 삽입된 발현벡터를 형질감염시켜 제조한 불멸화된 돼지 폐포대식세포주를 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 불멸화된 돼지 폐포대식세포주를 이용하여 폐포대식세포 감염 바이러스를 검출 및 증식시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 제조한 불멸화된 돼지 폐포대식세포주(PAM-KNU)는 PRRSV 분리 시 흔히 사용되어온 기존의 돼지 폐장 유래 초대배양대식세포(PAM-pCD163) 및 배양세포(Marc-145)의 단점을 모두 극복할 수 있었으며, 유럽형 및 북미형 PRRSV 분리 및 배양은 물론 이를 이용한 진단법과 백신개발 등 다양한 분야에 활용이 가능하여 국내에서 발생되는 PRRSV의 특성 파악 및 이를 통한 PRRS 예방 및 피해를 경감시킬 수 있었다.
도 1은 서열번호 1의 hTERT 유전자 증폭사진이다.
도 2는 서열번호 1의 hTERT 유전자가 삽입된 발현 벡터의 개열지도이다.
도 3은 pFB-Neo-hTERT 발현 벡터를 확인한 사진이다.
도 4는 PAM-KNU 세포주에서의 hTERT 발현을 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 5는 PAM-KNU 세포주에서의 TRAP를 통한 텔로머라아제 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 시간대별 PAM-KNU 세포주의 세포형태 변화를 관찰한 결과이다.
도 7은 PAM-KNU와 PAM-pCD163 세포의 세포성장 곡선이다.
도 8은 웨스턴 블랏을 이용한 PAM-KNU 세포주에서의 pCD163 발현을 확인한 결과이다.
도 9는 형광항체법을 이용한 PAM-KNU 세포주에서의 pCD163 발현을 확인한 결과이다.
도 10은 FACS를 이용한 PAM-KNU 세포주에서의 pCD163 발현을 확인한 결과이다.
도 11은 PAM-KNU 세포주에 유럽형(LV, Type1)와 북미형(VR2332, Type2) PRRS 바이러스 접종 시 세포변성효과(CPE) 및 형광항체법으로 세포내 바이러스가 감염 및 증식을 확인한 결과를 보여준다.
도 12는 PAM-KNU 세포주에 유럽형(LV, Type1)와 북미형(VR2332, Type2) PRRS 바이러스 접종 후 PRRSV ORF7 특이 프라이머를 이용한 바이러스 증식 확인 사진이다.
도 13은 PAM-KNU 및 PAM-pCD163 세포주의 바이러스 감염율을 비교한 그래프이다.
도 2는 서열번호 1의 hTERT 유전자가 삽입된 발현 벡터의 개열지도이다.
도 3은 pFB-Neo-hTERT 발현 벡터를 확인한 사진이다.
도 4는 PAM-KNU 세포주에서의 hTERT 발현을 확인한 RT-PCR 결과이다.
도 5는 PAM-KNU 세포주에서의 TRAP를 통한 텔로머라아제 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 시간대별 PAM-KNU 세포주의 세포형태 변화를 관찰한 결과이다.
도 7은 PAM-KNU와 PAM-pCD163 세포의 세포성장 곡선이다.
도 8은 웨스턴 블랏을 이용한 PAM-KNU 세포주에서의 pCD163 발현을 확인한 결과이다.
도 9는 형광항체법을 이용한 PAM-KNU 세포주에서의 pCD163 발현을 확인한 결과이다.
도 10은 FACS를 이용한 PAM-KNU 세포주에서의 pCD163 발현을 확인한 결과이다.
도 11은 PAM-KNU 세포주에 유럽형(LV, Type1)와 북미형(VR2332, Type2) PRRS 바이러스 접종 시 세포변성효과(CPE) 및 형광항체법으로 세포내 바이러스가 감염 및 증식을 확인한 결과를 보여준다.
도 12는 PAM-KNU 세포주에 유럽형(LV, Type1)와 북미형(VR2332, Type2) PRRS 바이러스 접종 후 PRRSV ORF7 특이 프라이머를 이용한 바이러스 증식 확인 사진이다.
도 13은 PAM-KNU 및 PAM-pCD163 세포주의 바이러스 감염율을 비교한 그래프이다.
