CN113736750B - 一株盖他病毒毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株盖他病毒毒株及其应用。本发明从源自江西省的家兔脾脏中分离，并经传代和蚀斑纯化获得一株盖他病毒GETV JXNC，其微生物保藏编号为CGMCC No.22111。该分离株能够在传代细胞稳定增殖，产生典型细胞病变。本发明分离的盖他病毒GETV JXNC株是世界范围内首例从家兔中分离得到的，全基因组测序和进化树分析其处于基因Ⅲ群，与当前的猪源盖他病毒亲缘关系较近，具有良好的毒株背景，可制备成灭活疫苗和作为检验用毒种，为后续的实验研究提供材料，奠定了物质基础。

Description

一株盖他病毒毒株及其应用

技术领域

本发明涉及病原微生物领域，属于兽用生物制品领域，涉及一种盖他病毒毒株的分离鉴定及在灭活疫苗中的应用。

背景技术

盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种蚊子传播的病毒，于1955年在马来西亚首次发现，GETV M1株于1964年在我国海南省首次从蚊子中分离得到。盖他病毒感染引起的疾病已成为对我们国家动物和公共卫生日益严重的威胁。盖塔病毒是一种单股正链RNA病毒，属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)，其基因组包含一个5'非编码区(5'UTR)、一个3'非编码区和两个开放阅读框(ORF)，开放阅读框编码的两个大的多聚蛋白被加工成为四个非结构蛋白(nsP1，nsP2，nsP3和nsP4)和五个结构蛋白(C、E3、E2、6K和E1)。根据结构蛋白E2基因将盖他病毒分为四个基因群：I-IV，其中1964年以后在世界范围内从家畜分离得到的盖他病毒均属于基因III群，源自中国的YN12031株、俄罗斯的LEIV/16275/Mag株和泰国的GTERV/SW株属于基因IV群分支。

盖他病毒的感染可导致小猪死亡、生殖障碍甚至怀孕母猪流产，可导致马全身皮疹和腿部水肿。日本和印度发生的几起猪和马感染盖他病毒的疫情造成了严重的经济损失。在过去的十年里，盖他病毒在我国的一些地方从蚊子和其他哺乳动物中分离出来；近年来，源于蚊子的盖他病毒在我们国家存在分布广泛，包括河北、上海、云南、甘肃、贵州、湖南、安徽、四川和广东；此外，最近发生了盖他病毒在山东引起的蓝狐感染事件，在吉林引起的肉牛感染事件，以及在广东引起的马群感染事件。包括猪、马、牛、狐和各种蚊子等在内的广泛宿主范围通常导致了盖他病毒在自然界中人畜共患传播循环，这就构成了日益严重的威胁。

目前，关于该病的防控尚无可用的生物疫苗制品，国内养殖场对于该病的防控主要取决于生物安全防控，但是鉴于盖他病毒在养殖动物中广泛的宿主范围和人畜共患的特点，研制相应的生物制品防控该病的暴发和流行十分迫切。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株新分离的盖他病毒毒株。

本发明的再一个目的是针对现有盖他病毒生物制品的不足，提供一种有效安全的猪用盖他病毒病疫苗以及该灭活疫苗的制备方法；该灭活疫苗所采用的的制备方法简单安全，疫苗免疫效果良好。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明首先提供一株盖他病毒，名称为盖他病毒(Getah virus)GETV JXNC CGMCCNo.22111。该病毒分离自家兔，跟当前的猪源流行毒株亲缘关系较近；国际病毒分类委员会将其分类为：Togaviridae，Alphavirus；本发明的盖他病毒GETV JXNC株分离自江西省内某家兔养殖场。已于2021年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.22111。

上述盖他病毒的分离培养方法，具体步骤如下：

采集家兔的脾脏，剪碎后用含有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的无菌PBS制成1:5的悬液，研磨，涡旋振荡混匀，反复冻融3次后，10000×g离心10min，上清用0.22μm的滤器过滤除菌，分装冻存于-80℃，备用。

将PK-15细胞接种于6孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用PBS清洗两遍；将1mL过滤的盖他病毒处理液接种PK-15细胞，同时设置未接毒对照孔，于37℃、5％CO₂条件下吸附培养2小时，然后弃去接种液体，加入2mL维持培养基，继续培养1～3d，每天观察细胞状态；待发生明显细胞病变时，将细胞冻融3次后收集培养上清，取200μL培养上清用RT-PCR的方法进行鉴定；同时，将收集的细胞培养上清继续传代培养，待接毒PK-15细胞的病变稳定明显时，表示分离得到一株稳定传代的盖他病毒毒株；进一步地，利用蚀斑纯化的方法对该株病毒进行纯化，至少蚀斑纯化5代。

上述盖他病毒的蚀斑纯化方法，具体步骤如下：

1)制备单层的PK-15细胞，当融合度达到95％时，加入稳定传代的盖他病毒也，吸附1～2小时；

2)将吸附后的细胞用PBS清洗两遍，加上含1％低熔点琼脂糖、2％胎牛血清的半固体培养基，倒置培养至病毒蚀斑出现；

3)挑取3～5个病毒蚀斑，接种单层PK-15细胞，待其细胞发生病变，收获病毒培养物；

4)将收获的病毒培养物进行下一轮的克隆纯化试验，进行5次蚀斑纯化试验后获得盖他病毒克隆纯化毒株。

本发明提供的盖他病毒GETV JXNC CGMCC No.22111能够用于制备预防由盖他病毒所致疾病的疫苗，还能够用于制备盖他病毒相关的诊断试剂和治疗药物。

本发明提供一种预防由盖他病毒所致疾病的疫苗，其活性成分为经灭活的盖他病毒GETV JXNC CGMCC No.22111；具体的该疫苗含有经灭活的盖他病毒GETV JXNC CGMCCNo.22111和药学上可接受的佐剂。

