CN110904055B - 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株prrsv-sp及其制备方法与应用 - Google Patents

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株prrsv-sp及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV‑SP及其制备方法与应用。本发明将疫苗株SP的T3448A位点突变，得到重组疫苗株PRRSV‑SP。本发明将一株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒湖北分离株HUB2的主要结构蛋白GP5和M的基因ORF5和ORF6放进重组疫苗株PRRSV‑SP相应编码区域进行表达，获得了嵌合毒株vSP‑Hub2。本发明提供的重组疫苗株PRRSV‑SP和嵌合毒株vSP‑Hub2没有明显的致病性，可以作为进一步研究弱毒疫苗及PRRSV毒株变异机制的基础材料，通过感染性克隆系统构建新的弱毒疫苗株的成功，也可用于制备抗PRRSV同源以及异源毒株的新型高效广谱疫苗。

Description

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP及其制备方法 与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合重组疫苗株PRRSV-SP及其制备方法与应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状的病毒性传染病，具有发病急、传染性强、致死率高的特点。PRRSV感染对全球的养猪业每年都造成巨大经济损失。目前，主要使用灭活疫苗和弱毒疫苗控制PRRSV感染。但灭活苗对异源毒株免疫效果较差，接种剂量较大，免疫次数多，成本高，需要一定时间才能产生免疫力；弱毒苗虽然对同源毒株效力较高，但对异源毒株效果却不显著。因此，开发具有高效广谱作用的疫苗尤为重要，而利用反向遗传技术建立PRRSV感染性克隆系统并应用感染性克隆系统构建突变或重组病毒是开发这类疫苗可行的策略。
PRRSV疫苗株SP的全基因组测序和比较已完成，但其感染性克隆在此工作之前尚未建立，这大大阻碍了有关病毒与宿主相互作用方面的研究，使其人工对病毒进行精准改造的工作不能进行，从而严重影响新一代高效广谱疫苗的研发。因此，本发明针对疫苗株SP构建了新的感染性克隆系统。鉴于疫苗株SP对异源毒株保护效力有限，而广谱疫苗主要需要提高PRRSV次要结构蛋白GP2、GP3、GP4等产生的中和抗体共同作用。所以应用猪繁殖与呼吸综合征感染性克隆系统对疫苗株SP的主要结构蛋白GP5和M进行定向的改造和替换强毒株的结构蛋白，从而构建了新的嵌合疫苗株，进而可以通过多种疫苗株之间的协同作用来产生广谱的中和抗体，从而为PRRS新型广谱高效疫苗的研发提供了新的途径。
发明内容
本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一株猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP。
本发明的另一目的在于提供上述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的制备方法与应用。
本发明的再一目的在于提供以上述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP为载体构建的嵌合毒株vSP-Hub2。
本发明的目的通过下列技术方案实现：一株猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP，是将疫苗株SP的T3448A位点突变得到，该突变作为一个分子标记，导致疫苗株SP该位置原有一个的BsmBI酶切位点突变后则不被BsmBI酶切。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的氨基酸序列参见疫苗株SP的蛋白编码序列(CDS)，GenBank登录号为AF184212.1。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
上述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的制备方法，是将疫苗株SP的RNA逆转录获得第一链cDNA，将其全长cDNA分为大小适中的片段，然后分别克隆进对应的质粒，重组质粒转化大肠杆菌，扩增后提取各片段，连接各片段，得到重组疫苗株PRRSV-SP的全长cDNA，体外转录并电转染细胞，获得重组疫苗株PRRSV-SP；具体包括以下步骤：
(1)以疫苗株SP的cDNA作为模板，扩增横跨重组疫苗株PRRSV-SP全基因组的A、B、C、D 4个片段，克隆入质粒中，得到重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D；在构建过程中，对片段做以下改造：
1)将酶切位点BsmBI、NotI以及T7启动子引入A片段的始端；
2)将B片段在3448nt位的T核苷酸通过一个点突变换成A以消除在此位点的BsmBI酶切位点，此位点同时作为重组疫苗株PRRSV-SP的一个标记位点；
3)将酶切位点BsmBI分别引入D片段的始端和末端；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D扩增，提取质粒，采用BsmBI酶切，回收对应片段，用T4 DNA连接酶进行连接，得到5’端含T7启动子，3’端含35个碱基A的重组疫苗株PRRSV-SP的全长cDNA；
(3)将步骤(2)得到的重组疫苗株PRRSV-SP的全长cDNA纯化，之后作为模板进行体外转录，得到全长转录本，即为重组疫苗株PRRSV-SP的mRNA；
(4)将步骤(3)得到的重组疫苗株PRRSV-SP的mRNA电转染细胞，培养，当细胞出现50％以上凋亡时-80℃冻融三次，离心，取上清，即得到重组疫苗株PRRSV-SP。
步骤(1)中所述的片段A覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第1～3130位核苷酸。
步骤(1)中所述的片段B覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第3058～5720位核苷酸。
步骤(1)中所述的片段C覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第5690～10581位核苷酸。
步骤(1)中所述的片段D覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第10576～15520位核苷酸。
步骤(1)中所述的质粒为pCR-TOPO-2.1或pCR-XL-TOPO。
步骤(1)中所述的片段A适用的质粒优选为pCR-TOPO-2.1。
步骤(1)中所述的片段B适用的质粒优选为pCR-TOPO-2.1。
步骤(1)中所述的片段C适用的质粒优选为pCR-XL-TOPO。
步骤(1)中所述的片段D适用的质粒优选为pCR-XL-TOPO。
步骤(1)中所述的片段A、片段B、片段C和片段D是以cDNA为模板，采用特异性引物和高保真DNA聚合酶扩增得到。
所述的特异性引物按照A、B、C、D 4个片段的顺序依次如下：
F1:5’-gcgtctcgcggccgctaatacgactcactataggatgacgtataggtgttggct-3’；
R1:5’-cacttcaagaacgtccccgt-3’；
F2:5’-gtctgcatcctcgcatactg-3’；
R2:5’-gaagggacccgagctgagac-3’；
F3:5’-ctgtttaccccgtctcagct-3’；
R3:5’-gcgtctcatcacagatattctgtcc-3’；
F4:5’-gcgtctctgtgatgccatccagcc-3’；
R4:5’-gcgtctctttttt(30)aatttcggccgcatggttt-3’。
所述的cDNA是以提取的疫苗株SP的RNA为模板，逆转录获得。
所述的疫苗株SP的RNA提取前先通过以下步骤处理：用商品化的疫苗株SP感染细胞(方法见文献“吕永钢[1],et al.不同接毒方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖效果比较”)，继续培养3～4天，当细胞出现50％以上凋亡时置于-80℃冻存；将细胞连同培养基冻融三次，收获病毒液，6000rpm、4℃离心15min，将上清液加入含有质量体积比为20％的蔗糖的TNE缓冲液，150,000g、4℃离心2h，将沉淀悬浮于TNC缓冲液，于-80℃保存(病毒的纯化见文献“Shen,S.,et al.Determination of the complete nucleotide sequence of avaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus andidentification of the Nsp2 gene with a unique insertion.”)。
所述的细胞优选为Marc-145和BHK21细胞中的一种。
所述的TNC缓冲液的配制：100mM NaCl、2mMCaCl2、20mM Tris-HCl，pH 7.4。
步骤(2)中所述的扩增是将重组质粒转化入大肠杆菌中进行扩增。
步骤(2)中所述的连接所用的各片段的摩尔浓度相同。
步骤(3)中所述的纯化是采用苯酚/氯仿/异戊醇抽提纯化。
步骤(3)中所述的体外转录的反应体系和反应条件为：5×缓冲液4μL、2×NTP/CAP(CAP:GTP＝1:3)10μL、30mMGTP1.5μL，模板2.5μL、T7RNA聚合酶2uL，37℃孵育3h。
步骤(4)中所述的细胞的制备步骤如下：用含10％(v/v)FBS的MEM培养基培养Marc-145或BHK21细胞生长密度达到90％，胰酶消化，采用预冷的PBS悬浮，4℃条件下500g离心5min，弃上清，用预冷的PBS悬浮，重复离心一次，弃上清，采用预冷的PBS重悬细胞。
所述的PBS的配制：80mM Na2HPO4、20mM NaH2PO4、100mM NaCl，pH7.5。
步骤(4)中所述的电转染细胞的条件如下：4mm电击杯、450V、50μF条件下进行一次脉冲。
步骤(4)中所述的培养是将含2％(v/v)FBS的DMEM培养基加入电转后的细胞，培养3～4天得到。
步骤(4)中所述的重组疫苗株PRRSV-SP于-80℃保存。
上述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP在研究PRRSV毒株变异机制和/或制备弱毒疫苗中的应用。
所述的制备弱毒疫苗包括利用利用弱毒疫苗株的复制酶系统和高致病性毒株的结构蛋白区域之间的嵌合互补作用来开发抗PRRSV同源以及异源毒株的新型高效广谱疫苗。
一株嵌合毒株vSP-Hub2，为利用上述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP制备得到。
所述的嵌合毒株vSP-Hub2的获得具体是将一株高致病性猪蓝耳病病毒湖北分离株HUB2的主要结构蛋白GP5和M的基因ORF5和ORF6放进重组疫苗株PRRSV-SP的第13897位～15008位编码区域得到。
所述的嵌合毒株vSP-Hub2的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。
上述嵌合毒株vSP-Hub2的制备方法包括以下步骤：
(1)扩增横跨嵌合毒株vSP-Hub2全基因组的A、B、C、D1、Hub2、N6个片段，克隆入质粒中，得到重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D1、重组质粒Hub2、重组质粒N；在构建过程中，对片段做以下改造：
1)将酶切位点BsmBI、Not I以及T7启动子引入A片段的始端；
2)在D1片段的始端和片段N的末端分别引入一个BsmBI酶切位点；
3)将片段Hub2放入重组疫苗株PRRSV-SP的相应编码区域(13897-15008nt)；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D1、重组质粒Hub2、重组质粒N扩增，提取质粒，酶切，回收，连接，得到5’端含T7启动子，3’端含35个碱基A的嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA；
(3)将步骤(2)得到的嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA纯化，体外转录，得到重组疫苗株PRRSV-SP的mRNA，电转至细胞，培养，当细胞出现50％以上凋亡时-80℃冻融3次，取上清感染细胞，重复冻融和感染的步骤3次，取上清，即得嵌合毒株vSP-Hub2。