본 발명은 기존의 PRRS 바이러스 분리 시 흔히 사용되는 돼지 폐장 유래 초대배양 대식세포를 불멸화시켜 PRRS 바이러스를 보다 용이하게 분리할 수 있도록 제조한 돼지 폐포대식세포주(PAM-KNU)에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 돼지 폐에서 분리한 초대배양 대식세포에 서열번호 1의 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT) 유전자 도입을 통해 형질전환시켜 제조한 불멸화된 돼지 폐포대식세포주(PAM-KNU)를 제조하였다. 보다 상세하게는 상기 세포주는 서열번호 1의 hTERT 유전자가 삽입된 발현 벡터를 돼지 폐포대식세포주에 형질감염시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 발현 벡터는 도 2에 도시된 개열지도의 구성을 갖는 것일 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상기 불멸화된 돼지 폐포대식세포주(PAM-KNU)를 이용하여 폐포대식세포 감염 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 상기 검출 방법은 불멸화된 돼지 폐포대식세포주에 야외 가검물을 첨가하여 배양하는 단계; 및 배양물을 수득하여 불멸화된 돼지 폐포대식세포주에서 증식된 바이러스를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양 과정은 RPMI1640 배지를 이용하여 37℃의 CO2 배양기에서 3?6일 정도 배양하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 폐포대식세포주(PAM-KNU)를 이용하여 폐포대식세포 감염 바이러스를 증식시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 상기 증식 방법은 불멸화된 돼지 폐포대식세포주에 폐포대식세포 감염 바이러스를 첨가하여 배양하는 단계; 및 배양물을 수득하여 증식된 바이러스를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양 과정은 RPMI1640 배지를 이용하여 37℃의 CO2 배양기에서 3?6일 정도 배양하는 것이 바람직하다.
상기 폐포대식세포 감염 바이러스는 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스, 돼지써코 바이러스(1과 2), 동물 및 사람 인플루엔자 바이러스, 돼지싸이토메갈로 바이러스, 수포성구내염 바이러스, 오제스키 바이러스, 돼지열병 바이러스, 돼지수포성질병 바이러스, 돼지폭스 바이러스, 아프리카돼지열병 바이러스, 돼지허피스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 소아데노 바이러스, 돼지아데노 바이러스 또는 벡시니아 바이러스 등을 포함할 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 불멸화된 돼지 폐포대식세포주(PAM-KNU)에서 증식시킨 폐포대식세포 감염 바이러스 또는 그 산물을 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명에 의한 백신은 당업계에 통상적으로 알려진 방법으로 제조가 가능하며, 폐포대식세포주에서 증식시킨 폐포대식세포 감염 바이러스 또는 그 산물을 단독으로 또는 다른 질병 백신주와 혼합한 생백신, 상기 폐포대식세포 감염 바이러스를 불활화한 사독 백신, 상기 폐포대식세포 감염 바이러스의 유전자를 사용하여 생산한 폐포대식세포 감염 바이러스 서브유니트(subunit) 백신, 벡터(vector) 백신, 키메라(chimera) 백신 또는 DNA 백신 등과 같은 다양한 형태로 제조될 수 있으므로, 그 활용도가 매우 넓다. 상기 백신은 당업계에서 통상적으로 사용하는 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제를 포함할 수 있으며, 어쥬번트를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 백신을 접종하는 방법에는 특별한 제한은 없지만, 음수, 점안 또는 분무 방식으로 접종하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] 불멸화된 돼지 폐포대식세포주 제조
<
hTERT
유전자
클로닝
>
돼지 유래 초대배양 폐포대식세포의 불멸화 유도를 위한 시스템을 구축하기 위하여, 서열번호 1의 hTERT 유전자를 이용한 클로닝을 실시하였다. HeLa 세포로부터 토탈 RNA를 TRIzol 킷트(Invitrogen)를 이용하여 추출하였으며, 서열번호 1의 hTERT 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머는 추후 클로닝을 위하여 제한효소를 첨가하여 작성하였다. hTERT를 증폭하기 위한 센스 프라이머는 제한효소 SalⅠ사이트를 5' 말단에 연장시켜 설계하였으며 (5'-GCCGTCGACACCATGCCGCGCGCTCCC-3': 서열번호 2), 안티센스 프라이머 또한 3' 말단에 제한효소 EcoRⅠ사이트를 연장시켜 설계하였다(5'-GCCGAATTCTCAGTCCAGGATGGTCTT-3': 서열번호 3). 상기 프라이머를 이용한 cDNA 합성은 RNA 2 ㎕, 20 pmole의 안티센스 프라이머 및 SuperScriptIII 역전사효소를 이용하여 42℃에서 1시간 반응시켜 합성하였다. 이때 PCR 반응 조건은 94℃에서 5분간 초기변성시킨 후 94℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 3분 30초간 연장시키는 사이클을 30회 실시하였으며, 이후 72℃에서 10분간 연장 반응시켰다. PCR 산물은 0.8% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 확인하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 결과에서 증폭된 유전자가 약 3.4 kb에 해당하는 밴드로 확인되었으며, 이를 pGemTeasy 벡터(Promega)에 클로닝하여 hTERT의 ORF(open reading frame)을 포함하는 플라스미드 pGEM-hTERT를 제작하였다.
