CN108753739B - 表达猪瘟病毒e2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株及其制备方法和应用 - Google Patents

表达猪瘟病毒e2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒弱毒株，其插入的外源序列包括：CMV启动子、猪瘟病毒E2蛋白的信号肽及编码E2蛋白第1‑342位氨基酸和SV40 polyA的核苷酸序列。本发明还公开了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒弱毒株的制备方法和应用。本发明的重组伪狂犬病毒弱毒株，对伪狂犬病毒及猪瘟病毒均有较好的免疫保护效果，适于作为防治伪狂犬病及猪瘟的疫苗候选株。

Description

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒 株及其制备方法和应用。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、高度接触性传染病,该病全球流行，对养猪业危害严 重，是各国防控和检疫的重要传染病。自从成功研制并广泛应用猪瘟疫苗(C株)以来，猪 瘟在我国得到了有效控制，鲜有大面积的爆发。但是，我国并未消灭猪瘟，且近十几年来， 猪瘟仍在全国范围内流行，而且流行态势日趋复杂，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。 中国研制的猪瘟疫苗(C株)是世界公认的优秀疫苗，但在中国复杂的养殖环境下，虽然采 取了猪瘟疫苗强制免疫防控策略，但猪瘟病毒在我国仍然广泛流行。
目前，很多国家采用猪瘟弱毒疫苗免疫来控制猪瘟，但弱毒疫苗最大的缺陷是用血清学 方法无法区分免疫猪群与野毒感染的猪群，不利于猪瘟的根除。而一部分国家采用的非免疫 清除策略，要对感染猪群实施扑杀策略，这种策略也面临经济损失和防控风险，而且不适于 我国的国情。猪瘟标记疫苗免疫(在血清学上可以与野毒感染猪相区分)与清除措施相结合是 世界公认的控制猪瘟最理想的方法。
伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为 主要特征的一种烈性传染病。PRV能感染多种宿主，但猪是该病毒主要的天然宿主、贮存者 和传播者。不同年龄段的猪都可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪 高死亡率，及种猪不育。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链DNA， 长约150kb，由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的重复序列所组成，编码70多种蛋 白。病毒粒子由核衣壳、外壳及囊膜三层组成。核衣壳是由6种衣壳蛋白包裹病毒基因组形 成的二十面体结构；外壳介于核衣壳与囊膜层间，由14种蛋白组成；囊膜由15种蛋白镶嵌 于双层脂膜组成，其中糖蛋白11种。病毒表面蛋白决定了病毒的细胞嗜性，也是主要的保护 性抗原。一些重要的病毒基因，如tk，对病毒毒力存在显著影响，其缺失能使病毒致弱。
伪狂犬最早发生于美国，我国于上世纪40年代末在猫中首次发现了PRV，60年代初在 猪群中也出现了该病毒流行，至今伪狂犬病毒仍在我国广泛流行，严重威胁着我国猪群的健 康，并造成了严重经济损失。猪感染PRV后，有的呈隐性感染，但长期携带病毒；出现临床 症状的耐过猪也能成为病毒的携带者，成为传染源，这增加了PRV防治的难度。为了控制PRV，我国猪场自上世纪末开始广泛使用PRV弱毒活疫苗，如PRV Bartha-K61株活疫苗，猪伪狂犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等伪狂犬的临床症状。童武、彭金美等人也分别从发病猪中分离到了PRV野毒株，并通过基因序列分析与抗体中和试验证实了分离 的野毒株较疫苗株和经典毒发生了较大的变异。这表明，我国猪场中出现了PRV变异株，而 目前使用的商品化疫苗对变异株的保护效果差，导致了我国猪场伪狂犬发病率的抬头。
猪瘟和伪狂犬病均是影响我国养猪业健康发展的重大疾病，对这两种病的防控主要还是 靠疫苗接种。临床中，考虑到猪瘟疫苗和伪狂犬疫苗之间的干扰，使得免疫程序的制定比较 繁琐。近几年来，伪狂犬病病毒出现了变异，导致现有疫苗保护效果不佳。因此，我们以伪 狂犬病病毒变异株活疫苗(JS-2012-ΔgI/gE株)为载体(本实验室保存；专利申请见：童光志、 童武、郑浩、刘飞、梁超、周艳君、单同领、于海、姜一峰、高飞.伪狂犬病毒基因缺失弱毒 株及其制备方法和应用.申请号或专利号：201410002656.7；发表文章见：WuTong,Guoxin Li, Chao Liang,Fei Liu,Qing Tian,Yanyun Cao,Lin Li,Xuchen Zheng,Hao Zheng,Guangzhi Tong.A live, attenuated pseudorabies virus strain JS-2012deleted for gE/gI protects against both classical and emerging strains.Antiviral Research 130(2016)110-117.)，运用同源重组的方法，将猪瘟病毒的主要保护性抗原蛋白 (E2蛋白)的基因序列，分别插入到载体JS-2012-ΔgI/gE疫苗株基因组gG基因与gD基因间隔 区、融合入gG基因中及插入gI/gE基因缺失区域，成功构建出了3株含猪瘟病毒E2蛋白基因序 列的重组伪狂犬病毒基因缺失疫苗株，rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2(gG基因后独立表达E2蛋白)、 rPRV JS-2012-E2(gG)-ΔgI/gE(gG基因后融合表达E2蛋白)、rPRVJS-2012-E2(ΔgI/gE)-ΔgI/gE (gI/gE基因缺失区域独立表达E2蛋白)。将获得的3株重组伪狂犬病毒基因缺失疫苗株在Vero 细胞上连续传20代，经PCR及测序验证3株重组伪狂犬病毒的稳定性，同时用间接免疫荧光验 证3株重组伪狂犬病毒基因缺失疫苗株的外源基因表达情况。结果表明：3株重组伪狂犬病毒 基因缺失疫苗株，rPRV JS-2012-E2(ΔgI/gE)-ΔgI/gE病毒在第4代时E2外源基因出现了丢失， 外源基因不稳定外；其他两株重组伪狂犬病毒基因缺失疫苗株(rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2、 rPRV JS-2012-E2(gG)-ΔgI/gE)插入的猪瘟病毒E2蛋白在载体病毒JS-2012-ΔgI/gE中均能稳 定且高效表达。同时，我们测定rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-ΔgI/gE两 株遗传稳定性好的重组病毒对猪瘟强毒株的保护效果，以rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-ΔgI/gE疫苗候选株分别免疫试验猪后，用猪瘟病毒强毒株shimen株进行攻 毒。