CN113046329B - 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56 - Google Patents

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56 Download PDF

Info

Publication number
CN113046329B
CN113046329B CN202011248670.7A CN202011248670A CN113046329B CN 113046329 B CN113046329 B CN 113046329B CN 202011248670 A CN202011248670 A CN 202011248670A CN 113046329 B CN113046329 B CN 113046329B
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
prrsv
cdy
dna
vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011248670.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113046329A (zh
Inventor
张松林
刘鸿艳
李峰
刘磊
马永彪
公鑫婧
沈志强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Original Assignee
Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy filed Critical Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy
Priority to CN202011248670.7A priority Critical patent/CN113046329B/zh
Publication of CN113046329A publication Critical patent/CN113046329A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113046329B publication Critical patent/CN113046329B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种猪繁殖与呼吸障碍综合征嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56的构建方法和应用。利用基因Ⅱ型经典毒株DY株作为亲本株，用高致病性PRRSV XZ株的ORF5和ORF6基因替换亲本株相应基因，构建嵌合重组PRRSV疫苗株cDY56。本发明的嵌合重组PRRSV毒株cDY56相对于目前商品化的疫苗，在诱导体液免疫和细胞免疫以及降低免疫抑制等方面具有更好的效果，具有广阔的应用前景。

Description

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株 cDY56
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56的构建方法和应用。
背景技术
猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)于1987年在美国首次发现，目前该病已在全世界范围内流行,对养猪业造成了重大的经济损失。世界范围内，疫苗被广泛使用来保护或者减少PRRSV带来的损失。然而，无论减毒疫苗还是灭活疫苗以及各种亚单位疫苗都被证明效果不佳，只能提供部分保护。近些年来，人们尝试各种佐剂，试图改善PRRSV疫苗免疫保护效果差的问题。造成PRRSV疫苗免疫保护效果不好的原因很多，其中由于该病毒介导的特殊的免疫逃避机制以及抗原性基因的异质性占有很大一部分因素，因此，新型PRRS疫苗设计中，必须要考虑增加PRRSV不同亚型或毒株的交叉保护率的问题。
目前认为，PRRSV的GP2a、GP3、GP4、GP5和M蛋白被证明具有诱导产生中和抗体的能力。在所有五个蛋白中，GP5被认为是诱导中和抗体的能力最强的蛋白，PRRSV的GP2a、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白能够诱导细胞免疫，其中以M蛋白诱导细胞免疫能力为最强。关于中和抗体在PRRSV免疫保护的作用存在比较大的争议。因为大量研究显示PRRSV与中和抗体在体内是同时存在的，并且体外实验表明，中和抗体(包括非中和抗体)还可以增强PRRSV在巨噬细胞中的复制。中和抗体出现在感染后的2-4周期间，然而，这个时期的中和抗体水平比较低，不能阻止或清除病毒的复制和病毒血症。中和抗体滴度≥1：8能够抵御病毒血症的发生，但无法阻止病毒的复制和外周淋巴组织中病毒的感染和传播；中和抗体滴度≥1：32至少能够提供50％的消除性免疫(Sterilizing immunity)。
T细胞介导的PRRSV细胞免疫特征为Ⅰ型细胞因子的表达，其中也包括IFN-γ和IL-2。在免疫后的第4周，细胞因子的增殖反应可以在外周血液中检测到，在第7周达到峰值，并一直持续到第11周。IFN-γ和IL-2表达能够在感染的4～12周内被检测。研究表明，IFN-γ虽然不能抑制PRRSV的感染，但是能够保护猪对抗病毒血症。此外，IL-10的表达量被认为与IFN-γ的表达量成线性负相关，说明IL-10可能是PRRSV细胞免疫向着体液免疫转换的某种标志。
PRRSV的GP2a、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白能够诱导细胞免疫，其中以M蛋白诱导细胞免疫能力为最强。遗憾的是，迄今为止大多数蛋白的相关诱发细胞免疫的氨基酸序列还没有确定。目前发现GP5存在117LAALICFVIRLAKNC131和149KGRLYRWRSPVII/VEK163两个T细胞免疫肽，并且这两个肽在美洲型疫苗株和流行毒株中都是保守的。M蛋白存在的9CNDSTAPQKVLLAFS23(M3)、33ALKVSRGRLLGLLHL47(M6)、57FGYMTFVHFESTNRV71(M8)和93KFITSRCRLCLLGRK107(M12)四个T细胞免疫肽能够诱导高水平的IFN-γ，并且M6在所有的42株美洲型PRRSV中均高度保守。
猪繁殖与呼吸障碍综合征对养猪业造成了重大的经济损失。世界范围内，疫苗被广泛使用来保护或者减少PRRSV带来的损失。然而，无论减毒疫苗还是灭活疫苗以及各种亚单位疫苗都被证明效果不佳，只能提供部分保护。
发明内容
本发明针对猪繁殖与呼吸障碍综合征目前存在的无论减毒疫苗还是灭活疫苗以及各种亚单位疫苗都被证明效果不佳问题提出一种新型的猪繁殖与呼吸障碍综合征嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56的构建方法和应用。
为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：
一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56，利用基因Ⅱ型经典毒株DY株作为亲本株，用高致病性PRRSV XZ株的ORF5和ORF6基因替换亲本株相应基因，构建嵌合重组PRRSV疫苗株cDY56。
所述嵌合重组PRRSV疫苗株的全基因序列如SEQ ID NO:1所示。
所述嵌合重组PRRSV疫苗株，命名为PRRSV cDY56，保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，存活，分类命名:嵌合重组的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒疫苗株，保藏编号为:CGMCCNo.20711，保存日期为：2020年10月15日。
猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56的构建方法，包括如下步骤：
(1)斧头状核酶基因序列的PCR扩增及重组质粒pSK-1R的构建
以PRRSV DY株cDNA为模板，以R-1S/R-1R为引物，PCR扩增片段R1，R1纯化后作为模板，以R-2S/R-1R为引物，PCR扩增片段R2，R2纯化后作为模板，以R-3S/R-1R为引物，PCR扩增片段R3；
将R3回收纯化的产物和质粒pSK-1分别用XhoI、EcoRI双酶切，然后用T4连接酶将二者连接起来，1h后转到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒，得到质粒pSK-1R；
(2)PRRSV DY株Nsp2基因抗原肽FQQVKRLSS的敲除及SgrAI酶切位点的填加
以PRRSV DY株cDNA为模板，以引物N-1S、N-1R和N-2S、N-2R进行PCR扩增片段N1和N2，以N-1S/N-2R为引物，对两片段进行重叠延伸扩增，获得融合目的片段N12，片段N12纯化回收后和重组质粒pSK-1R进行MluI、ApaI双酶切后用T4连接酶进行连接，转化DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒；
(3)PRRSV DY株3’末端HDV核酶基因序列和BGH基因序列的填加
以PRRSV DY株cDNA为模板，引物H-1S/H-1r进行PCR扩增片段H1；H1纯化后作为模板，以H-1S/H-2R为引物，PCR扩增片段H2，H2纯化后作为模板，以H-1S/H-3R为引物PCR扩增片段H3；
以质粒pCDNA3.1(+)为模板，以B-1S/B-1R为引物，PCR扩增片段BGH；以H3和BGH为模板，以HDV-S为引物，对两片段进行重叠延伸扩增，获得融合目的片段HB；将重组质粒pSK-4用NotI单酶切，将片段HB和重组质粒pSK-4进行连接，1h后转到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒；重组质粒命名为pSK-4HB；
(4)PRRSV DY株全长cDNA克隆的构建
以PRRSV DY株cDNA为模板，用P2S/P2R和P3S/P3R为引物扩增，扩增片段P-2和P-3；以重组质粒pSK-1R和重组质粒pSK-1N为模板，P1S/P1R和P4S/P4R为引物，PCR扩增片段P-1和P-4；将纯化回收的4段PCR产物片段逐一连接，最终获得含有PRRSV DY株全长基因组cDNA的质粒pCI-DY；
(5)含有PRRSV XZ株ORF5和ORF6的重组质粒pCI-XZ56的构建
以PRRSV XZ株cDNA为模板，XZ-5S为引物，PCR扩增获得片段XZ56；
以重组质粒pSK-1N为模板，以DY-1和DY-2为引物，扩增获得目的片段DY1和DY2；将DY1、XZ56和DY2利用引物DY-1S/XZ-6R和DY-1S/DY-2R对三片段进行重叠延伸扩增，获得融合片段DY-ZX-56；将重组质粒pCI-DY用NruI/NotI双酶切,按照NEBuilder HiFiDNAAssembly Master Mix/NEBuilder HiFi DNAAssembly Cloning Kit(NEB)说明书连接，1h后转到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒；重组质粒命名为pCI-XZ56；
病毒的拯救与传代
提取质粒pCI-XZ56，经NheI酶切后，转染细胞BHK，置37℃，5％CO2培养箱中；转染2d后，收取转染细胞，反复冻融3次后收取上清液接种Marc-145细胞，按照常规的病毒传代方法传至第63代，将拯救病毒命名为cDY56。
各引物的序列详见序列表。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
按照本发明所建立的IL-2荧光定量检测检测方法，对所采集的各个分组的猪全血进行荧光定量PCR检测，并对检测结果进行统计学分析。cDY56免疫组数据在14、42和56天显著高于阴性对照组(P＜0.05)，商用疫苗免疫组在28天显著低于嵌合病毒免疫组和阴性对照组(P＜0.05)，cDY56免疫组数值在49和56天显著高于商用疫苗免疫组(P＜0.05)。
附图说明
图1为PRRSV DY株基因组全长cDNA克隆的构建策略。
图2为pCI-neo表达载体改造鉴定结果。
图3为重组质粒pSK-1N酶切鉴定结果。M:Marker DL 15000；1：重组质粒pSK-1N经Eco RI、Not I双酶切鉴定。
图4重组质粒pSK-1N酶切鉴定结果。M:MarkerDL 15000；1:重组质粒pSK-4经EcoRV,NotI双酶切鉴定；2:重组质粒pSK-4HB经EcoRV,NotI双酶切鉴定。
图5为重组质粒pCI-DY酶切鉴定结果。M:Marker DL 15000；1、2:重组质粒pCI-DY经NheI单酶切鉴定。
图6为重组质粒pCI-XZ56酶切鉴定结果。M:Marker DL 15000；1、2:重组质粒pCI-XZ56经NheI单酶切鉴定。
