CN104894076A - 表达猪瘟病毒e2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其应用，属于伪狂犬病病毒变异株的构建及应用领域。本发明以gE/gI双基因缺失重组病毒rPRVTJ-delgE/gI为基础，在rPRVTJ-delgE/gI中插入猪瘟病毒E2基因，对所获得的重组病毒克隆最终筛选出一株复制特性好、稳定性好、外源蛋白表达量高的重组病毒株rPRVTJ-delgE/gI-E2，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10411。本发明重组病毒株rPRVTJ-delgE/gI-E2具有良好的安全性和免疫原性，免疫仔猪后能够对PRV及CSFV的攻击提供完全保护，能够应用于制备预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的疫苗或试剂。

Description

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其应用

技术领域

本发明涉及伪狂犬病病毒变异株，尤其涉及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株，本发明还涉及所述重组伪狂犬病病毒变异株在制备预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的疫苗或试剂中的用途，属于伪狂犬病病毒变异株的构建及应用领域。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床上主要以高热稽留、广泛性出血和高死亡率为主要特征(Moennig,2000)。猪瘟被世界动物卫生组织(OIE)列入OIE疫病名录(OIE-listed diseases)，为须申报的(notifiable)动物性传染病，在中国CSF被列为“一类动物疫病”。该病呈世界范围内流行，对养猪业危害严重，造成巨大的经济损失。

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)又称奥耶茨基氏病，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪、羊、牛等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎、呼吸和神经系统障碍为主要特征的急性传染病(Mettenleiter et al.,2008)。

在PRV基因中缺失一个或多个病毒复制非必需基因，可以使病毒毒力减弱，但同时又不影响自身的增殖和免疫原性，这样以PRV作为载体携带其他外源抗原基因进入生物体内，不仅可以刺激机体产生对PRV的免疫反应，同时也可以产生对外源抗原的免疫应答。因此，这些基因缺失的PRV常常用来作为载体来表达外源基因，从而构建多价疫苗(路明华,路迎迎,王宏俊.伪狂犬病病毒载体疫苗研究进展.动物医学进展.2013；34(6):136-140)。因此，开发一种安全有效的预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的新型PRV病毒活载体多价疫苗极具应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株，该变异株稳定性好，外源蛋白表达水平高，具有良好的安全性和免疫原性，能够用于制备预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的疫苗或试剂。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明以分离的伪狂犬病流行毒株(TJ株)构建了gE/gI双基因缺失的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI，以此为基础，以CSFV强毒Shimen株E2蛋白为模式抗原，在rPRVTJ-delgE/gI中插入CSFV的主要保护性抗原E2基因，并对所获得的重组病毒进行了进一步的克隆，筛选出一株复制特性好、稳定性好、外源蛋白表达量高的重组伪狂犬病病毒变异株rPRVTJ-delgE/gI-E2。

本发明将获得的重组伪狂犬病病毒变异株rPRVTJ-delgE/gI-E2提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10411；分类命名为：表达猪瘟病毒E2蛋白的重组变异株伪狂犬病病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2015年03月19日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明进一步公开了所述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株的构建方法，包括以下步骤：(1)构建含有猪瘟病毒E2基因的转移载体；(2)将经酶切处理的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-EGFP-Neo基因组和步骤(1)构建的转移载体共转染动物细胞，收获病毒，筛选，纯化，即得。

本发明以特异引物对分别扩增CMV片段和CSFV E2片段，再经融合PCR获得CMV-E2片段。然后将CMV-E2片段克隆至pOK-LR载体上，获得转移载体pOK-LR-CMV-E2。本发明进一步将经酶切处理(经PacⅠ和PmeⅠ双酶切处理)的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-EGFP-Neo基因组和pOK-LR-CMV-E2质粒共转染Vero细胞，收获转染细胞产物，反复冻融后，取上清接种PK-15细胞，进行蚀斑筛选，挑取有细胞病变但不发绿色荧光的蚀斑。进一步对获得的重组病毒进行蚀斑纯化，随机挑取10个克隆，对每个克隆连续传20代后，经PCR鉴定，猪瘟病毒E2蛋白基因仍然存在于所有病毒株的基因组中，对每个毒株所扩增的E2基因测序结果均与理论序列一致，说明外源基因可以稳定存在于重组病毒中。IFA结果显示，重组病毒不同克隆株接种PK-15细胞后都能够表达猪瘟病毒E2蛋白，在蛋白表达量上不同毒株之间有一定的差异。流式细胞仪分析不同病毒株表达蛋白的平均荧光强度，结果显示，有一株病毒表达外源蛋白的荧光强度要明显高于其它毒株(p<0.05)，命名为rPRVTJ-delgE/gI-E2。