本发明还公开了上述疫苗的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

1)病毒培养：将盖他病毒GETV JXNC CGMCC No.22111接种至PK-15细胞进行培养，收获病毒培养物；

2)病毒培养物的灭活：病毒培养物经反复冻融3次，离心，收取上清，加入灭活剂，将病毒灭活，得到灭活的病毒液；

3)按比例混合灭活的盖他病毒液和佐剂，乳化，制备成盖他病毒灭活疫苗。

根据上述疫苗组合物的制备方法，其中步骤1)的具体过程为：用含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的低糖DMEM培养基，37℃、5％CO₂条件下培养箱贴壁培养PK-15细胞；待其融合度达到80％左右时，弃去培养液，按照感染系数为0.1接种盖他病毒GETVJXNC株，37℃、5％CO₂条件下吸附2小时后，更换为含有2％胎牛血清的低糖DMEM维持培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养箱贴壁培养24小时左右，待细胞完全病变后收获细胞培养物。

根据上述疫苗组合物的制备方法，步骤2)所述灭活剂为二乙烯亚胺，病毒液中加入二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/L，灭活条件为30℃灭活28小时；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/mL。灭活效果接种PK-15细胞盲传3代未出现病变为灭活合格。

根据上述疫苗组合物的制备方法，步骤3)所述的佐剂为ISA201或ISA206，灭活病毒液与佐剂的体积比例为1:1。

本发明的积极有益效果：

本发明分离的盖他病毒GETV JXNC CGMCC No.22111是世界范围内首次在兔子中分离得到，与当前的猪源流行毒株亲缘关系较近，具有良好的毒株背景，可作为灭活疫苗生产毒株及检验用毒种，为后续的相关实验研究提供了材料，奠定了物质基础。

本发明公开了一种盖他病毒分离培养及蚀斑纯化方法，该方法具有稳定、易操作的有点，为分离及纯化盖他病毒提供了一种简单可行的方法。

本发明的疫苗组合物有良好的免疫原性，免疫后能够诱导动物产生较强的中和抗体。由于国内外市场上尚无该类病毒源的疫苗相关的生物制品，该疫苗组合物所用毒株为2018年新近分离得到的毒株，近年来在猪群流行的毒株具有较近的亲缘关系，具备较强的产品竞争优势，可有效预防盖他病毒在猪群中的流行与传播，降低该病造成的经济损失，具有广阔的应用前景。

本发明的疫苗所采用的制备方法快速、简单、安全。

附图说明

图1为组织病料中盖他病毒RT-PCR鉴定结果图，第1个泳道为DL5000 DNA Ladder，第2个泳道为未接种的PK-15对照，第3个泳道为接种家兔脾脏研磨液的PK-15细胞培养上清。

图2为盖他病毒感染PK-15细胞引起的细胞病变结果图。

图3为基于全基因组序列的盖他病毒GETV JXNC株进化树分析结果图。

图4为盖他病毒GETV JXNC株在PK-15细胞的一步生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下们可以对本发明进行修改和替换。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在本发明中，我们从中国江西省某家兔养殖中，从兔子的脾脏分离得到了一株盖他病毒毒株，对其进行了分离培养、蚀斑克隆纯化。并进一步建立了以该流行毒株为基础制备灭活疫苗的方法，评价了该灭活疫苗的免疫原性，为及时开展安全高效的盖他病毒灭活疫苗奠定了基础。

实施例1：盖他病毒GETV JXNC CGMCC No.22111的分离鉴定

1.1实验材料

实验中所用的病料样本来源于江西省某家兔养殖场，采集时间为2018年10月；猪肾细胞系(Porcine Kidney，PK-15)购自美国菌种中心ATCC。

1.2引物设计

参照NCBI GenBank中公布的盖他病毒基因组序列，针对基因nsP3保守区域，用Primer Premier设计了1对特异性引物P1-F和P1-R(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1本研究中所用引物信息

注：P2-R1和P2-R2引物用于通过巢式PCR进行5′RACE，P14-F引物用于3′RACE。

1.3病料的采集和处理

采集家兔的脾脏，剪碎后用含有100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的无菌PBS制成1:5的悬液，研磨，涡旋振荡混匀，反复冻融3次后，10000×g离心10min，上清用0.22μm的滤器过滤除菌，分装冻存于-80℃，备用。

1.4组织病料中盖他病毒的RT-PCR检测

按照Axygen病毒基因组提取试剂盒(Axygen)的要求和说明提取病料中病毒基因组RNA；以提取的RNA为模板，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen)配置反转录反应体系进行反转录反应；将反转录得到的cDNA为模板，用Takara LA Taq酶(Takara)进行PCR扩增，扩增反应体系(50μL)为：2×GC BufferⅡ25μL、上下游引物(10μM)各2μL、dNTP Mix 8μL，LA Taq酶0.5μL，cDNA模板2μL，补加灭菌双蒸水至50μL。PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min。取PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测(图1)。如图1所示，扩增出一条810bp左右的条带，与预期扩增片段大小相符。

将上述PCR产物用胶回收纯化试剂盒回收目的片段，克隆至pMD18-T载体上，送北京擎科生物科技有限公司测序。测序结果在NCBI数据库中进行BLAST分析，发现该段序列基因与盖他病毒已知序列同源，证实该病料中盖他病毒核酸阳性。

1.5病毒的分离与培养

将单层PK-15细胞接种于6孔细胞培养板，待其融合度达到80％时，用PBS清洗两遍；将步骤1.3中冻存备用的盖他病毒过滤液接种PK-15细胞，接种量为1mL，同时设置未接毒阴性对照孔，于37℃、5％CO₂培养箱中吸附2小时后，弃去接种物，加入2mL维持培养基，继续培养1～3d，每天观察细胞状态；接种细胞在第2d出现明显的细胞病变，而未接种的对照孔PK-15细胞没有病变(图2)。将该培养上清在PK-15细胞上连续传代4代，对每一代细胞培养物提取样品RNA，按照步骤1.4进行RT-PCR检测细胞中盖他病毒核酸。从兔子脾脏研磨液接种PK-15时，每一代均发生明显的细胞病变，表现为细胞变圆、脱落、出现空斑(图2)，且从第2代至第5代细胞完全病变时间稳定在24小时左右，表明该病毒已经适应PK-15细胞并且能够在该细胞上稳定增殖，分离得到一株可稳定传代的盖他病毒毒株。

