CN104059889A - 伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用。本发明提供了一株缺失gI和gE基因的伪狂犬病病毒株，其微生物保藏编号是CGMCC.No.8786。本发明进一步提供了构建所述双基因缺失毒株的方法，包括：（1）构建含有EGFP和Neo基因完整表达盒的伪狂犬病病毒TJ株转移载体；（2）将转移载体转染于接种伪狂犬病病毒TJ株后的细胞，获得过渡病毒；（3）过渡病毒基因组酶切处理后与转移载体共转染细胞，经蚀斑筛选即得。本发明缺失毒株被完全致弱，免疫猪只后未出现任何临床反应，能够迅速诱导伪狂犬病病毒特异性抗体的产生，中和抗体滴度高，对当前流行的伪狂犬病病毒变异株的攻击能提供完全的免疫保护。

Description

伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及伪狂犬病病毒变异株，尤其涉及一株伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法，本发明还涉及伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株在制备防治由伪狂犬病病毒变异株引起的动物传染病药物中的应用，属于伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株的构建及应用领域。

背景技术

伪狂犬病(pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)引起的猪、羊、牛等多种家畜及野生动物的一种以发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎、呼吸和神经系统障碍为主要特征的急性传染病。PRV是疱疹病毒科α疱疹病毒亚科水痘病毒属的成员，基因组为线性双链DNA，长约145kb，G+C含量高达73％。整个基因组由独特长区UL、独特短区US及位于US两侧的末端重复序列TRS和内部重复序列IRS构成，共编码约70～100种病毒蛋白，其中有近一半基因被认为是病毒复制非必需的(Pomeranz LE,Reynolds AE,Hengartner CJ.Molecular biology of pseudorabies virus:impact on neurovirology and veterinary medicine.Microbiol Mol Biol Rev.2005,69(3):462-500.)。PRV含有11种糖蛋白，即：gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM和gN，其中gE糖蛋白是PRV的主要毒力因子，属于典型的I型跨膜蛋白，在介导细胞的感染融合、病毒在细胞间的扩散、病毒粒子的释放及病毒的嗜神经性等方面发挥着重要作用(Mengeling WL,Brockmeier SL,Lager KM,Vorwald AC.The role of biotechnologically engineered vaccines and diagnostics in pseudorabies(Aujeszky's disease)eradication strategies.Vet Microbiol.1997,55(1-4):49-60；Nauwynck HJ,Labarque GG,Pensaert MB.Efficacy of an intranasal immunization with gEgC and gEgI double-deletion mutants of Aujeszky's disease virus in maternally immune pigs and the effects of a successive intramuscular booster with commercial vaccines.Zentralbl Veterinarmed B.1999,46(10):713-22.)。

伪狂犬病目前尚无特效治疗药物，主要以预防为主，其中，疫苗免疫接种是防治伪狂犬病的重要措施。然而，自2011年以来，中国大部分免疫过伪狂犬病弱毒疫苗Bartha-K61的猪场出现了典型的伪狂犬病症状(Wu R,Bai C,Sun J,Chang S,Zhang X.Emergence of virulent pseudorabies virus infection in northern China.J Vet Sci.2013,14(3):363-365.)，感染猪表现为高热(40～42℃)，精神沉郁、食欲下降、咳嗽、气喘及神经症状，且新生猪死亡率高达50％以上(彭金美，安同庆，赵鸿远，赵鸿远，刘益民，陈家锃，冷超粮，孙艳，常丹，田志军，童光志.猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析.中国预防兽医学报,2013,35(1):1-4.)，感染猪出现了以往PR病例未见的瘙痒症状。初步研究结果表明，与以前的毒株相比，新的流行毒株的抗原性已发生变异，PRV变异株致病性明显增强，传统疫苗Bartha-K61株对目前流行的PRV变异株不能提供完全的免疫保护。因此，研制针对PRV变异株的疫苗，对于伪狂犬病的有效预防具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株；

本发明的目的之二是提供一种构建伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株的方法；

本发明的目的之三是提供构建的伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株在制备防治由伪狂犬病病毒(尤其是PRV变异株)引起的动物传染病药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一株伪狂犬病病毒变异株双基 因缺失毒株。

本发明以PRV变异毒株PRV TJ株为亲本毒，利用改进的方法构建了gI/gE双基因缺失并且不含任何外源基因的伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株rPRVTJ-delgE。

本发明所用的亲本毒PRV TJ株是2012年从中国天津某猪场的病猪脑组织中分离到的。该毒株与目前流行的PRV变异株具有极高的同源性，而与以往的PRV毒株具有明显差异，尤其是该毒株与PRV经典强毒株有明显差异，其主要毒力蛋白gE基因蛋白中有18处氨基酸发生了突变，并且在第48位和第494位氨基酸处插入了天冬氨酸。动物实验表明，PRV TJ株对绵羊和仔猪表现为高度致死性，接种后4～5d大部分死亡；仔猪感染PRV TJ株后，出现明显的瘙痒症状，这在以往的PRV感染病例中是罕见的。