步骤(1)中所述的片段A、片段B、片段C、片段D1、片段Hub2、片段N是以cDNA为模板，采用特异性引物和高保真DNA聚合酶扩增得到。
步骤(1)中所述的片段A覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第1～3130位核苷酸。
步骤(1)中所述的片段B覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第3058～5720位核苷酸。
步骤(1)中所述的片段C覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第5690～10581位核苷酸。
步骤(1)中所述的片段D1覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第10576～13902位核苷酸。
步骤(1)中所述的片段Hub2覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第13897～15008位核苷酸。
步骤(1)中所述的片段N覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒的第15004～15520位核苷酸。
步骤(1)中所述的载体为pCR-TOPO-2.1、pCR-XL-TOPO、pUCIDT或pGEM。
步骤(1)中所述的片段A适用的质粒优选为pCR-TOPO-2.1。
步骤(1)中所述的片段B适用的质粒优选为pCR-TOPO-2.1。
步骤(1)中所述的片段C适用的质粒优选为pCR-XL-TOPO。
步骤(1)中所述的片段D1适用的质粒优选为pGEM。
步骤(1)中所述的片段Hub2适用的质粒优选为pUCIDT。
步骤(1)中所述的片段N适用的质粒优选为pGEM。
所述的特异性引物按照A、B、C、D1、N5个片段的顺序依次如下：
F5:5’-gcgtctcgcggccgctaatacgactcactataggatgacgtataggtgttggct-3’；
R5:5’-cacttcaagaacgtccccgt-3’；
F6:5’-gtctgcatcctcgcatactg-3’；
R6:5’-gaagggacccgagctgagac-3’；
F7:5’-ctgtttaccccgtctcagct-3’；
R7:5’-gcgtctcatcacagatattctgtcc-3’；
F8:5’-gcgtctctgtgatgccatccagcc-3’；
R8 5’-atcgtctccaacatacttaaacattc-3’；
F9:5’-aacgtctcaaataacaacggcaaac-3’；
R9:5’--gcgtctctttttt(30)aatttcggccgcatggttt-3’。
所述的cDNA是以提取的疫苗株SP的RNA为模板，逆转录获得。
步骤(2)中所述的酶切具体为：重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C以及重组质粒N采用BsmBI酶切；重组质粒D1采用BsmBI和ScaI双酶切；重组质粒Hub2采用BsaI酶切。
步骤(2)和(3)中所述的扩增、连接纯化、体外转录、电转以及培养的步骤与上述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的制备方法中的步骤相同。
所述的嵌合毒株vSP-Hub2的氨基酸序列中：GP5和M的蛋白编码序列参见HUB2的GP5和M蛋白编码序列，GenBank登录号为EF112446.1；GP5和M以外的其他蛋白编码序列参见SP蛋白编码序列，GenBank登录号为AF184212.1。
上述嵌合毒株vSP-Hub2在研究PRRSV毒株变异机制和/或制备弱毒疫苗中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一株猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP和一株以重组疫苗株为载体的嵌合毒株vSP-Hub2。该重组疫苗株PRRSV-SP和嵌合毒株vSP-Hub2没有明显的致病性，可以作为进一步研究弱毒疫苗及PRRSV毒株变异机制的基础材料。
(2)本发明的制备方法可快速获得重组病毒。全基因组DNA分布在多个亚克隆中，每个亚克隆包含的基因组不大。因此，PCR产物不大，所以在PCR反应的过程中不易随机引入错误，克隆容易成功；此外，精准突变或局部基因的替换更易操作。
(3)通过本发明的重组疫苗株PRRSV-SP为载体构建的嵌合毒株vSP-Hub2，可以人为地对病毒基因进行定位修改，从而获得既有较强免疫能力又致病性较低的理想病毒疫苗株，利用弱毒疫苗株的复制酶系统和高致病性毒株的结构蛋白区域之间的嵌合互补作用来开发抗PRRSV同源以及异源毒株的新型高效广谱疫苗。
附图说明
图1是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的感染性克隆构建流程图。
图2是重组疫苗株PRRSV-SP的cDNA片段酶切示意图；其中，图(A)是酶切产物的电泳照片图，圈出的片段为目的片段；图(B)是A、B1、B2、C、D各片段的位置示意图。
图3是嵌合毒株vSP-Hub2的感染性克隆构建流程图。
图4是嵌合毒株vSP-Hub2的cDNA片段及酶切示意图；其中，图(A)是酶切产物的电泳照片图，圈出的片段为目的片段；图(B)是A、B1、B2、C、D1、Hub2、N各片段的位置示意图。
图5是重组疫苗株PRRSV-SP和嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA连接产物凝胶电泳图。
图6是重组疫苗株PRRSV-SP和嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA体外转录产物凝胶电泳图。
图7是重组疫苗株PRRSV-SP突变位点测序图。
图8是嵌合毒株vSP-Hub2的GP5M蛋白基因(ORF5-6)测序图。
图9是免疫细胞化学法检测重组疫苗株PRRSV-SP滴度的结果照片图；其中，照片图旁的数值分别为稀释倍数和病变计数结果，病变计数结果的分子为出现CPE孔数，分母为每个稀释度的总孔数。
图10是免疫细胞化学法验证嵌合毒株vSP-Hub2滴度的结果照片图；其中，照片图旁的数值分别为稀释倍数和病变计数结果，病变计数结果的分子为出现CPE孔数，分母为每个稀释度的总孔数。
具体实施方式
下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的感染性克隆的构建
首先，构建4个质粒，这些质粒包含横跨整个重组疫苗株PRRSV-SP基因组的5个片段A、B1、B2、C和D(B1和B2是Bm片段的两部分，Bm片段内在含有BsmBI酶切位点，因此被酶切分成B1和B2片段)。如图1所示。在片段A的始端分别引入一个BsmBI和NotI酶切位点以及一个T7启动子，利用T7RNA聚合酶进行体外转录，具体步骤(图1)如下：
(1)用商品化的疫苗株SP(购自Schering-Plough Animal Health公司)感染Marc-145细胞(购自美国ATCC公司)，接毒方法见文献“吕永钢,et al.不同接毒方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖效果比较。”接毒后继续培养3～4天，当细胞出现50％以上凋亡时置于-80℃冰箱冻存，将细胞连同培养基冻融三次，收获病毒液后，对病毒进行纯化。病毒的纯化见文献“Shen,S.,et al.Determination of the complete nucleotide sequence of avaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus andidentification of the Nsp2gene with a unique insertion.”。
(2)从步骤(1)获得的细胞中提取疫苗株SP病毒RNA(按照Qiagen公司RNeasy Minikit试剂盒的说明书提取)，以此病毒RNA用作模板，通过逆转录获得第一链cDNA(Qiagen公司QuantiTect Reverse Transcription Kit)。以此cDNA为模板，用重组疫苗株PRRSV-SP的特异性引物(IDT Singapore公司合成)进行PCR反应扩增出重组疫苗株PRRSV-SP的全长cDNA片段。然后将PCR产物纯化并分别将它们克隆进相应的质粒pCR-TOPO2.1和pCR-XL-TOPO(Invitrogen公司)中，获得相应的重组质粒pTOPO-SP-A、pTOPO-SP-Bm、pXL-SP-C和pXL-SP-D。
构建重组疫苗株PRRSV-SP全长感染性克隆的质粒名称、含重组疫苗株PRRSV-SP序列在疫苗株SP全基因组的位置(起始-终止)、各片段在质粒内的方向、在母株的基础上所做的修改、用于PCR链反应的特异性引物如表1所示。
表1
(3)将步骤(2)构建的4个重组质粒分别转化大肠杆菌DH5α或TOP10并扩增，用质粒提取试剂盒(Qiagen)提取质粒后送测序公司(IDT Singapore公司)测序。测序正确的4个质粒分别用BsmBI酶切，片段跑DNA胶分离，用胶回收试剂盒(Omega)回收图2(A)中圈出的大小正确的片段1A、2B1、2B2、3C、4D(各片段的位置见图2(B)，即覆盖重组疫苗株PRRSV-SP全长基因组的cDNA片段。
表2
(4)胶回收纯化5个片段1A、2B1、2B2、3C、4D，在16℃下用T4 DNA连接酶(NEB)连接过夜。各片段的摩尔浓度需保持一致，各片段加入量比例见表3。
表3
cDNA片段 bp ng ng
1A 3119 400 1000
2B1 916 118 294
2B2 1697 218 544
3C 4870 625 1561
4D 4974 638 1595
(5)将步骤(4)中得到的连接产物用苯酚/氯仿/异戊醇抽提纯化(参照《分子克隆》操作)。纯化后的产物即为重组疫苗株PRRSV-SP的全长cDNA，其5’端含T7启动子，3’端含35个碱基A。将全长cDNA用作体外转录的模板，使用高产量加帽RNA转录试剂盒(mMmessagemMachine T7 kit，Ambion)在体外生成全长转录本。转录反应20μL标准体系：取5×缓冲液4μL、2×NTP/CAP(CAP:GTP＝1:3)10μL、30mMGTP1.5μL，模板cDNA(纯化后的重组疫苗株PRRSV-SP的全长cDNA)2.5μL、T7RNA聚合酶2uL，37℃孵育3h，得到体外转录的重组疫苗株PRRSV-SP的mRNA。转录反应体系见表4。
表4
组分 体积/μL
5×反应缓冲液 4
2×NTP/CAP(CAP:GTP＝1:3) 10
30mM GTP 1.5
模板cDNA 2.5
T7 RNA聚合酶 2
总体系 20
(6)用含10％(v/v)FBS的MEM培养基培养Marc-145或BHK21细胞生长密度达到90％，胰酶(Gibco)胰酶消化，再用预冷的PBS(80mM Na2HPO4、20mM NaH2PO4、100mM NaCl，pH7.5)悬浮，4℃条件下500g离心5min，弃去上清，再用预冷的PBS悬浮，重复离心一次，弃去上清后用预冷的PBS重悬细胞。将步骤(5)得到的体外转录的重组疫苗株PRRSV-SP的mRNA与400μL Marc-145或BHK21悬浮细胞(约2×106个细胞/mL)混匀加入预冷好的4mm电击杯(Bio-Rad)，在450V、50μF的条件下用Bio-Rad Gene Pulser II电转。电转后的细胞加含2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(Gibco)培养3～4天，当细胞出现50％以上凋亡时置于-80℃冰箱冻存。将细胞连同培养基冻融三次，离心，取上清，即得到了重组疫苗株PRRSV-SP的病毒液，于-80℃保存。
实施例2嵌合毒株vSP-Hub2感染性克隆的构建
首先，构建6个质粒，这些质粒包含横跨整个嵌合毒株vSP-Hub2基因组的7个片段(A、B1、B2、C、D1、Hub2、N)，如图3所示。在片段A的始端分别引入一个BsmBI和NotI酶切位点以及一个T7启动子。利用T7RNA聚合酶进行体外转录，具体步骤(图3)如下：
(1)质粒pTOPO-SP-A，pTOPO-SP-Bm，pXL-SP-C的构建见实施例1。
(2)以实施例1中获得的重组疫苗株PRRSV-SP的全长cDNA为模板，通过使用特异性引物(表4)和高保真DNA聚合酶(High Fidelity PCR)试剂盒进行聚合酶链反应，扩增并获得嵌合毒株vSP-Hub2核苷酸片段D1(10576-13902nt)和N(15004-15520nt)，然后分别将它们克隆进对应的质粒pGEM，获得相应的重组质粒pGEM-SP-D1和pGEM-SP-N。片段Hub2(13897-15008nt)在新加坡IDT合成，克隆出来的重组质粒是pUCIDT-Hub2。