实施例2：盖他病毒的蚀斑纯化和全基因组测序

2.1盖他病毒的蚀斑纯化

将T75cm²细胞培养瓶内生长良好、融合度达95％以上的PK-15细胞用PBS清洗两遍次，加入2mL 0.25％的胰蛋白酶(Gibco)消化，用36mL用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素的低糖DMEM培养基悬浮细胞制成悬液，按照2mL/孔接种于6孔细胞培养板，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养12小时，细胞长成单层，此时融合度为95％，用PBS清洗两遍后备用。用无血清低糖DMEM培养基将步骤1.5中的第5代盖他病毒液作10倍系列稀释至10^-1～10^-8，将稀释度10^-3～10^-8分别以1mL的体积加入PK-15单层细胞，置于37℃、5％CO₂培养箱中吸附1～2h。将吸附后的细胞用PBS清洗两遍，加上含1％低熔点琼脂糖、2％胎牛血清的半固体培养基，倒置培养至病毒蚀斑出现，然后挑取3～5个病毒蚀斑。按照该步骤将病毒液纯化至少5次，最后获得一株盖他病毒蚀斑纯化毒株。将该纯化毒株命名为GETV JXNC。

2.2盖他病毒GETV JXNC CGMCC No.22111的全基因组测序

1)引物设计：

根据NCBI上公布的多株盖他病毒全基因组序列，选择基因组的保守区域，用Primer Premier设计了11对特异性引物对P3～P13，以及基因组末端序列精确测序5′RACR用引物P2-R1和P2-R2、3′RACR用引物P14-F(表1)，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

2)RT-PCR：

取蚀斑纯化后盖他病毒液，按照Axygen病毒基因组提取试剂盒(Axygen)的要求和说明提取病料中病毒基因组RNA；以提取的RNA为模板，按照RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit(Invitrogen)配置反转录反应体系进行反转录反应；将反转录得到的cDNA为模板，利用Takara LA Taq酶(Takara)，通过11对特异性引物对(P3～P13)针对基因组核苷酸1222～11624位置进行PCR扩增，扩增反应体系(50μL)为：2×GC BufferⅡ25μL、上下游引物(10μM)各2μL、dNTP Mix 8μL，LA Taq酶0.5μL，cDNA模板2μL，补加灭菌双蒸水至50μL。PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸10min。取PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后将PCR产物装入pMD18-T载体，用通用引物在北京擎科生物科技有限公司测序。

3)基因组末端5′RACE：

取蚀斑纯化后盖他病毒液，按照Axygen病毒基因组提取试剂盒(Axygen)的要求和说明提取病料中病毒基因组RNA；以提取的RNA为模板，按照Clontech SMARTer RACE 5′/3′试剂盒(Takara)的要求和说明分别进行5′RACE反应。

5′RACE反应：取10μL RNA于PCR管中，加入1μL 10×Random primer mix，于PCR仪72℃孵育3min，42℃冷却2min；然后加入已配制好的以下体系(20μL)：5×First-strandbuffer 4μL，DTT(100mM)0.5μL，dNTPs(20mM)1μL，SMARTerⅡA Oligonucleotide 1μL，RNase inhibitor(40U/μL)0.5μL，Reverse transcriptase(100U)2μL；42℃反应90min，72℃反应10min得到5′RACE第一链cDNA。用通用引物UPM(长引物5′-TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTG GTATCAACGCAGAGT-3′，短引物5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)和特异性引物P2-R2进行PCR反应(50μL)体系：H₂O 15.5μL，2×Seqamp buffer 25μL，Seqamp DNA polymerase 1μL，5′RACE ready cDNA 2.5μL，10×UPM 5μL，P2-R2(10μM)1μL。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s、72℃延伸2min，5个循环；94℃变性30s、70℃退火30s、72℃延伸2min，5个循环；94℃变性30s、68℃退火30s、72℃延伸2min，20个循环；72℃延伸10min。

取2μL以上PCR产物作为模板，用通用引物UPM和特异性引物P2-R1，按照上述PCR反应体系和反应条件进行巢式PCR反应，将最终获得的PCR产物装入pMD18-T载体，用通用引物在北京擎科生物科技有限公司测序。

4)基因组末端3′RACE：

取蚀斑纯化后盖他病毒液，按照Axygen病毒基因组提取试剂盒(Axygen)的要求和说明提取病料中病毒基因组RNA；以提取的RNA为模板，按照Clontech SMARTer RACE 5′/3′试剂盒(Takara)的要求和说明分别进行3′RACE反应。

取11μL RNA于PCR管中，按以下体系(15μL)在RNA的3′末端加poly(A)尾：RNA 10.5μL，10×poly(A)buffer 1.5μL，1mM rATP 1.5μL，poly(A)聚合酶1.5μL；在37℃反应10min，得到加poly(A)尾的RNA。

取11μL加poly(A)尾RNA于PCR管中，加入1μL 3′-CDS primers A，于PCR仪72℃孵育3min，42℃冷却2min。然后加入已配制好的以下体系(20μL)：5×First-strand buffer 4μL，DTT(100mM)0.5μL，dNTPs(20mM)1μL，RNase inhibitor(40U/μL)0.5μL，Reversetranscriptase(100U)2μL；42℃反应90min，72℃反应10min得到3′RACE第一链cDNA。用特异性引物P14-F和通用引物UPM配制PCR体系，取2μL 3′RACE第一链cDNA作为模板，按照上述5′RACE PCR反应体系和反应条件进行PCR反应，将最终获得的PCR产物装入pMD18-T载体，用通用引物在北京擎科生物科技有限公司测序。

5)全基因组序列的拼接：

通过手工校对、序列拼接，最终获得GETV JXNC的全基因组序列，并将NCBI公布的多株盖他病毒全基因组序列与GETV JXNC进行比对，将该株病毒全基因组序列按照病毒的非编码区和编码区分成5′UTR(序列1)、nsP1(序列2)、nsP2(序列3)、nsP3(序列4)、nsP4(序列5)、conjunction region(序列6)、C(序列7)、E3(序列8)、E2(序列9)、6K(序列10)、E1(序列11)和3'UTR(序列12)。结果显示：GETV JXNC株全基因组全长11689个核苷酸，5'UTR含有78个核苷酸，3'UTR含有401个核苷酸；位于基因组5'的7401个核苷酸编码病毒的非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4，位于基因组3'的3762个核苷酸编码病毒的结构蛋白C、E3、E2、6K和E1，非结构蛋白和结构蛋白之间有一段44bp的非编码连接序列。