<
hTERT
유전자가 삽입된 발현 벡터 제조 >
초대배양 PAM 세포의 불멸화를 유도하기 위해 hTERT 유전자 형질감염(transfection) 기법과 레트로바이러스 유전자 전달(retrovirus gene transfer) 시스템을 응용하였다. 초대배양 PAM 세포에 레트로바이러스 유전자 전달 시스템을 이용하여 hTERT 유전자를 삽입하기 위한 발현벡터를 제조하였다. 이때, 벡터로는 레트로바이러스 발현 플라스미드 벡터인 pFB-Neo(Stratagene)를 이용하였다.
상기 과정에서 제작한 플라스미드 pGEM-hTERT와 pFB-Neo를 SalⅠ및 EcoRⅠ으로 절단하고 1.5% 아가로오스 겔에 전기영동하여 밴드를 확인한 후 겔 추출 키트(gel extraction kit)를 이용하여 절편을 분리하였다. 제한효소로 잘린 hTERT(약 3.4 kb)과 pFB-Neo 벡터(약 9.7 kb)를 결찰(ligation)시켜 최종적으로 도 2에 도시된 개열지도의 구성을 갖는 pFB-Neo-hTERT 발현 벡터를 작성하였으며, 제작된 pFB-Neo-hTERT 발현 벡터를 확인한 결과를 도 3에 나타내었다.
<
불멸화된
돼지
폐포대식세포주
선발 >
레트로바이러스 유전자 전달 시스템을 이용하기 위하여 고역가의 레트로바이러스를 생산하였다. 이를 위해 동종지향성 패키징(ecotropic packaging) 세포주인 HEK-293T 세포주에 상기 과정에서 제작한 pFB-Neo-hTERT 발현 벡터, 피막을 형성하는 수포성 구내염 바이러스 G 당단백질(vesicular stomatitis virus G glycoprotein; pVPack-VSV-G) 및 MMLV(replication-defective Molony Murine Leukemia virus) gag/pol 유전자를 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 형질감염시켰다.
한편, PRRS 바이러스 및 항체 음성의 5주령 돼지의 폐 장기를 적출하고 무균적으로 세척 및 lavage 방법 통해 초대배양 PAM 세포를 준비하였다. 상기 과정에서 생산된 다클론(polyclonal) 레트로바이러스를 상기 초대배양 PAM 세포에 접종하고 48시간 이후에 네오마이신(neomycin; Invitrogen)을 100 ㎍/ml 농도로 첨가하여 선택배양하였다. 네오마이신 처리에 의해 선택된 세포 클론에서 RT-PCR [센스 프라이머 5'-GCACTGGCTGATGAGTGTGT-3'(서열번호 4), 안티센스 프라이머 5'-CTCGGCCCTCTTTTCTCTG-3'(서열번호 5)]을 수행하여 hTERT mRNA 발현 검출을 시도하였다. 이를 위한 cDNA 합성은 RNA 2 ㎕, 20 pmole의 안티센스 프라이머 및 SuperScriptIII 역전사효소를 이용하여 42℃에서 1시간 반응시켜 합성하였다. 이때 PCR 반응 조건은 94℃에서 5분간 초기변성시킨 후 94℃에서 20초간 변성, 55℃에서 20초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 연장시키는 사이클을 40회 실시하였으며, 이후 72℃에서 10분간 연장 반응시켰다. PCR 산물은 0.8% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 확인하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 결과에서, 선택된 클론에서 hTERT 유전자가 성공적으로 세포내에 삽입된 것을 확인하였다.