重组质粒名称、含嵌合毒株vSP-Hub2序列在重组疫苗株PRRSV-SP全基因组的位置、用于PCR链反应的特异引物如表5所示。
表5
(3)将构建的6个质粒分别转化大肠杆菌DH5α或TOP10并扩增，用质粒提取试剂盒(Qiagen)提取质粒后送测序公司(IDT Singapore公司)测序。将pTOPO-SP-A、pTOPO-SP-Bm、pXL-SP-C和pGEM-SP-N这4个质粒分别用BsmBI酶切，pGEM-SP-D1用BsmBI和ScaI双酶切，pUCIDT-Hub2用BsaI酶切。将酶切片段跑DNA胶分离，用胶回收试剂盒(Omega)回收图4(A)中圈出的大小正确的片段条带1A、2B1、2B2、3C、4Dx(D1)、4Dy(Hub2)、4Dz(N)，即覆盖嵌合毒株vSP-Hub2全长基因组的cDNA片段(各片段的位置见图4(B)，因Bm片段含一个内在BsmBI酶切位点，因此酶切后被分成了B1和B2片段。)将这7个片段用T4 DNA连接酶(NEB)连接起来即得到重组疫苗株PRRSV-SP和嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA(图5)，其5’端含T7启动子，3’端含35个碱基A。引物合成和核苷酸测序由IDT Singapore公司完成。各cDNA片段、对应质粒、载体抗性、所用感受态细胞及内切酶如表6所示。
表6
(4)胶回收纯化7个片段1A、2B1、2B2、3C、4Dx、4Dy、4Dz，在16℃下用T4 DNA连接酶(NEB)连接过夜，各片段的摩尔浓度需保持一致，各片段加入量比例见表7。
表7
cDNA片段 bp ng ng
1A 3119 400 1000
2B1 916 118 294
2B2 1697 218 544
3C 4870 625 1561
4Dx 3321 426 1065
4Dy 1106 142 355
4Dz 547 70 175
(5)将步骤(4)中得到的连接产物用苯酚/氯仿/异戊醇抽提纯化(参照《分子克隆》操作)。纯化后的产物即为嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA，将其用作体外转录的模板，使用高产量加帽RNA转录试剂盒(mMmessage mMachinekit，Ambion)在体外生成重组疫苗株PRRSV-SP和嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA转录本(图6)。转录反应20μL标准体系：取5×缓冲液4μL、2×NTP/CAP(CAP:GTP＝1:3)10μL、30mMGTP1.5μL、模板cDNA(纯化后的嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA)2.5μL、T7RNA聚合酶2uL进行体外转录，37℃孵育3h，得到体外转录的嵌合毒株vSP-Hub2的mRNA。转录反应体系见表4。
(6)用含10％(v/v)FBS的MEM培养基培养Marc-145或BHK21细胞生长密度达到90％，胰酶(Gibco)胰酶消化后再用预冷的PBS(80mM Na2HPO4、20mM NaH2PO4、100mM NaCl，pH7.5)悬浮，4℃条件下500g离心5min，弃去上清，再用预冷的PBS悬浮。重复离心一次，弃去上清后用预冷的PBS重悬细胞。将步骤(5)得到的体外转录的嵌合毒株vSP-Hub2的mRNA与400μL悬浮细胞(约2×106个细胞/mL)混匀加入预冷好的4mm电击杯(Bio-Rad)，在450V、50μF的条件下用Bio-Rad Gene Pulser II电转。电转后的细胞加含2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(Gibco)培养3～4天。当细胞出现50％以上凋亡时置于-80℃冰箱冻存。将细胞连同培养基冻融三次，离心，取上清，即得到嵌合毒株vSP-Hub2的病毒液，于-80℃保存。
实施例3重组病毒测序验证
(1)重组疫苗株PRRSV-SP的验证。
将实施例1步骤(6)电转得到的重组疫苗株PRRSV-SP感染Marc-145或BHK21细胞，接毒方法见文献“吕永钢,et al.不同接毒方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖效果比较。”接毒后继续培养3～4天，待细胞出现50％以上凋亡时置于-80℃冰箱冻存。将细胞连同培养基冻融三次后离心，取上清，重复感染两次。收取第3次感染后的上清，即为重组疫苗株PRRSV-SP，冻存。将感染后的细胞提取总RNA。将此RNA用作模板，用特异引物(PRRSV-T3448A-F和PRRSV-T3448A-R)进行RT-PCR。其PCR产物用BsmBI酶切后跑胶仍为原产物的单一片段，将PCR产物测序，测序结果与疫苗株SP序列比较，结果显示，重组疫苗株PRRSV-SP相比疫苗株SP有一个特异性的位点突变T3448A，该突变作为一个分子标记，导致疫苗株SP该位置原有的一个BsmBI酶切位点失效。
PRRSV-T3448A-F:5’-acgttcttgaagtggaggagc-3’；
PRRSV-T3448A-R:5’-aacctgacggcttagtaggtc-3’。
(2)重组嵌合毒株vSP-Hub2的验证。
将实施例1步骤(6)电转得到的嵌合毒株vSP-Hub2感染Marc-145或BHK21细胞，接毒方法见文献“吕永钢,et al.不同接毒方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖效果比较。”接毒后继续培养3～4天，待细胞出现50％以上凋亡时置于-80℃冰箱冻存。将细胞连同培养基冻融三次后离心，取上清，重复感染两次。收获第3次感染后的上清，即为嵌合毒株vSP-Hub2，冻存。将感染后的细胞用于提取总RNA。将此RNA用作模板，用特异引物(PRRSV-GP5M-SeqF和PRRSV-GP5M-SeqR)作RT-PCR。将PCR产物测序，测序结果与重组疫苗株PRRSV-SP序列比较。结果显示，嵌合毒株vSP-Hub2的GP5M蛋白基因序列(ORF5-6)与重组疫苗株PRRSV-SP的GP5M蛋白基因序列(ORF5-6)不一致，其GP5M蛋白基因序列(ORF5-6)为高致病性猪蓝耳病病毒湖北分离株(HUB2)的GP5-M蛋白基因序列(ORF5-6)(图8)。
PRRSV-GP5M-SeqF：5’-gatcatgtgcggctgctc-3’；
PRRSV-GP5M-SeqR：5’-cagcatctggcacagctg-3’。
实施例4重组疫苗株PRRSV-SP和嵌合毒株vSP-Hub2的滴度测定
利用免疫细胞化学法将感染病毒的细胞进行染色标记，进而计算病毒滴度。由于PRRSV在Marc-145细胞上增殖最为理想。进行病毒传代扩增和病毒滴度测定时所选细胞为Marc-145细胞。具体操作如下：将实施例1得到的重组疫苗株PRRSV-SP病毒液和实施例1得到的嵌合毒株vSP-Hub2病毒液分别稀释成10-1～10-9，每个稀释度取100μL病毒液接种于生长密度达到80％～90％的Marc-145单层细胞的96孔板中，并补加100μL含2％(v/v)FBS的DMEM培养基(Gibco)。72h后甩掉板内液体，1×PBS洗3次，每孔加100μL预冷的甲醇，将细胞平放于-20℃固定30min，自然干燥10min；弃去甲醇，1×PBS洗3次，每孔加入100μL PRRSV阳性猪血清抗体(1:100)(华农(肇庆)生物产业技术研究院提供)，37℃孵育2h；1×PBS洗3次，每孔加入100μL山羊抗猪的HRP二抗(1:700)，37℃孵育1h；1×PBS洗3次，每孔加100μLAEC显色工作液，37℃避光孵育30min；显色完成后甩掉板内液体，1×PBS洗3次。肉眼粗略观察细胞染色情况后，显微镜下准确计数，每个稀释梯度3次重复取平均值，病变计数结果见图9和图10(照片旁分数的分子为出现CPE孔数，分母为每个稀释度的总孔数)。
按Reed-Muench两氏法(参照傅继华(病毒学实用实验技术)TCID50计算方法)计算重组疫苗株PRRSV-SP(连续传5代)的半数细胞感染量(TCID50)为10-5.38595/0.1mL；嵌合毒株vSP-Hub2(连续传5代)的半数细胞感染量(TCID50)为10-5.67159/0.1mL。结果显示，重组疫苗株PRRSV-SP和嵌合毒株vSP-Hub2都不能对细胞产生明显的病变，所以才需要借助于间接免疫荧光或间接免疫细胞化学染色进行标记来测定其滴度，这可以看出重组疫苗株PRRSV-SP和嵌合毒株vSP-Hub2都很好的保留了疫苗株SP的低致病性。另一方面，通过比较TCID50可以看出，经过重组改造后的嵌合毒株vSP-Hub2病毒滴度相比亲本疫苗株PRRSV-SP有所提高，说明该嵌合毒株vSP-Hub2不仅能够利用弱毒疫苗株SP的复制酶系统，同时也可以利用高致病性毒株HUB2的结构蛋白GP5M的抗原特性，使病毒复制能力增强，对机体的免疫刺激作用也会相应提高。综上所述，该重组疫苗株PRRSV-SP和嵌合毒株vSP-Hub2不但可以作为进一步研究弱毒疫苗及PRRSV毒株变异机制的基础材料，而且也可以利用感染性克隆系统从而获得既有较强免疫能力又致病性较低的理想病毒疫苗株，从而可以利用弱毒疫苗株的复制酶系统和高致病性毒株的结构蛋白区域之间的嵌合互补作用进一步开发新一代高效广谱的抗病毒疫苗。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南农业大学
<120>猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP及其制备方法与应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15520
<212> DNA
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<220>
<223>编码猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的核苷酸序列
<400> 1
atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg acatttgtat tgtcaggagc tgtgatcatt 60
gacacagccc aaagcttgct gcacagaaac acccttctgt gacagcctcc ttcaggggag 120
tttaggggtc tgtccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccac 180
ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt 240
catggcggag ggccaagtct actgcacacg atgcctcagt gcacggtctc tccctcctct 300
gaatctccaa gttcctgaac tcggggtgct gggcctattc tataggcccg aagagccact 360
ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gagcctgctg 420
gctttctgcc atctttccaa ttgcacgaat gaccagtgga aatctgaact ttcaacaaag 480
aatggtgcgg gtcgcagctg agctttacag agccggccag ctcacccctg cagtcttgaa 540
gactctacaa gtttatgaac ggggttgcca ctggtacccc attgttggac ctgttcctgg 600
agtggccgtt tatgccaact ccctacatgt gagtgataaa cctttcccgg gagcaactca 660
cgtgttaacc aacctgccgc tcccgcagag acccaagcct gacgattttt gcccctttga 720
gtgtgctatg gctactgtct atgacattgg tcatgacgcc gtcatgtatg tggccgaaga 780
gaaagtctcc tgggcccctc gtggcgggga tgaagtgaaa ttcgaacctg tccccgggga 840
gttgaagttg attgcgaacc gactccgcac ctccttcccg ccccaccacg cagtggacat 900
gtctaagttc accttcacag cccctgggcg tggtgtttct atgcgggtcg aacgccaaca 960
cggctgcctc cccgctgaca cagttcctga aggcaactgc tggtggagct tgttcaactt 1020