2.3全基因组系统发育进化分析

以盖他病毒全基因组核苷酸序列为基础，利用MEGA 7分析软件，将GETV JXNC株与NCBI公布的43株盖他病毒(表2)全基因组序列通过最大相似法(maximum likelihoodmethod)绘制进化树，结果显示GETV JXNC株属于GETV III群分支(图3)，分析显示盖他病毒GETV JXNC株与以往分离的盖他病毒毒株序列不同，为一株新分离毒株。GETV JXNC株跟2016年从猪群分离的猪源流行株HNNY-1亲缘关系较近，全基因组核苷酸相同率为99.6％，非结构蛋白和结构蛋白氨基酸相同率分别为99.7％、99.8％；此外，E2基因的核苷酸和氨基酸相同率分别为99.6％、99.7％。

表2 NCBI公布的43株GETV参考毒株信息

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该GETV JXNC株已于2021年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.22111。

实施例3：盖他病毒毒株GETV JXNC病毒生长曲线的测定

3.1病毒效价测定

将消化吹散的PK-15细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，培养过夜，待单层细胞融合度至90％时，取步骤2.4中克隆纯化5次的GETV JXNC株的细胞培养物用细胞维持液进行10倍倍比稀释，稀释度从10^-1到10^-10；将96孔细胞培养板中细胞培养基吸弃，用无菌PBS清洗PK-15细胞1次后吸弃，然后将各个稀释度的GETV JXNC株病毒稀释液加入96孔板，每孔100μL，每个稀释度做8个重复，每个细胞培养板做设置未接种病毒阴性对照组；置于37℃、5％CO₂培养箱培养。连续观察4d，逐日观察病变情况并记录。按照Reed-Muench法计算TCID₅₀。

3.2病毒的一步生长曲线测定

将消化吹散的PK-15细胞悬液接种到6孔细胞培养板，取蚀斑纯化后的盖他病毒液，按照感染系数为0.1接种，置于37℃、5％CO₂培养箱吸附2小时，然后更换培养基维持培养基。分别在感染后3、6、12、24、36、48和60小时收获培养物，反复冻融3次后，10000×g离心10min后收获上清，冻存于-80℃，备用。

将各个时间点收集的培养上清，按照3.1步骤分别测定其病毒效价，然后根据各个时间点的病毒效价，制作盖他病毒毒株GETV JXNC株的生长曲线(图4)。结果显示，GETVJXNC株以感染系数为0.1感染PK-15细胞时，感染后24小时病毒效价最高，可达10^8.42TCID₅₀/mL。

实施例4：盖他病毒毒株GETV JXNC株灭活疫苗的制备

4.1病毒培养

用含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养基和T225cm2细胞培养瓶，在37℃、5％CO₂条件下培养箱贴壁培养PK-15细胞；待其融合度达到95％左右时，弃去培养液，按感染系数为0.1接种盖他病毒毒株GETV JXNC株，然后用维持低糖DMEM培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养箱贴壁培养24小时左右，待细胞完全病变后，反复冻融3次，10000×g离心10min，去除细胞碎片，收取上清，得到盖他病毒GETV JXNC病毒液，置于-80℃，备用。

4.2病毒液的灭活及灭活检验

在病毒含量合格的病毒液中(优选≥10^7.0TCID₅₀/mL)加入灭活剂二乙烯亚胺，使二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/L，置于30℃恒温摇床，80rpm，灭活28小时，灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。

将PK-15细胞接种于6孔细胞培养板，待其融合度达到90％时，将单层PK-15细胞用PBS清洗两遍；将灭活后的病毒液用维持DMEM培养基作10倍倍比稀释，接种量为500μL，同时设置阴性对照孔，于37℃、5％CO₂条件下培养吸附2小时，弃去接种物，加入2mL维持DMEM培养液，继续培养2～3d，每天观察细胞状态。盲传3代，未出现细胞病变；且对每一代细胞培养物提取样品RNA，按照步骤1.4进行RT-PCR检测细胞中盖他病毒核酸。如果结果均为阴性，表明病毒液灭活完全。

4.3制备含盖他病毒GETV JXNC株的疫苗组合物

将灭活完全的盖他病毒GETV JXNC株病毒液与ISA 206佐剂按照体积比1:1混合，将油相和水相进行乳化，条件为30℃恒温摇床，120rpm，15min。待混合完全后，即得疫苗组合物，疫苗乳化质量能够达到国家规定的质量标准。

实施例5：盖他病毒GETV JXNC株灭活疫苗对仔猪的免疫效力试验

4～8周龄的健康易感仔猪8头，分组情况：随机选取5头仔猪免疫盖他病毒GETVJXNC株灭活疫苗，每头颈部肌肉注射1头份疫苗，每头份含2mL疫苗组合物；对照组3头，每头颈部肌肉注射DMEM培养液2mL。免疫第0～7d和第14d每天测定体温；连续14d观察猪群采食情况；观察、触摸注射部位局部是否存在肿块。免疫后第4周，对所有仔猪肌肉注射GETVJXNC株1mL(10⁷TCID₅₀/mL)攻毒。在攻毒前第1天和攻毒后每天监测体温并观察临床表现，包括有无食欲减退、震颤和腹泻等症状，连续观察14d。攻毒后第1、3、7和14天对所有动物采集鼻拭子样品和血样，按照步骤1.4方法检测病毒血症和排毒情况。

盖他病毒GETV JXNC株灭活疫苗免疫仔猪后没有出现明显的体温升高现象(表3)，猪群采食正常、精神状态良好，经观察14天内均未见注射部位有肿块出现。结果表明，该疫苗对免疫仔猪安全性良好。

表3灭活疫苗免疫后动物体温监测表

灭活疫苗免疫仔猪后第4周攻毒，观察各组体温反应和临床症状。结果显示，所有实验组和对照组动物全部存活，其中，攻毒对照组3头仔猪均在攻毒后第1～2天出现体温升高1℃以上的发热现象，并存在不同程度的震颤和厌食，攻毒后的第3天体温和食欲即恢复正常；而灭活疫苗免疫组5头动物均未出现明显体温升高(超过0.5℃)和其他症状(表4)。

