CN113061586B - 表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制备方法 - Google Patents

表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，发明的原理和最核心的关键技术是利用sgRNA，替换EGFP后进行病毒纯化，获得可以稳定扩增血清8型禽腺病的纤突蛋白的重组禽腺病毒。利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入的血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F，成功获得了表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白的重组FAdV‑4，在体外实验结果显示，FAdV4‑F1‑F‑F2重组病毒与FAdV‑4野毒的复制能力几乎相同，可作为防控FAdV‑4和FAdV‑8的灭活重组多价苗。

Description

表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制 备方法
技术领域
本发明涉及一种表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制备方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型(FAdV-1～8a,FAdV-8b～11)。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdVs引起的包涵体肝炎、心包积液综合征的病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，心包积液综合征主要是由高致病性FAdV-4引起的，而FAdV-8是包涵体肝炎的主要病因。然目前尚无FAdV-4和FAdV-8的商品化疫苗。为此开发一种高效、优质的二价疫苗显得尤为重要。疫苗种类的主要分为灭活疫苗、弱毒活疫苗和基因工程疫苗。而腺病毒作为开发多价苗的病毒载体在许多文献中也有报道，因此，本发明利用本实验室已开发的重组的FAdV4-EGFP病毒作为载体插入血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因(F)，成功获得了重组的FAdV4-F1-F-F2病毒，旨在防制FAdV-4和FAdV-8，为构建FAdV-4重组多价苗提供了坚实的理论基础。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，一种表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒以及制备方法，发明的原理和最核心的关键技术是利用sgRNA，替换EGFP后进行病毒纯化，获得可以稳定扩增血清8型禽腺病的纤突蛋白的重组禽腺病毒。
本发明的目的是这样实现的，一种血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，其载体为重组EGFP血清4型禽腺病毒FAdV-4-EGFP。
所述重组血清4型禽腺病毒的外源基因为血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F，其序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1为：
ATGGCGACCTCGACGCCTCACGCCTTCTCCTTTGGCCAAATCGGCTCCCGAAAACGCCCTGCGGGTGGCGATGGCGAGCGAGACGCCTCCAAAGTGCCGAAAATGCAGACCCCCGCTCCGAGCGCGACCGCCAACGGAAATGACGAGCTGGACCTGGTCTACCCCTTTTGGCTCCAAAACGGCTCTACCGGAGGAGGCGGCGGCGGTTCCGGTGGAAACCCGTCCCTCAACCCGCCGTTTTTGGACCCCAACGGACCCCTGGCCGTCCAAAACAGCCTCCTGAAGGTCAATACCGCAGCCCCCATCACCGTCACCAATAAGGCCCTGACACTCGCCTATGAACCGGAGAGTCTCGAGCTCACTAACCAACAGCAACTGGCGGTCAAAATCGACCCCGAAGGACCTCTGAAAGCCACGACCGAGGGAATACAGCTGTCGGTCGACCCTACGACGTTGGAGGTTGATGATGTCGACTGGGAGTTAACCGTGAAACTCGACCCCGATGGCCCCCTGGATTCCTCAGCCGCAGGAATCACGGTCCGAGTCGATGAGACCTTGCTCATCGAAGATGATGTATCCGGACAGGGCAAAGAACTCGGAGTCAATCTCAACCCCGCGGGACCGATTACGGCCGACGAACAGGGCCTGGACTTAGAAATAGACAACCAGACACTCAAGGTCAACAGTGTCACCGGCGGGGGCGTCCTAGCTGTACAACTCAAATCCCAAGGTGGACTTACCGTACAGACTGACGGTATCCAAGTGAACACTCAGAACAGCATCACCGTTACTAACGGAGCTCTGGACGTGAAAGTAGCCGCCAACGGACCTTTGGAATCAACCGACACCGGGCTCACACTCAACTATGACCCCGGAGACTTCACAGTTAATGCGGGCACATTGAGTATTATTAGGGATCCGGCTCTCGTAGCCAATGCGTACCTCACATCCGGCGCCTCCACCCTTCAGCAATTTACAGCTAAGAGTGAGAATTCCAGTCAATTTTCTTTCCCGTGCGCGTACTATCTGCAACAGTGGCTTTCCGATGGGTTGATTGTTAGCTCCCTCTATCTGAAGCTCGACAGAGCACAGTTCACGAACATGCCAACGGGTGCTAACTATCAGAACGCTAGGTACTTTACCTTCTGGGTTGGAGCGGGCACTTCGTTTAATCTTTCTGCCCTTACCGCACCCACTATTACACCCAACACCACACAATGGAATGCATTCGCCCCTGCCCTTGATTACTCAGGTGCTCCTCCCTTCATCTACGACGCGTCTTCCGTAGTTACGATTTATTTTGAACCCACCAGTGGTCGACTGGAAAGCTATCTCCCCGTCCTTACCGATAACTGGAGCCAGACCTACAACCCCGGCACCGTGACCCTGTGTGTAAAAACGGTAAGGGTTCAATTGAGATCACAAGGAACCTTCAGCACTCTAGTCTGTTACAATTTCCGCTGTCAGAACACGGGCATTTTTAACAACAACGCTACAGCGGGAACCATGACACTTGGACCTATCTTCTTCAGTTGTCCCGCCCTAAGCACAGCCAACGCTCCGTAA。
一种血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因重组血清4型禽腺病毒的制备方法，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对EGFP基因上下游位置的sgRNA，选择分数较高排名靠前的sgRNA，其序列如SEQ ID NO.2-5所示；
SEQ ID NO.2-5为：
CACCGGGTTACGTCTACTCCCCCAA
AAACTTGGGGGAGTAGACGTAACCC
CACCGTCTTTATTTGACACGCGGTG
AAACCACCGCGTGTCAAATAAAGAC；
(2)通过同源重组的方法构建带有血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因Fiber的Fiber2供体质粒，同源重组的方法使用的引物序列如SEQ ID NO.6-9所示；
SEQ ID NO.6-9为：
TGTTCCCGTTGGGGGAGTAG
ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG
CTCCCCCAACGGGAACAATGGCGACCTCGACGCCTCAC
CTTTTAGGGGCCCGGAGCATTTACGGAGCGTTGGCTGTG；
(3)在转染的前一天铺LMH细胞，次日转染两条sgRNA和供体质粒各2ug，转染6h后换成10％生长液；
(4)转染48h后感染FAdV-4-EGFP，2h后换成1％维持液；
(5)感染FAdV-4-EGFP后反向选择不发荧光的空斑，利用空斑实验和有限稀释法，通过反向筛选不发绿色荧光的方法进行纯化，获得表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白的FAdV-4重组病毒。
步骤(3)中，LMH细胞系为鸡肝癌细胞。
本发明公开一种基于CRISPR-Cas9技术的重组血清4型禽腺病毒以及制备方法，
本发明所述的一种血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因重组血清4型禽腺病毒以及制备方法，利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入的血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F，成功获得了表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白的重组FAdV-4，在体外实验结果显示，FAdV4-F1-F-F2重组病毒与FAdV-4野毒的复制能力几乎相同，可作为防控FAdV-4和FAdV-8的灭活重组多价苗。
发明内容
图1为本发明的构建流程图。
图2为PCR扩增pMD19-HR1-F2-HR2线性化载体以及FAdV-8病毒F蛋白基因片段的电泳图；
M：Super DNA marker；1：pMD19-HR1-F2-HR2线性化载体；2：F蛋白基因片段。
图3为通过针对FAdV-8的F的特异性引物进行PCR鉴定纯化的重组毒；
M：Super DNA marker；1：阴性对照；2：纯化的重组毒；3：FAdV-8。
图4为利用FAdV-4的F1的上游和F2的下游的引物进行PCR鉴定纯化的重组毒M：Super DNA marker；1：阴性对照；2：纯化的重组毒；3：FAdV-4。
图5为IFA鉴定纯化后的重组毒；
A：抗FAdV-4阳性鸡血清；B：抗FAdV-8的F的单抗5F10；C：A和B组合的荧光图。
图6为Western blot鉴定纯化后的重组毒的F1,F2表达；
M：蛋白marker；1：LMH细胞裂解液；2：感染FA-4-F1-F-F2重组毒的LMH细胞裂解液；3：感染FAdV-4的LMH细胞裂解液；4：感染FAdV-8的LMH细胞裂解液。
图7为Western blot鉴定纯化后的重组毒的F表达；
M：蛋白marker；1：LMH细胞裂解液；2：感染FA-4-F1-F-F2重组毒的LMH细胞裂解液；3：感染FAdV-4的LMH细胞裂解液；4：感染FAdV-8的LMH细胞裂解液。
具体实施方式
实施例：