gctcccactg gaagttcaga acaaagaaat tcgtcatgcc ggccaatttg gctaccagac 1080
taagcatggt gtctctggca agtacctaca gcggaggctg caagttaatg gtcttcgagc 1140
agtaactgac ctaaatggac ctatcgtcgt acagtgcttc tccgttaagg agagttggat 1200
ccgccacttg aaactggcgg aagaacccag ctaccctggg tttgaggacc tcctcagaat 1260
aagggttgag cccaacacgt cgccattggc tgacaaggat gaaaaaattt tccggtttgg 1320
caatcacaag tggtatggcg ctggaaagag agcaaggaaa gcacgctcta gtgcgactgc 1380
tacagtcgct ggccgcgctt tgcccgttcg tgaaacccgg caggtcgagg agcacgaggt 1440
tgccggcgcc aacaaggctg agcacctcaa acactactcc ccgcctgccg aagggaattg 1500
tggttggcac tgcatttccg ccatcggcaa ccggatgttg aattccaaat ttgaaaccac 1560
ccttcccgaa agagtgagac ctccagatga ctgggctact gatgaggatc ttgtgaatgc 1620
catccaaatc ctcagactcc ctgcggcctt ggacaggaac ggtgcttgtg ctagcgccaa 1680
gtacgtactt aagctggaag gtgagcattg gactgtcact gtgacccctg ggatgtcccc 1740
ttctttgctc cctcttgaat gtgttcaggg ctgttgcgag cataagggcg gtcttggttc 1800
cccagatgca gtcgaggttt tcggatttga ccctgcctgc cttgactggc tggctgaggt 1860
gatgcacttg cctagcaatg ccatcccagc cgctctggcc gaaatgtccg gcgattccaa 1920
tcgtccggct tccccggtca ccaccgtgtg gactgtttcg cagttcttag cccgccacaa 1980
cggagggaat caccctgacc aaatacgctt agggaaaatt atcagccttt gtcaggtgat 2040
tgaggactgc tgctgttccc agaacaaaac caaccgggtc accccggagg aggtcgcagc 2100
aaagattgac ctgtacctcc gtggtgcaac aaatcttgaa gaatgcttgg ccaggcttga 2160
gaaagcgcgc ccgccacgcg taatggacac ctcctttgat tgggatgttg tgctccctgg 2220
ggttgaggcg gcaactcaaa cgaccgaact gccccaagtc aaccagtgtc gcgctctggt 2280
ccctgttgtg actcaaaagt ccttggacaa caactcggtc cctctgaccg ccttttcact 2340
ggctaactac tactaccgcg cgcaaggtga cgaagttcgt caccgtgaaa gactaaccgc 2400
cgtgctctct aagttggaag gggttgttcg agaagaatac gggctcatgc caaccgggcc 2460
tggtccacgg cccacactgc cacgcgggct cgacgaactc aaggaccaga tggaggtgga 2520
cttgctgaaa ctggctaacg cccagatgac ttcggacatg atggcctggg cagtcgagca 2580
ggttgaccta aaaacttggg tcaagaacta tccgcggtgg acaccaccac ctcctccgcc 2640
aatagttcag cctcgaaaaa cgaagcttgt caagagctta ccagagagca agcctgttcc 2700
tgcaccgcgt aggaaggtca ggtccgattg tgactgcccc accctatcgg gcaacaatct 2760
tcctgacagt tgggaagatt tggctgttgg ttgcccctct gatctcccta cctcacctga 2820
gccggtaaca cctttgagtg agccggcatc tgtgtccgca ccgcgacgct cttttaggcc 2880
ggtgaagcct ttgagtgaac cagtcccagt ccctgcaccg cgcaagactg tgtcccgacc 2940
ggcaacacct ctgagtgagc cgatccctgt gcccgcaccg cgacgcaagt ttcagcaggt 3000
agaaaaagtg aatccggcgg cggcaaccct ggggtgccaa gacgagtttc cagatttgtc 3060
tgcatcctcg catactgaat atgaggcgtc tccccttgta ctaccgcaga acggggacgt 3120
tcttgaagtg gaggagcggg aagctgagga aatcctgagt ggaatctcag acatactgga 3180
tgccatcaaa ccggcatctg catcatcaag cagctccctg tcaagtgtgg cgatcacacg 3240
cccgaaatac tcagctcaag ccatcattga ctcgggtggg ccctacagcg ggcatctcca 3300
agaggtgaag gaaacatgcc taagcatcat gagtgaggca tgtgatgtga ccaagcttga 3360
tgaccctgcc acgcaggaat ggctttctcg catgtgggat agggtggaca tgctgacttg 3420
gcgcaatacg tctgttcacc aggcgtcacg caccttggac gacagattta agtttctccc 3480
gaagatgata cttgaaacac cgccgcccta cccgtgtggg ttcgtgatga tgcctcgcac 3540
acctgcaccc tccgtgggtg cggagagcga cctcactatt ggctcagtcg ctactgagga 3600
cgttccacgc atcttcggga aagtaaatga tgtctgcaag atgatcgacc agagaccctt 3660
ggtactcttt gaaaatgagc tggcagatga ccaacctgcc agagatcctc ggacatcatc 3720
gcagaggttt gacgggagca caccagctcc gcccgcaggc acggatggca ccggtttggc 3780
ttcgggccct ggagtgagag aagtggattc atgtgaggcg agctcaaccg agaaaattga 3840
acagcccttc gtgttgaacg gcggcgccag cacacaggcg tcaacgttta ccaatttgcc 3900
gcctccaggc ggtatagatg cgggcgggag tgggccgtta caaacggtgc gaaagaaggc 3960
tgaacggttc tttgacctac taagccgtca ggtttttaat ctcgtctccc atctccctgt 4020
tttcttctca cgccttttca aacctggcgg tgactattct ccgggtgatt ggggttttgc 4080
agcttttact ttattgtgcc tctttttgtg ttacagttac ccggcctttg gtgctgttcc 4140
cctcttgggt gtattttctg ggtcttctcg gcgtgttcga atggggtttt ttggctgctg 4200
gttggctttt gctgttagtc tgttcaaacc tgtgtccgac ccagtcggcg ctgcttgtga 4260
atttgattcg ccagagtgta gaaacatcct tcattctttt gagcttctca aaccttggga 4320
ccctgttcgc ggccttgttg tgggccccgt cggtctcagt cttgccattt ttggcaggtt 4380
attgggcggg gcacgccaca tctggcactt tttgcttagg tttggcattg ttgcagattg 4440
tatcttggct ggagcttatg tgctttctca aggcaggtgt aaaaagtgct ggggatcttg 4500
tataagaact gctcctaatg aggtcgcctt taacgtgttt ccttttacac gtgcgaccag 4560
gtcgtcactt atcgacctgt gcaatcggtt ttgcgcgcca aaaggtatgg accccatttt 4620
cttcgccact gggtggcgcg ggtgctggac cggccgaagc cccattgagc aaccctctga 4680
aaaacccatc gcgtttgccc agttggatga aaaaaagatt acggctagga ctgtggtcgc 4740
ccagccctat gaccccaacc aagctgtaaa atgcttgcgg gtattgcagg cgggcggggt 4800
gatggtggct gaggcagtcc caaaagtggt caaagtttct gctgtcccat tccgagcccc 4860
cttctttccc accggagtga aagttgatcc tgaatgcagg attgtggttg accccgacac 4920
tttcactgca gccctccgat ctgggtactc caccacaaac ctcgtccttg gtgtggggga 4980
ctttgcccag ctgaatggat taaaaatcag gcaaatttcc aagccttcag ggggaggtcc 5040
acacctcatg gctgccctgc atgttgcttg ctctatggct ctgcacatgc ttgttgggat 5100
ttatgtgact gctgtgggtt cttgcggcac cggcactaac gatccgtggt gcgccaaccc 5160
gtttgccgtc cctggctacg gacctggctc tctctgcacg tccagattgt gcatctccca 5220
acatggcctt accctaccct tgacagcact tgtggcggga ttcggctttc aggaaattgc 5280
cttggttatt ttgatttttg tttctatcgg aggcatggct catagattga gttgcaaggc 5340
tgatatgctg tgtattttgt ttgcaatcgc cagctatgtt tgggtacctc ttacctggtt 5400
gctttgtgtg tttccttgct ggttgcgctg tttttcgttg caccccctca ccatcctatg 5460
gttggtgttt ttcctgattt ctgtaaatat gccttcagga atcttggcct tggtgttgtt 5520
gatttctctc tggcttcttg gtcgttatac caacgttgcc ggtcttgtca ctccctatga 5580
cattcatcat tacaccagtg gcccccgcgg tgttgccgcc ttggctaccg caccagatgg 5640
gacctacttg gccgctgtcc gccgcgccgc gttgactggt cgcaccatgc tgtttacccc 5700
gtctcagctc gggtcccttc ttgagggcgc tttcagaact cgaaagccct cactgaacac 5760
cgttaatgtg gtcgggtcct ccatgggctc tggcggggtg ttcatcatcg acgggaaaat 5820