表4灭活疫苗接种动物攻毒后的体温监测表

攻毒后第1、3、7和14天对鼻拭子样品和血样检测病毒血症和排毒情况，结果显示，灭活疫苗免疫组的5头仔猪只有2头动物分别在攻毒后第1和3天检测到病毒血症，鼻拭子样品中没有检测到排毒；相反地，攻毒对照组的3头仔猪均存在一定时间的病毒血症和排毒(表5)。

表5灭活疫苗免疫组和对照组仔猪攻毒后的病毒血症和排毒检测结果

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以上结果证明了本发明的盖他病毒灭活疫苗组合物可保护免疫动物阻止盖他病毒感染引起的临床症状，可有效降低盖他病毒感染引起的病毒血症和排毒。此数据为该灭活疫苗的临床使用奠定一定的理论及实践基础。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例呈现，然而并非用于限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出一定范围内的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 一株盖他病毒毒株及其应用

<130> WHOI210054

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 78

<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 1

atggcggacg tgtgacatca ccgttcgctc tttctaggat cctttgctac tccacatagt 60

gagagacaaa caacccaa 78

<210> 2

<211> 1602

<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 2

atgaaggtaa ccgtggacgt tgaggctgat agcccattcc ttaaggccct tcagaaggcg 60

tttcccgcct ttgaggttga atcacagcag gtcacaccga atgaccatgc taacgctaga 120

gcattttcgc atctggctac taaactgatt gagcaagagg ttccaacagg cgtcaccatc 180

ctggacgtgg gtagtgcacc cgcaaggagg ttgatgtctg accacaccta ccactgcatc 240

tgccccatga aaagtgcgga agacccagag aggctggcga attacgctcg aaagctggcg 300

aaagcatcgg ggactgtgct agacaagaat gtgtccggaa agataacgga cctacaagac 360

gtcatggcca ctcctgactt ggaatccccg actttttgcc tgcatactga cgagacgtgc 420

cgcactaggg ctgaggtcgc cgtgtaccag gacgtgtacg ctgtgcacgc accgacgtca 480

ctgtaccacc aggccatcaa aggtgtcagg acggcgtatt ggattggatt cgacaccact 540

ccattcatgt tcgaggcact agcgggcgcg taccctgcgt actcgaccaa ctgggcagat 600

gagcaagtgc tgcaggctcg taacatcggc ctgtgcgcga caggcctctc cgaggggcgt 660

cgcggcaaac tctccattat gagaaagaag tgcttgcgac cgagcgacag agtaatgttt 720

tcggtcgggt ccaccttgta caccgagagc cgaaagctgc tgcgcagctg gcacttacct 780

tccgtgtttc acctgaaggg taagaacagt tttacctgca ggtgcgacac ggtggtgtca 840

tgcgaaggtt atgtggtaaa gaagatcacc ataagcccgg gcatatatgg aaaaacagtc 900

gattacgcag ttacccatca cgcagagggt ttcctgatgt gtaagatcac tgatacagtc 960

agaggagaaa gagtctcttt cccggtctgt acctatgtgc ctgcaaccat atgcgaccag 1020

atgacgggta tacttgccac tgacgtgaca ccagaggatg cccagaagct cctggttgga 1080

ttgaaccaac gcatagtggt gaacggtagg acgcaaagaa acacaaacac aatgaaaaac 1140

tacctactgc cagtggtagc gcaagcattc agtaaatggg cacgagaggc acgcgcagac 1200

atggaggacg aaaaacccct aggcaccaga gaacgcacgt tgacgtgttg ttgcctgtgg 1260

gcgtttaaaa gccacaaaat ccacaccatg tacaagcggc ctgaaacaca aactatcgtc 1320

aaagtgcctt ccacttttga ctcctttgtg ataccgagcc tgtggtcatc cagtctttcc 1380

atgggtatca gacagaggat caaattgcta ctcagcgcaa gaatggccca aggcctacca 1440

tactcaggag atcgcactga agctcgcgcg gcagaagaag aagagaagga ggtgcaggag 1500

gctgaactta cgagggcagc gctgccaccg ctagtgagcg gctcttgtgc tgacgatatc 1560

gcccaggtgg acgtagagga actaaccttc agagccggag cc 1602

<210> 3

<211> 2394

<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 3

ggggttgtgg aaacacccag gaatgccctg aaggttacac cgcaagcaca cgaccatctc 60

ataggctcct acttgatcct ttccccccaa acggtgttga aaagcgagaa gctggcaccc 120

atccaccctc ttgctgagca agtcacggtc atgacccact ctggaagatc cggcagatac 180

ccagtcgaca agtacgacgg acgggtattg atcccaacag gagcagccat cccagtgagt 240

gagttccagg cactcagcga gagcgcaacc atggtgtaca atgagaggga atttataaat 300

cgcaagctac accacatagc gctatacggg ccagccttga atacggacga ggaaagctac 360

gaaaaagtga gagctgaaag ggcagagaca gagtatgtgt tcgacgtgga caagaaggca 420

tgtatcaaga aggaggaggc atcaggcctt gtgttaacag gggacctaat caatccacct 480

ttccacgaat tcgcatacga aggactcaag atccgcccag cagccccgta ccacacgacg 540

atcattggtg tgttcggcgt tccgggttcg ggcaagtcgg ctatcattaa gaacatggtg 600

acgactcgcg atctggtggc cagtggaaaa aaggagaact gccaagagat catgaatgat 660

gtaaagaggc aacgcggatt ggacgtaacc gctaggaccg tcgactcaat cttgttgaat 720

gggtgcaaga aaggcgtaga aaacctttac gtcgatgagg cgttcgcgtg tcactcgggt 780

actttgctag cgctcatcgc gctggtgaga ccgtcaggta aggtagtact gtgcggcgac 840

cctaagcagt gtggtttctt caatttgatg caactgaagg tgcactataa ccacaacatc 900

tgtacaaggg tgctccataa gagcatctcc agaagatgca ctctacctgt tacggcgatc 960

gtgtccacct tgcactacca agggatgatg agaacgacga accgatgcaa cacccccatt 1020

cagattgaca ccaccggttc ctccaaacca gcctcaggag acatcgtgtt aacgtgcttc 1080