本发明构建的缺失病毒rPRVTJ-delgE缺失了PRV TJ株的gE基因和gI基因(缺失位点为PRV TJ株基因组的第122804-125101位序列，共缺失2298bp)。gE是一个重要的毒力基因，gI也与毒力有关。gE蛋白和gI蛋白以非共价键形式结合成复合体gE/gI，它们与PRV在神经系统中的侵袭和扩散作用密切相关。gE和gI基因的共同缺失，将使病毒致弱更加充分，作为疫苗株更加安全可靠。有研究指出，gI/gE复合物具有结合IgG的能力，从而阻止补体途径，导致机体免疫抑制。单独缺失gI或gE基因所获得的缺失病毒，无论是灭活还是直接接种动物，所诱导的抗体滴度均不高，不能够对PRV强毒的攻击提供完全保护(吕素芳，郭广君，管宇，魏风，张松林，沈志强.伪狂犬病毒SA株gI-/gE-/YFP+基因缺失载体构建及突变株筛选.中国动物检疫.2009,26(8):38-40.董炳梅，郭广君，吕素芳，唐娜，魏凤，管宇，张松林，沈志强.猪伪狂犬病病毒双基因缺失gI-/gE-/PRV SA738灭活疫苗的安全性与免疫效力.中国兽医学报.2011,3l(7):950-954.)。另外，本发明所构建的缺失病毒rPRVTJ-delgE不含有 任何外源基因，接种动物后不会诱导针对其它外源蛋白的抗体产生，有效提高了缺失病毒的生物安全性和稳定性。

PCR检测及间接免疫荧光试验表明，本发明所构建的缺失病毒株rPRVTJ-delgE已正确缺失gI和gE基因。一步生长曲线结果显示，缺失病毒株rPRVTJ-delgE具有与亲本毒PRV TJ株相类似的生长动力学，只是在感染细胞10h后增殖速度较亲本毒PRV TJ株缓慢，毒价上略低于亲本毒。在缺失病毒株rPRVTJ-delgE与亲本毒PRV TJ株接种细胞后所产生的蚀斑形态和大小上未见有明显差异。

本发明用不同滴度的缺失病毒株rPRVTJ-delgE免疫猪只后，免疫猪没有出现任何临床反应和排毒现象，说明缺失病毒株被完全致弱。该缺失病毒株免疫猪只后1周就能够产生较高的gB特异性抗体，至攻毒后3天，rPRVTJ-delgE株不同剂量免疫组均产生了中和抗体，平均抗体滴度分别为10⁵TCID₅₀免疫组1:7.75、10⁴TCID₅₀免疫组1:6.25、10³TCID₅₀免疫组1:5.25，均高于Bartha-K61疫苗免疫组5.00，表明本发明所构建的缺失病毒株保持良好免疫原性；攻毒后，rPRVTJ-delgE免疫猪得到完全保护。

本发明将构建的伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株rPRVTJ-delgE提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.8786；分类命名为：伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年2月17日：保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供了一种构建伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株的方法，包括以下步骤：

(1)构建转移载体；所述的转移载体含有PRV TJ株病毒DNA的左右同源重组臂L和R，还含有EGFP、Neo基因的完整表达盒；

(2)构建具有指示标记的过渡病毒；将构建的转移载体转染于接种 PRV TJ株后的Vero细胞，经蚀斑筛选与纯化获得过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo；

(3)将具有指示标记的过渡病毒基因组酶切处理后与转移载体pOK-LR共转染Vero细胞，经蚀斑筛选获得了缺失gI和gE基因的重组病毒rPRVTJ-delgE。

本发明根据PRV Kaplan株(GenBank登录号JQ809328.1)US区基因序列，参照PRV Bartha-K61株的缺失部位设计两对引物，其中引物对1的核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，引物对2的核苷酸序列为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；本发明以PRV TJ株病毒DNA为模板，以引物对1和2为扩增引物，分别扩增左右同源重组臂L和R，将扩增得到的左右同源重组臂L和R克隆于pOK12载体上，获得转移载体pOK-LR；再以pEGFP-N1质粒为模板，用引物扩增含有EGFP、Neo基因的完整表达盒；将含有EGFP、Neo基因的完整表达盒克隆于pOK-LR的L和R片段之间获得转移载体pOKLR-EGFP-Neo。