结果显示：rPRVJS-2012-E2(gG)-ΔgI/gE疫苗免疫组：整个监测期内，虽然没有试验猪 死亡，但在攻毒后的第4～7天，试验猪出现高热情况(体温41℃以上)，血清和鼻拭子分别 在5～7天和5～9天均检出高拷贝的病毒RNA，保护效果不佳。而rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2疫 苗免疫组：整个监测期内，试验猪未见明显体温升高和其他临床症状，获得100％的保护。同 时比对国内外发表文章发现：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建的两株表达猪瘟病毒E2 蛋白的重组伪狂犬病毒疫苗候选株(rPRVTJ-delgE/gI-E2，rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2)需经两 次免疫后才能有效的抵抗猪瘟病毒强毒株(shimen株)的攻击(Yimin Wang,Jin Yuan,Xin Cong,Hua-Yang Qin,Chun-Hua Wang,Yongfeng Li,Su Li,Yuzi Luo,Yuan Sun,Hua-JiQiu.Generation and efficacy evaluation of a recombinant pseudorabies virusvariant expressing the E2protein of classical swine fever virus in pigs.ClinVaccine Immunol.2015,22(10):1121-1129.Jian-Lin Lei,Shui-Li Xia,Yimin Wang,Mingliang Du, Guang-Tao Xiang,Xin Cong,Yuzi Luo,Lian-Feng Li,Lingkai Zhang,Jiahui Yu,Yonghao Hu,Hua-Ji Qiu,Yuan Sun.Safety and immunogenicity of a gE/gI/TK gene-deleted pseudorabies virus variant expressing the E2protein ofclassical swine fever virus in pigs.Immunology Letters 174(2016)63–71.)。而且，这两个毒株中猪瘟 病毒E2基因的插入位置均是在gE/gI基因缺失处。而本研究构建的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组 伪狂犬病毒基因缺失疫苗株(rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2株)是在缺失伪狂犬病毒gE和gI基因 的基础上，在gG和gD基因之间插入猪瘟病毒E2基因而来的，该重组疫苗具有很好的遗传稳定 性，且经一次免疫后就能有效的抵抗猪瘟病毒强毒株(shimen株)的攻击。进一步实验证实， 我们构建的重组伪狂犬病毒基因缺失疫苗株对仔猪具有很好的安全性，且对猪瘟病毒强毒株 和伪狂犬病病毒强毒株的攻击均能起到很好的保护效果。该重组病毒疫苗免疫后能与猪瘟病 毒和伪狂犬病病毒野毒感染在血清学上进行区分，不仅实现“一针防两病”的目的，而且有助 于猪瘟病毒和伪狂犬病病毒的净化和根除。因此我们将重组伪狂犬病毒基因缺失疫苗株 (rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2株)作为有效的疫苗候选株来开发疫苗。
发明内容
目前，我国猪瘟弱毒疫苗免疫无法在血清学诊断中与野毒感染进行区别，难以对猪瘟病 毒进行净化，亟需开发猪瘟标记疫苗。同时，我国广泛存在猪瘟和伪狂犬病共流行，为了简 化猪场免疫程序、节约疫病防控成本，有将猪瘟弱毒疫苗与伪狂犬病毒活疫苗混合制成猪瘟- 伪狂犬二联疫苗，然而上述二联疫苗免疫效果差，难以推广使用，因此，亟需开发新的高效 CSFV-PRV二联疫苗。为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用伪狂犬病毒gE/gI缺失变 异株为载体表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株(rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2株)，该 重组毒株接种15日龄内仔猪，不出现PRV临床症状，安全性高，且对PRV变异株及猪瘟病 毒强毒攻击均具有良好的免疫保护效果，能作为防治伪狂犬病及猪瘟的二联基因工程疫苗候 选株。且该疫苗侯选株缺失gE基因，能与PRV野毒感染相区分，用于PRV净化；该疫苗侯 选株仅表达CSFV E2蛋白，也能与CSFV野毒感染相区分，用于CSFV净化。
此外，本发明还提供了一种上述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株的制备方法 和应用。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株，其特征 在于，所述重组毒株插入的外源序列包括：CMV启动子、E2蛋白信号肽、编码猪瘟病毒E2 蛋白第1-342位氨基酸的核苷酸及SV40polyA的核苷酸序列，所述重组毒株插入的外源序列 为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
优选的，所述重组毒株表达的猪瘟病毒基因序列包括：猪瘟病毒shimen株基因组第 2353-2440位碱基的核苷酸序列(E2蛋白信号肽)(GENBANK号：AF092448)、以及猪瘟病毒shimen株E2基因第1-1026位碱基的核苷酸序列(GENBANK号：AF092448)，所述重组 毒株表达的猪瘟病毒基因序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
本发明所述的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株，其特征在于，所述病毒株(分 类命名：伪狂犬病病毒rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2Pseudorabies virus rPRV JS-2012-△ gI/gE+E2)，于2018年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为湖 北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:V201822。
在本发明的另一方面，还提供了一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株的制备 方法，包括以下步骤：
(1)构建重组载体，所述重组载体包含伪狂犬病毒JS-2012-△gI/gE株gG基因和gD基因的部 分序列，其中不包含权利要求1中所述的猪瘟病毒基因序列，所述重组载体还包含有EGFP 荧光标记基因；
(2)提取伪狂犬病毒JS-2012-△gI/gE株总DNA，将该总DNA与步骤(1)的重组载体共转染细 胞，获得含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒；