图7为拯救病毒cDY56中导入的突变在基因组中稳定存在。
图8为嵌合重组DIVA疫苗株构增殖曲线。
图9为间接免疫荧光实验。
图10为肽ELISA检测。
图11为抗体检测。
图12为IL-2检测。
图13为IL-10检测。
图14为γ干扰素检测。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
实施例1，如图1-14所示。
1.1主要实验材料
Marc-145细胞、BHK细胞、感受态细胞DH5α、PRRSV DY株、PRRSVXZ株、载体pBluescript II SK(+)、pcDNA3.1(+)、pCI-neo以及含有PRRSV DY株基因组5’端序列(1bp-5388bp)的重组质粒pSK-1和3’端序列(12201bp-15442bp)的重组质粒pSK-4均由作者实验室制备保存。
1.2主要试剂质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、RNA提取试剂盒、大提质粒试剂盒购自中国Omega Bio-TekInc公司；T4 DNA连接酶、反转录试剂盒、PCR聚合酶、限制性内切酶、NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix/NEBuilder HiFi DNA Assembly CloningKit购自美国New England Biolabs公司；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent购自瑞士Roche公司；过氧化物酶标记的羊抗猪IgG、FITC标记的羊抗鼠IgG购自中国EARTH公司；TMB购自中国天根公司；偶联短肽“F552QQVKRLSS560”由武汉百意欣生物技术有限公司合成。本试验所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.3pCI-neo表达载体改造
对PCI-neo的多克隆位点区的Mlu I改造成Asc I，用于构建PRRSV DY株全长cDNA。以PCI-neo质粒为模板，分别以PA-1S:GCA AATG GGCG GTAG GCGTGTACGGTG/PA-1R:5-GGTAGGCGGGGCCAATTCTCGAGGCTAG为引物扩增片段P1,以PA-2S:CTAGCCTCGAGAATTGGCCCGCCCTACC/PA-2R:CCTCCC ACATCT CC CC CTGAACCTGAAACATA为引物扩增片段P2,用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化，再以回收的纯化产物P1和P2为模板，以P-1S/P-2R为引物对两片段进行重叠延伸扩增，获得融合目的片段P3，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。将纯化回收得到的目的片段P3和PCI-neo表达载体分别用Mlu I、Apa I双酶切，然后用T4连接酶将二者连接起来，1h后转到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒。将改造好的载体命名为pCI-MA。由宝生物工程(大连)有限公司测序验证。
1.4PRRSV DY株5’端斧头状核酶基因序列的填加
1.4.1斧头状核酶基因序列的PCR扩增
首先以PRRSV DY株cDNA为模板，以R-1S:GGGGTCTA CGTCATACTGA/R-1R:GATGGCATTCACAAGATCCTCGTCA为引物，PCR扩增片段R1，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。以回收的纯化产物R1为模板，以R-2S:GGTCACGTCATACTGATT CCGTGAGGACGAAACCCTA/R-1R为引物，PCR扩增片段R2，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。再以回收的纯化产物R2为模板，以R-3S:GGACGAAACCCTATAGTGAGTAT AGGGTATGACGTATAGGTGTGCT/R-1R为引物，PCR扩增片段R3，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。
1.4.2重组质粒pSK-1R的构建
将上述回收纯化的产物R3和质粒pSK-1分别用Xho I、Eco RI双酶切，然后用T4连接酶将二者连接起来，1h后转到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒。重组质粒命名为pSK-1R。由宝生物工程(大连)有限公司测序验证。
1.5PRRSV DY株Nsp2基因抗原肽“FQQVKRLSS”的敲除及SgrAI酶切位点的填加
首先以PRRSV DY株cDNA为模板，以N-1S:ACCTCCGTGGTGCAACAAATCTTGAAG/N-1R:ACGGTGGGATTGCCGCCGC ACTTACGCACCGGTGCGGGCAC和N-2S:CTGTGCCCGCACCGGTGCGTAAGTGCGGCGGCAATCCCA/N-2R:CACTAAG GCATGTTTCCTTTACCTCT为引物，PCR扩增片段N1和N2，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。再以回收的纯化产物N1和N2为模板，以N-1S/N-2R为引物，对两片段进行重叠延伸扩增，获得融合目的片段N12，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。将纯化回收的片段N12和上述1.3中构建的重组质粒pSK-1R进行Mlu I、Apa I双酶切，将双酶切回收的产物N12和pSK-1R用T4连接酶进行连接，转化DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒。重组质粒命名为pSK-1N并送宝生物工程(大连)有限公司测序验证。
1.6PRRSV DY株3’末端HDV核酶基因序列和BGH基因序列的填加
1.6.1HDV核酶基因序列的PCR扩增
首先以PRRSV DY株cDNA为模板，以H-1S:TGTGCGCCTGATTCGCGTCCAGCATCACCCTCA/H-1r:GGAGGTGGAGATGC CATGCCGACCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAT为引物，PCR扩增片段H1，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。以回收的纯化产物H1为模板，以H-1S/H-2R:GAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCAG GT CGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCAT为引物，PCR扩增片段H2，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。以回收的纯化产物H2为模板，以H-1S/H-3R:TGCGC GGCCGCGCACTCGAGCGCCCTCCC TTAGCCA TCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTC，PCR扩增片段H3，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。
1.6.2BGH基因序列的PCR扩增
以质粒pCDNA3.1(+)为模板，以B-1S:CCCCTCGAGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCT/B-1R:CCCGCGGCCGCAA GCCATAGAGCCCACCGCATC为引物，PCR扩增片段BGH，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。
1.6.3重组质粒pSK-4HB的构建
以上述PCR扩增回收的片段H3和BGH为模板，以HDV-S:AAAAAAAAAAAAAAAGGGTCGGCATGGCATCTCCA/BGH:CCTCACTAAAGGGAAGCGGCCGCAAGCCATAGAGCCCAC为引物，对两片段进行重叠延伸扩增，获得融合目的片段HB，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。将重组质粒pSK-4用NotI单酶切，按照NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix/NEBuilderHiFi DNA Assembly Cloning Kit说明书将目的片段HB和重组质粒pSK-4进行连接，1h后转到大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒。重组质粒命名为pSK-4HB。由宝生物工程(大连)有限公司测序验证。
1.7 PRRSV DY株全长cDNA克隆的构建
根据PRRSV DY株全基因组序列(GeneBank：JN864948)，用Primer Premier 5设计了4对涵盖全基因组序列的引物(表1)。以PRRSV DY株cDNA为模板，用表1中的P2S/P2R和P3S/P3R为引物，按照常规PCR条件扩增，扩增片段P-2和P-3。以上述1.5构建的重组质粒pSK-1R和1.6构建的重组质粒pSK-1N为模板，P1S/P1R和P4S/P4R为引物，PCR扩增目的片段P-1和P-4。PRRSV DY株基因组全长cDNA连接方案如图所示(图1)。将纯化回收的4段PCR产物按照图1所示流程将各个片段逐一连接，最终获得含有PRRSV DY株全长基因组cDNA的质粒pCI-DY，由宝生物工程(大连)有限公司测序验证。
表1引物设计
1.8含有PRRSV XZ株ORF5和ORF6的重组质粒pCI-XZ56的构建
1.8.1PRRSV XZ株ORF5和ORF6基因PCR扩增
以PRRSV XZ株cDNA为模板，XZ-5S:ATGTTGGGAAGTGCTTGAC/XZ-6R:TGCTGCTTGCCGTTG TTATTTGGCATATTTAACAAGGTTC为引物，PCR扩增获得目的片段XZ56，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。
1.8.2PRRSV DY株ORF4基因及3’末端PCR扩增
以上述1.6构建的重组质粒pSK-1N为模板，以DY-1S:GACATCAGTTGCCTTAGGCATCGCGACTCGGCCTCTGAGGCGAT/DY-1R:GCACTTCCCCAACATACTTAAACATTCAAATTGCCAACA和DY-2S:AAATATGCCAAATAACAACGGCAAGCAGCAGAAG/DY-2R:CTCACTAAAG GGAAGCGGCCGCAAGCCATAGAGCCCACCGCA为引物，PCR扩增获得目的片段DY1和DY2，用DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化。
1.8.3含有PRRSV XZ株ORF5和ORF6的重组质粒pCI-XZ56的构建
将上述回收纯化片段DY1、XZ56和DY2利用引物DY-1S/XZ-6R和DY-1S/DY-2R对三片段进行重叠延伸扩增，获得融合片段DY-ZX-56。将重组质粒pCI-DY用Nru I/Not I双酶切,按照NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix/NEBuilder HiFi DNA AssemblyCloningKit(NEB)说明书连接，1h后转到大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒。重组质粒命名为pCI-XZ56。由宝生物工程(大连)有限公司测序验证。
1.9病毒的拯救与传代
按照EndoFree Plasmid Max Kit(Qiagen)试剂盒说明书，提取质粒pCI-XZ56，经NheI酶切正确后，按照X-treme GENE HP DNATransfection Reagent试剂盒说明书，转染细胞BHK，置37℃，5％CO2培养箱中。转染2d后，收取转染细胞，反复冻融3次后收取上清液接种Marc-145细胞，按照常规的病毒传代方法传至第63代，将拯救病毒命名为cDY56。
1.10拯救病毒cDY56的遗传稳定性检测
收取传至63代的拯救病毒cDY56的上清液，按照RNA提取试剂盒和反转录试剂盒说明书合成第一链cDNA，以合成第一链cDNA为模板，N-1S/N-2R为引物，PCR扩增包含敲除抗原肽“FQQVKRLSS”和填加的SgrAI酶切位点的目的片段，通过DNA胶回收试剂盒对扩增的片段进行回收纯化，送由宝生物工程(大连)有限公司测序验证。
1.11拯救病毒cDY56生长曲线的测定