cgcggctggg tgaagcaact gcaaatcgac tatcgtggac acgaggtgat gaccgcagct 1140

gcttcccagg gtctgacaag gaaaggcgtg tacgccgtga gacagaaagt gaacgaaaac 1200

ccactgtact cacctctgtc ggagcatgtc aacgtgctgt tgacccgaac tgaaaaccga 1260

ctggtgtgga agacactgtc gggtgacccg tggataaagg tgttaaccaa tgttccacgt 1320

ggggatttca gtgcaactct ggaggaatgg caagaagaac atgacggtat catgagagtg 1380

ttgaacgagc gaccggcgga ggtcgatcca ttccaaaaca aggccaaggt gtgctgggca 1440

aaatgtctgg tacaagttct tgagacggcc ggaatacgta tgacggcaga tgaatggaac 1500

accatcctgg ctttcagaga ggacagagcg tactcaccag aagtcgctct caacgagatt 1560

tgcactcgtt actacggcgt tgacctagac agtggcctat tctcagcgca gtcggtctcc 1620

ctcttttatg agaacaacca ctgggacaac aggcctggag gacgcatgta cgggttcaac 1680

catgaagtag ccaggaaata tgcagctagg tttccatttc tacgtggcaa catgaactcg 1740

gggctacaac taaatgtccc tgagaggaag ctccagccct ttagcgctga atgcaacata 1800

gtcccatcca atcgtcggtt accgcatgct ctggtcacaa gttatcagca gtgccgtggg 1860

gagagggtag agtggttgct gaaaaagatt ccaggtcacc aaatgttact tgtaagtgag 1920

tacaacctgg tgatacctca caaaagagtc ttctggattg cacctccgcg ggtgtcaggc 1980

gcggaccgca cgtacgactt ggacctaggg ttacctatgg atgcaggccg ttacgacctg 2040

gtattcgtca acatccatac tgagtaccgg caacaccact accaacaatg cgtcgaccat 2100

tcaatgcgcc tgcagatgct gggaggggat tcactacacc tgctcagacc aggaggctcg 2160

ctgctgatga gagcatatgg ttacgcagac agagtcagcg agatggtggt gacagccctg 2220

gcaaggaaat tttcggcgtt ccgtgtcctg agaccggcgt gtgtgacgag caacacagaa 2280

gtgttcctgc tgttttctaa ctttgataac ggcagaagag cggtaacctt gcaccaagct 2340

aaccaaaaac ttagctcaat gtatgcctgc aacggattgc acactgctgg ctgt 2394

<210> 4

<211> 1572

<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 4

gcaccgtcat acagggtccg ccgcgcagat atatcaggac acagtgagga agcggtcgta 60

aatgctgcca atgccaaagg taccgtgagc gacggagtgt gcagggcggt tgctaagaag 120

tggccatcat ctttcaaagg ggctgcaact ccagtcggca cagccaaaat gatccgcgca 180

gatggcatga ccgtaatcca cgcagtggga ccaaacttct ccaccgtaac agaagccgaa 240

ggggacagag agctagcggc cgcgtatcga gctgtggcta gcataatcag taccaacaac 300

ataaagagcg ttgcagtacc gctgctgtcc acaggcacct tctccggcgg taaggacaga 360

gtgatgcagt ccttgaacca cttattcacg gcactggacg caaccgacgc agacgtggtt 420

atctactgca gagataaaaa ctgggaaaag aagattcagg aagccatcga caggcggacg 480

gcaatcgagc tcgtatctga agacgtgacc ttggaaaccg atctggttag ggtacacccg 540

gacagttgcc tagtcggcag aaatggttac agtgcaactg acggtaaact gtactcttac 600

cttgagggca cgaggttcca ccagacggcg gtcgacatgg ctgaaatatc aactttatgg 660

ccaagactcc aagatgctaa cgagcagatc tgcctgtacg ccctagggga gacgatggac 720

agcatacgca ctaaatgccc agtagaggac gccgattcgt ctacgccgcc gaaaacggta 780

ccgtgtctat gtcggtacgc gatgaccgcg gagcgggttg ccagacttag gatgaataac 840

accaaaaaca tcatcgtgtg ctcctccttt ccattaccga agtacaggat agaaggcgtg 900

cagaaggtga agtgtgaccg agtgctaatc tttgaccaga ccgtcccgtc actagtaagt 960

cccagaaagt acatacagca gccgccggaa cagctggata atgtgagcct gacttctacg 1020

acgtcgacgg gatccgcatg gtcatttcca tcggaaacga cctacgaaac catggaagtc 1080

gtagccgagg tacacaccga acctccaatc cctccgcctc gccgacgtag agcagccgtc 1140

gcccaactta gacgggatct ggaagtcacc gaggagatcg agccgtatgt gacacagcaa 1200

gcagaggtca tggtcatgga gagggtcacg acgacagaca tacgcgctat cccagtcccg 1260

gcacggcggg ccattacaat gccagtccca gcccccaggg ttcgtaaggt cgctactgaa 1320

cctccattag aaccggaagc tcctatcccg gcaccaagaa agagaagaac cactagcacc 1380

ccacctccgc ataaccccga ggatttcgtt cccagggtac ctgttgagtt accgtgggag 1440

ccggaagacc tagacatcca attcggtgac ttggagccac gccgccggaa caccagggac 1500

cgagatgtca gcacaggaat acagttcggt gacatcgact ttaaccagtc ctgactaggc 1560

agggctggcg cg 1572

<210> 5

<211> 1833

<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 5

tatatctttt cgtctgacac tggcccgggt cacctacaac agaagtctgt aaggcaacat 60

gaattgccat gcgagactct gtacgcccat gaagacgaac gcatataccc gccggcattt 120

gacggagaga aagaaaaagt actccaggca aagatgcaga tggccccgac agaagcgaat 180

aagagcaggt accagtcgag gaaagtagag aacatgaagg cattaattgt agaaagatta 240

cgcgaaggag caaagttgta cctccatgag caaaccgaca aagtacccac gtacaccagc 300

aagtacccta gacctgtgta ctcaccatcg gtggatgaca gcctgagcga tccggaagtg 360

gctgtggccg cctgtaactc tttcttagag gagaattatc caaccgtggc gaactaccag 420