(3)构建重组载体，所述重组载体包含伪狂犬病毒JS-2012-△gI/gE株gG基因和gD基因的部 分序列，其中包含权利要求1中所述的猪瘟病毒基因序列，所述重组载体不包含EGFP荧光 标记基因；
(4)提取步骤(2)获得的重组伪狂犬病毒的总DNA，将该总DNA与步骤(3)的重组载体共转染细 胞，获得不包含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒，该重组伪狂犬病毒即为表达猪瘟病毒E2 蛋白的重组伪狂犬病毒毒株。
在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，所述组合物包含与佐剂或药用载体混 合的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株。
所述疫苗组合物适于滴鼻、注射接种。
在本发明的另一方面，还提供了一种上述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株在 制备预防或治疗伪狂犬病及猪瘟的疫苗中的应用。
本发明的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株(rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2株)，接 种15日龄仔猪，不出现临床症状，对免疫猪分别抵抗伪狂犬病毒及猪瘟病毒的致死性攻击均 能提供100％的免疫保护率，安全可靠，能作为有效防治伪狂犬病及猪瘟的疫苗候选株。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的rPRV JS-2012-△gI/gE+EGFP毒在纯化不同代次在荧光显微镜下 的结果；
图2是本发明实施例1的3株重组病毒接种细胞后同一视野在荧光显微镜及普通光学显微 镜下的病变图；
图3是本发明实施例1的3株重组病毒插入E2基因的PCR鉴定结果图；
图4是本发明实施例1的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2病毒不同代次病毒插入E2基因的PCR 鉴定结果图；
图5是本发明实施例1的rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病毒不同代次病毒插入E2基因的 PCR鉴定结果图；
图6是本发明实施例1的rPRV JS-2012-E2(△gI/gE)-△gI/gE病毒不同代次病毒插入E2 基因的PCR鉴定结果图；
图7是本发明实施例1的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病 毒不同代次病毒E2单抗IFA实验结果
图8是本发明实施例1的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病毒 第20代次病毒E2基因的测序结果
图9是本发明实施例1的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病毒 及亲本病毒的体外生长曲线；
图10是本发明实施例2的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病 毒接种哺乳仔猪后体温检测结果；
图11是本发明实施例2的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病 毒免疫仔猪后剖检结果；
图12是本发明实施例3的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病 毒分别免疫仔猪后猪瘟病毒攻毒的体温结果；
图13是本发明实施例3的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病 毒分别免疫仔猪后猪瘟病毒攻毒的存活率结果；
图14是本发明实施例3的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病 毒免疫仔猪后猪瘟病毒攻毒后血清中猪瘟病毒RNA的拷贝数；
图15是本发明实施例3的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病 毒免疫仔猪后猪瘟病毒攻毒后鼻拭子中猪瘟病毒RNA的拷贝数。
图16是本发明实施例4的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2免疫仔猪后伪狂犬病病毒攻毒的体温 结果；
图17是本发明实施例4的rPRV JS-2012-△gI/gE+E2免疫仔猪后伪狂犬病病毒攻毒的存活 率结果；
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实 验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
目前，我国广泛使用的猪瘟弱毒疫苗免疫后无法在血清学诊断中与野毒感染进行区别， 难以对猪瘟病毒进行净化。同时，我国猪场广泛存在猪瘟和伪狂犬病共流行，需要利用疫苗 防控猪瘟和猪伪狂犬病。为了简化猪场免疫程序、节约疫病防控成本，存在猪瘟-伪狂犬病二 联疫苗的重要需求。本发明利用伪狂犬病病毒变异株gE/gI缺失活疫苗株(JS-2012-△gI/gE) 为载体，运用同源重组方法，将猪瘟病毒E2基因插入到载体病毒的基因组中，成功构建出“表 达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒基因工程二联活疫苗候选株(rPRV JS-2012-△ gI/gE+E2株)”。该重组毒株接种15日龄内仔猪，不出现PRV临床症状，安全性高，且对 PRV变异株及猪瘟病毒强毒株均具有良好的免疫保护效果，同时能与PRV和CSFV野毒感染 进行血清学鉴别诊断，可用于猪伪狂犬病及猪瘟的防治与净化。
在本发明的下述实施例中，使用的实验材料如下：
病毒和细胞:BHK-21细胞(美国细胞保藏中心ATCC，保藏号为：CCL-10)，Vero细胞(中 国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,保藏号为：GN010)，伪狂犬病毒JS-2012-△gI/gE株(本 实验室保存；专利申请见：童光志、童武、郑浩、刘飞、梁超、周艳君、单同领、于海、姜 一峰、高飞.伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用.申请号或专利号：201410002656.7；发表文章见：Wu Tong,Guoxin Li,Chao Liang,Fei Liu,Qing Tian,Yanyun Cao,Lin Li, Xuchen Zheng,Hao Zheng,Guangzhi Tong.A live,attenuatedpseudorabies virus strain JS-2012deleted for gE/gI protects against bothclassical and emerging strains.Antiviral Research 130(2016)110-117.)