以传至63代的拯救病毒cDY56和PRRSV DY株分别感染长满单层Marc-145细胞的六孔板，分别在接毒后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h和120h收取培养上清。不同时间点收取样品的病毒滴度采用病毒组织培养半数感染(TCID50)法进行测定。将待测病毒用DMEM维持液按10倍系列稀释。将100μL不同稀释度的病毒液加入已长满Marc-145细胞的96孔培养板中，每个稀释度8孔，置37℃5％CO2培养箱中培养，于接毒第七天观察并记录细胞病变孔数，按Reed-Muench两氏法计算TCID50。
1.12拯救病毒cDY56的间接免疫荧光(IFA)检测
将传至63代的拯救病毒cDY56接种于长满Marc-145细胞的6孔板。37℃，CO2培养箱培养48h。然后用PBS溶液洗长满细胞的6孔细胞培养板3次，自然风干，以100％的甲醛固定5min(0.5mL/孔)，PBS溶液洗3次，吸干。每孔加入高免血清200μL，37℃，CO2培养箱培养1h。PBS洗1次，ddH2O洗5次。加入FITC标记的羊抗鼠IgG二抗，200μL/孔。37℃，CO2培养箱培养1h。PBS洗3次，加入适量PBS，荧光显微镜观察。
1.12拯救病毒cDY56免疫猪血清抗体的Peptide-ELISA检测
选取30日龄断奶仔猪10只被随机分成2组，每组5只，分别免疫PRRSV DY株和拯救病毒cDY56株，免疫剂量为106TCID50/mL。分别于接种后0d、7d、14d、21d、28d、35d和42d从所有试验动物进行采血，3000r/min离心15min后分离血清，-20℃保存。采用本实验室已经建立的以“FQQVKRLSS”抗原肽为包被抗原的猪血清抗体的Peptide-ELISA检测方法，对上述血清进行检测。判定标准为：若S/P的比值≧0.28，则样品判定为抗体阳性。若S/P的比值≦0.22，则样品判定为抗体阴性。若0.22<S/P的比值<0.28，则判为可疑，请重新检测，如果结果相同，判定为阳性。
1.13cDY56株的动物免疫试验
1.13.1实验动物
免疫方式采用肌肉注射形式进行。30日龄断奶仔猪15只被随机分成3组，每组5只，分别免疫嵌合重组DIVA疫苗株cDY56，免疫剂量为106TCID 50/mL，商品化PRRSV疫苗按照说明书免疫剂量进行，5只仔猪肌肉注射DMEM作为阴性对照。分别于接种后0d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d从所有试验动物进行采血，3000r/min离心15min后分离血清，-20℃保存。
1.13.2免疫猪血清的抗体检测
将上述采集的不同组分的猪血清用IDEXX猪繁殖与呼吸综合征ELISA检测试剂盒进行抗体检测，并对检测结果进行分析。
1.13.3免疫猪全血的细胞因子检测
1.13.3.1引物设计
根据GenBank中猪干扰素r，白介素2，白介素10，编码基因序列，应用Primer 5.0软件设计特异性引物qINγ-1s/qINγ-1r、qIL2-1S/qIL2-1R和qIL10-1S/qIL10-1R。引物均由生工生物技术(上海)有限公司合成。引物序列为(表2)
表格2引物设计
1.13.3.2模板制备
冻融三次后，按照Total RNA Kit II(omega)试剂盒说明书提取全血总RNA，再按照Thermo Scientific RevertAid First Storand cDNA Synthesis Kit(Thermo)试剂盒说明书反转录成cDNA。保存于存于-20℃备用。
1.13.3.3重组质粒pMD18-γ，pMD18-IL2，pMD18-IL10的构建
以上述cDNA为模板qINγ-1s/qINγ-1r、qIL2-1S/qIL2-1R和qIL10-1S/qIL10-1R为引物，PCR扩增片段INγ、IL2和IL10，PCR反应条件95℃3min，95℃30s，48℃30s，72℃30s，30个循环，72℃延伸10min。胶回收放零下20度保存。将PCR回收产物INγ、IL2和IL10克隆至pMD18-T(TaKaRa)，构建重组质粒pMD18-γ，pMD18-IL2，pMD18-IL10。经酶切鉴定正确后，送上海生工进行测序。
1.13.3.4标准曲线的建立
将重组质粒pMD18-γ，pMD18-IL2，pMD18-IL10按10倍梯度稀释，分别取10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8为模板。每个模板做2个重复，建立标准曲线。根据LightCycter480 SYBR Green I Master(Roche)说明书进行操作，反应体系为:ddH2O 7.2ul,SYBR Green I Master 10ul,PCR Forward Primer(10uM)0.4ul,PCR Reverse Primer(10uM)0.4ul,DNA模板2ul,Total 20ul。反应条件：95℃5min,95℃10s,48℃20s,72℃20s,40个循环，95℃5min,65℃1min,97℃-40℃10s。
1.13.3.5样本的检测
利用建立的INγ、IL2和IL10实时荧光定量PCR方法对仔猪免疫后全血中INγ、IL2和IL10的表达情况进行检测。
2结果
2.1pCI-neo表达载体改造鉴定结果
通过重叠延伸PCR方法获得将PCI-neo的多克隆位点区的Mlu I改造成Asc I的目的片段P3，经用Mlu I、Apa I双酶切后，定向克隆到PCI-neo表达载体的相应位点。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒，并将改造好的载体命名为pCI-MA。PCI-neo表达载体和重组质粒pCI-MA经Asc I、BamHI双酶切鉴定。结果显示PCI-neo表达载体酶切片段大小为5500bp左右，重组质粒pCI-MA酶切片段大小为两条2700bp左右的条带，与试验预期结果一致(图2)。
2.2重组质粒命名为pSK-1R的酶切鉴定结果
首先通过PCR方法扩增获得含有斧头状核酶基因序列的目的片段R3，经Xho I、EcoR I双酶切后，定向克隆于质粒pSK-1的相应的位点，获得重组质粒pSK-1R。再将通过重叠延伸PCR方法获得含有敲除抗原肽“FQQVKRLSS”及填加SgrA I酶切位点的目的片段N12经Mlu I、Apa I双酶切后，定向克隆于重组质粒pSK-1R，转化DH 5α感受态细胞中，筛选阳性菌并提取质粒，重组质粒命名为pSK-1N。重组质粒pSK-1N用EcoR I、Not I双酶切鉴定，酶切片段大小分别约为3700bp、3000bp和1600bp，与试验预期结果一致(图3)。
2.3重组质粒命名为pSK-4HB的酶切鉴定结果
通过PCR方法扩增目的片段HDV核酶基因序列和BGH基因序列，再通过重叠延伸PCR方法获得含有HDV和BGH的融合片段HB，将重组质粒pSK-4用Not I单酶切，按照NEBuilderHiFi DNA Assembly Master Mix/NEBuilder HiFi DNAAssembly Cloning Kit说明书将目的片段HB和重组质粒pSK-4进行连接，筛选阳性菌并提取质粒,重组质粒命名为pSK-4HB。将重组质粒pSK-4和pSK-4HB分别用EcoR V、Not I双酶切鉴定，酶切片段大小分别约为3500bp、3000bp和3900bp、3000bp，与试验预期结果一致(图4)。
2.4PRRSV DY株全长cDNA克隆的构建
通过PCR扩增获得的P-1、P-2、P-3、P-4四个片段，按照图1所示的策略将各个片段逐一连接到改造好的pCI-neo表达载体上，构建成一个含有全长cDNA的重组质粒pCI-DY。pCI-DY经Nhe I单酶切鉴定，酶切片段大小分别约为8600bp、7800bp、4000bp、2000bp左右，与试验预期结果一致(图5)。
2.5含有PRRSV XZ株ORF5和ORF6基因的重组质粒pCI-XZ56的鉴定
通过PCR方法扩增获得含有PRRSV XZ株ORF5和ORF6基因的目的片段XZ56，以及含有PRRSV DY株ORF4基因和3’末端的目的片段DY1和DY2。再将回收纯化片段DY1、XZ56和DY2利用引物DY-1S/XZ-6R和DY-1S/DY-2R对三片段进行重叠延伸扩增，获得融合片段DY-ZX-56。将重组质粒pCI-DY用Nru I/Not I双酶切，按照NEBuilder HiFi DNA AssemblyMasterMix/NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit(NEB)说明书连接，筛选阳性菌并提取质粒，重组质粒命名为pCI-XZ56。pCI-XZ56经Nhe I单酶切鉴定，酶切片段大小分别约为11300bp、7600bp、2300bp，与试验预期结果一致(图6)。
2.6拯救病毒cDY56的遗传稳定性分析
为了验证将基因组中的抗原肽“FQQVKRLSS”敲除和填加SgrA I酶切位点的拯救病毒cDY56能否稳定的遗传。对拯救病毒cDY56第63代的病毒RNA进行RT-PCR，将纯化回收后的PCR送由由宝生物工程(大连)有限公司测序验证。序列分析表明，在获救病毒基因组中稳定存在“FQQVKRLSS”抗原肽的缺失突变，所填加的作为基因标记的酶切位点SgrA I也稳定存在(图7)。
2.7亲本菌株PRRSV DY与第63代拯救病毒cDY56的TCID50的测定及其生长曲线的比较
对第63代拯救病毒cDY56和PRRSV DY株感染Marc-145细胞的病毒液分别进行TCID50测定。结果显示，感染拯救病毒cDY56的Marc-145细胞3d后出现典型的细胞病变，病毒滴度最高值出现在接种后的72h-84h之间，TCID50约为109.50/0.1mL。而亲本菌株PRRSV DY的TCID50约为108.75/0.1mL(图8)。
间接免疫荧光实验结果显示，拯救的cDY56能与PRRSV高免血清反应(图9)。
2.8肽ELISA利用IDEXX ELISAkit分别对免疫PRRSV DY株和cDY56猪血清检测结果如图10A所示，Peptide-ELISA检测结果如图10B所示。在抗体监测的6周期间，cDY56免疫组诱导的抗体水平略高于其亲本株DY免疫组。利用Peptide-ELISA对DY株免疫组和cDY56免疫组进行检测，cDY56免疫组在监测期间Cut-Off值均在阴性范围(S/P临界值为0.28)，其亲本株诱导的抗体水平与IDEXX ELISA检测结果相似，说明敲除了“FQQVKRLSS”抗原肽，cDY56所诱导的体液免疫不受影响。
2.9免疫检测
2.9.1免疫猪血清的抗体检测
cDY56免疫组抗体数据随时间呈上升趋势，cDY56免疫组和商用疫苗免疫组抗体数据在14-56天与阴性对照组差异显著(P＜0.05)，cDY56免疫组抗体数据在35天和42天显著高于商用疫苗免疫组(P＜0.05)(图11)。
注：图11中的a表示试验组与阴性对照组差异显著(P＜0.05)，b表示商用疫苗免疫组与阴性对照组差异显著(P＜0.05)，c表示试验疫苗组与商用疫苗组差异显著(P＜0.05)。
2.9.2免疫猪全血的IL-2检测
按照本文所建立的IL-2荧光定量检测检测方法，对所采集的各个分组的猪全血进行荧光定量PCR检测，并对检测结果进行统计学分析。cDY56免疫组数据在14、42和56天显著高于阴性对照组(P＜0.05)，商用疫苗免疫组在28天显著低于嵌合病毒免疫组和阴性对照组(P＜0.05)，cDY56免疫组数值在49和56天显著高于商用疫苗免疫组(P＜0.05)(图12)。
注：图12中的a表示试验组与阴性对照组差异显著(P＜0.05)，b表示商用疫苗免疫组与阴性对照组差异显著(P＜0.05)，c表示试验疫苗组与商用疫苗组差异显著(P＜0.05)。
2.9.3免疫猪全血的IL10检测
cDY56免疫组和商用疫苗免疫组IL10检验结果在第14-56天显著低于阴性对照组(P＜0.05)，cDY56免疫结果在第35天和42天显著低于商用疫苗免疫组(P＜0.05)(图13)。
注：图13中的a表示试验组与阴性对照组差异显著(P＜0.05)，b表示商用疫苗免疫组与阴性对照组差异显著(P＜0.05)，c表示试验疫苗组与商用疫苗组差异显著(P＜0.05)。
2.9.4免疫猪全血的γ干扰素检测
cDY56免疫组和商用疫苗免疫组结果在第14-56天显著低于阴性对照组(P＜0.05)，嵌合病毒免疫结果在第35天和42天显著低于商用疫苗免疫组(P＜0.05)(图14)。
注：图14中的a表示试验组与阴性对照组差异显著(P＜0.05)，b表示商用疫苗免疫组与阴性对照组差异显著(P＜0.05)，c表示试验疫苗组与商用疫苗组差异显著(P＜0.05)。
世界范围内，疫苗被广泛使用来减少PRRSV带来的损失。然而，无论减毒疫苗还是灭活疫苗以及各种亚单位疫苗都被证明效果不佳，只能提供部分保护。近些年来，人们尝试各种佐剂，试图改善PRRSV疫苗免疫保护效果差的问题。然而实验数据表明，相对于不添加佐剂的减毒疫苗，各种佐剂的免疫增强效果并不是很理想。