따라서, hTERT의 mRNA 발현이 확인된 세포 클론을 선발하여 "PAM-KNU"로 명명하였으며, hTERT 삽입을 통해 돼지 초대배양 폐포대식세포를 불멸화 세포로 형질전환시킬 수 있었다.
[시험예 1] PAM - KNU 세포주의 텔로머라아제 발현 지속성 조사
상기 실시예 1에서 제조한 PAM-KNU 세포 클론의 텔로머라아제 활성을 확인하기 위하여, 염색체 말단의 반복증식조사법 TRAP(telomeric repeat amplification protocol) 분석을 실시하였다. 세포 펠릿을 CHAPS 버퍼로 얼음에서 30분간 용해시킨 후 4℃에서 30분간 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액에서 TS 프라이머[AATCCGTCGAGCAGAGTT(서열번호 6)] 및 ACX 프라이머[GCGCGG(CTTACC)3CTAACC(서열번호 7)]를 이용하여 SYBR green 실시간 PCR을 실시하였으며 PCR 반응 조건은 95℃에서 10분간 초기변성시킨 후 95℃에서 20초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 90초간 연장시키는 사이클을 40회 실시하여 바이러스 유전자 검출을 시도하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 결과에서, 상기 실시예 1에서 제조한 PAM-KNU 세포 클론에서 hTERT 유전자가 지속적으로 발현되는 것을 확인하였다.
[시험예 2] PAM - KNU 세포주의 시간대별 세포형태 및 성장률 조사
상기 실시예 1에서 제조한 PAM-KNU 세포의 특성을 조사하기 위하여, 상기 PAM-KNU 세포주를 RPMI1640(10% FBS, 항균-항진균액(antibiotic-antimycotic solutions), 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 1 mM 비필수아미노산(non-essential amino acids)) 배지에 넣고 37℃의 CO2 배양기에서 배양하면서 12, 24, 36, 48 및 60 시간 동안 세포 형태를 관찰하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
또한 PAM-KNU 세포주의 성장률을 확인하기 위하여 각 시간대별로 세포수를 측정하여 작성한 성장 곡선을 도 7에 나타내었다. 도 7의 결과에서, 상기 실시예 1에서 제조한 PAM-KNU 세포주는 기존의 PAM-pCD163 세포주와 비슷한 성장률을 보였으며, 이를 통해 본 발명에서 불멸화 유도를 위하여 삽입한 서열번호 1의 hTERT 유전자가 전반적인 세포 성장률에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
[시험예 3] 불멸화 PAM - KNU 세포주의 CD163 발현 여부 확인
상기 실시예 1에서 제조한 불멸화 PAM-KNU 세포주를 이용하여 PRRS 바이러스의 세포 수용체인 pCD163 단백질 발현 정도를 확인하였다.
먼저, 웨스턴 블랏 기법을 이용하여 pCD163 단백질 검출을 시도하였다. SDS-PAGE에서 얻은 세포단백 분획을 니트로셀룰로오스막에 전이시킨 후 1차 항체로는 항-pCD163 항체를 사용하고 2차 항체로는 염소 항-마우스 IgG-HRP를 사용하여 단백질의 발현 및 분자량을 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8의 결과에서, PAM-KNU 세포에서 약 130 kDa의 pCD163 단백질 밴드를 확인할 수 있었다.
또한 pCD163 단백질의 세포 표면에서의 발현 여부를 확인하기 위하여 형광항체법으로 세포를 관찰하였다. 먼저, 실시예 1의 PAM-KNU 세포를 RPMI1640(10% FBS, 항균-항진균액(antibiotic-antimycotic solutions), 10 mM HEPES, 1 mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 1 mM 비필수아미노산(non-essential amino acids) 배지를 이용하여 37℃의 CO2 배양기에서 배양한 후 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하였으며, 고정된 세포에 항-pCD163 항체를 반응시키고 2차 항체로는 형광항체인 염소 항-마우스 IgG-Alexa Fluor를 사용하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9의 결과에서, 본 발명에 의한 실시예 1의 PAM-KNU 세포 표면이 강하게 염색된 것을 확인할 수 있었다.