质粒与菌株：pEGFP-N1、pEGFP-C3和pBluescript SK(+)购自上海基音生物技术有限公司； 大肠杆菌DH5α感受态；购自北京天根。
其他试剂:MEM和DMEN,Invitrogen公司产品；AseI、SacI、XhoI、ScaI和T4DNA连接酶,NEB公司产品；Fugene HD转染试剂，promega公司产品；DNA片段小量快速回收试剂盒，Omega公司；2×GC BufferⅡ，dNTP Mix(2.5mmol/L each)，LA-Taq，DL-15000,DL-2000 DNAMarker购自TakaRa；其它化学试剂均是进口或国产分析纯。
在本发明的实施例中，BHK-21细胞的培养方法如下：
BHK-21细胞在含有10％FBS的MEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后，弃去细 胞培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以0.25％的胰酶将细胞消化下，加入新的含有10％FBS 的MEM培养基，以1:8的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。
在本发明的实施例中，Vero细胞的培养方法如下：
Vero细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后，弃去细胞 培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以0.25％的胰酶将细胞消化下，加入新的含有10％FBS的 DMEM培养基，以1:6的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。
实施例1表达猪瘟病毒E2蛋白重组伪狂犬病毒疫苗候选株的构建
以伪狂犬病基因缺失弱毒活疫苗(PRV JS-2012-△gI/gE株)为基础，利用同源重组的方 法，将猪瘟病毒的主要保护性抗原蛋白(E2蛋白)的基因序列，分别插入到载体PRVJS-2012- △gI/gE疫苗株gG基因后面及gI/gE基因缺失区域，成功构建出了3株含猪瘟病毒E2蛋白基 因序列的重组伪狂犬病毒基因缺失疫苗株(rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRVJS-2012-E2(gG) -△gI/gE、rPRV JS-2012-E2(△gI/gE)-△gI/gE)。将获得的3株重组伪狂犬病毒在Vero细 胞上连续传20代，经PCR及测序验证3株重组伪狂犬病毒的稳定性，同时用间接免疫荧光 验证3株重组伪狂犬病毒的外源基因表达情况。结果表明：3株重组伪狂犬病毒，除了rPRV JS-2012-E2(△gI/gE)-△gI/gE不稳定外，其他两株重组伪狂犬病毒(rPRVJS-2012-△gI/gE+E2、 rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE)插入的猪瘟病毒E2蛋白在载体病毒PRV JS-2012-△gI/gE 中均能稳定且高效表达。生物学特性进一步表明：重组病毒rPRVJS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE与亲本病毒PRV JS-2012-△gI/gE基本相似。
1.1引物设计
根据PRV JS-2012株的全基因组序列(GENBANK号：KP257591)，用Oligo 6.0软件设计了多条引物(见表1)。JS+EGFP-LF/JS+EGFP-LR与JS+EGFP-RF/JS+EGFP-RR，用于来扩 增同源重组左臂与右臂，分别在左重组臂的前后两端加SacⅠ和AseⅠ酶切位点，在右重组臂 的前端加了EcoRⅤ和AflⅡ酶切位点，后端加了Xho Ⅰ酶切位点。PgGLF/PgGLR和 PgGRF/PgGRR为引物，PCR扩增gG编码区与其下游非编码区域作为E2转移载体的左、右重组 臂。以猪瘟病毒shimen株基因组cDNA为模板，以PgGE2F和PgGE2R引物，扩增出的2A-E2片 段。rPRV-E2up/rPRV-E2down用于扩增E2外源基因大小。
表1引物序列
Figure BDA0001699372180000081
1.2gG基因处含EGFP绿色荧光蛋白的重组PRV JS-2012-△gI/gE病毒的构建
用引物JS+EGFP-LF/JS+EGFP-LR与JS+EGFP-RF/JS+EGFP-RR，通过PCR的方法扩增出位 于PRV JS-2012基因组中119652至121157位碱基和121168至122680位碱基的两条片段，用作同 源重组的左、右重组臂。同时，通过内切酶酶切，从pEGFP-C3质粒中切出CMV启动子-EGFP 基因片段，从pEGFP-N1质粒中切出SV40polyA信号序列片段，并将左重组臂-CMV启动子 -EGFP基因-SV40polyA信号序列-右重组臂依序组装于pBluescript SK(+)载体中，获得了重组 转移载体pBG-GFP。
以PRV JS-2012-△gI/gE感染BHK-21细胞，待70％-80％的细胞病变，收集病变细胞， 以酚-氯仿法从感染细胞中提取PRV JS-2012-△gI/gE的总DNA。将PRV JS-2012-△gI/gE总 DNA与pBG-GFP共转染至BHK-21细胞，获得了重组病毒。将收的重组病毒做空斑纯化，经过4轮空斑纯化后，所获得的病毒接种vero细胞，产生的空斑均能表达EGFP(如图1)。 提示含EGFP绿色荧光蛋白的PRV JS-2012-△gI/gE病毒构建成功，并将该病毒命名为rPRVJS-2012-△gI/gE+EGFP。
1.3表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒疫苗候选株的构建
1.3.1gG基因处独立表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒疫苗候选株的构建
提取猪瘟病毒shimen株基因组，以反转录试剂盒(Primerscript RT Master Mix)进行反转录。 以rPRV-E2up和rPRV-E2down为引物，扩增出E2基因及其信号肽片段，并以NheI、XbaI进行 双酶切。酶切回收片段与NheI/XbaI酶切pBG-GFP质粒后获得大片段相连接，获得新的重组质 粒命名为pBG-E2。
参照1.2中的方法提取gG基因处含EGFP绿色荧光蛋白的重组PRV JS-2012-△gI/gE病毒 (rPRV JS-2012-△gI/gE+EGFP)的总DNA。将提取的总DNA与pBG-E2共转染至BHK-21细胞 中，通过4轮蚀斑纯化得到gG基因处独立表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒疫苗候选株， 通过荧光显微镜观察该重组病毒初步构建成功(图2)，并将所构建的重组病毒命名为：rPRV JS-2012-△gI/gE+E2。
1.3.2gG基因处融合表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒疫苗候选株的构建
以JS-2012-ΔgE/gI基因组为模板，分别以PgGLF/PgGLR和PgGRF/PgGRR为引物，PCR扩 增gG编码区与其下游非编码区域作为E2转移载体的左、右重组臂。以猪瘟病毒shimen株基因 组cDNA为模板，以PgGE2F和PgGE2R引物，扩增出的2A-E2片段。胶回收左重组臂、右重组 臂、2A-E2片段和经Eco RV酶切的pBluescript SK(+)载体，参照说明书以体外重组酶系统Gibson Assembly Master Mix将四片段连接，连接物转化TOP10感受态，并以SalⅠ和PstⅠ进行双酶切 鉴定，酶切阳性质粒进一步测序，获得E2转移载体pBgGE2。