鉴于PRRSV体液免疫和细胞免疫的特点，因此，本发明选择替换GP5和M蛋白基因构建嵌合重组病毒，期望以此增加疫苗株的交叉保护能力。本发明利用基因Ⅱ型经典毒株DY株(JN864948)作为亲本株，用高致病性PRRSV XZ株的ORF5(DSub16630)和ORF6(DSub16645)基因替换DY株相应基因，构建嵌合重组PRRSV毒株cDY56。其目的是为了cDY56能够同时预防PRRSV经典毒株和地方流行毒株。为实现cDNA转录后的完整剪切，在基因组两端加入斧头状核酶和丁型肝炎病毒核酶序列。在基因组552-560位置敲除“FQQVKRLSS”抗原肽，并以此抗原肽偶联后建立Peptide-ELISA检测方法，配合DIVA疫苗株达到区分疫苗免疫和自然感染动物的目的。此外，本发明利用动物实验，通过与商品化PRRSV疫苗在诱导体液免疫和细胞免疫方面的差异分析，表明本发明的嵌合重组PRRSV毒株cDY56相对于目前商品化的疫苗，在诱导体液免疫和细胞免疫以及降低免疫抑制等方面具有更好的效果，具有广阔的应用前景。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院
<120> 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56
<130> 1
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15820
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgtcatact gatgagtccg tgaggacgaa acggtacccg gtaccgtcta tgacgtatag 60
gtgttggctc tatgccttgg catttgtatt gtcaggagct gtgaccattg gcacagccca 120
aaacttgctg cacagaaaca cccttctgtg atagcctcct tcaggggagc ttagggtttg 180
tccctagcac cttgcttccg gagttgcact gctttacggt ctctccaccc ctttaaccat 240
gtctgggata cttgatcggt gcacgtgtac ccccaatgcc agggtgttta tggcggaggg 300
ccaagtctac tgcacacgat gcctcagtgc acggtctctc cttcccctga acctccaagt 360
ttctgagctc ggggtgctag gcctattcta caggcccgaa gagccactcc ggtggacgtt 420
gccacgtgca ttccccactg ttgagtgctc ccccgccggg gcctgctggc tttctgcaat 480
ctttccaatc gcacgaatga ccagtggaaa cctgaacttc caacaaagaa tggtacgggt 540
cgcagctgag ctttacagag ccggccagct cacccctgca gtcttgaagg ctctacaagt 600
ttatgaacgg ggttgccgct ggtaccccat tgttggacct gtccctggag tggccgtttt 660
cgccaattcc ctacatgtga gtgataaacc tttcccggga gcaactcacg tgttgaccaa 720
cctgccgctc ccgcagagac ccaagcctga agacttttgc ccctttgagt gtgctatggc 780
tactgtctat gacattggtc atgacgccgt catgtatgtg gccgaaagga aaatctcctg 840
ggcccctcgt ggcggggatg aagtgaaatt tgaagttgtc cccggggagt tgaagttgat 900
tgcgaaccgg ctccgcacct ccttcccgcc ccaccacaca gtggacatgt ctaagttcgc 960
cttcacagcc cctgggtgtg gtgtttctat gcgggtcgaa cgccaacacg gctgccttcc 1020
cgctgacact gtccctgaag gcaactgctg gtggagcttg tttgacttgc ttccactgga 1080
agttcagaac aaagaaattc gccatgctaa ccaatttggc taccagacca agcatggtgt 1140
ctctggcaag tacctacagc ggaggctgca agttaatggt ctccgagcag taactgacct 1200
aaacggacct atcgtcgtac agtacttctt cgttaaggag agttggatcc gccatttgaa 1260
actggcggga gaacccagct actctgggtt tgaggacctc ctcagaataa gggttgagcc 1320
taacacgtcg ccattggctg acaaggaaga aaaaattttc cggtttggca gtcacaagtg 1380
gtacggcgct ggaaagagag caagaaaagc acgctcttgt gcgactgcta cagtcgctgg 1440
ccgcgctttg tccgttcgtg aaacccggca ggccaaggag cacgaggttg ccggcgccaa 1500
caaggctgag cacctcaaac actactcccc gcctgccgaa gggaattgtg gttggcactg 1560
catttccgcc atcgccaacc ggatggtgaa ttccaaattt gaaaccaccc ttcccgaaag 1620
agtgagacct ccagatgact gggctactga cgaggatctt gtgaatgcca tccaaatcct 1680
cagactccct gcggccttag acaggaacgg tgcttgtact agcgccaagt acgtacttaa 1740
gctggaaggt gagcattgga ctgtcactgt gacccctggg atgtcccctt ctttgctccc 1800
tcttgaatgt gttcagggct gttgtgggca caagggcggt cttggttccc cagatgcagt 1860
cgaggtctcc ggatttgacc ctgcctgcct tgaccggctg gctgaggtga tgcacctgcc 1920
tagcagtgct atcccagccg ctctggccga aatgtctggc gattccgatc gttcggcttc 1980
tccggtcacc actgtgtgga ctgtttcgca gttctttgcc cgtcacagcg gagggaatca 2040
ccctgaccaa gtgcgcttag ggaaaattat cagcctttgt caggtgattg aggactgctg 2100
ctgttcccag aacaaaacca accgggtcac cccggaggag gtcgcagcaa agattgacct 2160
gtacctccgt ggtgcaacaa atcttgaaga atgcttggcc aggcttgaga aagcgcgccc 2220
gccacgcgta atcgacacct tctttgattg ggatgttgtg ctccctgggg ttgaggcggc 2280
aacccagacg atcaagctgc cccaggtcaa ccagtgtcgt gctctggtcc ctgttgtgac 2340
tcaaaagtcc ttggacaaca actcggtccc cctgaccgcc ttttcactgg ctaactacta 2400
ctaccgtgcg caaggtgacg aagttcgtca ccgtgaaaga ctaaccgccg tgctctccaa 2460
gttggaaaag gttgttcgag aagaatatgg gctcatgcca accgagcctg gtccacggcc 2520
cacactgcca cgcgggctcg acgaactcaa agaccagatg gaggaggact tgctgaaact 2580
ggctaacgcc cagacgactt cggacatgat ggcctgggca gtcgagcagg ttgacctaaa 2640
aacttgggtc aagaactacc cgcggtggac accaccaccc cctccgccaa aagttcagcc 2700
tcgaaaaacg aagcctgtca agagcttgcc ggagagaaag cctgtccccg ccccgcgcag 2760
gaaggttggg tccgattgtg gcagcccggt ttcattaggc ggcgatgtcc ctaacagttg 2820
ggaagatttg gctgttagta gcccctttga tctcccgacc ccacctgagc cggcaacacc 2880
ttcaagtgag ctggtgattg tgtcctcacc gcaatgcatc ttcaggccgg cgacaccctt 2940
gagtgagccg gctccaattc ccgcacctcg cggagctgtg tctcgaccgg tgacaccctt 3000
gagtgggccg atccctgtgc ccgcaccgcg gcgtaagttt cagcaggtga aaagattgag 3060
ttcggcggcg gcaatcccac cgtaccagaa cgagcccctg gatttgtctg cttcctcaca 3120
gactgaatat gaggcctctc ccccagcacc gccgcagagc gggggcgttc tgggagtaga 3180
ggggcatgaa gctgaggaaa ccctgagtga aatctcggac atgtcgggta acattaaacc 3240
tgcgtccgtg tcatcaagca gctccttgtc cagcgtgaga atcacacgcc cagaatactc 3300
agctcaagcc atcatcgact cgggcgggcc ctgcagtggg catctccaag aggtaaagga 3360
aacatgcctt agtgtcatgc gcgaggcatg tgatgcgact aagcttgatg accctgctac 3420
gcaggaatgg ctttctcgca tgtgggatcg ggtggacatg ctgacttggc gcaacacgtc 3480
tgtttaccag gcgatttgca ccttagatgg caggttaaag ttcctcccaa aaatgatact 3540
cgagacaccg ccgccctatc cgtgtgagtt tgtgatgatg cctcacacgc ctgcaccttc 3600
cgtaggtgcg gagagcgacc ttaccattgg ctcagttgct actgaagatg ttccacgcat 3660
cctcgagaaa atagaaaatg tcggcgagat ggccaaccag ggacccttgg ccttctccga 3720
ggataaaccg gtagatgacc aacttgtcaa cgacccccgg atatcgtcgc ggaggcctga 3780
cgagagcaca tcagctccgt ccgcaggcac aggtggcgcc ggctctttta ccgatttgcc 3840
gccttcagat ggcgcggatg cggacggggg ggggccgttt cggacggtaa aaagaaaagc 3900
tgaaaggctc tttgaccaac tgagccgtca ggtttttgac ctcgtctccc atctccctgt 3960
tttcttctca cgccttttct accctggcgg tggttattct ccgggtgatt ggggttttgc 4020
agcttttact ctattgtgcc tctttttatg ttacagttac ccagcctttg gtattgctcc 4080
cctcttgggt gtgttttctg ggtcttctcg gcgcgttcga atgggggttt ttggctgctg 4140
gttggctttt gctgttggtc tgttcaagcc tgtgtccgac ccagtcggcg ctgcttgtga 4200
gtttgactcg ccagagtgta gaaacatcct tcattctttt gagcttctca aaccttggga 4260
ccctgttcgc agccttgttg tgggccccgt cggtctcggt cttgccattc ttggcaggtt 4320