本发明将CMV启动子置于E2基因的上游，而没有使用PRV本身的启动子，这大大能够增加外源蛋白的表达量。在构建方法上，采用了指示病毒反向筛选与引入单一酶切位点相结合的方法，大大加快了重组病毒的获得与纯化。本发明经过6轮的蚀斑筛选就获得了目的病毒。

Western blot分析显示，重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2插入的外源片段CSFV E2基因能够正确的进行表达。一步生长曲线绘制结果显示，重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2与亲本毒PRV TJ株的一步生长曲线走势基本相符，说明外源片段CSFV E2的插入对病毒本身的增殖无影响；但重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2的滴度比亲本病毒PRV TJ株低约10¹ _. ⁷⁵，在接毒后10-16h二者病毒滴度具有显著性差异(p<0.05)。

本发明重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2能够应用于制备预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的疫苗或试剂。

本发明进一步公开了一种预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的疫苗组合物，包括：免疫有效量的表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株rPRVTJ-delgE/gI-E2和药学上可接受的佐剂。

对靶动物猪的致病性及免疫原性实验结果表明，重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2具有良好的安全性和免疫原性，免疫仔猪后能够对PRV及CSFV的攻击提供完全的保护。

rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪针对PRV TJ株的攻毒保护实验结果表明：免疫后6d，不同剂量的rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫组个别猪PRV gB抗体转为阳性，攻毒后gB抗体滴度迅速升高，至攻毒后6d达到较高的水平，随后gB抗体水平趋于平稳。PRV gE抗体检测结果显示，对于不同剂量rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪，仅10⁴TCID₅₀免疫组有2头猪于攻毒后15d才发生gE抗体阳转，其它剂量免疫猪均没有产生gE抗体。在攻毒后6d，不同剂量rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪检测到了针对PRV TJ株的中和抗体的产生，随后逐渐升高，高剂量免疫猪的中和抗体滴度要高于低剂量免疫组。攻击PRV TJ株后，rPRVTJ-delgE/gI-E2不同剂量免疫猪均没有出现任何临床症状，仅10⁴TCID50rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫组有1头猪出现排毒。

rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪针对CSFV的攻毒保护实验结果表明：以不同剂量的rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫仔猪后，最高剂量(10⁶TCID₅₀)一次免疫组于免疫后4w有2头猪CSFV特异性抗体转阳，至攻毒前该组所有猪的猪瘟抗体均发生阳转；rPRVTJ-delgE/gI-E2两次免疫组(10⁵或10⁴TCID₅₀免疫组)于加强免疫后CSFV特异性抗体逐渐升高，攻毒后所有免疫猪抗体迅速上升，并于攻毒后9d达到峰值，抗体阻断率达到80％左右。攻毒后免疫猪产生的CSFV中和抗体迅速上升，于攻毒后9d达到较高水平。CSFV攻击后，不同剂量rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫组所有猪均没有出现发热及猪瘟特异性的临床症状，均没有检测到CSFV核酸的存在。对存活猪进行剖检和病理解剖学观察，不同剂量免疫猪均没有出现明显的病理变化，而PBS对照组出现明显的猪瘟特征性病变。

在对CSFV的攻毒保护评价上，rPRVTJ-delgE/gI-E2以10⁶TCID₅₀剂量一次免疫或以10⁵TCID₅₀或10⁴TCID₅₀剂量两次免疫即可对CSFV强毒的攻击提供完全的攻毒保护，即使在攻毒之前没有检测到猪瘟特异性的抗体或抗体滴度较低的猪在攻击CSFV之后也没有出现任何临床反应和病理变化，而且在攻毒之后猪瘟特异性抗体迅速上升，提示产生了免疫记忆反应。究其原因可能与非特异性的细胞免疫反应有关，有研究显示，PRV作为疫苗载体构建的重组病毒免疫动物后能够诱导非常强的细胞免疫反应，这对抵抗病毒的攻击也起到非常重要的作用。