参照1.2中的方法提取gG基因处含EGFP绿色荧光蛋白的重组PRV JS-2012-△gI/gE病毒 (rPRV JS-2012-△gI/gE+EGFP)的总DNA。将提取的总DNA与pBgGE2共转染至BHK-21细胞 中，通过6轮蚀斑纯化得到gG基因处融合表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒疫苗候选株， 通过荧光显微镜观察该重组病毒初步构建成功(图2)，并将所构建的重组病毒命名为：rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE。
1.3.3gE/gI基因缺失处独立表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒疫苗候选株的构建
提取猪瘟病毒shimen株基因组，以反转录试剂盒(Primerscript RT Master Mix)进行反转录。 以rPRV-E2up和rPRV-E2down为引物，扩增出E2基因及其信号肽片段，并以NheI、XbaI进行 双酶切。酶切回收片段与NheI/XbaI酶切pBIE-GFP(本实验室保存：见专利1.6。专利信息： 童光志、童武、郑浩、刘飞、梁超、周艳君、单同领、于海、姜一峰、高飞.伪狂犬病毒基因 缺失弱毒株及其制备方法和应用.申请号或专利号：201410002656.7)质粒后获得大片段相连 接，获得新的重组质粒命名为pBIE-E2。
参照1.2中的方法提取病毒PRV JS-2012-△gI/gE-EGFP(本实验室保存：见专利实施例2。 专利信息：童光志、童武、郑浩、刘飞、梁超、周艳君、单同领、于海、姜一峰、高飞.伪狂 犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用.申请号或专利号：201410002656.7)的总DNA。 将提取的总DNA与pBIE-E2共转染至BHK-21细胞中，通过4轮蚀斑纯化得到gE/gI基因缺失处 独立表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒疫苗候选株，通过荧光显微镜观察该重组病毒初 步构建成功(图2)，并将所构建的重组病毒命名为：rPRV JS-2012-E2(△gI/gE)-△gI/gE。
1.4三株重组病毒的插入外源基因E2的PCR鉴定及病毒滴度测定
用DNA提取试剂盒提取3株重组病毒的DNA，分别用rPRV-E2up/rPRV-E2down引物进行 PCR鉴定。PCR反应体系为20μL：10×LA-Taq BufferⅡ2ul；dNTP Mix(2.5mmol/L each)2ul； rPRV-E2up 0.5ul(10pmol/ul)；rPRV-E2down 0.5ul(10pmol/ul)；LA-Taq 0.5ul；ddH2O 12.5ul； 病毒的DNA 2ul。反应条件均为:94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸 1.5min，循环35次；最后于72℃延伸10min。PCR产物以1％的琼脂糖电泳，凝胶成像仪中 观察。PCR结果显示，3株重组病毒以rPRV-E2up/rPRV-E2down引物扩增出的片段大小与外 源基因序列大小相符(图3)。
将3株重组病毒接种分别Vero细胞，待80％细胞出现CPE时，收获病毒。参照文献(殷震 等，动物病毒学，科学出版社，1997),用96孔组织培养板方法测定3株重组病毒的滴度。将3 株重组病毒分别用含2％FBS的DMEM作10倍系列稀释后，分别将稀释的病毒接种96孔细胞培 养板上的Vero单层细胞。每稀释度接种8孔，设8孔对照(以含2％FBS的DMEM接种),置37℃ 5％的二氧化碳培养箱中培养，每天观察至接种后第4天，记录出现CPE的孔数，根据 Reed-Muench法计算TCID50。结果显示，rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG) -△gI/gE、rPRV JS-2012-E2(△gI/gE)-△gI/gE，3株重组毒在Vero细胞上的滴度分别为107.67 TCID50/ml、107.38TCID50/ml、107.5TCID50/ml。
1.5三株重组病毒的遗传稳定性验证
将3株重组病毒分别在Vero细胞上盲传20代，分别提取每代病毒的基因组，用rPRV-E2 up/rPRV-E2down引物分别进行E2外源基因扩增。结果显示：rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE两株重组病毒的各个代次病毒均扩增出了E2外源基因(图4、图5)； rPRV JS-2012-E2(△gI/gE)-△gI/gE病毒在第4代时E2外源基因出现了丢失(图6)。分别将 rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE两病毒传代病毒第1代(F1)、F5、 F10、F15和F20接种Vero细胞后，以E2蛋白单克隆抗体进行间接免疫荧光分析(IFA)。IFA 结果显示：rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE两病毒的F1、F5、F10、 F15、F20代病毒中的外源基因E2均高效表达(图7)。将rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE两病毒的第20代毒分别进行E2外源基因测序。测序结果显示：rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE两病毒的第20代毒的E2外源基因序列均 未见突变(图8)。上述结果表明：除了rPRV JS-2012-E2(△gI/gE)-△gI/gE不稳定外，其他 两株重组伪狂犬病毒(rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE)均具有 很好的遗传稳定性，且均能高效表达外源基因。
1.6rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病毒的生物学特性分析
以rPRV JS-2012-△gI/gE+E2病毒、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病毒和亲本毒都以1MOI 的毒量接种Vero细胞，分别在接毒后不同的时间点(4、8、12、16、20、24、28、32、36h) 收取细胞上清液，分别进行病毒的TCID50测定，根据测定结果绘制成曲线。结果显示rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE病毒和亲本毒PRV JS-2012-△gI/gE的生 长趋势基本一致(见图9)。
实施例2表达猪瘟病毒E2蛋白重组伪狂犬病毒疫苗候选株的安全性测定
为了测定实施例1中rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE两 株遗传稳定性好的重组病毒对仔猪的安全性,本研究分别将上述两株重组病毒以105.0TCID50/头的剂量，各接种5头阴性哺乳仔猪。结果显示：两株重组病毒接种组与空白对 照组无差异，均无体温升高，无临床症状发生，剖检观察显示各组织脏器正常。根据以上 结果rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE两株重组病毒对哺乳仔 猪均安全。
