CN116286685A - 一种基于CRISPR-Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法 - Google Patents

一种基于CRISPR-Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入H9N2禽流感病毒HA基因，成功获得H9N2禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒，为同时免疫防控血清4型禽腺病毒和H9亚型禽流感病毒提供技术支撑和疫苗候选。与传统的重组禽腺病毒构建方法不同，本发明中靶向毒力基因fiber‑2，使用了双荧光体系，且整合了CRISPR/Cas9技术和Cre‑loxP重组系统，不需要对禽腺病毒全基因组进行克隆，使得重组禽腺病毒的构建、筛选及其纯化非常快捷及高效。

Description

一种基于CRISPR-Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株 HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于CRISPR-Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属的双链DNA病毒，目前有5个基因型(A-E)，12个血清型(1-7，8a，8b，9-11)。其中，由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)感染导致的肝炎-心包积液综合征在国内鸡群尤为流行。肝炎-心包积液综合征的特征为心包腔中出现大量淡黄色的透明液体，肝脏和肾脏严重肿大出血，且病程短，死亡率可高达30-80％，对国内养禽业造成了巨大的经济损失。与此同时，虽然国内禽流感病毒疫苗的广泛使用对控制禽流感爆发起到了一定效果，然而近些年H9亚型禽流感病毒时常能从国内免疫鸡群中分离到，且能为鸡群中出现的H3，H10等其他新型禽流感病毒提供基因片段。因此，H9亚型禽流感病毒依然是国内鸡群常在病原，持续影响家禽养业的健康发展。本发明以FAdV-4为病毒载体，通过CRISPR/Cas9技术和Cre-loxP重组系统，靶向Fiber-2，利用双荧光体系构建了表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组禽腺病毒FAdV4-HA(H9)。研究结果表明重组禽腺病毒FAdV4-HA(H9)不仅能够稳定表达HA蛋白，动物试验还表明重组病毒能够有效诱导鸡体内针对H9N2禽流感病毒XZ491毒株的HI抗体，为同时免疫防控血清4型禽腺病毒和H9亚型禽流感病毒提供技术支撑和疫苗候选。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术问题，提供一种基于CRISPR-Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法。本发明的关键技术是在FAdV-4中寻找到合适的位置插入外源基因；同时利用CRISPR-Cas9技术在血清4型禽腺病毒中插入H9N2禽流感病毒HA基因以及带有LoxP位点的RFP表达盒，利用RFP蛋白进行病毒的纯化，纯化完成后使用Cre重组酶敲除RFP表达盒，最后获得可以稳定表达H9N2禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒。
本发明的目的是这样实现的：一种基于CRISPR-Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒。
所述H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示。
所述重组血清4型禽腺病毒，其中使用H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA基因替换FAdV-4的Fiber-2基因，替换的是FAdV-4的Fiber-2基因的253位核苷酸到1440位核苷酸，FAdV-4的Fiber-2基因序列如SEQ ID NO.2所示。
重组血清4型禽腺病毒的制备方法，其特征是，该制备方法包括以下步骤：
(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对血清4型禽腺病毒Fiber-2基因的sgRNA，其序列如表1所示；
表1针对Fiber-2基因的sgRNA序列
Figure SMS_1
(2)通过PCR和同源重组的方法构建携带H9N2禽流感病毒XZ491毒株的HA基因和RFP表达盒的供体质粒，其中的RFP表达盒两端分别带有LoxP位点，PCR使用的引物序列如表2所示；
表2构建供体质粒所用的PCR引物
Figure SMS_2
Figure SMS_3
(3)将生长良好的LMH细胞经胰酶消化后接种六孔板培养，第二天转染sgRNA和供体质粒各3μg，转染6h后换成细胞生长液；转染12h后感染表达EGFP的重组病毒FA4-EGFP，感染2h后换成细胞维持液；
(4)感染血清4型禽腺病毒后观察RFP红色荧光，利用空斑试验和有限稀释的方法进行红色荧光重组病毒的纯化，获得带有RFP表达盒的表达H9N2禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒。
还包括步骤(5)，获得的红色荧光重组病毒接种转染Cre重组酶的LMH细胞，2-3d后取感染的细胞上清再次接种转染Cre重组酶的LMH细胞，重复该过程直至红色荧光病毒完全消失；使用PCR、IFA和Western Blot的方法对去除RFP表达盒的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒进行鉴定。
表达EGFP的重组病毒FA4-EGFP，其特点是能够表达绿色荧光EGFP，区别于重组病毒的红色荧光蛋白RFP，便于快速纯化重组病毒，重组病毒FA4-EGFP的详细构建方法见专利CN112877303A。
本发明方法先进科学，利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入H9N2禽流感病毒HA基因，成功获得H9N2禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒，为同时免疫防控血清4型禽腺病毒和H9亚型禽流感病毒提供技术支撑和疫苗候选。与传统的重组禽腺病毒构建方法不同，本发明中靶向毒力基因fiber-2，使用了双荧光体系，且整合了CRISPR/Cas9技术和Cre-loxP重组系统，不需要对禽腺病毒全基因组进行克隆，使得重组禽腺病毒的构建、筛选及其纯化非常快捷及高效。
附图说明
图1为供体质粒元件的扩增；其中：
a：带有LoxP序列的RFP表达盒；b：Fiber-2基因及其左右同源臂；c：H9N2禽流感病毒HA基因；
图2为表达H9N2禽流感病毒HA蛋白的重组病毒的构建策略示意图；
图3为初代重组病毒FAdV4-HA(H9)-RFP的荧光图；其中：
a：重组病毒FAdV4-HA(H9)-RFP；b：母本病毒FA4-EGFP；c：阴性对照；
图4为PCR鉴定重组病毒FAdV4-HA(H9)的纯度；其中：
M：DNA marker；1：未纯化的重组病毒；2：纯化后的重组病毒；3：母本病毒FA4-EGFP；4：野生型FAdV-4；
图5为测序鉴定删除RFP表达盒的重组病毒FAdV4-HA(H9)；
图6为重组病毒FAdV4-HA(H9)中HA蛋白的表达鉴定；其中：
a：2G10单抗鉴定重组病毒中HA蛋白的表达；b：利用针对FAdV-4的多抗鉴定重组病毒；c：阴性LMH细胞对照；d：WB鉴定重组病毒中HA蛋白的表达；
图7为重组病毒FAdV4-HA(H9)的生长曲线测定；
图8为重组病毒FAdV4-HA(H9)在LMH细胞中的稳定性测试；其中：
a：2G10单抗鉴定重组病毒中HA蛋白的表达；b：利用抗FAdV-4的多抗鉴定重组病毒；
图9为SPF鸡接种重组病毒FAdV4-HA(H9)后的存活曲线；
图10为SPF鸡接种重组病毒FAdV4-HA(H9)后体内针对H9N2禽流感病毒的HI效价测定。
具体实施方式
实施例：
1.病毒基因组的制备：使用天根公司的基因组提取试剂盒进行提取，取禽腺病毒上清200uL于1.5mL指形管内，加入200uL Proteinase K溶液，混匀。加入200uL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃水浴10min，短暂离心后加入200uL无水乙醇，充分振荡混匀15sec。将上述溶液加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放在收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。向吸附柱CB3中加入600uL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中，重复加入600uL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟以晾干吸附材料中的漂洗液。将吸附柱CB3转入1.5mL指形管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200ul洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集到离心管中的溶液即为病毒的基因组。
2.sgRNA表达载体的构建：根据FAdV-4的Fiber-2基因序列利用sgRNA在线设计网站(http://crispor.tefor.net/)进行sgRNA的设计。将设计好的sgRNA克隆到lentiCRISPRv2质粒，通过测序进行sgRNA表达载体的验证。具体的sgRNA序列见表1，由南京擎科生物科技有限公司合成。
表1针对Fiber-2基因的sgRNA序列
Figure SMS_4
3.供体质粒的构建：由南京擎科生物科技有限公司合成带有两个连续LoxP序列的pUC-57载体，利用同源重组的方法在上述载体中插入RFP表达盒，构建的pUC-57-LoxP-RFP载体由本实验室保存。以pUC-57-LoxP-RFP载体为模板扩增带有LoxP序列的RFP表达盒(如图1a)；以pMD19-T载体为模板将pMD19-T载体线性化；以血清4型禽腺病毒基因组为模板扩增Fiber-2基因及其左端同源臂HR1和右端同源臂HR2(如图1b)，并克隆至pMD19-T载体中；以pdp-HA质粒为模板扩增H9N2禽流感病毒的HA基因(如图1c)。琼脂糖凝胶电泳后进行胶回收，通过同源重组的方法按照HR1-Fiber-2-RFP-HR2的顺序组装在pMD19-T上，最终获得的供体质粒送南京擎科生物科技有限公司测序并由实验室保存。构建供体质粒所用的引物序列见表2。
表2构建供体质粒所用的PCR引物
Figure SMS_5
4.红色荧光重组病毒的拯救：构建策略如图2，在6孔板中铺LMH细胞，次日，将3ugsgRNA、3ug的供体质粒以及6uL的转染试剂Mirus加入到200uL的Opti-MEM中，室温孵育45min。随后加入到LMH细胞中，转染6h后换成细胞生长液。转染12h后，弃去细胞生长液，用0.1MOI的FA4-EGFP感染LMH细胞，感染2h后换成细胞维持液。感染病毒3天后，去上清12000rpm离心10分钟后，盲传至新的96孔板的LMH细胞中，每天通过荧光显微镜观察红色荧光簇。红色荧光簇的出现表明成功构建了重组病毒(如图3)，并命名为FAdV4-HA(H9)-RFP。
5.红色荧光重组病毒的纯化及鉴定：将拯救的红色荧光重组病毒利用空斑试验和有限稀释法纯化，获得纯化的红色荧光重组病毒，通过PCR鉴定纯度，结果如图4。结果表明成功获得纯的重组病毒FAdV4-HA(H9)-RFP。PCR所用的引物见表3。
表3 PCR鉴定重组病毒的引物
Figure SMS_6
6.RFP表达盒的删除：用0.1MOI的红色荧光重组病毒感染转染Cre重组酶的LMH细胞，感染2h后换成细胞维持液，观察接种病毒的细胞中无红色荧光，但是存在CPE的LMH细胞，挑取该处细胞进行有限稀释，获得删除RFP表达盒的重组病毒。通过测序对去除RFP表达盒的重组病毒进行鉴定，成功去除了重组病毒的RFP表达盒(如图5)，获得重组病毒FAdV4-HA(H9)。
7.重组病毒中HA蛋白的表达鉴定：用0.01MOI纯化后不带RFP表达盒的重组病毒接种LMH细胞，3天后将LMH细胞进行固定，利用针对H9N2禽流感病毒HA蛋白的鼠单抗2G10和针对FAdV-4的鸡血清多抗进行IFA鉴定。结果如图6，同一视野中可同时检测到HA蛋白和FAdV-4，表明HA成功插入FAdV-4中，并获得良好表达。
8.删除RFP表达盒的重组病毒的生长曲线测定：在6孔板中铺LMH细胞，次日分别用0.1MOI的野生型FAdV-4和重组病毒接种LMH细胞，2h后换成1％维持液，感染后24h、48h和72h收取细胞上清。之后利用TCID50测定病毒各个时间点的病毒滴度，绘制病毒的生长曲线。结果显示，重组病毒的复制能力与野生型FAdV-4的生长速度和滴度接近(如图7)。
9.删除RFP表达盒的重组病毒的稳定性测试：将重组病毒FAdV4-HA(H9)进行连续传代15代，每隔5代进行提基因组和测序鉴定，并在第15代进行IFA鉴定。结果如图8所示，重组病毒FAdV4-HA(H9)在LMH细胞中进行稳定复制，并且在第15代病毒仍然能够用针对HA蛋白的单抗2G10通过IFA检测到HA蛋白，表明连续传代后的重组病毒可以稳定表达HA蛋白。
10.删除RFP表达盒的重组病毒的体内致病性评估和HI效价测定：将36只2周龄的SPF鸡分为三组，分别命名为阴性对照组、野生型FAdV-4组和重组病毒组。野生毒组和重组病毒组均攻毒105TCID50的病毒，阴性对照组注射相同体积1％的维持液，连续观察14天，在7天和14的时间点采血，并统计最终的发病死亡率。结果如图9，野生型FAdV-4在4天内导致鸡群全部死亡，而重组病毒FAdV4-HA(H9)则只导致25％的死亡率，阴性组则全部存活，表明重组病毒FAdV4-HA(H9)的致病性远远低于野生型FAdV-4。进一步对感染的存活鸡血清的HI效价进行测定，结果如图10所示，7天和14天时间点的鸡血清中针对H9N2禽流感病毒XZ491毒株的HI效价平均值分别为31.1和80，并且最高的HI效价可达160，表明重组病毒FAdV4-HA(H9)能够在早期有效诱导鸡体产生针对H9N2禽流感病毒的HI抗体。

Claims (5)

1.一种基于CRISPR-Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒，其特征是：所述H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒，其特征是：重组血清4型禽腺病毒，其中使用H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA基因替换FAdV-4的Fiber-2基因，替换的是FAdV-4的Fiber-2基因的253位核苷酸到1440位核苷酸，FAdV-4的Fiber-2基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，其特征是，该制备方法包括以下步骤：
(1)利用sgRNA在线设计网站设计针对血清4型禽腺病毒Fiber-2基因的sgRNA，其序列如表1所示；
表1针对Fiber-2基因的sgRNA序列
Figure FDA0004104170290000011
(2)通过PCR和同源重组的方法构建携带H9N2禽流感病毒XZ491毒株的HA基因和RFP表达盒的供体质粒，其中的RFP表达盒两端分别带有LoxP位点，PCR使用的引物序列如表2所示；
表2构建供体质粒所用的PCR引物
Figure FDA0004104170290000012
Figure FDA0004104170290000021
(3)将生长良好的LMH细胞经胰酶消化后接种六孔板培养，第二天转染sgRNA和供体质粒各3μg，转染6h后换成细胞生长液；转染12h后感染表达EGFP的重组病毒FA4-EGFP，感染2h后换成细胞维持液；
(4)感染血清4型禽腺病毒后观察RFP红色荧光，利用空斑试验和有限稀释的方法进行红色荧光重组病毒的纯化，获得带有RFP表达盒的表达H9N2禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒。
4.根据权利要求3所述的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，其特征是，还包括步骤(5)，获得的红色荧光重组病毒接种转染Cre重组酶的LMH细胞，2-3d后取感染的细胞上清再次接种转染Cre重组酶的LMH细胞，重复该过程直至红色荧光病毒完全消失；使用PCR、IFA和Western Blot的方法对去除RFP表达盒的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒进行鉴定。
5.根据权利要求3所述的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，其特征是，表达EGFP的重组病毒FA4-EGFP，能够表达绿色荧光EGFP，区别于重组病毒的红色荧光蛋白RFP，便于快速纯化重组病毒。
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