1.血清8型禽腺病毒的分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5的比例加入PBS制成悬液；5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和链霉素各1000IU/ml，37℃反应30min；经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为禽腺病毒后，－20℃保存。
2.血清8型禽腺病毒基因组的制备：取禽腺病毒分离毒株病毒上清400uL于1.5mL指形管内，加入400uL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％ SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用3小时；加入400uLTris平衡酚，充分混匀后10000r/min离心10分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入400uL酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000r/min离心5分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入800uL无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000r/min离心15分钟，弃尽上清；室温自然干燥后向沉淀加入30uL灭菌超纯水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得血清8型禽腺病毒基因组，置-20℃备用。
3.重组EGFP血清4型禽腺病毒FAdV-4-EGFP，由本实验室制备保存。
4.根据重组EGFP血清4型禽腺病毒FAdV-4-EGFP的EGFP基因，利用sgRNA在线设计网站(http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp和http://crispr.mit.edu)进行sgRNA序列设计。将设计好的sgRNA分别克隆到lentiCRISPR v2质粒，并通过测序验证构建成功：具体sgRNA序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表1.针对EGFP基因上下游位置的sgRNA序列
5.PCR扩增pMD19-HR1-F2-HR2线性化载体以及FAdV-8病毒F蛋白基因片段：设计能扩增出pMD19-HR1-F2-HR2线性化载体与FAdV-8禽腺病毒F蛋白基因片段的引物：具体引物序列见表2，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。分别以pMD19-HR1-EGFP-F2-HR2载体质粒(本实验室构建和保存)以及步骤2制备的禽腺病毒基因组为模板，表2所述相应引物为引物分别进行PCR扩增出线性化的pMD19-HR1-F2-HR2载体以及禽腺病毒F基因序列。PCR扩增反应体系为：模板1μL，5×Buffer 10μL，10mM dNTP Mix 1μL，上游引物为10μmol 2μL，下游引物为10μmol 2μL，高保真酶1μL，加入灭菌超纯水至50μL。PCR扩增反应循环参数为：95℃预变性4min，随后进行35个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min)，72℃延伸10min。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图2所示)，线性化的pMD19-HR1-F2-HR2和Fiber的长度分别约是5000bp和1500bp，并进行切胶纯化。
表2.PCR扩增线性化pMD19-HR1-F2-HR2及FAdV-8的F基因引物
6.pMD19-HR1-F-F2-HR2供体质粒的构建：将以上纯化的线性化载体pMD19-HR1-F2-HR2以及FAdV-8的F基因片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTMⅡ的作用下进行重组克隆。重组克隆经序列验证后，命名为pMD19-HR1-F-F2-HR2。具体重组反应体系如下：纯化的FAdV-8的F基因片段PCR产物50-100ng，纯化的pMD19-HR1-F2-HR2线性化载体50ng，2μL商品化的ExnaseTMⅡ酶，4μL 5倍的缓冲液，其它补加水至20μL。反应物于37℃作用30min后，置冰上5min。随后将20μL反应物转化到感受态细胞DH5α，涂于具有氨苄抗性的LB平板。次日挑取阳性克隆株进行质粒制备，并进行PCR鉴定，并测序。
7.表达FAdV-8-F的重组FAdV-4的拯救：转染前一天在6孔板中铺LMH细胞，每孔120-150w细胞；次日细胞密度生长至80％左右准备转染，2条sgRNA和供体质粒各2μg，利用2μL转染试剂Mirus与1μg质粒2：1的比例进行室温孵育45min，孵育结束后将转染试剂和质粒混合物滴加到预先用Opti-MEM覆盖的细胞中转染，转染6h后换成10％生长液。转染48h后，弃去生长液，用0.1MOI的FAdV-4-EGFP感染LMH细胞，感染2h后弃去病毒，换成1％维持液。感染病毒后，每天用荧光显微镜观察细胞中是否产生没有荧光但有细胞病变的现象。
8.表达FAdV-8-F的重组FAdV-4病毒的纯化及鉴定：通过有限稀释法进行纯化，最终获得纯化的表达FAdV-8-F的重组FAdV-4病毒即FA-4-F1-F-F2。