taagtgcgta actgctgcac atgtccttac gggtaattca gctagggttt ccggggttgg 5880
cttcaatcaa atgcttgact tcgatgtgaa aggagacttc gccatagccg attgcccaga 5940
ctggcaaggg gctgctccca agacccaatt ctgcgaggaa ggatggactg gccgggccta 6000
ttggctaacg tcttctggtg tcgaacccgg cgtcattgga aaaggattcg ccttctgctt 6060
caccgcgtgc ggcgattccg gatccccagt aatcaccgag gccggcgagc ttatcggcgt 6120
tcacacgggg tcaaataaac aaggaggagg catcgtcacg cgcccctcag gccagttttg 6180
tagtgtggca cccgtcaaat taagcgaact aagtgaattc tttgcagggc ctaaggtccc 6240
gctcggtgat gtgaaagttg gcagccacat aattgaagac gtaggcgagg tgccttcaga 6300
tctttgcgcc ttgcttgctg ccaaacctga actggaagga ggcctctcca ccgttcaact 6360
tctgtgtgtg tttttcctcc tgtggagaat gatgggacat gcctggacgc ccttggttgc 6420
cgtagggttt tttatcttga atgaggtcct cccagctgtc ctggtccgga gtgttttctc 6480
ctttggaatg tttgtgctat cctggctcac accatggtct gcgcaagttc tgatgatcag 6540
gcttctaaca gcagctctta acaggaatag atggtcactt gccttttaca gcctcggtgc 6600
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gagtttgagc acttatgcat tcctgcctcg gataatggtt gtgacttcac cagtcccagt 6720
ggttgcgtgt ggtgttgtgc acctacttgc catcattttg tacttgttta agtaccgctg 6780
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tgatttcaag tgctttgttt ctgcgtccaa catgagaaat gctgcgggcc aattcatcga 7020
ggctgcctat gctaaagcac ttagagtaga acttgcccag ttggtgcagg ttgataaggt 7080
tcggggtact ttggccaaac ttgaagcttt tgccgacacc gtggcacccc aactctcgcc 7140
cggtgacatt gttgtcgctc ttggccatac gcctgttggc agtatcttcg acctgaaggt 7200
tggtaacacc aagcacactc tccaagccat cgagaccagg gtccttgctg ggtccaaaat 7260
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cctcccaccg aaggttttgg agaacggtcc aaacgcttgg ggggatgaag accgtttgaa 7380
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ccagaaattt tgggacaaga attccggtga cgtgttttat gaggaggtcc ataacaacac 7500
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tttgtgtggg catgtcacca ttgaagatag ggcttaccat gtttacacct ccccatctgg 7620
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aaactgctag ccgctagcgg cttgacccgc tgtggtcgcg gcggcttggt tgttactgag 7860
acagcggtaa aaatagtcaa atttcacaac cggaccttca ccttgggacc tgtaaattta 7920
aaagtggcta gtgaggttga gctaaaagac gcggtcgagc acaaccaaca cccggttgct 7980
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cttgattcta ggcccgactg ccctaaacag ttgacggagc acggctgtga agatgccgca 8520
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aaaattctgg cgtgcgcgga attctcgttg gatgacccag tcaagtacaa acatacttgg 12000
gggtttgaat cggatacagc gtatctgtat gagttcaccg gaaacggtga ggattgggag 12060
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aatgaaatgg ggtccatgca aagccttttt gacaaaattg gtcaactttt tgtggatgct 12240
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ccagtgtcag gtggacattc ccacctgggg aatcaaacat cctctggggg tgctttggca 12480
ccataaggtg tcaaccctga ttgatgaaat ggtgtcgcgt cgaatgtacc gcatcatgga 12540
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tagtttggat gtggtggctc attttcaaca tcttgccgcc gttgaagccg agacctgtaa 12660
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catagtatat aatggtactt tgaatcaggt gtttgccatt ttcccgaccc ctggttcccg 12780
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tttttgtcct tcagttacac ggcccagttt catcctgaga tattcgggat agggaatgtg 13200
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ggttgctgct cgcgattgct ttctttttgg tgtatcgtgc cgttctgttt tgctgtgctc 13980
gtcaacgcca gctacagcag cagctctcat ttacagttga tttataactt gacgctatgt 14040
gagctgaatg gtacagattg gctggctaat aaatttgatt gggcagtgga gagttttgtc 14100
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agtagcatct acgcggtctg tgccctggct gcgttaattt gcttcgtcat taggttggcg 14280
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cggctccaca gaaggtgctc ttggcgtttt ctattactta cacgccagtg atgatatatg 14580
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tgaatggcac tgattgatat tgtgcctcta agtcacctat tcaattaggg cgaccgtgtg 15480
ggggtaagat ttaattggcg aaaaccatgc ggccgaaatt 15520
<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒
<223>编码嵌合毒株vSP-Hub2的核苷酸序列
<400> 2
atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg acatttgtat tgtcaggagc tgtgatcatt 60
gacacagccc aaagcttgct gcacagaaac acccttctgt gacagcctcc ttcaggggag 120
tttaggggtc tgtccctagc accttgcttc cggagttgca ctgctttacg gtctctccac 180
ccctttaacc atgtctggga tacttgatcg gtgcacgtgt acccccaatg ccagggtgtt 240
catggcggag ggccaagtct actgcacacg atgcctcagt gcacggtctc tccctcctct 300
gaatctccaa gttcctgaac tcggggtgct gggcctattc tataggcccg aagagccact 360
ccggtggacg ttgccacgtg cattccccac tgtcgagtgc tcccccgccg gagcctgctg 420
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cgttccacgc atcttcggga aagtaaatga tgtctgcaag atgatcgacc agagaccctt 3660
ggtactcttt gaaaatgagc tggcagatga ccaacctgcc agagatcctc ggacatcatc 3720
gcagaggttt gacgggagca caccagctcc gcccgcaggc acggatggca ccggtttggc 3780
ttcgggccct ggagtgagag aagtggattc atgtgaggcg agctcaaccg agaaaattga 3840
acagcccttc gtgttgaacg gcggcgccag cacacaggcg tcaacgttta ccaatttgcc 3900
gcctccaggc ggtatagatg cgggcgggag tgggccgtta caaacggtgc gaaagaaggc 3960
tgaacggttc tttgacctac taagccgtca ggtttttaat ctcgtctccc atctccctgt 4020
tttcttctca cgccttttca aacctggcgg tgactattct ccgggtgatt ggggttttgc 4080
agcttttact ttattgtgcc tctttttgtg ttacagttac ccggcctttg gtgctgttcc 4140
cctcttgggt gtattttctg ggtcttctcg gcgtgttcga atggggtttt ttggctgctg 4200
gttggctttt gctgttagtc tgttcaaacc tgtgtccgac ccagtcggcg ctgcttgtga 4260
atttgattcg ccagagtgta gaaacatcct tcattctttt gagcttctca aaccttggga 4320
ccctgttcgc ggccttgttg tgggccccgt cggtctcagt cttgccattt ttggcaggtt 4380
attgggcggg gcacgccaca tctggcactt tttgcttagg tttggcattg ttgcagattg 4440
tatcttggct ggagcttatg tgctttctca aggcaggtgt aaaaagtgct ggggatcttg 4500