또한 상기 실시예 1의 PAM-KNU 세포주의 FACS 분석 결과를 도 10에 나타내었다. 트립신 처리를 통해 펠릿(pellet)화 시킨 PAM-KNU 세포는 1% BSA 및 0.1% 아지드화 나트륨(sodium azide)이 포함된 차가운 인산완충액으로 세척하였다. 이 후 1×106으로 부유시킨 세포에 일차 항-pCD163 항체 또는 정상 마우스 IgG1을 첨가하여 4℃에서 30분간 반응시킨 후 위의 인산완충액으로 세척하였다. 이 후 2차 항체인 Fluor 488-컨쥬게이트된 항-마우스 IgG를 첨가하여 위의 1차 항체와 같은 방식으로 반응 및 세척하였으며, 이 염색된 세포는 2% 포름알데히드 용액으로 고정하여 FACE 분석을 실시하였다. 도 10의 결과에서, 실시예 1의 PAM-KNU 세포 집단에서 95% 이상의 세포 표면에서 pCD163가 발현되었음을 확인하였다. 따라서, 초대배양세포 유래 불멸화가 유도된 실시예 1의 형질전환 PAM-KNU 세포주에서 pCD163 발현에는 변화가 없음을 확인할 수 있었다.
[시험예 4] 형질전환 불멸화 PAM - KNU 세포주의 PRRS 바이러스 감수성 확인
상기 실시예 1의 PAM-KNU 세포주들을 이용하여 PRRS 바이러스(제1형 LV & 제2형 VR-2332)를 감수성 테스트를 실시하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다. 4×105 cell/well로 세포를 부유하여 6웰 플레이트에 넣은 후 24시간 배양하였다. 각각의 바이러스는 0.1 MOI(multiplicity of infection)로 접종한 후 37℃에서 반응시켰다. 1시간 후 인산완충액으로 1회 세포를 세척하였으며, 배양배지를 첨가하여 3-4일간 바이러스를 배양하였다.
도 11의 결과에서, 각 바이러스 접종 후 PAM-KNU 세포주에서 특이적인 세포변성효과(CPE)를 확인할 수 있었으며, PRRS 바이러스 비구조 단백질 NSP2/3 항체 및 구조 단백질 뉴클레오캡시드 단백질 특이 단클론항체(SDOW17)를 이용한 형광항체법에서도 많은 수의 바이러스가 감염된 세포 집단(cell cluster)들을 확인할 수 있었다.
또한 PRRS 바이러스 게놈 복제(genome replication)가 성공적으로 이루어지고 있는지 확인하기 위하여 바이러스에 감염된 세포 상층액을 이용하여 뉴클레오캡시드를 증폭할 수 있는 RT-PCR [제2형 검출용 센스 프라이머(5'-GCCGGAATTCATGCCAAATAACAACGGC-3'; 서열번호 8) 및 안티센스 프라이머(5'-GCCGGGATCCTCATGCTGAGGGTGATGC-3'; 서열번호 9), 제1형 검출용 센스 프라이머(5'-GCCGGGATCCATGGCCGGTAAAAACC-3'; 서열번호 10) 및 안티센스 프라이머(5'-GCCGGGATCCTTAACTTGCACCCTG-3'; 서열번호 11)]을 수행하였다. 이를 위한 각각의 cDNA 합성은 RNA 2 ㎕, 20 pmole의 안티센스 프라이머 및 SuperScriptIII 역전사효소를 이용하여 42℃에서 1시간 반응시켜 합성하였다. 이 후 각 PCR 반응 조건은 94℃에서 5분간 초기변성시킨 후 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 연장시키는 사이클을 40회 실시하였으며, 이후 72℃에서 10분간 연장 반응을 실시하여 바이러스 유전자 검출을 시도하였으며, 그 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.
도 12의 결과에서, 각각의 바이러스에 감염된 PAM-KNU 세포주에서 바이러스 뉴클레오캡시드 유전자가 성공적으로 증폭되었다. 이 결과들은 실시예 1의 불멸화 PAM-KNU 세포주가 PRRS 바이러스에 완전하게 감수성이 있음을 보여준다.
또한 도 13의 결과에서, 기존에 구축한 pCD163 발현 PAM 세포주인 PAM-pCD163과의 감염율 비교에서도 본 발명에 의한 실시예 1의 불멸화 PAM-KNU 세포주의 감염능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에서는 국내의 북미형 및 유럽형 PRRS 바이러스의 유전형과 상관없이 폐포대식세포에 감염되는 다양한 바이러스를 분리 및 배양할 수 있는 돼지 불멸화된 폐포대식세포주(PAM-KNU cell line)를 개발함으로써 국내 및 해외에서 발생하는 폐포대식세포 감염 바이러스의 특성을 파악하고, 이를 통해 적절한 백신 및 진단법의 개발이 용이하도록 해줌으로써 폐포대식세포 감염 바이러스에 의한 질병을 예방하고 이로 인해 가축 농가의 피해를 경감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.