actgggcggg gcacgctgca tctggcactt tttgcttagg cttggcattg ttgcagactg 4380
tatcttggct ggagcttacg tgctttctca aggtaggtgt aaaaagtgct ggggatcttg 4440
tataagaact gctcctaatg aggtcgcttt taacgtgttt cctttcacac gtgcgaccag 4500
gtcgtcactt atcgacctgt gcgatcggtt ttgtgcgcca aaaggaatgg accccatttt 4560
tctcgccact gggtggcgcg ggtgctgggc cggccgaagc cccattgagc aaccctctga 4620
aaaacccatc gcgtttgccc aattggatga aaagaagatt acggctagga ctgtggtcgc 4680
ccagccttat gaccccaacc aagccgtaaa gtgcttgcgg gtattgcagg cgggtggggc 4740
gatggtggct aaggcggtcc caaaagtggt taaggtttcc gctgttccat tccgagcccc 4800
cttctttccc actggagtga aagttgaccc tgattgcagg gtcgtggttg accctgacac 4860
tttcactgca gctctccggt ctggctactc caccacaaac ctcgtccttg gtgtagggga 4920
ctttgcccag ctgaatggat taaaaatcag gcaaatttcc aagccttcag ggggaggccc 4980
acatctcatg gctgccctgc atgttgcctg ctcgatggct ctgcacatgc ttgctgggat 5040
ttatgtgact gcggtgggtt cttgcggcac cggcaccaac gacccgtggt gcgctaaccc 5100
gtttgccgtc cctggctacg gacctggctc tctctgcacg tccagattgt gcatttccca 5160
acacggcctt accctgccct tgacagcact tgtggcggga ttcggtattc aagaaattgc 5220
cttggtcgtt ttgatttttg tttccatcgg aggcatggct cataggttga gctgtaaggc 5280
tgacatgctg tgtgttttgc ttgcaattgc cagctatgtt tgggtacctc ttacctggtt 5340
gctttgtgtg tttccttgct ggttgcgctg tttttctttg caccccctca ccatcctatg 5400
gttggtgttt ttcttgattt ctgtgaatat gccttcagga atcttggcca tggtgttgtt 5460
ggtttctctt tggcttcttg gtcgttatac taatgttgct ggccttgtca ccccctacga 5520
cattcatcat tacaccagtg gcccccgcgg tgttgccgcc ttggctaccg caccagatgg 5580
gacctacttg gccgctgtcc gccgcgctgc gttgactggc cgcaccatgc tgtttacccc 5640
gtcccagctt gggtctcttc ttgagggtgc tttcagaact cgaaagccct cactgaacac 5700
cgtcaatgtg atcgggtcct ctatgggctc tggcggggtg tttaccatcg acgggaaagt 5760
caagtgcgta actgccgcac atgtccttac gggcaattca gctcgggttt ccggggtcgg 5820
cttcaatcaa atgcttgact ttgacgtaaa gggagatttc gctatagctg attgcccgaa 5880
ttggcaaggg gctgccccca agacccaatt ctgcacggat ggatggactg gccgtgccta 5940
ttggctaaca tcctctggcg tcgaacccgg cgtcattgga aaaggattcg ccttctgctt 6000
caccgcatgt ggcgattccg ggtccccagt gatcaccgag gccggtgagc ttgtcggcgt 6060
tcacacggga tcgaataaac aagggggggg cattgttacg cgcccctcag gccagttttg 6120
caatgtggca cccatcaagc taagcgaatt aagtgaattc tttgctgggc ctaaggtccc 6180
gctcggtgat gtgaaggtcg gcagccacat aattaaagac ataagcgagg tgccttcaga 6240
tctttgtgcc ttgcttgctg ccaaacctga actggaagga ggcctctcca ccgtccaact 6300
tctttgtgtg ttttttctcc tgtggagaat gatgggacat gcctggacgc ccttggttgc 6360
tgtgagtttc tttattttga atgaggttct ccctgccgtc ctggtccgaa gtgttttctc 6420
ctttggaatg tttgtgctat cctggctcac gccatggtct gcgcaagttc tgatgatcag 6480
gcttctgaca gcagctctta acaggaacag atggtcactt gcctttttca gcctcggtgc 6540
agtgaccggt tttgtcgcag atcttgcgac cactcagggg catccgttgc aggcagtgat 6600
gaatttgagc acctatgcat tcctgcctcg gatgatggtt gtgacctcac cagtcccagt 6660
gatcacgtgt ggtgtcgtgc acctacttgc catcattttg tacttgttta agtaccgtgg 6720
cctgcaccat atccttgttg gcgatggagt gttctctgcg gctttcttct tgagatactt 6780
tgccgaggga aagttgaggg aaggggtgtc gcaatcctgc ggaatgaatc atgagtctct 6840
gactggtgcc ctcgctatga gactcaatga cgaggacttg gatttcctta tgaaatggac 6900
tgattttaag tgctttgttt ctgcgtccaa catgaggaat gcagcgggtc aatttatcga 6960
ggctgcctat gctaaagcac ttagagtaga actggcccag ttggtgcagg ttgataaagt 7020
tcgaggtact ttggccaaac ttgaagcttt tgctgatacc gtggcacctc aactctcgcc 7080
cggtgacatt gttgtcgctc tcggccacac gcctgttggc agtatcttcg acctaaaggt 7140
tggtagcacc aagcataccc tccaagccat tgagaccaga gtccttgctg ggtccaaaat 7200
gaccgtggcg cgcgtcgtcg acccgacccc cacgccccca cccgcacccg tgcccatccc 7260
cctcccaccg aaagttctgg agaatggccc caacgcttgg ggggatgagg accgtttgaa 7320
taagaagaag aggcgcagga tggaagccct cggcatctat gttatgggcg ggaaaaagta 7380
ccagaaattt tgggacaaga attccggtga tgtgttttat gaggaggtcc ataataacac 7440
agatgagtgg gagtgtctca gagttggcga ccctgccgac tttgaccctg agaagggaac 7500
tctgtgtgga catgtcacca ttgaaaacaa ggcttaccat gtttacacct ccccatctgg 7560
taagaagttc ttggtccccg tcaacccaga gaatggaaga gttcaatggg aagctgcaaa 7620
gctttccgtg gagcaggccc taggtatgat gaatgtcgac ggcgaactga ctgccaaaga 7680
actggagaaa ctgaaaagaa taattgacaa actccagggc ctgactaagg agcagtgttt 7740
aaactgctag ccgccagcga cttgacccgc tgtggtcgcg gcggcttggt tgttactgaa 7800
acagcggtaa aaatagtcaa atttcacaac cggaccttca ccctgggacc tgtgaattta 7860
aaagtggcca gtgaggttga gctaaaagac gcggttgagc acaaccaaca cccggttgcg 7920
agaccgatcg atggtggagt tgtgctcctg cgttccgcgg ttccttcgct tatagacgtc 7980
ttgatctccg gtgctgatgc atctcccaag ttacttgccc atcacgggcc gggaaacact 8040
gggatcgatg gcacgctctg ggattttgag tccgaagcca ctaaagagga agtcgcactc 8100
agtgcgcaaa taatacaggc ttgtgacatt aggcgcggcg acgctcctga aattggtctc 8160
ccttacaagc tgtaccctgt taggggtaac cctgagcggg tgaaaggagt tcttcagaat 8220
acaaggtttg gagacatacc ttacaaaacc cccagtgaca ctggaagccc agtgcacgcg 8280
gctgcctgcc ttacgcccaa cgccactccg gtgactgatg ggcgctccgt cttggccacg 8340
accatgcccc ccgggtttga gttatatgta ccgaccatac cagcgtctgt ccttgattac 8400
cttgactcta ggcctgactg ccctaaacag ctgacagagc acggctgcga agatgccgca 8460
ctgaaagacc tctctaaata tgacttgtcc acccaaggct ttgttttacc tggagttctt 8520
cgccttgtgc ggaaatacct gtttgcccat gtaggtaagt gcccacccgt tcatcggcct 8580
tccacttacc ctgctaagaa ttctatggct ggaataaatg ggaacaggtt cccaaccaag 8640
gacattcaga gcgtccctga aatcgacgtt ctgtgcgcac aggctgtgcg agaaaactgg 8700
caaactgtca ccccttgtac tcttaagaaa cagtattgcg ggaagaagaa gactaggacc 8760
atactcggca ccaataactt catcgcacta gcccaccgag cagtgttgag tggtgttacc 8820
cagggcttca tgaaaaaggc gtttaactcg cccatcgccc tcggaaagaa taagtttaag 8880
gagctacaga ctccggtcct gggcaggtgc cttgaagctg atctcgcatc ctgcgatcga 8940
tccacgcctg caattgtccg ctggtttgcc gccaaccttc tttatgaact tgcctgtgct 9000
gaagagcatc taccgtcgta cgtgctgaac tgctgccacg acttactggt cacgcagtcc 9060
ggcgcagtga ctaagagagg tggcctgtcg tctggcgacc cgatcacctc tgtgtctaac 9120
accatttata gtttggtgat ctatgcacag catatggtgc ttagttactt caaaagtggt 9180