重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2对非靶动物小鼠的致病力试验结果表明，接种后小鼠没有出现任何PRV特异性的临床反应，观察期内没有出现死亡，剖检后在脑组织中也没有检测到PRV核酸，小鼠各器官均没有发生任何变化，剖检变化上与PBS对照组无明显差异。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明以PRV双基因缺失病毒rPRVTJ-delgE/gI为载体构建、筛选出一株复制特性好、稳定性好、外源蛋白表达量高的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2。对靶动物猪的致病性及免疫原性实验结果表明，重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2具有良好的安全性和免疫原性，免疫仔猪后能够对PRV及CSFV的攻击提供完全的保护。以上实验结果证明rPRVTJ-delgE/gI能够作为一种安全有效的活病毒载体来构建多价疫苗。本发明重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2能够应用于制备预防或治疗猪瘟和/或伪狂犬病的疫苗或试剂。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。

术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。

附图说明

图1为重组病毒不同克隆株的PCR鉴定；其中，1-10：重组病毒不同克隆株；11：CSFV对照；12：PK-15细胞对照；13：H₂O对照；M：DL2000；

图2为重组病毒不同克隆株的IFA鉴定；

图3为重组病毒不同克隆株表达外源蛋白的荧光强度检测；

图4为重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2的Western blot鉴定；

图5为重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2的一步生长曲线；

图6为rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪产生的PRV gB特异性抗体；

图7为rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪攻毒后产生的PRV gE特异性抗体；

图8为rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪产生的CSFV E2特异性抗体。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、质粒、载体、病毒和生化试剂

质粒pOK-LR(含有同源重组左右臂的质粒载体)、pShuttle-E2(含有CSFV E2基因的质粒)和pEGFP-N1(含有CMV启动子的质粒)均由本发明人实验室构建及保存；重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-EGFP-Neo由本发明人实验室构建(Wang CH,Yuan J,Qin HY,Luo Y,Cong X,Li Y,ChenJ,Li S,Sun Y,Qiu HJ.A novel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRVvariant emerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China.Vaccine.2014；32(27):3379-85.)；PK-15和Vero细胞由本发明人实验室保存；高保真聚合酶Primer STAR及rTaq、限制性内切酶MluI均为TaKaRa公司产品；转染试剂X-treme GENE HP购自罗氏公司；Tissue DNA Kit试剂盒(批号D3396-01)为Omega公司产品。

实施例1重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2的拯救与筛选

1、实验方法

1.1转移载体pOK-LR-CMV-E2的构建

以质粒pEGFP-N1为模板，以P1S/P1R为引物对(表1)扩增CMV片段；以pShuttle-E2为模板，P2S/P2R为引物对(表1)扩增CSFV E2片段，再以CMV和E2为模板，P1S/P2R为引物对经融合PCR扩增CMV-E2片段。将CMV-E2片段纯化后连接至pMD18-simple载体，测序鉴定正确后用MluI酶切后回收目的片段，将其克隆至经MluI酶切和磷酸化处理的pOK-LR载体上，酶切及测序鉴定正确的阳性克隆命名为pOK-LR-CMV-E2。

表1引物名称及序列

1.2重组病毒的获得

将1μg的rPRVTJ-delgE/gI-EGFP-Neo基因组(经PacⅠ和PmeⅠ双酶切处理)和7μg的pOK-LR-CMV-E2质粒共转染至密度为70％～80％的单层Vero细胞。当转染48～72h后观察到细胞病变时收获转染细胞产物，于-80℃/37℃条件下反复冻融3次后，离心取上清接种PK-15细胞，进行蚀斑筛选，挑取有细胞病变但不发绿色荧光的蚀斑。