tataagaact gctcctaatg aggtcgcctt taacgtgttt ccttttacac gtgcgaccag 4560
gtcgtcactt atcgacctgt gcaatcggtt ttgcgcgcca aaaggtatgg accccatttt 4620
cttcgccact gggtggcgcg ggtgctggac cggccgaagc cccattgagc aaccctctga 4680
aaaacccatc gcgtttgccc agttggatga aaaaaagatt acggctagga ctgtggtcgc 4740
ccagccctat gaccccaacc aagctgtaaa atgcttgcgg gtattgcagg cgggcggggt 4800
gatggtggct gaggcagtcc caaaagtggt caaagtttct gctgtcccat tccgagcccc 4860
cttctttccc accggagtga aagttgatcc tgaatgcagg attgtggttg accccgacac 4920
tttcactgca gccctccgat ctgggtactc caccacaaac ctcgtccttg gtgtggggga 4980
ctttgcccag ctgaatggat taaaaatcag gcaaatttcc aagccttcag ggggaggtcc 5040
acacctcatg gctgccctgc atgttgcttg ctctatggct ctgcacatgc ttgttgggat 5100
ttatgtgact gctgtgggtt cttgcggcac cggcactaac gatccgtggt gcgccaaccc 5160
gtttgccgtc cctggctacg gacctggctc tctctgcacg tccagattgt gcatctccca 5220
acatggcctt accctaccct tgacagcact tgtggcggga ttcggctttc aggaaattgc 5280
cttggttatt ttgatttttg tttctatcgg aggcatggct catagattga gttgcaaggc 5340
tgatatgctg tgtattttgt ttgcaatcgc cagctatgtt tgggtacctc ttacctggtt 5400
gctttgtgtg tttccttgct ggttgcgctg tttttcgttg caccccctca ccatcctatg 5460
gttggtgttt ttcctgattt ctgtaaatat gccttcagga atcttggcct tggtgttgtt 5520
gatttctctc tggcttcttg gtcgttatac caacgttgcc ggtcttgtca ctccctatga 5580
cattcatcat tacaccagtg gcccccgcgg tgttgccgcc ttggctaccg caccagatgg 5640
gacctacttg gccgctgtcc gccgcgccgc gttgactggt cgcaccatgc tgtttacccc 5700
gtctcagctc gggtcccttc ttgagggcgc tttcagaact cgaaagccct cactgaacac 5760
cgttaatgtg gtcgggtcct ccatgggctc tggcggggtg ttcatcatcg acgggaaaat 5820
taagtgcgta actgctgcac atgtccttac gggtaattca gctagggttt ccggggttgg 5880
cttcaatcaa atgcttgact tcgatgtgaa aggagacttc gccatagccg attgcccaga 5940
ctggcaaggg gctgctccca agacccaatt ctgcgaggaa ggatggactg gccgggccta 6000
ttggctaacg tcttctggtg tcgaacccgg cgtcattgga aaaggattcg ccttctgctt 6060
caccgcgtgc ggcgattccg gatccccagt aatcaccgag gccggcgagc ttatcggcgt 6120
tcacacgggg tcaaataaac aaggaggagg catcgtcacg cgcccctcag gccagttttg 6180
tagtgtggca cccgtcaaat taagcgaact aagtgaattc tttgcagggc ctaaggtccc 6240
gctcggtgat gtgaaagttg gcagccacat aattgaagac gtaggcgagg tgccttcaga 6300
tctttgcgcc ttgcttgctg ccaaacctga actggaagga ggcctctcca ccgttcaact 6360
tctgtgtgtg tttttcctcc tgtggagaat gatgggacat gcctggacgc ccttggttgc 6420
cgtagggttt tttatcttga atgaggtcct cccagctgtc ctggtccgga gtgttttctc 6480
ctttggaatg tttgtgctat cctggctcac accatggtct gcgcaagttc tgatgatcag 6540
gcttctaaca gcagctctta acaggaatag atggtcactt gccttttaca gcctcggtgc 6600
aatgactggt tttgtcgcag atctcgcggc tactcagggg tatccgttgc aggcagtgat 6660
gagtttgagc acttatgcat tcctgcctcg gataatggtt gtgacttcac cagtcccagt 6720
ggttgcgtgt ggtgttgtgc acctacttgc catcattttg tacttgttta agtaccgctg 6780
cctgcacaac atccttgttg gcgatggagt gttctctgcg gctttcttcc tgcgatattt 6840
tgccgaggga aagttgaggg agggggtgtc gcaatcctgc gggatgaatc atgagtcact 6900
taccggtgcc ctcgctatga gactcaatga cgaggacttg gatttcctca cgaaatggac 6960
tgatttcaag tgctttgttt ctgcgtccaa catgagaaat gctgcgggcc aattcatcga 7020
ggctgcctat gctaaagcac ttagagtaga acttgcccag ttggtgcagg ttgataaggt 7080
tcggggtact ttggccaaac ttgaagcttt tgccgacacc gtggcacccc aactctcgcc 7140
cggtgacatt gttgtcgctc ttggccatac gcctgttggc agtatcttcg acctgaaggt 7200
tggtaacacc aagcacactc tccaagccat cgagaccagg gtccttgctg ggtccaaaat 7260
gaccgtggcg cgcgtcgtcg atccgacccc cacgctccca cccgcacccg tgcccatccc 7320
cctcccaccg aaggttttgg agaacggtcc aaacgcttgg ggggatgaag accgtttgaa 7380
taaaaagagg aggcgcagga tggaagccct cggcatctat gttatgggcg ggaaaaagta 7440
ccagaaattt tgggacaaga attccggtga cgtgttttat gaggaggtcc ataacaacac 7500
agatgagtgg gagtgcctca gagttggcga ccctgccgac tttgaccctg agaagggaac 7560
tttgtgtggg catgtcacca ttgaagatag ggcttaccat gtttacacct ccccatctgg 7620
taagaaattc ctagtccccg tcaacccaga gaacggaaga gttcaatggg aggctgcaaa 7680
gctttccgtt gagcaggccc ttggtatgat gaacgtcgac ggcgagctga ctgccaagga 7740
actggagaaa ctgaaaagaa taattgacaa actccagggc ctgactaagg agcagtgttt 7800
aaactgctag ccgctagcgg cttgacccgc tgtggtcgcg gcggcttggt tgttactgag 7860
acagcggtaa aaatagtcaa atttcacaac cggaccttca ccttgggacc tgtaaattta 7920
aaagtggcta gtgaggttga gctaaaagac gcggtcgagc acaaccaaca cccggttgct 7980
agaccagtcg atggtggtgt tgtgctcatg cgttccgcgg ttccctcgct tatagatgtc 8040
ctgatctccg gtgctgatgc atctcccaaa ttacttgccc atcacggacc gggcaacacc 8100
gggatcgatg gcacgctctg ggattttgag tccgaagcca ctaaagagga agtcgcactc 8160
agcgcgcaaa taatacaggc ttgtgacatt aggcgcggcg acgcacctga aattggtctc 8220
ccttacaagc tgtaccctat taggggcaac cctgagcggg taaagggagt tttacggaat 8280
acaaggtttg gagacatacc ttataaaacc cccagtgaca ctggaagccc agtgcacgcg 8340
gctgcctgcc tcacgcctaa caccactccg gtgactgacg ggcgctccgt cttggccacg 8400
accatgccct ccgggtttga gttgtatgta ccgaccatac cagcgtctgt ccttgactat 8460
cttgattcta ggcccgactg ccctaaacag ttgacggagc acggctgtga agatgccgca 8520
ctgagagacc tctccaagta tgacttgtcc acccaaggct ttgttttgcc tggagttctt 8580
cgccttgtgc ggaagtacct gtttgcccat gtgggcaaat gcccgcccgt tcatcggcct 8640
tccacttacc ctgccaagaa ttctatggct ggaataaatg ggaacaggtt tccaaccaag 8700
gacatccaga gcgtccctga aatcgacgtt ctgtgcgcac aggctgtgcg agaaaattgg 8760
caaactgtta ccccttgtac cctcaagaaa cagtattgtg ggaagaagaa gactaggacc 8820
atactcggca ccaataactt tatagcgctg gctcaccgtg cagcgttgag tggtgtcacc 8880
cagggcttca tgaaaaaggc gtttaactcg cctatcgccc tcgggaaaaa caaatttaag 8940
gagctacaga ctccggtcct aggcaggtgc cttgaagctg atcttgcatc ctgcgatcga 9000
tctacacctg caattgtccg ctggtttgcc gccaatcttc tttataagct tgcctgtgct 9060
gaagagcatc taccgtcgta tgtgctgaac tgctgtcacg acttactggt cacgcagtcc 9120
ggtgcagtga ctaagagagg cggcctgtcg tctggcgacc cgataacctc tgtgtctaat 9180
accatttaca gcttggtgat ctatgcacag cacatggtac ttagttgctt caaaagtggt 9240
cacccccatg gccttctgtt cttacaagac caactaaagt ttgaggacat gctcaaggtt 9300