利用步骤2提取重组毒的基因组。通过针对FAdV-8的F的特异性引物，同时，利用FAdV-4的F1的上游和F2的下游的引物进行PCR鉴定，PCR所用的引物见表3。PCR扩增反应体系为：模板1μL，5×Buffer 5μL，10mM dNTP Mix 0.5μL，上游引物为10μmol 1μL，下游引物为10μmol 1μL，高保真酶0.5μL，加入灭菌超纯水至25μL。PCR扩增反应循环参数为：95℃预变性4min，随后进行30个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min)，72℃延伸10min。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图3,4所示)。
表3.PCR扩增鉴定重组病毒的引物
0.01MOI纯化的重组病毒感染LMH细胞，4天之后用丙酮乙醇固定液固定细胞5分钟，自然干燥后，针对FAdV-4的阳性鸡血清和针对FAdV-8的F的单抗5F10作为一抗，37℃孵育45min，PBS洗涤3遍；商品化的FITC标记的羊抗鸡抗体和商品化的PE标记的羊抗鼠抗体作为二抗37℃孵育45min，PBS洗涤3遍，之后在倒置荧光显微镜下观察，只有同时发绿光和红光的细胞才可判定为阳性(如图5所示)。0.01MOI纯化的重组病毒感染LMH细胞，4天之后收集细胞，通过Western blot验证重组毒中F1，F2以及F的表达，并做对照(如图6，7所示)。
SEQ ID NO.1
血清8型禽腺病毒Fiber基因序列：
ATGGCGACCTCGACGCCTCACGCCTTCTCCTTTGGCCAAATCGGCTCCCGAAAACGCCCTGCGGGTGGCGATGGCGAGCGAGACGCCTCCAAAGTGCCGAAAATGCAGACCCCCGCTCCGAGCGCGACCGCCAACGGAAATGACGAGCTGGACCTGGTCTACCCCTTTTGGCTCCAAAACGGCTCTACCGGAGGAGGCGGCGGCGGTTCCGGTGGAAACCCGTCCCTCAACCCGCCGTTTTTGGACCCCAACGGACCCCTGGCCGTCCAAAACAGCCTCCTGAAGGTCAATACCGCAGCCCCCATCACCGTCACCAATAAGGCCCTGACACTCGCCTATGAACCGGAGAGTCTCGAGCTCACTAACCAACAGCAACTGGCGGTCAAAATCGACCCCGAAGGACCTCTGAAAGCCACGACCGAGGGAATACAGCTGTCGGTCGACCCTACGACGTTGGAGGTTGATGATGTCGACTGGGAGTTAACCGTGAAACTCGACCCCGATGGCCCCCTGGATTCCTCAGCCGCAGGAATCACGGTCCGAGTCGATGAGACCTTGCTCATCGAAGATGATGTATCCGGACAGGGCAAAGAACTCGGAGTCAATCTCAACCCCGCGGGACCGATTACGGCCGACGAACAGGGCCTGGACTTAGAAATAGACAACCAGACACTCAAGGTCAACAGTGTCACCGGCGGGGGCGTCCTAGCTGTACAACTCAAATCCCAAGGTGGACTTACCGTACAGACTGACGGTATCCAAGTGAACACTCAGAACAGCATCACCGTTACTAACGGAGCTCTGGACGTGAAAGTAGCCGCCAACGGACCTTTGGAATCAACCGACACCGGGCTCACACTCAACTATGACCCCGGAGACTTCACAGTTAATGCGGGCACATTGAGTATTATTAGGGATCCGGCTCTCGTAGCCAATGCGTACCTCACATCCGGCGCCTCCACCCTTCAGCAATTTACAGCTAAGAGTGAGAATTCCAGTCAATTTTCTTTCCCGTGCGCGTACTATCTGCAACAGTGGCTTTCCGATGGGTTGATTGTTAGCTCCCTCTATCTGAAGCTCGACAGAGCACAGTTCACGAACATGCCAACGGGTGCTAACTATCAGAACGCTAGGTACTTTACCTTCTGGGTTGGAGCGGGCACTTCGTTTAATCTTTCTGCCCTTACCGCACCCACTATTACACCCAACACCACACAATGGAATGCATTCGCCCCTGCCCTTGATTACTCAGGTGCTCCTCCCTTCATCTACGACGCGTCTTCCGTAGTTACGATTTATTTTGAACCCACCAGTGGTCGACTGGAAAGCTATCTCCCCGTCCTTACCGATAACTGGAGCCAGACCTACAACCCCGGCACCGTGACCCTGTGTGTAAAAACGGTAAGGGTTCAATTGAGATCACAAGGAACCTTCAGCACTCTAGTCTGTTACAATTTCCGCTGTCAGAACACGGGCATTTTTAACAACAACGCTACAGCGGGAACCATGACACTTGGACCTATCTTCTTCAGTTGTCCCGCCCTAAGCACAGCCAACGCTCCGTAA
序列表
<110> 扬州大学
<120> 表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcgacct cgacgcctca cgccttctcc tttggccaaa tcggctcccg aaaacgccct 60
gcgggtggcg atggcgagcg agacgcctcc aaagtgccga aaatgcagac ccccgctccg 120
agcgcgaccg ccaacggaaa tgacgagctg gacctggtct accccttttg gctccaaaac 180