1.3重组病毒的筛选

为了获得外源蛋白表达量高、复制特性及遗传稳定性好的重组病毒株，对获得的重组病毒进行蚀斑纯化，随机挑取10个克隆，于80℃/37℃条件下反复冻融3次后，离心取上清接种PK-15细胞，如此反复传20代，然后对不同的病毒株进行PCR、免疫荧光试验(Immunofluorescence assay,IFA)、流式细胞术分析。

1.3.1PCR

将随机挑取的10个毒株于-80℃/37℃条件下反复冻融后，在PK-15细胞上连续传20代，分别收集每个毒株的第20代病毒接种PK-15细胞后的细胞培养产物，提取组织DNA，再以P2S/P2R引物对扩增CSFV E2片段，并对扩增片段进行测序分析，检测病毒基因组中插入的E2基因在传代过程中是否稳定存在。

1.3.2IFA

将挑取的不同重组病毒株，以0.1MOI剂量感染PK-15细胞，24h后弃上清，用4℃预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞2次，然后用-20℃预冷的无水乙醇固定细胞20min，加入CSFV E2蛋白的单克隆抗体HQ06，37℃作用2h后用PBS和含0.05％Tween 20的PBS(PBST)分别洗涤3次，加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG(Sigma公司)，置于湿盒中37℃作用45min，用PBS/PBST分别洗涤3次后，置于倒置荧光显微镜下观察，分析CSFV E2蛋白的表达情况。

1.3.3不同毒株间外源蛋白表达量的比较

将随机挑取的10个毒株于-80℃/37℃条件下反复冻融后，在PK-15细胞上连续传20代，用流式细胞术分析将每个毒株蛋白表达量的差异。方法如下：1)将每个毒株的第20代病毒以1MOI剂量接种PK-15细胞，12h后弃培养液上清，用胰酶消化细胞，并用300目铜网进行过滤，分散细胞。2)用预冷的PBS洗细胞3次，离心弃上清，加入CSFV E2蛋白的单克隆抗体HQ06(1:1000稀释)500μL，37℃作用2h后用预冷的PBS洗涤3次，加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG 500μL，37℃作用1h后用预冷的PBS洗涤3次。最后用500μL预冷的PBS重悬细胞。3)将所有细胞用流式细胞仪分析表达荧光蛋白细胞的比例及强度，用以评价不同毒株之间的表达量差异。

1.4统计学分析

应用SPSS统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异。其中，p≥0.05为差异不显著，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。

2、实验结果

将rPRVTJ-delgE/gI-EGFP-Neo基因组与转移载体pOK-LR-CMV-E2共转染Vero细胞，2d后大量的细胞出现病变，荧光显微镜下观察到大多数的病变细胞发出绿色荧光，只有少数的病变细胞没有绿色荧光，将此细胞培养物反复冻融3次后，在PK-15细胞上进行6轮蚀斑筛选，直至筛选出的病毒蚀斑接种PK-15细胞后，视野内存在细胞病变且无绿色荧光。

为了获得外源蛋白表达量高、复制特性及遗传稳定性好的毒株，对获得的重组病毒又进行一轮蚀斑纯化，随机挑选了10个克隆，对每个克隆连续传20代后，经PCR鉴定，猪瘟病毒E2蛋白基因仍然存在于所有病毒株的基因组中(图1)，对每个毒株所扩增的E2基因测序结果均与理论序列一致，说明外源基因可以稳定存在于重组病毒中。

IFA结果显示，重组病毒不同克隆株接种PK-15细胞后都能够表达猪瘟病毒E2蛋白，在蛋白表达量上不同毒株之间有一定的差异，其中1号克隆株的猪瘟病毒E2蛋白的表达量最高(图2)，将1号克隆株命名为rPRVTJ-delgE/gI-E2。

将不同克隆株以相同的剂量接种PK-15细胞，感染12h后，先后加入CSFV E2蛋白的单克隆抗体HQ06及FITC标记的羊抗鼠IgG，然后用流式细胞仪分析不同病毒株表达蛋白的平均荧光强度，结果显示，1号克隆株(命名为rPRVTJ-delgE/gI-E2)表达外源蛋白的荧光强度要明显高于其它毒株(p<0.05)(图3)。

本发明将重组病毒株rPRVTJ-delgE/gI-E2提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.10411。