2.1病毒
rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE均第5代细胞毒，病毒滴度分别为108.0TCID50/ml、107.5TCID50/ml。
2.2动物试验
15头15日龄PRV、CSFV、PRRSV、PCV2抗原和PRV、CSFV抗体均为阴性的健康 哺乳仔猪，随机分成三组。第一组5头猪接种rPRV JS-2012-△gI/gE+E2第5代细胞毒， 剂量为105.0TCID50/头，第二组5头猪接种rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE第5代细胞毒， 剂量为105.0TCID50/头，第三组5头猪作为对照组不进行接种。免疫后监测体温，观察临 床状态，免疫后14天剖杀仔猪，进行眼观病理变化观察。
2.3临床症状
两株重组病毒接种组在接种后在整个观察期内生长正常，无发烧、厌食等临床症状(表 2)。体温方面，两株重组病毒接种组与对照组均无发热现象(图10)。剖检方面，剖检结果 显示各组织脏器无病变(图11)。
表2rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE分别接种仔猪后不同时间的临床记录
Figure BDA0001699372180000121
a为体温大于或等于40.5℃的天数。
实施例3表达猪瘟病毒E2蛋白重组伪狂犬病毒疫苗候选株对猪瘟病毒强毒株的保护 效果
为了测定实施例1中rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-ΔgI/gE两株遗 传稳定性好的重组病毒对猪瘟强毒株的保护效果，本研究以rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-ΔgI/gE疫苗候选株分别免疫试验猪后，用猪瘟病毒强毒株shimen株进行 攻毒。结果显示：猪瘟病毒强毒株(shimen株)攻毒后，rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2疫苗免疫 组：整个监测期内，试验猪未见明显体温升高和其他临床症状，获得100％的保护。rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE疫苗免疫组：整个监测期内，虽然没有试验猪死亡，但在攻毒后 的第4～7天，试验猪出现发热情况(体温41℃以上)，血清和鼻拭子分别在5～7天和5～9 天均检出高拷贝的病毒RNA。而空白对照组：攻毒后第3天，体温开始升高，并持续高温(41℃ 以上)10～12天，所有猪表现出精神沉郁、厌食，并可以观察到明显的鼻孔流血；在攻毒后 第13、14、15天，分别死亡2、1、2头试验猪；血清和鼻拭子分别在3天和5天开始均检出 高拷贝的病毒RNA，死亡率为100％。
3.1病毒
rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE均第5代细胞毒，病毒滴度分别为108.0TCID50/ml、107.5TCID50/ml。猪瘟病毒强毒株(shimen株)第1代细胞毒， 病毒滴度107.5TCID50/ml。
3.2动物试验
15头4周龄PRV、CSFV、PRRSV、PCV2抗原和PRV、CSFV抗体均为阴性的健康 断奶仔猪，随机分成三组。第一组5头猪接种rPRV JS-2012-△gI/gE+E2第5代细胞毒， 剂量为105.0TCID50/头，第二组5头猪接种rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE第5代细胞毒， 剂量为105.0TCID50/头，第三组5头猪作为对照组不进行接种。待免疫后第28日，所有试 验猪，均耳后肌肉注射接种2ml含106.5TCID50的猪瘟病毒强毒株(shimen株)，攻毒后 每天观察试验猪的临床症状、测温并采集血液及鼻拭子，连续监测21天。
3.3临床症状
猪瘟病毒强毒株(shimen株)攻毒后，rPRV JS-2012-△gI/gE+E2疫苗免疫组：整个监 测期内，试验猪未见明显体温升高和其他临床症状，获得100％的保护。rPRV JS-2012-E2(gG) -△gI/gE疫苗免疫组：整个监测期内，虽然没有试验猪死亡，但在攻毒后的第4～7天，试验 猪出现发热情况(体温41℃以上)，血清和鼻拭子分别在5～7天和5～9天均检出高拷贝的 病毒RNA。而空白对照组：攻毒后第3天，体温开始升高，并持续高温(41℃以上)10～12 天，所有猪表现出精神沉郁、厌食，并可以观察到明显的鼻孔流血；在攻毒后第13、14、15天，分别死亡2、1、2头试验猪；血清和鼻拭子分别在3天和5天开始均检出高拷贝的病毒RNA，死亡率为100％。(图12、图13、图14、图15)。
实施例4表达猪瘟病毒E2蛋白重组伪狂犬病毒疫苗候选株对伪狂犬病病毒强毒株的保 护效果
为了测定实施例3中，遗传稳定性好且对猪瘟病毒强毒株免疫保护效果强的疫苗候选株 (rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2)，对伪狂犬病病毒强毒株的保护效果，本研究以rPRVJS-2012-ΔgI/gE+E2疫苗候选株免疫试验猪后，用伪狂犬病病毒强毒株JS-2012株进行攻毒。 结果显示：伪狂犬病病毒强毒株(JS-2012株)攻毒后，rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2疫苗免疫组： 整个监测期内，试验猪除了出现短暂的体温升高外，未见其他明显临床症状，获得100％的保 护。而空白对照组：在攻毒后第2～3天，体温升高到41℃以上，高温持续3～7天，所有猪 表现出精神沉郁、厌食，并可以观察到明显的神经症状(如共济失调、转圈等)，在攻毒后第 7、9天各死亡1头试验猪，发病率为100％。
3.1病毒
表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒疫苗候选株(rPRV JS-2012-△gI/gE+E2)第 5代细胞毒，病毒滴度108.0TCID50/ml。伪狂犬病病毒强毒株(JS-2012株)第5代细胞毒，病毒滴度107.37TCID50/ml。
3.2动物试验
10头4周龄PRV、CSFV、PRRSV、PCV2抗原和PRV、CSFV抗体均为阴性的健康 断奶仔猪，随机分成二组。第一组5头猪均接种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒 活载体疫苗(rPRV JS-2012-△gI/gE+E2株)第5代细胞毒，105.0TCID50/头，第二组5头 作为对照组不进行接种。待免疫后第28日，所有试验猪均滴鼻接种2ml含105.0TCID50的猪伪狂犬病病毒强毒株(JS-2012株)，攻毒后每天观察试验猪的临床症状并测温，连 续监测14天。
3.3临床症状
猪伪狂犬病病毒强毒株(JS-2012株)攻毒后，rPRV JS-2012-△gI/gE+E2疫苗免疫组： 整个监测期内，试验猪除了出现短暂体温升高外，正常进食，未见其他临床症状，获得100％的保护。而空白对照组：在攻毒后第2～3天，体温升高到41℃以上，高温持续3～ 7天，所有猪表现出精神沉郁、厌食，并可以观察到明显的神经症状(如共济失调、转圈 等)，在攻毒后第7、9天各死亡1头试验猪，发病率为100％(图16、图17)。