ggctctaccg gaggaggcgg cggcggttcc ggtggaaacc cgtccctcaa cccgccgttt 240
ttggacccca acggacccct ggccgtccaa aacagcctcc tgaaggtcaa taccgcagcc 300
cccatcaccg tcaccaataa ggccctgaca ctcgcctatg aaccggagag tctcgagctc 360
actaaccaac agcaactggc ggtcaaaatc gaccccgaag gacctctgaa agccacgacc 420
gagggaatac agctgtcggt cgaccctacg acgttggagg ttgatgatgt cgactgggag 480
ttaaccgtga aactcgaccc cgatggcccc ctggattcct cagccgcagg aatcacggtc 540
cgagtcgatg agaccttgct catcgaagat gatgtatccg gacagggcaa agaactcgga 600
gtcaatctca accccgcggg accgattacg gccgacgaac agggcctgga cttagaaata 660
gacaaccaga cactcaaggt caacagtgtc accggcgggg gcgtcctagc tgtacaactc 720
aaatcccaag gtggacttac cgtacagact gacggtatcc aagtgaacac tcagaacagc 780
atcaccgtta ctaacggagc tctggacgtg aaagtagccg ccaacggacc tttggaatca 840
accgacaccg ggctcacact caactatgac cccggagact tcacagttaa tgcgggcaca 900
ttgagtatta ttagggatcc ggctctcgta gccaatgcgt acctcacatc cggcgcctcc 960
acccttcagc aatttacagc taagagtgag aattccagtc aattttcttt cccgtgcgcg 1020
tactatctgc aacagtggct ttccgatggg ttgattgtta gctccctcta tctgaagctc 1080
gacagagcac agttcacgaa catgccaacg ggtgctaact atcagaacgc taggtacttt 1140
accttctggg ttggagcggg cacttcgttt aatctttctg cccttaccgc acccactatt 1200
acacccaaca ccacacaatg gaatgcattc gcccctgccc ttgattactc aggtgctcct 1260
cccttcatct acgacgcgtc ttccgtagtt acgatttatt ttgaacccac cagtggtcga 1320
ctggaaagct atctccccgt ccttaccgat aactggagcc agacctacaa ccccggcacc 1380
gtgaccctgt gtgtaaaaac ggtaagggtt caattgagat cacaaggaac cttcagcact 1440
ctagtctgtt acaatttccg ctgtcagaac acgggcattt ttaacaacaa cgctacagcg 1500
ggaaccatga cacttggacc tatcttcttc agttgtcccg ccctaagcac agccaacgct 1560
ccgtaa 1566
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caccgggtta cgtctactcc cccaa 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaacttgggg gagtagacgt aaccc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caccgtcttt atttgacacg cggtg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaccaccgc gtgtcaaata aagac 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgttcccgtt gggggagtag 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgctccggg cccctaaaag aag 23
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcccccaac gggaacaatg gcgacctcga cgcctcac 38
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cttttagggg cccggagcat ttacggagcg ttggctgtg 39

Claims (2)

1.表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，其载体为重组EGFP血清4型禽腺病毒FAdV-4-EGFP；
所述重组血清4型禽腺病毒的外源基因为血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因F，其序列如SEQ ID NO.1所示；
SEQ ID NO.1为：