caccctcatg gccttctgtt cttacaagac cagctaaagt ttgaggacat gctcaaggtt 9240
caacccctga tcgtctattc ggacgacctc gtgctgtatg ccgagtctcc caccatgcca 9300
aactatcact ggtgggttga acatctgaat ttgatgctgg ggtttcagac ggacccaaag 9360
aagacagcaa taacagactc gccatcattt ctaggctgta gaataataaa tgggcgccag 9420
ctagtcccca accgtgacag gatcctcgcg gccctcgcct atcacatgaa ggcgagtaat 9480
gtttctgaat actatgcctc agcggctgca atactcatgg acagctgtgc ttgtttggag 9540
tatgatcctg aatggtttga agaacttgta gttggaatag cgcagtgcgc ccgcaaggac 9600
ggctacagct ttcccggcac gccgttcttc atgtccatgt gggaaaaact caggtccaat 9660
tatgagggga agaagtcgag agtgtgcggg tactgcggag ccccggcccc gtacgctact 9720
gcctgtggcc tcgacgtctg catttaccac acccacttcc accagcattg tccagtcaca 9780
atctggtgtg gccatccagc gggttctggt tcttgtagtg agtgcaaatc ccctgtaggg 9840
aaaggcacaa gccctttaga cgaggtgctg gaacaagtcc cgtataagcc cccacggacc 9900
gttatcatgc atgtggagca gggtctcacc ccccttgatc caggtagata ccaaactcgc 9960
cgcggactag tctctgtcag gcgtggaatt aggggaaatg aagttgaact accagacggt 10020
gattatgcta gcaccgcctt gctccctacc tgcaaagaga tcaacatggt cgctgtcgct 10080
tccaatgtat tgcgcagcag gttcatcatc ggcccacccg gtgctgggaa aacatactgg 10140
ctccttcaac aggtccagga tggtgatgtt atttacacac caactcacca gaccatgctt 10200
gacatgatta gggctttggg gacgtgccgg ttcaacgtcc cggcaggcac aacgctgcaa 10260
ttccccgtcc cctcccgcac cggtccgtgg gttcgcatcc tagccggcgg ttggtgtcct 10320
ggcaagaatt ccttcctaga tgaagcggcg tattgcaatc accttgatgt tttgaggctt 10380
cttagtaaaa ctaccctcac ctgtctagga gacttcaagc aactccaccc agtgggtttt 10440
gattctcatt gctatgtttt tgacatcatg cctcaaactc aactgaagac catctggagg 10500
tttggacaga atatctgtga tgccattcag ccagattaca gggacaaact catgtccatg 10560
gtcaacacaa cccgtgtgac ccacgtggaa aaacctgtca ggtatgggca ggtcctcacc 10620
ccctaccaca gggaccgaga ggacgacgcc atcactattg actccagtca aggcgccaca 10680
ttcgatgtgg ttacattgca tttgcccact aaagattcac tcaacaggca aagagccctt 10740
gttgccatca ccagggcaag acacgctatc tttgtgtatg acccacacag gcagctgcag 10800
ggcttgtttg atcttcctgc aaaaggtaca cccgtcaacc tcgcagtgca ccgcgacggg 10860
cagctgatcg tgctggatag aaataacaaa gaatgcacgg ttgctcaggc tctaggcaac 10920
ggggataaat ttagggccac agataagcgt gttgtagatt ctctccgcgc catttgtgct 10980
gatctagaag ggtcgagctc tccgctcccc aaggtcgcac acaacttggg attttatttc 11040
tcatctgatt taacacagtt tgctaaactc ccagtagaac ttgcacctca ctggcccgtg 11100
gtgacaaccc agaacaatga aaagtggcca gatcggctgg ttgccagcct tcgccctatc 11160
cataaataca gccgcgcgtg catcggtgcc ggctatatgg tgggcccttc ggtgtttcta 11220
ggcactcctg gggtcgtgtc atactatctc acaaaatttg ttaagggcga ggctcaattg 11280
cttccggaga cggttttcag caccggccga attgaggtag actgccggga atatcttgat 11340
gatcgggagc gagaagttgc tgcgtccctc ccacacgctt tcattggcga cgtcaaaggc 11400
actaccgttg gaggatgtca tcatgtcacc tccagatacc tcccgcgcgt ccttcccaag 11460
gaatcagttg cggtagtcgg ggtttcaagc cccggaaaag ccgcgaaagc attgtgcaca 11520
ctgacagatg tgtacctccc agatcttgaa gcctatctcc acccggagac ccagtccaag 11580
tgctggaaaa tgatgttgga cttcaaagaa gttcgactaa tggtctggaa agacaaaaca 11640
gcctatttcc aacttgaagg tcgctatttc acctggtatc agcttgccag ctatgcctcg 11700
tacatccgtg ttcctgtcaa ctctacggtg tacttggacc cctgcatggg ccccgccctt 11760
tgcaacagga gagtcgtcgg gtccacccac tggggggctg acctcgcggt caccccttat 11820
gattacggcg ctaaaattat cctgtctagc gcgtaccatg gtgaaatgcc ccccggatac 11880
aaaattctgg cgtgcgcgga gttctcgttg gatgacccag ttaagtacaa acatacctgg 11940
gggtttgaat cggatacagc gtatctgtat gagttcaccg aaaacggtga ggactggaag 12000
gattacaatg atgcgtttcg tgcgcgccag gaagggaaaa tttacaaggc cactgccacc 12060
agcttgaagt tttattttcc cccgggccct gtcattgaac caactttagg cctgaattga 12120
aatgaaatgg ggtccatgca aagccttttt tacaaaattg gccaactttt tgtggatgct 12180
ttcacggagt tcttggtgtc cattgttgat atcattatat ttttggccat tttgtttggc 12240
ttcaccatcg ccggttggct ggtggtcttt tgcatcagat tggtttgctc cgcgatactc 12300
cgtacgcgct ctgccattca ctctgagcaa ttacagaaga tcttatgagg cctttctttc 12360
ccagtgccaa gtggacattc ccacctgggg aactaaacat cctttgggga tactttggca 12420
ccataaggtg tcaaccctga ttgatgaaat ggtgtcgcgt cgaatgtacc gcatcatgga 12480
aaaatcaggg caggctgcct ggaaacaggt ggtgagcgag gctacgctgt ctcgcattag 12540
tagtttggat gtggtggctc attttcagca tctagccgcc attgaagccg agacctgtaa 12600
atatttggcc tcccggccgc ccatgctaca caacctgcgc atgacaggtt caaatgtaac 12660
catagtgtat aatagcactt tgaatcaggt gtttgctatt tttccaaccc ctggttcccg 12720
gccaaagctt catgattttc agcaatggtt aatagctgta cattcctcca tattttcctc 12780
tgttgcagct tcttgtactc tttttgttgt gctgtggttg cgggttccaa tactacgtac 12840
tgtttttggt ttccgctggt taggggcaat ttttctttcg aactcactgt gaattacacg 12900
gtgtgtccac cttgcctcac ccggcaagca gccgcagaga tctacgaacc cggtaggtct 12960
ctttggtgca ggatagggta tgaccgatgt gaggaggatg atcatgacga gctagggttt 13020
atggtaccgc ctggcctctc cagcgaaggc cacttgacta gtgtttacgc ctggttggcg 13080
tttttgtcct tcagctacac ggcccagttc catcccgaaa tattcgggat agggaatgtg 13140
agtcgagttt atgttgacat caaacatcaa ctcatctgcg ccgaacatga cgggcagaac 13200
accaccttgc ctcgtcatga caacatttca gccgtgtttc agacctatta ccaacatcaa 13260
gtcgacggcg gcaattggtt tcacctagaa tggcttcgtc ccttcttttc ctcgtggttg 13320
gttttaaatg tctcttggtt tctcaggcgt tcgcctgcaa accatgtttc agttcgagtc 13380
ttgcagacat taagaccaac accaccgcag cggcaggctt tgctgtcctc caagacatca 13440
gttgccttag gcatcgcgac tcggcctctg aggcgattcg caaaatccct cagtgccgta 13500
cggcgatagg gacacctgtg tatgttacca tcacagccaa tgtgacagat gagaattatt 13560
tacattcttc tgatctcctc atgctttctt cttgcctttt ctatgcttct gagatgagtg 13620
aaaagggatt taaggtggtg tttggcaatg tgtcaggcat cgtggctgtg tgtgtcaatt 13680
ttaccagcta cgtccaacat gtcaaggagt ttacccaacg ctccctggtg gtcgaccatg 13740
tgcggttgct ccatttcatg acacctgaga ccatgaggtg ggcaactgtt ttagcctgtc 13800
tttttgccat tctgttggca atttgaatgt ttaagtatgt tggggaagtg cttgaccgcg 13860
tgctgttgct cgcgattgct ttttttgtgg tgtatcgtgc cgttctatct tgctgtgctc 13920