通过上述实施例，获得了表达E2的三株重组伪狂犬病毒rPRV JS-2012-△gI/gE+E2、rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE和rPRV JS-2012-E2(△gI/gE)-△gI/gE。通过体外遗传稳定性分 析，发现rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE具有良好的稳定性， 而rPRV JS-2012-E2(△gI/gE)-△gI/gE出现缺失。接种仔猪，rPRV JS-2012-△gI/gE+E2和 rPRV JS-2012-E2(gG)-△gI/gE均表现出良好的安全性。免疫仔猪，rPRV JS-2012-E2(gG) -△gI/gE对猪瘟强毒攻击呈现部分保护效果，而rPRV JS-2012-△gI/gE+E2对猪瘟强毒和PRV 变异株强毒均呈现完全保护效果。这表明，rPRV JS-2012-△gI/gE+E2具有良好的遗传稳定性 和安全性，对猪瘟强毒和PRV变异株强毒攻击均能提供完全保护，能用于开发高效的猪瘟- 伪狂犬二联苗。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而 理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株及其制备方法和应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1945
<212> DNA
<213> 表达猪瘟病毒E2蛋白的外源序列
<400> 1
TAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCC
GCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTT
TCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACG
CCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTG
GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGT
TTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTT
CCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGC
TGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCGCTAGCATGGCATTCCTCATCTGCTTGATAAAAGTATTAAGAGGACAGATCGTGC
AAGGTGTGATATGGCTGCTACTAGTAACAGGGGCACAAGGCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCA
TCAACCAATGAGATAGGGCTACTCGGGGCCGGAGGTCTCACTACCACCTGGAAAGAATACAGCCACGATTTGCAACTGAA
TGACGGGACCGTTAAGGCCATTTGCGTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGG
CATCATTGCATAAGGGGGCTTTACTCACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACCGAAGAA
ATGGGAGATGACTTCGGGTTCGGGCTGTGCCCGTTTGATACGAGTCCTGTTGTCAAGGGAAAGTACAATACAACCTTGTT
GAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTCTGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTTATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTC
TGAGAACAGAAGTGGTGAAGACCTTCAGGAGAGAGAAGCCTTTTCCACACAGAATGGATTGTGTGACCACCACAGTGGAA
AATGAAGATCTATTCTACTGTAAGCTGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGTGAACCAGTGGTCTACACAGGGGGGCA
AGTAAAACAATGCAAATGGTGTGGCTTCGACTTCAACGAGCCTGACGGACTCCCACACTACCCCATAGGTAAGTGCATTT
TGGCAAATGAGACAGGTTACAGAATAGTAGATTCAACGGACTGCAACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCGCGAAGGGGAGC
CATGAGTGCTTGATCGGCAACACAACTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCCAA
AGAGATTGTCTCTAGTGCAGGACCTGTAAGGAAAACTTCCTGTACATTCAACTACGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTACT
ATGAGCCCAGGGACAGTTACTTCCAGCAATATATGCTCAAGGGCGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGACGTGACAGAC
CGCCACTCAGATTACTTCGCAGAATTTTGATCTAGACTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTG
CTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCA
GCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG
TTTGTCCAAACTCATCAATGTATCT
<210> 2
<211> 1131
<212> DNA
<213> 猪瘟病毒E2蛋白信号肽及编码猪瘟病毒E2蛋白第1-342位氨基酸的核苷酸
<400> 2
GCTAGCATGGCATTCCTCATCTGCTTGATAAAAGTATTAAGAGGACAGATCGTGCAAGGTGTGATATGGCTGCTACTAGT
AACAGGGGCACAAGGCCGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTACAGGTACGCAATATCATCAACCAATGAGATAGGGCTACTCG
GGGCCGGAGGTCTCACTACCACCTGGAAAGAATACAGCCACGATTTGCAACTGAATGACGGGACCGTTAAGGCCATTTGC
GTGGCAGGTTCCTTTAAAGTCACAGCACTTAATGTGGTCAGTAGGAGGTATTTGGCATCATTGCATAAGGGGGCTTTACT
CACTTCCGTGACATTCGAGCTCCTGTTCGACGGGACCAACCCATCAACCGAAGAAATGGGAGATGACTTCGGGTTCGGGC
TGTGCCCGTTTGATACGAGTCCTGTTGTCAAGGGAAAGTACAATACAACCTTGTTGAACGGTAGTGCTTTCTATCTTGTC
TGCCCAATAGGGTGGACGGGTGTTATAGAGTGCACAGCAGTGAGCCCAACAACTCTGAGAACAGAAGTGGTGAAGACCTT