caacccctaa tcgtctattc ggacgacctc gtgctgtatg ccgagtctcc caccatgcca 9360
aactaccatt ggtgggttga acatctgaat ttgatgctgg ggtttcagac ggacccaaag 9420
aaaacagcca taacagactc gccatcattt ctaggctgta gaataataaa tgggcgccag 9480
ctagtcccca accgtgacag gattctcgcg gccctcgcct accacatgaa ggcgagtaat 9540
gtttctgaat actacgcctc agcggctgca atactcatgg acagctgtgc ttgtttggag 9600
tatgatcctg aatggtttga agaacttgta gttgggatag cgcagtgcgc ccgcaaagac 9660
ggctacagct ttcccggcac gccgttcttc atgtccatgt gggaaaaact caggtccaat 9720
tatgagggga agaagtcgag agtgtgcggg tactgcgggg ccccggcccc gtacgctact 9780
gcctgtggcc tcgacgtctg catttaccac acccacttcc accagcattg tccagtcaca 9840
atctggtgtg gccatccagc gggttctggt tcttgtagtg agtgcaaatc ccctgtatgg 9900
aaaggcacaa gccctttaga cgaggtgctg gaacaagtcc cgtataagcc cccacggacc 9960
gttatcatgc atgtggagca gggacttacc ccccttgacc caggtagata ccagactcgc 10020
cgcggattag tctctgtcag gcgtggaatc aggggaaatg aagttgaact accagacggt 10080
gattatgcta gtaccgcctt gctccctacc tgtaaagaga tcaacatggt cgctgtcgct 10140
tctaatgtat tgcgcagcag gttcatcatc ggtccacccg gtgctgggaa aacatactgg 10200
ctccttcaac aggttcagga tggtgatgtt atttacacac caactcacca gaccatgctt 10260
gacatgatta gagctttggg gacgtgccgg ttcaacgttc cggcaggcac aacgctgcaa 10320
ttccccgtcc cctcccgtac cggtccgtgg gttcgcattc tagccggcgg ttggtgtcct 10380
ggcaagaatt ccttcctgga tgaagcagca tattgcaatc accttgatgt tttgaggctt 10440
cttagcaaaa ctaccctcac ctgtctagga gacttcaaac aactccaccc agtgggtttt 10500
gattctcatt gctatgtttt tgacatcatg cctcaaactc aactgaagac catctggagg 10560
tttggacaga atatctgtga tgccatccag ccagattaca gggacaaact catgtccatg 10620
gtcaacacaa cccgtgtgac ctacgtggaa aaacctatca ggtatgggca agtcctcacc 10680
ccctaccaca gagaccgaga ggacgacgcc atcactattg actccagtca aggcgccaca 10740
ttcgatgtgg ttacactgca tttgcccact aaagattcac tcaacaggca aagagccctt 10800
gttgctatca ccagggccag acatgctatc tttgtgtatg acccacacag gcagctgcag 10860
agcttgtttg atcttcctgc aaaaggcaca cccgttaacc tcgcagtgca ccgcgacggg 10920
cagctgatcg tgctggatag aaataacaaa gaatgcacgg ttgctcaagc tctaggcaac 10980
ggggataaat ttagggccac agacaagcgt gttgtagatt ctctccgcgc tatttgtgct 11040
gacctagaag ggtcgagctc tccgctcccc aaggtcgcac acaacttggg attttatttc 11100
tcacctgatt taacacagtt tgccaaactc ccagcagaac ttgcacctca ctggcctgtg 11160
gtgacaaccc agaacaatga aaagtggcca gatcggctgg ttgccagcct tcgtcctatc 11220
catgagtata gccgcgcgtg catcggtgcc ggctatatgg ttggcccctc ggtgtttata 11280
ggcacccccg gggtcgtgtc atactatctc acaaaatttg ttaagggcga ggctcaagtg 11340
cttccgaaga cggtcttcag caccggccga attgaggtag attgccggga atatcttgac 11400
gatcgggagc gagaagttgc tgcgtccctc ccacatgcct tcattggcga cgtcaaaggc 11460
actaccgttg gaggatgtca tcatgtcacc tccagatacc tcccgcgctt cctccccaag 11520
gaatcagttg ctgtggtcgg ggtttcaagt cccggaaaag ccgcgaaagc attgtgcaca 11580
ctgacagatg tgtacctccc agaccttgaa gcctatctcc acccggagac ccagtccaag 11640
tgctggaaaa tgatgttgga cttcaaggaa gttcgactaa tggtctggaa agacaaaaca 11700
gcctatttcc aacttgaagg acgctatttc acctggtatc agcttgctag ctatgcctcg 11760
tacatccgtg ttcctgtcaa ctctactgtg tacttggacc cctgcatggg ccccgccctt 11820
tgcaacagga gagtcgttgg gtccactcac tggggggctg acctcgcagt caccccttat 11880
gattacggcg ctaaaattat cctgtctagc gcgtaccatg gtgaaatgcc ccccggatac 11940
aaaattctgg cgtgcgcgga attctcgttg gatgacccag tcaagtacaa acatacttgg 12000
gggtttgaat cggatacagc gtatctgtat gagttcaccg gaaacggtga ggattgggag 12060
gattacaatg atgcgtttcg tgcgcgccag gaagggaaaa tttataaggc cactgccacc 12120
agcatgaagt tttattttcc cccgggccct gtcattgaac caactttagg cctgaattga 12180
aatgaaatgg ggtccatgca aagccttttt gacaaaattg gtcaactttt tgtggatgct 12240
ttcacggaat tcttggtgtc cattgttgat atcatcatat ttttggccat tttgtttggc 12300
ttcaccgtcg ccggttggct ggtggtcttt tgcatcagat tggtttgctc cgcgatactc 12360
cgtgcacgcc ctgcctttca ctctgagcag ttacagaaga tcctatgagg cctttctttc 12420
ccagtgtcag gtggacattc ccacctgggg aatcaaacat cctctggggg tgctttggca 12480
ccataaggtg tcaaccctga ttgatgaaat ggtgtcgcgt cgaatgtacc gcatcatgga 12540
aaaagcagga caggctgcct ggaaacaggt ggtgagcgag gccacgctgt ctcgcattag 12600
tagtttggat gtggtggctc attttcaaca tcttgccgcc gttgaagccg agacctgtaa 12660
atatttggtc tctcggctac ccatgctaca caacctgcgc atgacggggt caaatgtaac 12720
catagtatat aatggtactt tgaatcaggt gtttgccatt ttcccgaccc ctggttcccg 12780
gccaaagctt catgattttc agcaatggct gatagctgtg cattcgtcca tattttcctc 12840
tgttgcagct tcttgtactc tgtttgttgt actgtggttg cgggtcccaa tgctacgtac 12900
tgtttttggt ttccgctggt taggggcaat ttttccttcg agctcttggt gaattacacg 12960
gtgtgcccac cttgcctcac ccggcaagca gccgcacagc gctacgaacc tggcaaggct 13020
ctttggtgca gaattgggta cgatcgatgt gaggaggacg atcacgacga gctagggttc 13080
gtgataccgt ctggcctctc cagcgaaggc cacttgacta gtgtttacgc ctggttggcg 13140
tttttgtcct tcagttacac ggcccagttt catcctgaga tattcgggat agggaatgtg 13200
agcaaagtct atgttgacat caaacaccaa ttcatctgcg ctgttcatga tgggcagaac 13260
accaccttgc cccgccatga caacttttca gccgtgtttc agacctatta ccagcatcaa 13320
gtcgacggcg gcaattggtt tcacctagaa tggctgcgtc ccttcttttc ctcttggttg 13380
gttttaaatg tctcgtggtt tctcaggcgt ttgcctgcaa gccatgtttc agttcgagtc 13440
tttcagacat taagaccaac accaccgcag cagcgggctt tgctgtcctc caggacatca 13500
gctgccttag gcatggcgac ccgtcctctg cggcgattcg caaaagctct cagtgccgca 13560
cggcgatagg gacacccgtg tatatcacca ttacagccaa tgtgacagat gagaattatt 13620
tacactcctc tgatctcctc atgctttctt cttgcctttt ctatgcttct gagatgagtg 13680
aaaagggatt taaggtggta tttggcaatg tgtcaggcat cgtggctgtg tgtgttaatt 13740
ttaccagcta cgtccaacat gtcagggact tcacccaacg ctccttggtg gtcgatcatg 13800
tgcggctgct ccatttcatg acacctgagg ccatgaggtg ggcaactgtt ttaccctgtc 13860
tttttgccat tctgttggca gtttgaatgt ttaagtatgt tggggaagtg cttgaccgcg 13920
tgctgttgct cgcgattgct ttttttgtgg tgtatcgtgc cgttctatct tgctgtgctc 13980