gccaacgcca gcaacaacaa cagctctcat attcagttga tttataactt aacgctatgt 13980
gagctgaatg gcacagattg gctggcacaa aaatttgact gggcagtgga gacttttgtc 14040
atcttccccg tgttgactca cattgtttcc tatggggcac tcaccaccag ccatttcctt 14100
gacacagttg gtctggccac tgtgtccacc gccggatatt atcacgggcg gtatgtcttg 14160
agtagcattt acgcagtctg tgctctggct gcgctgattt gctttgtcat taggcttgcg 14220
aagaactgca tgtcctggcg ctactcttgt accagatata ccaacttcct tctggacact 14280
aagggcagac tctatcgttg gcggtcaccc gtcattgtgg agaaaggggg taaggttgag 14340
gtcgaaggtc acctgatcga cctcaagaga gttgtgcttg atggttccgc ggcaacccct 14400
ttaaccagag tttcagcgga acaatggggt cgtctctaga cgacttctgc aatgatagca 14460
cagctccaca gaaggtgctt ttggcgtttt ccattaccta cacgccagtg atgatatatg 14520
ctctaaaggt aagtcgcggc cgactgctag ggcttctgca ccttttgatc tttctgaatt 14580
gtgcttttac cttcgggtac atgacattcg tgcactttga gagcacaaat agggtcgcgc 14640
tcactatggg agcagtagtt gcacttcttt ggggagtgta ctcagccata gaaacctgga 14700
aattcatcac ttccagatgc cgtttgtgct tgctaggccg caagtacatt ctggcccctg 14760
cccaccacgt cgaaagtgcc gcgggctttc atccgattgc ggcaaatgat aaccacgcat 14820
ttgtcgtccg gcgtcccggc tccactacgg tcaacggcac attggtgccc gggttgaaaa 14880
gcctcgtgtt gggtggcaga aaagctgtta agcagggagt ggtgaacctt gttaaatatg 14940
ccaaataaca acggcaagca gcagaagaga aagaaggggg atggccagcc agtcaatcag 15000
ctgtgccaga tgctgggtaa gatcatcgct cagtaaaacc agtccagagg caagggaccg 15060
ggaaagaaaa ataagaagca aaacccggag aagccccatt ttcctctagc gactgaagat 15120
gatgtcagac atcactttac ccctagtgag cggcaattgt gtctgtcgtc aatccagacc 15180
gcctttaatc aaggcgctgg gacttgcacc ctgtcagatt cagggaggat aagttacact 15240
gtggagttta gtttgcctac gcatcatact gtgcgcctga ttcgcgtcac agcatcaccc 15300
tcagcatgat gggctggcat tcttgaggca tctcagtgtt tgaattggaa gaatgtgtgg 15360
tgaatggcac tgattgacat tgcgcctcta agtcacctat tcaattaggg cgaccgtgtg 15420
ggggtgagat ttaattggcg agaaccatgc ggccgaaatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 15480
aaaaaaaaaa gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccgaa 15540
ggaggacgca cgtccactcg gatggctaag ggagggcgct gatcagcctc gactgtgcct 15600
tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 15660
gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 15720
tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 15780
aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt 15820
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtg 27
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtaggcggg gccaattctc gaggctag 28
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctagcctcga gaattggccc gccctacc 28
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctcccacat ctccccctga acctgaaaca ta 32
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggggtctacg tcatactga 19
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gatggcattc acaagatcct cgtca 25
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggtcacgtca tactgattcc gtgaggacga aacccta 37
<210> 9
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggacgaaacc ctatagtgag tatagggtat gacgtatagg tgtgct 46
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acctccgtgg tgcaacaaat cttgaag 27
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acggtgggat tgccgccgca cttacgcacc ggtgcgggca c 41
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctgtgcccgc accggtgcgt aagtgcggcg gcaatccca 39
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cactaaggca tgtttccttt acctct 26
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgtgcgcctg attcgcgtcc agcatcaccc tca 33
<210> 15
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggaggtggag atgccatgcc gacccttttt tttttttttt tttttttttt tttttaat 58
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gagtggacgt gcgtcctcct tcggatgcca ggtcggaccg cgaggaggtg gagatgccat 60
<210> 17
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgcgcggccg cgcactcgag cgccctccct tagccatccg agtggacgtg cgtcctcctt 60
c 61
<210> 18
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cccctcgagc tgatcagcct cgactgtgcc ttctbrcccg cggccgcaag ccatagagcc 60
caccgcatc 69
<210> 19
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aaaaaaaaaa aaaaagggtc ggcatggcat ctccabghcc tcactaaagg gaagcggccg 60
caagccatag agcccac 77
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctagcctcga gaattggcgc gccactcata ctgatgagtc cgtgagga 48
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
caggtaagag gtacccaaac atagctggca at 32
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctagcctcga gaaattggcg cgccggtacc tcttacctgg ttgcttgt 48
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gggccgcgag gatcctgtca cggtt 25
<210> 24
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctagcctcga gaaattggcg cgccgatcct cgcggccctc gcctatca 48
<210> 25
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cctcactaaa gggaagcggc cgcggccaaa aatataatga tatcaacaat ggacac 56
<210> 26
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ttggtgtcca ttgttgatat cgatatcatt atatttttgg ccatttt 47
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cctcactaaa gggaagcggc cgcaagccat agagcccac 39
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
atgttgggaa gtgcttgac 19
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tgctgcttgc cgttgttatt tggcatattt aacaaggttc 40
<210> 30
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gacatcagtt gccttaggca tcgcgactcg gcctctgagg cgatdyrgca cttccccaac 60
atacttaaac attcaaattg ccaaca 86
<210> 31
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
aaatatgcca aataacaacg gcaagcagca gaagdyrctc actaaaggga agcggccgca 60
agccatagag cccaccgca 79
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
acctcagatg tacctaatgg gtcattcagt ttcccagag 39
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
gttgcattgc actaaccctt ttcaattctg tagcctgctt 40