CAGGAGAGAGAAGCCTTTTCCACACAGAATGGATTGTGTGACCACCACAGTGGAAAATGAAGATCTATTCTACTGTAAGC
TGGGGGGCAACTGGACATGTGTGAAAGGTGAACCAGTGGTCTACACAGGGGGGCAAGTAAAACAATGCAAATGGTGTGGC
TTCGACTTCAACGAGCCTGACGGACTCCCACACTACCCCATAGGTAAGTGCATTTTGGCAAATGAGACAGGTTACAGAAT
AGTAGATTCAACGGACTGCAACAGAGATGGCGTTGTAATCAGCGCGAAGGGGAGCCATGAGTGCTTGATCGGCAACACAA
CTGTCAAGGTGCATGCATCAGATGAAAGACTGGGCCCTATGCCATGCAGACCCAAAGAGATTGTCTCTAGTGCAGGACCT
GTAAGGAAAACTTCCTGTACATTCAACTACGCAAAAACTTTGAAGAACAAGTACTATGAGCCCAGGGACAGTTACTTCCA
GCAATATATGCTCAAGGGCGAGTATCAGTACTGGTTTGACCTGGACGTGACAGACCGCCACTCAGATTACTTCGCAGAAT
TTTGATCTAGA
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> JS+EGFP-LF
<400> 3
CGAGCTCGCGACCGACGCCCAGCCCGTGAACC
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> JS+EGFP-LR
<400> 4
CATTAATAACTAGGACCGCTGGGCGTGGATCGCACCC
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> JS+EGFP-RF
<400> 5
CAGCTTAAGGGTCGGCGCCCCAGGTTCCCATAC
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> JS+EGFP-RR
<400> 6
CCGCTCGAGCAGCTCCACGCGCCCGCTGTAGTT
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> rPRV-E2 up
<400> 7
GCTAGCATGGCATTCCTCATCTGCTT
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> rPRV-E2 down
<400> 8
TCTAGATCAAAATTCTGCGAAGTAAT
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> PgGLF
<400> 9
GACGGTATCGATAAGCTTGATGACCGACGCCCAGCCCGTGAACC
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> PgGLR
<400> 10
TCACGGGCGCGCGCTTGGCGCGGGCGGAGGCCACGTGGCGGT
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> PgGRF
<400> 11
GAATTTTGATGACCCGGCCCCGCCCGACTCC
<210> 12
<211> 64
<212> DNA
<213> PgGRR
<400> 12
CGCTGGCAGGTGAGTGTATGGCCGGGCTGCAGGAATTCGATACAGCTCCACGCGCCCGCTGTAG
<210> 13
<211> 96
<212> DNA
<213> PgGE2F
<400> 13
CGCGCCAAGCGCGCGCCCGTGAAGCAGACGCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCGGGCGACGTGGAGTCGAAATGGCATTCCTCATCTGCTTGA
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> PgGE2R
<400> 14
CGGGGCCGGGTCATCAAAATTCTGCGAAGTAATCTGAG

Claims (3)

1.一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒株，其特征在于，该重组伪狂犬病毒株在伪狂犬病毒疫苗株JS-2012-ΔgI/gE基因组gG和gD基因之间插入了CMV启动子控制下猪瘟病毒E2基因表达框的外源序列，其中所插入的外源序列包括：CMV启动子序列、猪瘟病毒E2蛋白信号肽编码序列、猪瘟病毒E2基因序列、SV40poly A序列，该插入的外源序列为SEQID NO.1所示的核苷酸序列；所述病毒株的分类命名：伪狂犬病病毒rPRV JS-2012-ΔgI/gE+E2Pseudorabies virus rPRV JS-2012-△gI/gE+E2，于2018年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:V201822。
2.如权利要求1所述的一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒株，其中所述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株的制备方法为：
(1)构建重组载体，所述重组载体包含伪狂犬病毒JS-2012-ΔgI/gE株gG基因和gD基因的部分序列，其中不包含权利要求1中所述的猪瘟病毒基因序列，所述重组载体还包含有EGFP荧光标记基因；
(2)提取伪狂犬病毒JS-2012-ΔgI/gE株总DNA，将该总DNA与步骤(1)的重组载体共转染细胞，获得含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒；
(3)构建重组载体，所述重组载体包含伪狂犬病毒JS-2012-ΔgI/gE株gG基因和gD基因的部分序列，其中包含权利要求1中所述的猪瘟病毒基因序列，所述重组载体不包含EGFP荧光标记基因；
(4)提取步骤(2)获得的重组伪狂犬病毒的总DNA，将该总DNA与步骤(3)的重组载体共转染细胞，获得不包含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒，该重组伪狂犬病毒即为表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株。
3.权利要求1所述的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病毒毒株在制备预防或治疗伪狂犬病及猪瘟的疫苗中的应用。
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Yimin Wang等.Generation and Efficacy Evaluation of a Recombinant Pseudorabies Virus Variant Expressing the E2 Protein of Classical Swine Fever Virus in Pigs.《Clin Vaccine Immunol》.2015,第22卷(第10期), *

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