또한 본 발명에서 제공하는 유전자 조작 및 세포 클로닝을 이용한 초대배양 폐포대식세포의 불멸화 유도 과정은 차후 세포 수용체 연구를 포함한 다양한 바이러스-숙주 상호작용 관계 및 바이러스 세포 생물학적 연구들을 진행하는데 있어서 기본연구재료로도 활용될 것으로 기대된다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT: Ministry for Food, Agriculture, Forestry and Fisheries. National Veterinary Research and Quarantine Service(NVRQS))
<120> Immortalized porcine alveolar macrophage cell line and the method
for dectecting and proliferating alveolar macrophage infecting virus using the same
<130> YPD/201012-0022
<160> 11
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 3363
<212> DNA
<213> hTERT gene
<400> 1
atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60
gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120
cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180
gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240
gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300
ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360
agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420
ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480
ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540
gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600
cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660
gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720
ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780
aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840
gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900
cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960
tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020
ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080
gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140
cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200
gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260
ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320
gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380
gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440
aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500
gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560
cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620
ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680
ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740
tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800
ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860
ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920
ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980
ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040
ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100
gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gacaggctca cggaggtcat cgccagcatc 2160
atcaaacccc agaacacgta ctgcgtgcgt cggtatgccg tggtccagaa ggccgcccat 2220
gggcacgtcc gcaaggcctt caagagccac gtctctacct tgacagacct ccagccgtac 2280
atgcgacagt tcgtggctca cctgcaggag accagcccgc tgagggatgc cgtcgtcatc 2340
gagcagagct cctccctgaa tgaggccagc agtggcctct tcgacgtctt cctacgcttc 2400
atgtgccacc acgccgtgcg catcaggggc aagtcctacg tccagtgcca ggggatcccg 2460
cagggctcca tcctctccac gctgctctgc agcctgtgct acggcgacat ggagaacaag 2520
ctgtttgcgg ggattcggcg ggacgggctg ctcctgcgtt tggtggatga tttcttgttg 2580
gtgacacctc acctcaccca cgcgaaaacc ttcctcagga ccctggtccg aggtgtccct 2640
gagtatggct gcgtggtgaa cttgcggaag acagtggtga acttccctgt agaagacgag 2700
gccctgggtg gcacggcttt tgttcagatg ccggcccacg gcctattccc ctggtgcggc 2760
ctgctgctgg atacccggac cctggaggtg cagagcgact actccagcta tgcccggacc 2820
tccatcagag ccagtctcac cttcaaccgc ggcttcaagg ctgggaggaa catgcgtcgc 2880
aaactctttg gggtcttgcg gctgaagtgt cacagcctgt ttctggattt gcaggtgaac 2940
agcctccaga cggtgtgcac caacatctac aagatcctcc tgctgcaggc gtacaggttt 3000
cacgcatgtg tgctgcagct cccatttcat cagcaagttt ggaagaaccc cacatttttc 3060
ctgcgcgtca tctctgacac ggcctccctc tgctactcca tcctgaaagc caagaacgca 3120
gggatgtcgc tgggggccaa gggcgccgcc ggccctctgc cctccgaggc cgtgcagtgg 3180
ctgtgccacc aagcattcct gctcaagctg actcgacacc gtgtcaccta cgtgccactc 3240
ctggggtcac tcaggacagc ccagacgcag ctgagtcgga agctcccggg gacgacgctg 3300
actgccctgg aggccgcagc caacccggca ctgccctcag acttcaagac catcctggac 3360
tca 3363
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer
<400> 2
gccgtcgaca ccatgccgcg cgctccc 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer
<400> 3
gccgaattct cagtccagga tggtctt 27
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer
<400> 4
gcactggctg atgagtgtgt 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer
<400> 5
ctcggccctc ttttctctg 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TS primer
<400> 6
aatccgtcga gcagagtt 18
<210> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACX primer
<400> 7
gcgcggctta cccttaccct taccctaacc 30
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer
<400> 8
gccggaattc atgccaaata acaacggc 28
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 9
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<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense primer
<400> 10
gccgggatcc atggccggta aaaacc 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense primer
<400> 11
gccgggatcc ttaacttgca ccctg 25
Claims (8)
- 돼지 폐포대식세포주에 서열번호 1의 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT: human telomerase reverse transcriptase) 유전자가 삽입된 발현벡터를 형질감염시켜 제조한 불멸화된 돼지 폐포대식세포주.