ATGGCGACCTCGACGCCTCACGCCTTCTCCTTTGGCCAAATCGGCTCCCGAAAACGCCCTGCGGGTGGCGATGGCGAGCGAGACGCCTCCAAAGTGCCGAAAATGCAGACCCCCGCTCCGAGCGCGACCGCCAACGGAAATGACGAGCTGGACCTGGTCTACCCCTTTTGGCTCCAAAACGGCTCTACCGGAGGAGGCGGCGGCGGTTCCGGTGGAAACCCGTCCCTCAACCCGCCGTTTTTGGACCCCAACGGACCCCTGGCCGTCCAAAACAGCCTCCTGAAGGTCAATACCGCAGCCCCCATCACCGTCACCAATAAGGCCCTGACACTCGCCTATGAACCGGAGAGTCTCGAGCTCACTAACCAACAGCAACTGGCGGTCAAAATCGACCCCGAAGGACCTCTGAAAGCCACGACCGAGGGAATACAGCTGTCGGTCGACCCTACGACGTTGGAGGTTGATGATGTCGACTGGGAGTTAACCGTGAAACTCGACCCCGATGGCCCCCTGGATTCCTCAGCCGCAGGAATCACGGTCCGAGTCGATGAGACCTTGCTCATCGAAGATGATGTATCCGGACAGGGCAAAGAACTCGGAGTCAATCTCAACCCCGCGGGACCGATTACGGCCGACGAACAGGGCCTGGACTTAGAAATAGACAACCAGACACTCAAGGTCAACAGTGTCACCGGCGGGGGCGTCCTAGCTGTACAACTCAAATCCCAAGGTGGACTTACCGTACAGACTGACGGTATCCAAGTGAACACTCAGAACAGCATCACCGTTACTAACGGAGCTCTGGACGTGAAAGTAGCCGCCAACGGACCTTTGGAATCAACCGACACCGGGCTCACACTCAACTATGACCCCGGAGACTTCACAGTTAATGCGGGCACATTGAGTATTATTAGGGATCCGGCTCTCGTAGCCAATGCGTACCTCACATCCGGCGCCTCCACCCTTCAGCAATTTACAGCTAAGAGTGAGAATTCCAGTCAATTTTCTTTCCCGTGCGCGTACTATCTGCAACAGTGGCTTTCCGATGGGTTGATTGTTAGCTCCCTCTATCTGAAGCTCGACAGAGCACAGTTCACGAACATGCCAACGGGTGCTAACTATCAGAACGCTAGGTACTTTACCTTCTGGGTTGGAGCGGGCACTTCGTTTAATCTTTCTGCCCTTACCGCACCCACTATTACACCCAACACCACACAATGGAATGCATTCGCCCCTGCCCTTGATTACTCAGGTGCTCCTCCCTTCATCTACGACGCGTCTTCCGTAGTTACGATTTATTTTGAACCCACCAGTGGTCGACTGGAAAGCTATCTCCCCGTCCTTACCGATAACTGGAGCCAGACCTACAACCCCGGCACCGTGACCCTGTGTGTAAAAACGGTAAGGGTTCAATTGAGATCACAAGGAACCTTCAGCACTCTAGTCTGTTACAATTTCCGCTGTCAGAACACGGGCATTTTTAACAACAACGCTACAGCGGGAACCATGACACTTGGACCTATCTTCTTCAGTTGTCCCGCCCTAAGCACAGCCAACGCTCCGTAA；
制备方法包括如下步骤：
（1）利用sgRNA在线设计网站设计针对EGFP基因上下游位置的sgRNA，选择分数较高排名靠前的sgRNA，其序列如SEQ ID NO.2-5所示；
SEQ ID NO.2-5为：
CACCGGGTTACGTCTACTCCCCCAA
AAACTTGGGGGAGTAGACGTAACCC
CACCGTCTTTATTTGACACGCGGTG
AAACCACCGCGTGTCAAATAAAGAC；
（2）通过同源重组的方法构建带有血清8型禽腺病毒纤突蛋白基因Fiber的Fiber2供体质粒，同源重组的方法使用的引物序列如SEQ ID NO.6-9所示；
SEQ ID NO.6-9为：
TGTTCCCGTTGGGGGAGTAG
ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAG
CTCCCCCAACGGGAACAATGGCGACCTCGACGCCTCAC
CTTTTAGGGGCCCGGAGCATTTACGGAGCGTTGGCTGTG；
（3）在转染的前一天铺LMH细胞，次日转染两条sgRNA和供体质粒各2ug，转染6h后换成10%生长液；
（4）转染48h后感染FAdV-4-EGFP，2h后换成1%维持液；
（5）感染FAdV-4-EGFP后反向选择不发荧光的空斑，利用空斑实验和有限稀释法，通过反向筛选不发绿色荧光的方法进行纯化，获得表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白的FAdV-4重组病毒。
2.根据权利要求1所述的表达血清8型禽腺病毒纤突蛋白重组血清4型禽腺病毒，其特征在于，步骤（3）中，LMH细胞系为鸡肝癌细胞。
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I群禽腺病毒疫苗研究进展;楚电峰等;《中国家禽》;20171231;第39卷(第12期);摘要、第45页左栏第2段 *

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