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gcatccactt cccaaccatc ggcattacgt cttccag 37

Claims (1)

1.一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56，其特征在于，利用基因Ⅱ型经典毒株DY株作为亲本株，用高致病性PRRSV XZ株的ORF5和ORF6基因替换亲本株相应基因，构建嵌合重组PRRSV疫苗株cDY56；
所述嵌合重组PRRSV疫苗株，命名为PRRSV cDY56，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC No.20711。
CN202011248670.7A 2020-11-10 2020-11-10 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56 Active CN113046329B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011248670.7A CN113046329B (zh) 2020-11-10 2020-11-10 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011248670.7A CN113046329B (zh) 2020-11-10 2020-11-10 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113046329A CN113046329A (zh) 2021-06-29
CN113046329B true CN113046329B (zh) 2024-01-30

Family

ID=76507805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011248670.7A Active CN113046329B (zh) 2020-11-10 2020-11-10 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113046329B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117511936B (zh) * 2024-01-05 2024-04-09 广州奕昕生物科技有限公司 一种基于mb-rt-pcr检测高致病性猪蓝耳病病毒的试剂盒及检测方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2410694A1 (en) * 1998-06-16 1999-12-16 Serge Dea Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) dna vaccines
EP1882478A1 (en) * 2006-07-29 2008-01-30 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Fusion protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as PRRS vaccine
CN101220351A (zh) * 2007-12-07 2008-07-16 中国农业大学 利用Nsp2基因缺失构建PRRSV基因缺失疫苗毒株的方法及其应用
CN101401937A (zh) * 2008-01-23 2009-04-08 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 共表达prrsv orf5及orf6双基因核酸疫苗的制备方法
CN105606805A (zh) * 2016-01-27 2016-05-25 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒
CN109762792A (zh) * 2019-01-18 2019-05-17 南京农业大学 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株及其应用
CN110904055A (zh) * 2019-11-15 2020-03-24 华南农业大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株prrsv-sp及其制备方法与应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2410694A1 (en) * 1998-06-16 1999-12-16 Serge Dea Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) dna vaccines
EP1882478A1 (en) * 2006-07-29 2008-01-30 Healthbanks Biotech Co., Ltd. Fusion protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as PRRS vaccine
CN101220351A (zh) * 2007-12-07 2008-07-16 中国农业大学 利用Nsp2基因缺失构建PRRSV基因缺失疫苗毒株的方法及其应用
CN101401937A (zh) * 2008-01-23 2009-04-08 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 共表达prrsv orf5及orf6双基因核酸疫苗的制备方法
CN105606805A (zh) * 2016-01-27 2016-05-25 山东省滨州畜牧兽医研究院 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒
CN109762792A (zh) * 2019-01-18 2019-05-17 南京农业大学 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株及其应用
CN110904055A (zh) * 2019-11-15 2020-03-24 华南农业大学 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株prrsv-sp及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus differentiable (DIVA) strain through deletion of specific immunodominant epitopes;Marcelode Lima等;《Vaccine》;20080704;第26卷(第29-30期);摘要 *
Development of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus differentiable (DIVA) strain through deletion of specific immunodominant epitopes;Marcelode Lima等;Vaccine;第26卷(第29-30期);摘要，引文12表1 *
Identification and characterization of a porcine monocytic cell line supporting porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) replication and progeny virion production by using an improved DNA-launched PRRSV reverse genetics system;Y.W.Huang等;《Virus Research》;20091031;第145卷(第1期);摘要，图1 *
猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合基因标记疫苗株的构建和诊断检测技术平台的研究;刘磊等;科技成果登记表;第2页 成果简介第1-2段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113046329A (zh) 2021-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109762792B (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合毒株及其应用
CN110551695A (zh) 非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株及其应用
CN112980852B (zh) 新型冠状病毒b.1.351南非突变株rbd的基因及其应用
CN107090461B (zh) 一种烟草hkt1基因及其制备方法和应用
CN113061586B (zh) 表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制备方法
CN110904153A (zh) 表达非洲猪瘟病毒p12或p17蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用
CN110628817A (zh) 表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用
CN111676247A (zh) 一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型分离株感染性克隆构建、拯救与应用
CN113046329B (zh) 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒嵌合重组的PRRSV DIVA疫苗株cDY56
CN110904055B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组疫苗株prrsv-sp及其制备方法与应用
CN117511888A (zh) 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达鸡传染性贫血病病毒T1P6毒株VP2蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
CN110628725B (zh) 柑橘黄化脉明病毒突变体及其构建方法
CN110904152A (zh) 表达非洲猪瘟病毒p54蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建方法及其应用
CN116240222A (zh) 一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型e2蛋白基因及其应用
CN111875678B (zh) 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp3/gp5/m基因的重组伪狂犬病毒、构建方法和应用
CN111925449B (zh) 一种表达鸡vp2和鸡gal-1融合蛋白的重组cho细胞株及其构建方法和应用
CN110904056B (zh) 一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用
CN107653254B (zh) 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒重组orf5基因及其制备方法
CN105749272B (zh) 表达大熊猫犬瘟热病毒h、f基因重组山羊痘病毒的疫苗、其制备方法及免疫应用方法
Tu et al. Isolation and bioinformatics analysis of the NADC30_Like CJS01 strain of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus
CN112538460A (zh) 一种提高猪圆环病毒增殖的方法
CN114606207B (zh) 一种不依赖胰酶的猪流行性腹泻病毒变异毒株及其构建与应用
CN113736811B (zh) 促进tshs、yncE基因胞外表达的质粒及其构建方法和应用
CN115927458A (zh) 一种表达asfv e183l基因的重组prrsv的拯救方法和应用
CN116445528B (zh) 重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法及其感染性克隆和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant