CN106929485B - 伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用，本发明利用CRISPR/Cas9结合同源重组等技术，以伪狂犬病毒疫苗株Bartha‑K61基因组为骨架，通过将Bartha‑K61的gB基因替换为我国流行的伪狂犬病毒变异株JS‑2012株的gB基因，成功获得一株重组伪狂犬病毒Bar‑JS‑gB(BJB)。BJB具有稳定的遗传性，以之作为疫苗株制备的灭活疫苗免疫小鼠比Bartha‑K61株制备的灭活疫苗更能有效抵抗强毒株JS‑2012株攻击。这显示BJB株具有更好的免疫原性，更能有效控制我国PRV变异株的流行，将在我国控制猪伪狂犬病上发挥重要作用。

Description

伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种伪狂犬病毒技术领域，特别涉及一种伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株及应用。
背景技术
猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是目前严重危害我国养猪业的主要疫病之一，该病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)感染引起的，其主要临床症状以典型的神经系统疾病、高烧、奇痒和呼吸困难，母猪出现死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪高致死率为特征。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链DNA，长约150kb，由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的重复序列所组成，编码70多种蛋白，其中存在一些病毒复制非必须基因，其缺失不影响病毒复制，但能使病毒毒力减弱，如gE、gI、gG和TK。gE蛋白还作为免疫鉴别诊断分子，在广泛使用的伪狂犬病毒疫苗株，如Bartha-K61、BUK和Bucharest等，均存在该蛋白基因的缺失，以便于通过血清学方法区分免疫动物与野毒感染动物，有利于该病毒的根除。
猪伪狂犬病最早发生于美国，我国于20世纪60年代初在猪群中也出现了该病流行。在上世纪70年代，我国从匈牙利引入伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61，并在全国推广使用，使我国猪伪狂犬病得到有效控制。但2011年末以来，猪伪狂犬病在我国重新爆发，许多Bartha-K61免疫猪场也出现该病的大面积流行，造成了养猪业巨大经济损失。多份研究表明，我国出现了伪狂犬病毒变异株，其流行导致了伪狂犬病的重新爆发。与经典伪狂犬病毒相比，伪狂犬病毒变异株毒力出现增强，抗原也出现变异，Bartha-K61疫苗对变异株攻击不能提供完全免疫保护。为了有效控制伪狂犬病毒变异株的流行，有必要针对PRV变异毒株研制具有良好免疫保护效果的新型弱毒疫苗，控制猪伪狂犬病，提高养猪业经济效益。
发明内容
为了解决以上现有技术中猪伪狂犬病疫苗不能抵抗猪伪狂犬变异株感染等问题，本发明提供了一种可用于制备免疫效率高的疫苗的伪狂犬病毒基因工程gB重组病毒Bar-JSgB(BJB)，该疫苗株是在以经典伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61为骨架，将其主要保护性抗原gB基因编码区替换为伪狂犬变异株JS-2012的gB基因编码区，将Bartha-K61的弱毒特性与变异株JS-2012 gB蛋白的免疫原性结合，获得的重组毒株。
本发明利用CRISPR/Cas9结合同源重组等技术，以伪狂犬病毒疫苗株Bartha-K61基因组为骨架，通过将Bartha-K61的gB基因替换为我国流行的伪狂犬病毒变异株JS-2012株的gB基因，成功获得一株重组伪狂犬病毒即：Bar-JSgB(BJB)。BJB具有稳定的遗传性，以之作为疫苗株制备的灭活疫苗免疫小鼠比Bartha-K61株制备的灭活疫苗更能有效抵抗强毒株JS-2012株攻击。这显示BJB株具有更好的免疫原性，在控制我国流行的PRV变异株上具有更好的效果，可在我国控制PR上发挥重要作用。
本发明还提供一种上述基因工程gB重组疫苗株在制备免疫力高的疫苗中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种重组伪狂犬病毒，包含伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61的基因组核酸，所述Bartha-K61基因组在伪狂犬病毒gB蛋白基因区域包含一个突变，将Bartha-K61的gB基因替换为JS-2012的gB基因，即，采用CRISPR/Cas9技术结合同源重组，对Bartha-K61进行gB基因区域缺失的同时，插入JS-2012的gB基因区域序列。
所述突变选自：在Bartha-K61基因组序列(GenBank Accession no.JF797217.1)的15638-18998位核苷酸进行全部缺失，缺失的同时，插入编码伪狂犬病毒变异毒株JS-2012基因组序列(GenBank Accession no-KP257591.1)16403-19683位核苷酸序列(SEQ IDNo 13)，使JS-2012 gB蛋白的全部核苷酸序列插入缺失区域。Bartha-K61基因组在gB基因缺失区域插入JS-2012 gB基因区域之后获得一株重组伪狂犬病毒即：Bar-JSgB(BJB)。
在本发明的另一方面，提供了一种核酸分子，包含伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61的基因组多核苷酸序列，该多核苷酸序列在编码伪狂犬病毒gB蛋白的基因区域包含一个突变，将Bartha-K61的gB基因替换为JS-2012的gB基因，即，对Bartha-K61进行gB基因区域缺失的同时，插入JS-2012的gB基因区域序列。
所述缺失选自：Bartha-K61基因组序列15638-18998位核苷酸序列的缺失，使Bartha-K61 gB蛋白基因区域全部缺失。
所述插入选自：在上述缺失区(Bartha-K61基因组序列15638-18998位核苷酸)插入编码伪狂犬病毒变异毒株JS-2012基因组序列16403-19683位核苷酸序列(SEQ ID No13)，使JS-2012 gB蛋白的全部核苷酸序列插入缺失区域。
在本发明的另一方面，还提供了一种伪狂犬病毒弱毒疫苗株，包含猪伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61的基因组核酸，所述Bartha-K61基因组在编码伪狂犬病毒gB蛋白的基因区域包含一个突变，该突变是：对Bartha-K61基因组第15638-18998位核苷酸序列进行缺失，在该缺失区域插入猪伪狂犬病毒变异毒株JS-2012基因组第16403-19683位核苷酸序列。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述重组伪狂犬病毒在制备预防或治疗猪伪狂犬病的疫苗中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述伪狂犬病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗猪伪狂犬病的疫苗中的应用。
所述的应用中，疫苗的制备过程为：取含有BJB或Bartha-K61病毒的病毒液，甲醛灭活，加入佐剂乳化即得。
所述的应用中，病毒液与佐剂的重量比为1∶1。
所述的应用，病毒液中病毒含量为108.0TCID50/mL。
所述的应用，疫苗中病毒抗原含量大于107.0TCID50/mL。
有益效果
从我国发病猪群分离的伪狂犬病毒(PRV)毒株PRV JS-2012，通过CRISPR/Cas9结合同源重组技术将PRV JS-2012的gB基因替换入PRV弱毒疫苗株Bartha-K61，即，将原Bartha-K61的gB基因替换为JS-2012的gB基因，通过筛选纯化获得重组病毒Bar-JSgB(BJB)。重组病毒BJB引起的细胞病变、病毒生长曲线和体外增殖特性与亲本毒Bartha-K61较为一致。
由本发明伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株BJB制备的灭活疫苗，免疫小鼠后可有效诱导机体产生免疫应答，对免疫小鼠抵抗伪狂犬病毒变异株的致死性攻击提供有效的免疫保护，说明本发明的基因工程gB重组弱毒疫苗株BJB具有较好的免疫原性，可作为新的疫苗候选株，非常有利于变异伪狂犬病毒的预防和控制。
附图说明
图1CRISPR/Cas9结合同源重组技术替换PRV Bartha-K61的gB基因为PRV-JS-2012的gB基因的基因编辑设计示意图。
图2是本发明筛选鉴定重组伪狂犬病毒Bar-JSgB(BJB)的PCR检测结果图；
图3是本发明重组病毒BJB以及亲本毒Bartha-K61感染PK-15细胞后的细胞病变图；
图4是本发明重组病毒BJB与亲本毒Bartha-K61生长曲线比较图；
图5是本发明重组病毒BJB与亲本毒Bartha-K61蚀斑形态比较图；
图6是本发明实施例2伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株BJB制备的灭活疫苗免疫小鼠ELISA检测PRV gB抗体水平变化图；
图7是本发明实施例2伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株BJB制备的灭活疫苗攻毒后小鼠发病情况分析图；
图8是本发明实施例2伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株BJB制备的灭活疫苗攻毒后存活小鼠病理切片分析图；
图9是本发明实施例2伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株灭活疫苗攻毒后死亡保护率统计结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
下面通过实施例，具体阐述本发明。
在本发明的下述实施例中，使用的实验材料如下：
病毒和细胞：PRV疫苗株Bartha-K61来自中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心。PRV变异株JS-2012(GenBank Accession no.KP257591.1)由本实验室于2012年分离自某发病仔猪，并保存(Tong Wu，2013)。PK-15细胞由本实验室保存。
质粒与菌株：
Figure BSA0000142654460000051
购自Invitrogen，lentiCRISPRv1来自张峰实验室(Shalem et al.，2014；Sanjana et al.，2014)；大肠杆菌TOPO10感受态细胞购自北京天根生物技术公司。
其它试剂：T4DNA连接酶、限制性内切酶购自NEB公司；PCR所用高保真DNA聚合酶
Figure BSA0000142654460000052
HS DNA Polymerase购自宝生物工程(大连)有限公司；AxyPrep DNA片段回收试剂盒购自AxyGEN公司；质粒提取试剂盒Miniprep购自Qiagen公司；AxyPrep DNA GelExtraction Kit；酚氯仿、蛋白酶K、RNase与低熔点琼脂糖购自Sigma公司；转染试剂Lipofactamine 3000购自Invitrogen公司；DMEM细胞营养液与胎牛血清购自Gibco公司。
在本发明的实施实例中，PK-15细胞的培养方法如下：
PK-15细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后，弃去细胞培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以0.25％的胰酶将细胞消化下，加入新的含有10％FBS的DMEM培养基，以1∶4的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。
实施例1伪狂犬病毒基因工程gB重组毒株的构建及鉴定
根据Bartha-K61 gB基因序列，设计合成特异识别Bartha-K61 gB基因的指导RNA序列，并构建识别剪切Bartha-K61 gB的CRISPR/Cas9质粒pCas9-gB1和pCas9-gB2。扩增Bartha-K61 gB基因编码区两侧区域DNA片段作为左右重组臂，中间插入PRV变异株JS-2012gB基因编码区，构建出重组转移载体pTJSB。将Bartha-K61基因组、pCas9-gB1、pCas9-gB2和pTJSB共转染PK-15细胞，产生的病毒通过空斑纯化、PCR鉴定及序列分析，成功获得Bartha-K61基因组为骨架、Bartha-K61 gB基因替换为JS-2012 gB基因的重组病毒Bar-JSgB(BJB)(示意图如图1所示)。具体过程如下：
1.1特异识别Bartha-K61 gB基因的CRISPR/Cas9质粒pCas9-gB1和pCas9-gB2构建
根据PRV Bartha-K61株(GenBank Accession no.JF797217.1)基因组序列，使用CRISPR在线工具Blue Heron Biotechnology.Available online：https:// wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp(accessed on 1 September2015)进行sgRNA分析设计，共设计了2条sgRNA，合成其互补引物对gB1-sgRNA-F/gB1-sgRNA-R和gB2-sgRNA-F/gB2-sgRNA-R(如表1所示)，分别靶向Bartha-K61 gB基因的5’端和3’端区域。
表1 CRISPR/Cas9 gRNA序列
Figure BSA0000142654460000061
参照lentiCRISPRv1质粒的构建说明书，利用磷酸化酶(T4 PNK)对互补的gB-gRNA引物gB1-sgRNA-F/gB1-sgRNA-R和gB2-sgRNA-F/gB2-sgRNA-R进行磷酸化，随即高温(95℃5min)对T4 PNK灭活和引物变性，然后逐步降温复性使引物互补形成双链，获得两条双链gB-gRNA DNA。以Bsm B1酶切pCRISPR/Cas9载体，胶回大的载体片段。利用T4DNA连接酶将两条双链gB-gRNA DNA分别连入上述Bsm BI酶切回收的载体中，转化TOP10感受态，提取质粒，以NotI和Bam HI作双酶切鉴定，并将酶切阳性克隆进行测序分析。获得的两种克隆质粒分别称为pCas9-gB1和pCas9-gB2。
1.2转移载体pTJSB
根据PRV Bartha-K61株(GenBank Accession no.JF797217.1)基因组序列以及PRV变异株JS-2012(GenBank Accession no.KP257591.1)的基因组序列，用Olio6.0软件设计了3对引物dpLF/dpLR，dpRF/dpRR和dpgBF/dpgBR(见表2)，分别扩增Bartha-K61 gB基因编码区上游区域、下游区域和JS-2012 gB基因编码区。分别利用dpLF/dpLR与dpRF/dpRR两对引物，以PRV Bartha-K61病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得Bartha-K61 gB基因编码区上游区域为同源左臂(L-arm)和下游区域为同源右臂(R-arm)的片段，反应体系为50μl，反应条件为：95℃/5min，98℃/10s，68℃/2min30s，循环32次；最后于72℃延伸10min。
表2重组病毒供体质粒构建以及筛选所需引物名称及序列
Figure BSA0000142654460000062
利用引物dpgBF/dpgBR，以PRV JS-2012病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增JS-2012 gB基因片段gB-DNA，反应体系为50μl，反应条件为：95℃/5min，98℃/10s，68℃/5min，循环32次；最后于72℃延伸10min。
将上述获得的DNA片段进行胶回收。以dpLF/dpgBR为引物、以回收得到的L-arm与gB-DNA片段为模板进行Overlap PCR扩增，获得片段L-arm-gB。以dpgBF/dpRR为引物、以回收得到的R-arm与gB-DNA为模板进行OverLap PCR扩增，获得片段gB-R-arm。反应条件均为：95℃/5min，98℃/10s，68℃/6min，循环32次；最后于72℃延伸10min。
按照说明书，将胶回收的L-arm-gB和gB-R-arm分别连入
Figure BSA0000142654460000072
载体，转化感受态大肠杆菌TOP10，经过质粒提取，酶切鉴定和测序分析等获得阳性质粒pL-gB和pgB-R。
将pL-gB和pgB-R分别以NheI和BamHI进行双酶切反应，反应体系为50μl：5μl 10×Cutsmart buffer，2.5μl NheI，2.5μl BamHI，10μl质粒，37℃作用3h。胶回收产物使用T4连接酶连接，4℃连接过夜后，转化感受态大肠杆菌TOP10，经过质粒提取、酶切鉴定和测序分析等获得阳性供体质粒，并将其命名为pTJSB。
1.3重组病毒Bar-JSgB
以1MOI的剂量接种PRV Bartha-K61于PK-15细胞上，待肉眼观察到70％病变时，弃去培养基，刮取细胞，使用酚氯仿法提取总基因组DNA。
按照说明书进行操作，使用
Figure BSA0000142654460000071
3000 Transfection Reagent(ThermoFisher)转染试剂，将上述1μg pTJSB、1μg pCas9-gB1、1μg pCas9-gB2、和2μg Bartha-K61基因组共转染PK-15细胞。转染后每天观察病变情况。当细胞刚出现大约80％病变时，收取上清，-80℃保存备用。
将上述收取上清接种6孔细胞培养板中的PK-15细胞，1h后，弃去上清，覆盖含有2％FBS和1％低熔点琼脂糖(1％)的MEM，室温凝固后，37℃CO2培养箱中培养。60h后，挑取单个空斑，吹打入500μl DMEM溶解，放入-80℃储存备用。
取50μl病毒空斑溶液接种PK-15细胞，待细胞全部病变后，收取上清，提取病毒基因组。使用引物BJB screening-F/BJBscreening-R进行PCR鉴定，PCR阳性病毒液进行下一轮空斑纯化。经过3轮空斑纯化结合PCR筛选后，对获得的阳性毒株进行测序鉴定，将获得重组病毒命名为Bar-JSgB(BJB)。获得的重组PRV病毒经PCR检测能够扩增出特异性基因片段(参见图2)，其中，M.DNA分子量标准DL2000；1.供体质粒pTJSB的PCR检测结果作为阳性对照2.Bar-JSgB的PCR检测结果3.Bartha-K61的PCR检测结果4.阴性对照的PCR检测结果。
将获得的PRV重组病毒Bar-JSgB(BJB)接种PK-15细胞，待细胞全部病变后，收取上清，提取病毒基因组。以BJB基因组DNA为模板，使用引物dpLF/dpRR进行PCR扩增，对获得PCR产物经过测序鉴定，其序列如SEQ ID NO.14所示。经过序列比对分析，成功将Bartha-K61基因组15638-18999位核苷酸序列替换为伪狂犬病毒变异株JS-2012基因组16403-19683位核苷酸序列，使Bartha-K61的gB基因替换为JS-2012的gB基因。
1.4重组病毒生物学特性分析
1.4.1重组病毒细胞病变
以1MOI病毒(亲本毒PRV Bartha-K61和重组伪狂犬病毒Bar-JSgB弱毒疫苗株)感染PK-15细胞，感染后20h在光镜下拍摄，比较重组毒和亲本毒的细胞病变。结果显示，重组毒Bar-JSgB与Bartha-K61感染PK-15后，呈现较为一致的细胞病变，感染细胞出现细胞肿胀、空泡等现象(图3)。
1.4.2病毒一步生长曲线的绘制
以1MOI病毒(亲本毒PRV Bartha-K61和重组伪狂犬病毒Bar-JSgB弱毒疫苗株)感染PK-15细胞，在感染后每隔4h收取300μl细胞上清液进行病毒滴度测定，收取的每个时间点病毒用半数感染量(TCID50/ml)计算滴度，根据不同时间点病毒的滴度绘制病毒一步生长曲线。结果显示重组病毒Bar-JSgB与其亲本毒Bartha-K61较为一致，均在感染后20小时复制水平达到高峰，之后进入平台期，表明重组Bar-JSgB与其亲本毒在病毒的复制、增殖等时期的病毒滴度具有相似的生物学活性(图4)。病毒毒价测定方法如下：参照文献用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定(殷震等，1997)。将待检样品用维持也作10倍系列稀释后，将连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的PK-15单层细胞。每稀释度接种8孔，设8孔对照(用维持液代替病毒液)，置37℃5％CO2培养箱中培养，每天观察感染细胞，记录出现CPE的孔数，停止出现CPE时终止观察。根据结果按Reed-Muench法计算TCID50。
1.4.3病毒空斑形态比较
将重组病毒Bar-JSgB和亲本毒Bartha-K61接种6孔板中的单层Vero细胞后，加入覆盖层(含有2％FBS，1％低熔点琼脂糖的MEM)。37℃培养60h后用5％(W/V)结晶紫染色。重组病毒与亲本毒的空斑大小与形态均相近(图5)。
实施例2重组PRV弱毒疫苗株灭活疫苗免疫保护试验
本实施例中，分别将重组PRV病毒Bar-JSgB与疫苗株Bartha-K61为种株制备灭活疫苗，免疫小鼠后以强毒株JS-2012进行攻毒，结果显示，Bar-JSgB(BJB)灭活疫苗免疫组小鼠保护效果比Bartha-K61灭活疫苗免疫组更好。具体过程如下：
2.1重组PRV弱毒疫苗株灭活疫苗的制备
将实施例1中获得的重组PRV弱毒疫苗株Bar-JSgB(BJB)以及亲本毒株Bartha-K61分别接种PK-15细胞进行扩增，待细胞全病变后，收取细胞上清后高速离心，保留上清，除去细胞碎片。甲醛以1.5∶1000比例混入病毒原液，37℃培养箱灭活48h。佐剂与病毒原液以1∶1比例进行混合乳化，4℃保存备用。用于制备灭活疫苗的病毒滴度分别为Bartha-K61：6.31×107TCID50/ml Bar-JSgB(BJB)：1.58×108TCID50/ml
2.2免疫保护试验
120只8周龄SPF级别的KM小鼠随机分为5组，每组20只。将制备好的上述2中灭活疫苗作为实验用疫苗，将实验动物分为：25μl Bartha-K61试验组(A组)、25μl Bar-JSgB(BJB)(B组)、50μl Bartha-K61试验组(C组)、50μl Bar-JSgB(BJB)(D组)、25μl佐剂(E组)50μl佐剂(F组)。每组20只，进行SPF级隔离饲养。
分别通过皮下注射方式接种，免疫接种两次，两周一免，共免疫4周，每周采血分离血清，采用IDEXX PRV gB-ELISA抗体检测试剂盒检测gB抗体。免疫接种4周后采用PRV JS-2012细胞毒(105TCID50/100μl)进行皮下接种攻毒，接种100μl，攻毒后观察记录临床表现和死亡率持续14天。攻毒14天后，采集存活小鼠的脑组织，肺脏和脾脏进行病理组织切片分析，判定疫苗免疫保护效率。