- 제 1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 2에 도시된 구성을 갖는 것임을 특징으로 하는 불멸화된 돼지 폐포대식세포주.
- 제 1항 또는 제 2항에 의한 불멸화된 돼지 폐포대식세포주를 이용하여 폐포대식세포 감염 바이러스를 검출하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 폐포대식세포 감염 바이러스는 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스, 돼지써코 바이러스(1과 2), 동물 및 사람 인플루엔자 바이러스, 돼지싸이토메갈로 바이러스, 수포성구내염 바이러스, 오제스키 바이러스, 돼지열병 바이러스, 돼지수포성질병 바이러스, 돼지폭스 바이러스, 아프리카돼지열병 바이러스, 돼지허피스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 소아데노 바이러스, 돼지아데노 바이러스 및 벡시니아 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 의한 불멸화된 돼지 폐포대식세포주에서 폐포대식세포 감염 바이러스를 증식시키는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 폐포대식세포 감염 바이러스는 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스, 돼지써코 바이러스(1과 2), 동물 및 사람 인플루엔자 바이러스, 돼지싸이토메갈로 바이러스, 수포성구내염 바이러스, 오제스키 바이러스, 돼지열병 바이러스, 돼지수포성질병 바이러스, 돼지폭스 바이러스, 아프리카돼지열병 바이러스, 돼지허피스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 소아데노 바이러스, 돼지아데노 바이러스 및 벡시니아 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항에 의한 불멸화된 돼지 폐포대식세포주에서 증식시킨 폐포대식세포 감염 바이러스 또는 그 산물을 포함하는 백신.
- 제 7항에 있어서, 상기 폐포대식세포 감염 바이러스는 돼지 생식기호흡기증후군 바이러스, 돼지써코 바이러스(1과 2), 동물 및 사람 인플루엔자 바이러스, 돼지싸이토메갈로 바이러스, 수포성구내염 바이러스, 오제스키 바이러스, 돼지열병 바이러스, 돼지수포성질병 바이러스, 돼지폭스 바이러스, 아프리카돼지열병 바이러스, 돼지허피스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 소아데노 바이러스, 돼지아데노 바이러스 및 벡시니아 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 백신.
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015086739A1 (en) * | 2013-12-12 | 2015-06-18 | Intervet International B.V. | Immortalized porcine alveolar macrophage |
| KR20150085322A (ko) * | 2014-01-15 | 2015-07-23 | 경북대학교 산학협력단 | 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5), 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 검정 키트 |
| KR20200093899A (ko) | 2019-01-29 | 2020-08-06 | 건국대학교 산학협력단 | 불멸화된 돼지 폐대식세포주 및 이를 이용한 항원성 펩타이드의 검출 방법 |
| EP4043030A4 (en) * | 2019-10-11 | 2023-11-08 | National Agriculture And Food Research Organization | MANUFACTURING METHOD AND DETECTION METHOD FOR AFRICAN SWINE FEVER VIRUS |
-
2010
- 2010-12-31 KR KR1020100139967A patent/KR20120077858A/ko active Search and Examination
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015086739A1 (en) * | 2013-12-12 | 2015-06-18 | Intervet International B.V. | Immortalized porcine alveolar macrophage |
| CN105793416A (zh) * | 2013-12-12 | 2016-07-20 | 英特维特国际股份有限公司 | 永生化的猪肺泡巨噬细胞 |
| RU2683544C1 (ru) * | 2013-12-12 | 2019-03-28 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Иммортализованный макрофаг |
| KR20150085322A (ko) * | 2014-01-15 | 2015-07-23 | 경북대학교 산학협력단 | 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5), 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 검정 키트 |
| KR20200093899A (ko) | 2019-01-29 | 2020-08-06 | 건국대학교 산학협력단 | 불멸화된 돼지 폐대식세포주 및 이를 이용한 항원성 펩타이드의 검출 방법 |
| EP4043030A4 (en) * | 2019-10-11 | 2023-11-08 | National Agriculture And Food Research Organization | MANUFACTURING METHOD AND DETECTION METHOD FOR AFRICAN SWINE FEVER VIRUS |
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