实施例2重组病毒株rPRVTJ-delgE/gI-E2的鉴定

1、实验方法

1.1Western blot分析

将实施例1筛选到的重组病毒株rPRVTJ-delgE/gI-E2(微生物保藏编号为：CGMCC No.10411)以0.1MOI剂量感染PK-15细胞，36h后弃上清，用4℃预冷的PBS清洗细胞2次，然后经WB/IP细胞裂解液冰上作用1h，收集细胞裂解产物，4℃条件下12,000r/min离心20min，收集上清后加入适量比例的上样缓冲液，煮沸10min后进行SDS-PAGE电泳，以针对CSFV E2的单克隆抗体HQ06检测E2蛋白的表达情况。

1.2一步生长曲线

将实施例1筛选到的重组病毒株rPRVTJ-delgE/gI-E2与rPRVTJ-delgE/gI及亲本毒PRV TJ株以10MOI的剂量接种24孔细胞培养板中单层的PK-15细胞，于冰上感作1h后，换成细胞维持液于37℃温箱中培养1h，使用酸溶液灭活细胞外病毒(Mettenleiter,1989)，分别于接种病毒后0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、32h、36h和42h收取细胞及培养上清，并于37℃/-80℃条件下反复冻融2次后离心弃去细胞碎片，接种于PK-15细胞，进行毒价测定。重复3次，计算平均值和标准差，绘制一步生长曲线，比较该重组病毒与亲本病毒在生长动力学上是否存在差异。

1.3统计学分析

应用SPSS统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异。其中，p≥0.05为差异不显著，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。

2、实验结果

2.1Western blot分析

为了进一步鉴定筛选到的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2中E2的表达情况，以0.1MOI剂量接种PK-15细胞，36h后收集并处理样品，使用HQ06单克隆抗体进行Western blot分析。结果显示，重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2样品泳道检测到一条特异性条带，并且大小与阳性对照相符(图4)。结果表明，重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2插入的外源片段CSFV E2基因能够正确的进行表达。

2.2一步生长曲线

将获得的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2与rPRVTJ-delgE/gI及其亲本毒PRV TJ株接种PK-15细胞，于不同时间点收毒，并测定其毒价，绘制各自一步生长曲线(即病毒增殖滴度与时间关系的曲线，反映病毒生长增殖规律)，进行对比。结果显示，重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2与亲本毒PRV TJ株的一步生长曲线走势基本相符，说明外源片段CSFV E2的插入对病毒本身的增殖无影响；但重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2的滴度比亲本病毒PRV TJ株低约10^1.75，在接毒后10-16h二者病毒滴度具有显著性差异(p<0.05)(图5)。

实施例3重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2对靶动物猪的致病性及免疫原性

1、实验方法

1.1免疫与攻毒

选取CSFV和PRV抗原及抗体均为阴性的5周龄健康仔猪30头，随机分成6组，每组5头，试验设计见表2。前3组分别经颈部肌肉接种不同剂量(10⁶、10⁵、10⁴TCID₅₀)的实施例1筛选的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2(微生物保藏编号为：CGMCC No.10411)，第4和第5组接种PBS分别作为攻击PRV TJ株及CSFV石门(Shimen)株的对照，第6组接种1头份的猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)，其中第5、6组饲养在独立的感染舍中。免疫后1w，前4组所有猪用PRV TJ株进行攻击，攻毒剂量为10³LD₅₀/头，接种途径为颈部肌肉，观察15d后，对10⁵TCID₅₀或10⁴TCID₅₀剂量免疫组及C株疫苗免疫组所有猪进行加强免疫，免疫剂量及途径同初次免疫。加强免疫后2w，所有猪(包括第5、6组对照猪)用CSFV Shimen株进行攻击，攻毒剂量为10⁵MLD(minimal lethal dose，MLD)，攻毒后15d对所有存活猪进行安乐死，并对各组织器官进行病变观察及病理组织学检查；免疫及攻毒后每天对所有猪进行体温测定，并对临床反应进行观察。