gtcaacgcca gcaacaacaa cagctctcat attcagttga tttataactt aacgctatgt 14040
gagctgaatg gcacagattg gctggcacaa aaatttgact gggcagtgga gacttttgtc 14100
atcttccccg tgttgactca cattgtttcc tatggggcac tcaccaccag ccatttcctt 14160
gacacagttg gtctggccac tgtgtccacc gccggatatt atcacgggcg gtatgtcttg 14220
agtagcattt acgcagtctg tgctctggct gcgctgattt gctttgtcat taggcttgcg 14280
aagaactgca tgtcctggcg ctactcttgt accagatata ccaacttcct tttggacact 14340
aaaggcagac tctatcgttg gcggtcgccc gtcattgtgg agaaaggggg taaggttgag 14400
gtcgaaggtc acctgatcga cctcaagaga gttgtgcttg atggttccgc ggcaacccct 14460
ttaaccagag tttcagcgga acaatggggt cgtctctaga cgacttctgc aatgatagca 14520
cagctccaca gaaggtgctt ttggcgtttt ccattaccta cacgccagtg atgatatatg 14580
ctctaaaggt aagtcgcggc cgactgctag ggcttctgca ccttttgatt tttctgaatt 14640
gtgcttttac cttcgggtac atgacattcg tgcactttga gagcacaaat agggtcgcgc 14700
tcactatggg agcagtagtt gcacttcttt ggggagtgta ctcagccata gaaacctgga 14760
aattcatcac ctccagatgc cgtctgtgct tgctaggccg caagtacatt ctggcccctg 14820
cccaccacgt cgaaagtgcc gcgggctttc atccgattgc ggcaaatgat aaccacgcat 14880
ttgtcgtccg gcgtcccggc tccactacgg tcaacggcac attggtgccc gggttgaaaa 14940
gcctcgtgtt gggtggcaga aaagctgtta agcagggagt ggtaaacctt gttaaatatg 15000
ccaaataaca acggcaaaca gcagaagaaa aagaaggggg atggccagcc agtcaatcag 15060
ctgtgccaga tgctgggtaa gatcatcgcc cagcaaaacc agtccagagg taagggaccg 15120
ggaaagaaaa acaagaagaa aaacccggag aagccccatt ttcctctggc gactgaatat 15180
gacgtcagac accactttac ccctagtgag cggcaattgt gcctgtcgtc aatacagact 15240
gcctttaatc aaggcgctgg tacttgcacc ctgtccgatt cagggaggat aagttacact 15300
gtggagttta gtttgcccac gcatcatact gtgcgcctga ttcgcgtcac agcatcaccc 15360
tcagcatgat gggctggcat tcttgaggca tctcagtgtt tgaattggaa gaatgtgtgg 15420
tgaatggcac tgattgatat tgtgcctcta agtcacctat tcaattaggg cgaccgtgtg 15480
ggggtaagat ttaattggcg aaaaccatgc ggccgaaatt 15520
<223> F1
<400> 3
gcgtctcgcg gccgctaata cgactcacta taggatgacg tataggtgtt ggct 54
<223> R1
<400> 4
cacttcaaga acgtccccgt 20
<223> F2
<400> 5
gtctgcatcc tcgcatactg 20
<223> R2
<400> 6
gaagggaccc gagctgagac 20
<223> F3
<400> 7
ctgtttaccc cgtctcagct 20
<223> R3
<400> 8
gcgtctcatc acagatattc tgtcc 25
<223> F4
<400> 9
gcgtctctgt gatgccatcc agcc 24
<223> R4
<400> 10
gcgtctcttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttaatttcg gccgcatggt 60
tt 62
<223> F5
<400> 11
gcgtctcgcg gccgctaata cgactcacta taggatgacg tataggtgtt ggct 54
<223> R5
<400> 12
cacttcaaga acgtccccgt 20
<223> F6
<400> 13
gtctgcatcc tcgcatactg 20
<223> R6
<400> 14
gaagggaccc gagctgagac 20
<223> F7
<400> 15
ctgtttaccc cgtctcagct 20
<223> R7
<400> 16
gcgtctcatc acagatattc tgtcc 25
<223> F8
<400> 17
gcgtctctgt gatgccatcc agcc 24
<223> R8
<400> 18
atcgtctcca acatacttaa acattc 26
<223> F9
<400> 19
aacgtctcaa ataacaacgg caaac 25
<220>
<223> R9
<400> 20
gcgtctcttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttaatttcg gccgcatggt 60
tt 62
<223> PRRSV-T3448A-F
<400> 21
acgttcttga agtggaggag c 21
<223> PRRSV-T3448A-R
<400> 22
aacctgacgg cttagtaggt c 21
<223> PRRSV-GP5M-SeqF
<400> 23
gatcatgtgc ggctgctc 18
<223> PRRSV-GP5M-SeqR
<400> 24
cagcatctgg cacagctg 18

Claims (3)

1.一株嵌合毒株vSP-Hub2，其特征在于：利用猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP制备得到；其中，编码所述猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的核苷酸序列如SEQ NO.1所示；
所述的嵌合毒株vSP-Hub2的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。
2.权利要求1所述的嵌合毒株vSP-Hub2的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）扩增横跨嵌合毒株vSP-Hub2全基因组的A、B、C、D1、Hub2、N6个片段，克隆入质粒中，得到重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D1、重组质粒Hub2、重组质粒N；在构建过程中，对片段做以下改造：
1）将酶切位点BsmBI、Not I以及T7启动子引入A片段的始端；
2）在D1片段的始端和片段N的末端分别引入一个BsmBI酶切位点；
3）将片段Hub2放入重组疫苗株PRRSV-SP的相应编码区域13897-15008nt；
（2）将步骤（1）得到的重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C、重组质粒D1、重组质粒Hub2、重组质粒N扩增，提取质粒，酶切，回收，连接，得到5’端含T7启动子，3’端含35个碱基A的嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA；
（3）将步骤（2）得到的嵌合毒株vSP-Hub2的全长cDNA纯化，体外转录，得到嵌合毒株vSP-Hub2的mRNA，电转至细胞，培养，当细胞出现50%以上凋亡时-80℃冻融3次，取上清感染细胞，重复冻融和感染的步骤3次，取上清，即得嵌合毒株vSP-Hub2；
步骤（1）中的片段A、片段B、片段C、片段D1和片段N是以提取的重组疫苗株PRRSV-SP的RNA经逆转录获得的cDNA为模板，采用特异性引物和高保真DNA聚合酶扩增得到；
步骤（1）中的片段A覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的第1～3130位核苷酸；
步骤（1）中的片段B覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的第3058～5720位核苷酸；
步骤（1）中的片段C覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的第5690～10581位核苷酸；
步骤（1）中的片段D1覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的第10576～13902位核苷酸；
步骤（1）中的片段Hub2覆盖区域是嵌合毒株vSP-Hub2的第13897～15008位核苷酸；
步骤（1）中的片段N覆盖区域是猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株PRRSV-SP的第15004～15520位核苷酸；
步骤（1）中所述的质粒为pCR-TOPO-2.1、pCR-XL-TOPO、pUCIDT或pGEM；
步骤（1）中的片段A适用的质粒为pCR-TOPO-2.1；
步骤（1）中的片段B适用的质粒为pCR-TOPO-2.1；
步骤（1）中的片段C适用的质粒为pCR-XL-TOPO；
步骤（1）中的片段D1适用的质粒为pGEM；
步骤（1）中的片段Hub2适用的质粒为pUCIDT；
步骤（1）中的片段N适用的质粒为pGEM；
用于扩增的特异性引物按照A、B、C、D1、N5个片段的顺序依次如下：
F5: 5’-gcgtctcgcggccgctaatacgactcactataggatgacgtataggtgttggct-3’；
R5: 5’-cacttcaagaacgtccccg-3’t；
F6: 5’-gtctgcatcctcgcatactg-3’；
R6: 5’-gaagggacccgagctgagac-3’；
F7: 5’-ctgtttaccccgtctcagct-3’；
R7: 5’-gcgtctcatcacagatattctgtcc-3’；
F8: 5’- gcgtctctgtgatgccatccagcc-3’；
R8 5’-atcgtctccaacatacttaaacattc-3’；
F9: 5’-aacgtctcaaataacaacggcaaac-3’；
R9:5’- gcgtctcttttttttttttttttttttttttttttttttttttaatttcggccgcatggttt-3’；
步骤（2）中所述的酶切具体为：重组质粒A、重组质粒B、重组质粒C以及重组质粒N采用BsmBI酶切；重组质粒D1采用BsmBI和ScaI双酶切；重组质粒Hub2采用BsaI酶切；
步骤（2）中所述的扩增是将重组质粒转化入大肠杆菌中进行扩增；
步骤（2）中所述的连接所用的各片段的摩尔浓度相同；
步骤（3）中所述的纯化是采用苯酚/氯仿/异戊醇抽提纯化；
步骤（3）中所述的体外转录的反应体系和反应条件为：5×缓冲液4μL、2×NTP/CAP 10μL、30mMGTP1.5μL，模板2.5μL、T7RNA聚合酶2uL，37℃孵育3h；
步骤（3）中所述的电转的条件如下：4mm电击杯、450 V、50 μF条件下进行一次脉冲；
步骤（3）中所述的培养是将含体积比为2%的FBS的DMEM培养基加入电转后的细胞，培养3~4天得到。
3.权利要求1所述的嵌合毒株vSP-Hub2在制备弱毒疫苗中的应用。
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