BJB灭活疫苗以及Bartha-K61灭活疫苗接种后28天之内(即攻毒之前)，试验组的小鼠均无发现异常现象，说明了灭活疫苗是安全可靠的。
在试验小鼠免疫28天攻毒后，发现其中佐剂对照组(E组，F组)在攻毒后第2天出现发病症状，症状主要表现为神经症状、抓挠注射部位等，攻毒后第3天出现大批量死亡，攻毒后第5天小鼠全部死亡；Bartha-K61灭活疫苗免疫组小鼠，即A组和C组，均在JS-2012攻毒后第3天出现典型的临床症状，主要表现为瘙痒、神经症状等，攻毒后第3天和第4天出现大量死亡，攻毒后5天趋于稳定；BJB灭活疫苗免疫组小鼠，即B组和D组，均在JS-2012攻毒后第3天出现部分小鼠发病以及少量死亡情况，其中B组小鼠在攻毒后第4天出现大量死亡，攻毒后第5天B组和D组小鼠趋于稳定。对试验组A组、B组和C组小鼠，即25μl剂量免疫组，攻毒后发病时间以及病程进行了比较分析，BJB组免疫小鼠的死亡时间显著长于Bartha-K61免疫组以及对照组(图7)。
所有的试验组小鼠在首免后第7，14，21，28天采集所有试验组小鼠血清，使用PRV抗体检测试剂盒(IDEXX，USA)检测PRV-gB特异性抗体，结果显示除了佐剂对照组外各实验组在免疫后第7天抗体开始出现，此后抗体水平持续升高，特别是二免后，抗体水平呈高阳性值，直至攻毒前一直维持在较高水平(图6)，这表明Bar-JSgB灭活疫苗与Bartha-K61灭活疫苗均能够诱导小鼠产生较强的体液免疫反应。
对各试验组小鼠攻毒后死亡率统计结果如图9所示，佐剂对照组(E组，F组)在攻毒后第5天，所有小鼠全部死亡，死亡率高达100％；Bartha-K61灭活疫苗免疫组小鼠，即A组和C组，存活率较低仅为15％(A组)和40％(C组)；BJB灭活疫苗免疫组小鼠，B组小鼠在攻毒后第4天出现较多小鼠死亡，攻毒后第5天趋于稳定，最后存活率分别为40％(B组)，D组小鼠在攻毒后第4天出现个别小鼠发病死亡，攻毒后第5天趋于稳定，其余小鼠均健康存活，保护率为80％(D组)。这表明本发明的重组PRV BJB株灭活疫苗具有良好免疫保护效果，其抵抗强毒PRV变异株JS-2012攻击的能力显著高于亲本毒Bartha-K61灭活疫苗。
在攻毒后第14天分别采集C组和D组存活小鼠的组织样品，包括肺脏、脑和脾脏，进行病理切片分析，结果显示，空白对照组(未攻毒)小鼠各组织均正常，没有病理变化；Bartha-K61灭活疫苗免疫组小鼠的肺脏出现大面积肺泡萎缩，肺泡壁增厚，脾脏出现多核巨细胞增生以及淋巴细胞浸润，脑部未见明显的病理变化；BJB灭活疫苗免疫组小鼠肺脏中有少量肺泡出现肺泡壁血管淤血扩张，脾脏中仅有少量淋巴细胞浸润，脑中未见明显的病理变化(图8)。这表明，BJB灭活疫苗免疫组小鼠攻毒后组织病变程度低于Bartha-K61灭活疫苗免疫组，BJB灭活疫苗对变异株攻毒能提供更好的免疫保护。
综上所述，基于CRISPR/Cas9结合同源重组基因编辑技术的重组PRV疫苗株灭活疫苗对小鼠具有较好的安全性，免疫后可有效诱导机体产生保护性免疫反应，且其抵抗变异伪狂犬病毒JS-2012的能力显著高于亲本毒Bartha-K61灭活疫苗，有望在我国控制PRV变异株流行中发挥重要作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提上，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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Claims (2)

1.一种伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株，其特征在于，包含伪狂犬病毒弱毒疫苗株Bartha-K61的基因组核酸，所述Bartha-K61基因组序列如GenBank Accessionno.JF797217.1所示，其中将Bartha-K61的gB基因替换为JS-2012的gB基因，即对Bartha-K61进行gB基因区域缺失的同时，插入JS-2012的gB基因区域序列；
所述缺失为：Bartha-K61基因组序列15638-18998位核苷酸序列的缺失，使Bartha-K61gB基因区域全部缺失；
所述插入为：在上述缺失区域插入编码伪狂犬病毒变异株JS-2012的gB基因区域序列，其核苷酸序列如SEQ ID No：13所示。
2.权利要求1中所述的伪狂犬病毒基因工程gB重组弱毒疫苗株在制备预防或治疗伪狂犬病的疫苗中的应用。
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