ataaccgatg agtatgacgc ttatctggac ttggtcgacg gctctgaaag ctgcctcgac 480

agagctacgt tctgcccggc caaactaaga tgttacccta agcaccacgc ataccaccaa 540

ccacaaatca ggagcgcagt accttcccct tttcaaaaca cgctacaaaa cgtgctagcc 600

gcggccacta aaagaaattg caacgtcacc caaatgagag aattaccaac catggactct 660

gcggtgttca acgtagaaag cttcaagaaa tacgcatgca ccggcgaata ttggcaagaa 720

tttaaagaca atcctatacg gatcaccacc gaaaacataa cgacgtacgt ggctaaactc 780

aagggtccaa aggctgctgc cctttttgcc aagacgcata acctggtgcc gcttcaggag 840

gtgccaatgg accgcttcgt gatggatatg aagagagatg tgaaagttac accaggcacc 900

aagcataccg aagaaaggcc aaaagtgcaa gtgattcaag cggcggaacc attggccacg 960

gcatatttat gcggaatcca cagagagtta gtcaggcggc taaaagccgt tctgaccccg 1020

aacattcata ctctgtttga catgtcggcg gaggactttg atgccatcat agcggcacat 1080

ttccaaccgg gagatgctgt actggagaca gatatcgcat ccttcgacaa gagccaagac 1140

gactccttag cgctaacggc gctgatgctt ctggaagacc tcggggtcga ccaagaactg 1200

ctggacctta tcgaagctgc gtttggtgag atcacgagtg tgcatctacc taccggtaca 1260

agatttaaat tcggtgctat gatgaagtca ggaatgtttc ttacactctt catcaacacg 1320

ctgctgaaca ttgtcatagc gtgccgcgtc ttacgcgaca aattatcgtc ctcggcgtgc 1380

gccgccttca taggtgatga caacatagtg cacggcgtga ggtcagaccc gctaatggct 1440

gaaaggtgtg cgagttgggt caacatggaa gtgaagatca tcgacgccac aatgtgtgag 1500

aaaccaccgt acttttgtgg aggattcatc ctgtacgaca gtgtcaccgg cacagcgtgt 1560

agggttgcag acccgttaaa gaggctgttc aaactcggga aaccgctccc ggcggacgac 1620

aaccaggatg aagacagaag aagggcacta aaagatgaaa cagttaagtg gtcccgcata 1680

ggattgagag aagaattaga cgtggcattg agctcaagat accaagtcag tggcgtcgga 1740

aacatcacta gagcgatgtc cacgctgtct aagagtttga agtcgtttag gaaaataaga 1800

ggtcccatca tacatctgta cggcggtcct aaa 1833

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 6

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 7

atgaattaca ttccaactca aaccttttac ggacgccgtt ggcgaccacg cccggcgtac 60

cgtccatggc gggtgccgat gcagccggcc ccacccatgg tgatccctga gctgcaaact 120

ccgatcgtcc aggcccaaca gatgcagcag ctaatcagtg cagtttctgc cctgacgacc 180

aagcaaaatg gcaaagcacc gaagaagccg aagaaaaagc cgcaaaaggc gaaggctaag 240

aaaaatgaac agcaaaagaa gaacgagaac aagaaaccac cacctaagca gaagaatccg 300

gctaagaaga agaaaccagg aaaaagggaa cgcatgtgca tgaagataga gaatgattgc 360

atcttcgagg tcaagcttga cggtaaggtc acgggatacg cctgcctagt cggggataaa 420

gtgatgaagc cggcacacgt caaaggtgtg atcgacaacc ccgacctagc gaagcttacc 480

tacaagaaat cgagcaagta tgacctggag tgcgcccaga taccagtgca catgaaatca 540

gatgcttcaa agtacaccca tgaaaaacca gaagggcact acaattggca tcacggtgca 600

gtgcagtaca gcggtggcag gttcacgatc ccgacaggcg caggtaaacc aggagacagc 660

ggccggccga tcttcgacaa caaaggacgc gtggtggcca ttgtcctggg aggggccaac 720

gaaggagcca ggactgccct atccgtcgtg acctggacca aagacatggt cacacggtac 780

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<210> 8

<211> 192

<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 8

tccgccgcct tgatgatgtg cgtcttagcc aacgttacat tcccatgctc agagcccgcg 60

tgtgcaccct gctgctatga aaaacaacca gaacagacac tgaggatgtt agaggacaac 120

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cgccaccgtc gc 192

<210> 9

<211> 1266

<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 9

agtgtgacga aacacttcaa tgtctacaag gccacgaaac cgtatctagc gtattgcgcg 60

gactgcggag acgggcagtt ctgttacagc ccggtggcta tagaaaaaat tagggatgag 120

gcttccgatg gcatgataaa aatccaggtc gcagcgcaaa ttggcatcaa caaaggagga 180

acacacgaac acaacaaaat caggtacatc gccgggcatg acatgaaaga ggcaaaccgg 240

gattctttac aagtgcatac ttccggtgtg tgcgctattc gaggcacgat gggccacttc 300

atcgtggcct actgccctcc aggggacgaa ttaaaggtcc aattccaaga tgcagaatcg 360

cacacccagg cctgcaaagt gcagtacaaa cacgcaccgg ccccagtagg cagagaaaaa 420

ttcaccgtca ggccccactt cggtatcgaa gtgccatgca caacgtacca gctgactacc 480

gcaccgacgg aggaagagat cgacatgcat accccaccgg acatcccaga cataacgttg 540

ctgtcgcagc agtcaggtaa tgtaaagatc acagcaggag gaaaaaccat cagatacaac 600

tgcacgtgtg gtagtggcaa cgtgggcacc accagtagcg acaagactat caattcgtgc 660

aaaatagcac aatgccacgc tgcggtgact aaccacgata agtggcagta cacctcctcg 720

tttgtcccta gagccgacca gttgtctcgc aaaggtaaag tgcacgtacc tttccctctg 780

accaactcca cttgcagggt gcctgttgca cgtgcaccag gtgtcacata cggaaagaga 840