表2猪只免疫攻毒试验设计

注：免疫及攻毒途径均为颈部肌肉；间隔时间指距离首免的时间。

1.2阻断ELISA及病毒中和试验

免疫前、免疫后及攻毒后每3d，对所有猪前腔静脉采血，分离血清。应用PRV gB(IDEXX公司，批号DJ358)、gE(IDEXX公司，批号CJ291)及猪瘟抗体检测试剂盒(IDEXX公司，批号C281)进行抗体检测，具体操作方法见说明书。同时用病毒中和试验检测各时间点血清中的中和抗体。

1.3排毒检测

于免疫前、免疫后及攻毒后每天采集所有猪的鼻拭子和肛拭子，用PBS稀释后，按每毫升加入1000IU青霉素和1000μg链霉素，经0.45μm滤器过滤后接种于PK-15细胞，观察细胞病变，如果第一代没有细胞病变则盲传3代，然后用OMEGA Tissue DNA Kit提取基因组后，用扩增gE基因的特异性引物检测PRV的存在。

1.4荧光定量RT-PCR

攻CSFV 15d后，对所有存活猪进行安乐死，采集所有试验猪各组织器官，研磨后提取病毒总RNA，并进行反转录，然后用已报道的荧光定量RT-PCR方法(Zhao JJ,Cheng D,Li N,Sun Y,Shi Z,Zhu QH,Tu C,TongGZ,Qiu HJ.Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative anddifferential detection of wild-type viruses and C-strain vaccine of Classicalswine fever virus.Vet Microbiol.2008；126(1-3):1-10.)，检测试验猪各组织器官中CSFV核酸拷贝数，用以评价各组织器官中的CSFV含量。

1.5统计学分析

应用SPSS统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异。其中，p≥0.05为差异不显著，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。

2、实验结果

2.1rPRVTJ-delgE/gI-E2对猪的安全性

将重组病毒株rPRVTJ-delgE/gI-E2以不同剂量的免疫5周龄健康仔猪后，所有免疫猪均没有出现任何临床症状，体温维持在正常生理范围之内，食欲正常，体重增长与PBS对照猪无显著性差异。

2.2rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪针对PRV TJ株的攻毒保护

免疫后6d，不同剂量的rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫组个别猪PRV gB抗体转为阳性，攻毒后gB抗体滴度迅速升高，至攻毒后6d达到较高的水平，随后gB抗体水平趋于平稳，而PBS对照组存活猪仅在攻毒后6d出现了gB抗体(图6)。

PRV gE抗体检测结果显示，对于不同剂量rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪，仅10⁴TCID₅₀免疫组有2头猪于攻毒后15d才发生gE抗体阳转，其它剂量免疫猪均没有产生gE抗体，PBS对照组存活猪于攻毒后12d发生gE抗体阳转(图7)。

针对PRV TJ株的中和抗体检测结果显示，攻毒后3d内，所有免疫猪均没有产生中和抗体，在攻毒后6d，不同剂量rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪检测到了中和抗体的产生，随后逐渐升高，高剂量免疫猪的中和抗体滴度要高于低剂量免疫组的，PBS对照组存活猪于攻毒9d后产生了低水平的中和抗体(表3)。

表3 rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪产生的针对PRV TJ株的中和抗体

攻击PRV TJ株后，rPRVTJ-delgE/gI-E2不同剂量免疫猪均没有出现任何临床症状，体温和食欲正常，仅10⁴TCID₅₀rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫组有1头猪出现排毒。PBS对照组所有猪在攻击PRV TJ株后均出现不同程度的发热、食欲减退、精神沉郁、呼吸困难以及神经症状，所有猪均发生排毒，并有4头猪死亡(表4)。

表4 PRV TJ株攻毒后免疫猪的临床症状统计

2.3rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪针对CSFV的攻毒保护

以不同剂量的rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫5周龄仔猪后，最高剂量(10⁶TCID₅₀)一次免疫组于免疫后4w有2头猪CSFV特异性抗体转阳，至攻毒前该组所有猪的猪瘟抗体均发生阳转；rPRVTJ-delgE/gI-E2两次免疫组(10⁵或10⁴TCID₅₀免疫组)于加强免疫后CSFV特异性抗体逐渐升高，攻毒后所有免疫猪抗体迅速上升，并于攻毒后9d达到峰值，抗体阻断率达到80％左右，在攻毒后6d之内，C株疫苗免疫组的抗体滴度要明显高于其他各组(p<0.05)(图8)。

免疫后3w，仅C株疫苗免疫组检测到了低水平的中和抗体，加强免疫后各组抗体滴度逐渐上升，攻毒后抗体迅速上升，于攻毒后9d达到较高水平，但不同剂量rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫组的抗体滴度与C株疫苗免疫组与攻毒前6d差异显著(p<0.05)(表5)。

表5 rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪产生的CSFV中和抗体

CSFV攻击后，不同剂量rPRVTJ-delgE/gI-E2及C株疫苗免疫组所有猪均没有出现发热及猪瘟特异性的临床症状，PBS对照组于攻毒后2d开始出现高热、食欲减退、精神沉郁、便秘、腹泻、呼吸困难等特异性的猪瘟临床症状(表6)。各组织器官的病毒核酸检测结果显示，不同剂量rPRVTJ-delgE/gI-E2及C株疫苗免疫组所有猪均没有检测到CSFV核酸的存在，而PBS对照组所有猪的各个组织器官中均检测到了大量的核酸的存在，含量最高达到10⁷拷贝/μL。

表6 rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫猪经CSFV攻毒后的临床症状统计

攻击后CSFV 15d，安乐死所有存活猪，进行剖检和病理解剖学观察，结果显示，C株疫苗免疫组及不同剂量免疫猪均没有出现明显的病理变化，10⁴TCID₅₀rPRVTJ-delgE/gI-E2免疫组仅有各别猪的颌下淋巴结出现轻微的肿大与出血，而PBS对照组出现明显的猪瘟特征性病变。

实施例4重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-E2对非靶动物小鼠的致病力试验

1、实验方法

选取6周龄BALB/c小鼠20只，随机分成4组，每组5只。其中，前3组分别经腹腔接种10³TCID₅₀的实施例1筛选的rPRVTJ-delgE/gI-E2(微生物保藏编号为：CGMCC No.10411)、rPRVTJ-delgE/gI和Bartha-K61株弱毒疫苗，最后一组接种PBS作为对照，接种剂量为0.1mL/只。接种后每天观察小鼠的临床表现，接种后15d将所有小鼠剖杀，对各组织器官如心、肝、脾、肺、肾等进行剖检观察，比较不同病毒对小鼠的致病性反应，用以评价该转基因微生物rPRVTJ-delgE/gI-E2对非靶动物小鼠免疫后的临床反应。

应用SPSS统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异。其中，p≥0.05为差异不显著，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。

2、实验结果

rPRVTJ-delgE/gI-E2、rPRVTJ-delgE/gI、PRV Bartha-K61株病毒接种小鼠后，与PBS对照组一样均没有出现任何PRV特异性的临床反应，观察期内没有出现死亡，剖检后在脑组织中也没有检测到PRV核酸(表7)。剖检后，不同病毒接种的小鼠各器官均没有发生任何变化，剖检变化上与PBS对照组无明显差异。

表7 rPRVTJ-delgE/gI-E2注射非靶动物小鼠后的临床症状统计

Claims (8)

1.表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10411。

2.权利要求1所述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株在制备预防或治疗猪瘟的疫苗或试剂中的用途。

3.权利要求1所述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株在制备预防或治疗伪狂犬病的疫苗或试剂中的用途。

4.一种预防或治疗猪瘟的疫苗组合物，其特征在于，包括：免疫有效量的权利要求1所述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株和药学上可接受的佐剂。

5.一种预防或治疗伪狂犬病的疫苗组合物，其特征在于，包括：免疫有效量的权利要求1所述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株和药学上可接受的佐剂。

6.权利要求1所述表达猪瘟病毒E2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建含有猪瘟病毒E2基因的转移载体；(2)将经酶切处理的重组病毒rPRVTJ-delgE/gI-EGFP-Neo基因组和步骤(1)构建的转移载体共转染动物细胞，收获病毒，筛选，纯化，即得。

7.按照权利要求6所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)所述转移载体为pOK-LR-CMV-E2。

8.按照权利要求6所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)所述动物细胞为Vero细胞。