gaactgacag tgaaactgca cccagatcat cccacgctgt tgacgtaccg gagtctagga 900

gcggatccgc gtccgtatga ggagtggata gaccgatacg tcgaacggac cataccggtg 960

accgaagatg ggatcgagta cagatgggga aacaacccac ccgtgcgctt gtgggcccag 1020

ctgacaactg aaggcaaacc ccatgggtgg ccgcacgaga tcatactcta ttactatggg 1080

ctatacccag cagccaccat cgccgccgtc tcagccgcgg gtctcgcagt cgtactatcg 1140

ctgctggcgt cttgttacat gttcgccact gcacgccgca agtgcctgac cccatacgcc 1200

ctgacccccg gagctgtcgt cccggtaaca ctaggagtac tatgctgcgc accacgagcg 1260

catgcc 1266

<210> 10

<211> 183

<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 10

gcgtcatttg cggaatctat ggcgtatcta tgggacgaga atcaaaccct gttttggctg 60

gagcttgcaa cgccgctcgc tgccataatc atacttgtat gctgcctgaa gaacctgctt 120

tgctgctgca aaccgctttc ttttttagtg ctggtgagcc tgggaactcc cgtcgtaaaa 180

act 183

<210> 11

<211> 1317

<212> DNA

<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 11

tacgaacaca ccgcaacgat cccgaatgtg gtgggattcc cgtataaggc tcacattgag 60

aggaacggct tctccccgat gaccctacag cttgaagtac ttggaaccag cttggaaccc 120

acgctaaact tagagtacat aacctgtgaa tacaagacag tcgtgccatc accttatatc 180

aagtgctgcg ggacatcaga atgcagatcc atggagcgcc ccgactatca atgccaggtc 240

tacacaggag tgtacccatt tatgtggggc ggcgcatact gcttctgcga cactgagaac 300

acccagctga gtgaagcata cgttgataga tcggacgtat gcaagcacga ccatgccgcc 360

gcctacaagg cgcacactgc ggcgatgaaa gccaccatcc gaataagcta cgggaacctc 420

aatcagacaa caacggcgtt cgtcaacggg gagcacacag tgaccgtcgg aggtagcagg 480

tttacttttg gtccaatctc cactgcctgg acgcctttcg acaacaagat cgtcgtctac 540

aagaacgacg tctacaacca ggacttccca ccctatgggt caggacaacc agggaggttt 600

ggagacatcc agagcaggac ggtagagagc aaggacctgt atgccaacac cgccctcaag 660

ttgtcaagac cttcgtccgg tactgttcac gtgccttaca cacagacccc ttctggcttt 720

aagtactgga taaaagagag aggcacgtcg ctgaatgaca aggctccctt tggatgcgta 780

atcaagacca acccggtcag agcggaaaat tgcgccgttg gcaacatccc agtctccatg 840

gacatcccgg acaccgcgtt tacgcgcgtg attgacgcac ctgccgtcac aaacctggag 900

tgccaagtgg cggtctgcac gcactcatcg gacttcggcg ggatcgcgac tctgactttc 960

aaaactgaca aacccggaaa atgtgctgtc cattctcatt cgaacgtagc caccatacag 1020

gaggcagctg tggacatcaa gacagatggc aagataaccc tgcatttctc tacagcatca 1080

gcatccccgg cattcaaggt atctgtgtgc agtgccaaaa cgacatgcat ggcagcgtgt 1140

gagccgccga aggatcacat cgtcccttat ggggcgagcc ataacaacca agtttttcct 1200

gacatgtctg gcacggcaat gacatgggtg cagcgggtag ccggtggact cggcgggcta 1260

acactcgccg cagtggcagt acttatactg gtgacgtgtg tgaccatgcg ccgctaa 1317

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<213> 盖他病毒(Getah virus)

<400> 12

ccgggaggct tgacataatg tatacatata agcatcatag ttttgataaa gcatataaat 60

aatcaagtag atcaaagggc tacctaaccc ctgaatagta acaaaacgca aaatacaaaa 120

acattagttc aaagggccag taacccctga atagtaacaa aatataaaaa ccaaaaacag 180

tagttcaaag ggctatacaa cccctgaata gtaacaaaat acagaaaaac cataaaaatt 240

ataaaattaa ctaatcagat catctaaatt tgactaattg gaaatagccg aactctacgg 300

agatgtaggc gtccgaactc cacggagacg taggacaaaa ttctgccgaa ccccagacca 360

ccggggacgt aggcgtctaa tttgtttttt taatatttta c 401

Claims (10)

1.一株盖他病毒(Getah virus)毒株，其特征在于：所述盖他病毒毒株的名称为GETVJXNC，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.22111。

2.权利要求1所述的盖他病毒GETV JXNC在制备防治由盖他病毒所致疾病的疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述防治由盖他病毒所致疾病的疫苗为灭活疫苗。

4.一种防治由盖他病毒所致疾病的疫苗，其活性成分为经灭活的盖他病毒毒株GETVJXNC，所述盖他病毒毒株GETV JXNC的保藏编号为CGMCC No.22111。

5.根据权利要求4所述的防治由盖他病毒所致疾病的疫苗，其特征在于：所述防治由盖他病毒所致疾病的疫苗包含经灭活的权利要求1所述的盖他病毒GETV JXNC和药学上可接受的佐剂。

6.根据权利要求4或5所述的防治由盖他病毒所致疾病的疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)病毒培养：将权利要求1所述的盖他病毒GETV JXNC接种至PK-15细胞进行培养，收获病毒培养物；

2)病毒培养物的灭活：将步骤1)收获的病毒培养物经反复冻融三次，离心，收集上清，加入灭活剂，将病毒灭活，得到灭活的病毒液；

3)按比例混合灭活的盖他病毒GETV JXNC病毒液和佐剂，乳化，制备成盖他病毒灭活疫苗。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述灭活剂为二乙烯亚胺，步骤2)中收集的上清中加入二乙烯亚胺的终浓度为1mmol/L，灭活条件为30℃灭活28小时；灭活后加入硫代硫酸钠溶液中和二乙烯亚胺，所加入硫代硫酸钠溶液的终浓度为0.02g/ml。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的佐剂为ISA206或ISA201，灭活的盖他病毒GETV JXNC病毒液与佐剂的体积比例为1:1。

9.权利要求1所述的盖他病毒GETV JXNC在建立盖他病毒病动物模型中的应用。

10.权利要求1所述的盖他病毒GETV JXNC在制备抗盖他病毒病的抗体中的应用。

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