将转移载体pOKLR-EGFP-Neo质粒转染于接种PRV TJ株后的Vero细胞，经蚀斑筛选与纯化获得过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo。本发明所构建的过渡病毒中引入了PmeI和PacI两个独特的单一酶切位点，用这两个酶处理过渡病毒基因组后，再与转移载体共转染细胞，获得缺失病毒。本发明构建的过渡病毒中含有EGFP基因作为指示标记基因，在过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo中还引入了新霉素抗性基因Neo，结合EGFP可视化筛选与新霉素抗性筛选，大大提高了过渡病毒的纯化效率。在缺失病毒的构建过程中，在过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo中引入两个独特的单一酶切位点PmeI和PacI。将rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组用PmeI和PacI双酶切后再与转移载体pOK-LR共转染细胞，转染后有病变但没有荧光的细胞所占的比例约为80％(目的病毒引起的病变细胞)，故从其中筛选不表达绿色荧光的重组缺失病毒蚀斑较为容易，显著提高了缺失病 毒的筛选与纯化效率。而未经PmeI和PacI双酶切处理的rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组DNA与转移载体pOK-LR共转染细胞后，视野中绝大部分细胞均发绿色荧光，比例约为90％以上，目的病毒引起病变的细胞不到10％，使得从其中筛选重组病毒蚀斑的难度很大。提取过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组DNA并用PmeI和PacI限制性内切酶进行酶切，将转移载体pOK-LR质粒与酶切处理后的rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组DNA共转染细胞，经蚀斑筛选与纯化获得缺失了gI和gE基因的缺失病毒株rPRVTJ-delgE。

本发明还进一步提供了构建的伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株在制备防治由PRV变异株引起的动物传染病药物中的应用。

本发明构建的PRV变异株双基因缺失毒株对猪只安全，免疫后能够迅速产生PRV特异性抗体，能够对当前流行的PRV变异株的攻击提供完全的免疫保护。该缺失病毒可以用于制备防治由PRV变异株引起的动物传染性疾病药物，尤其用于制备防治由伪狂犬病病毒变异株引起的伪狂犬病疫苗，有效预防伪狂犬病。

附图说明

图1为缺失病毒株构建策略图。

图2为过渡病毒、缺失病毒株和亲本病毒株接种PK-15细胞后荧光及病变观察；A1：rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo接种细胞后荧光观察；A2：rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo接种细胞后病变观察；B1：rPRVTJ-delgE接种细胞后荧光观察；B2：rPRVTJ-delgE接种细胞后病变观察；C1：PRV TJ接种细胞后荧光观察；C2：PRV TJ株接种细胞后病变观察。

图3为过渡病毒、缺失病毒株和亲本病毒株中gE和gB基因的PCR扩增；A：gE基因的PCR扩增；B：gB基因的PCR扩增。

图4为过渡病毒、缺失病毒株和亲本病毒株接种细胞后gB和gE蛋 白表达的检测。

图5为过渡病毒、缺失病毒株和亲本病毒株的一步生长曲线。

图6为本发明构建的双基因缺失毒株免疫猪gB特异性抗体的检测结果。

图7为本发明构建的双基因缺失毒株免疫猪gE特异性抗体的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1、实验材料

PRV变异株TJ株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所分离、鉴定、保存；PRV Bartha-K61株购自哈尔滨维科生物技术有限公司(生产批号2013001)。Vero细胞和PK-15细胞由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存。pOK12载体(Novagene，USA)和pEGFP-N1载体(Clontech，USA)用于转移载体的构建。

实施例1缺失病毒的构建

1、实验方法

1.1转移载体的构建

根据PRV Kaplan株(GenBank登录号JQ809328.1)US区基因序列、参照PRV Bartha-K61株的缺失部位设计两对引物P1S/P1R和P2S/P2R(表1)。 然后以PRV变异株TJ株病毒DNA为模板，应用引物P1S/P1R(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)和P2S/P2R(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)分别扩增左右同源重组臂(L和R)，然后将L、R通过EcoRI和XbaI酶切位点克隆于pOK12载体上，获得转移载体pOK-LR。再以pEGFP-N1质粒为模板，应用引物P3S/P3R(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)(表1)扩增含有EGFP、Neo基因的完整表达盒。然后将此片段通过MluI酶切位点克隆于pOK-LR的L和R片段之间获得转移载体pOKLR-EGFP-Neo，具体构建策略见图1。

表1 引物序列及扩增片段

1.2缺失病毒的获得与纯化

碱裂解法提取转移载体pOKLR-EGFP-Neo质粒，参照X-tremeGENE HP DNA转染试剂说明书将其转染于接种PRV TJ株1h后的Vero细胞。24h后，反复冻融转染细胞，按文献介绍(王鑫，含GFP报告基因的伪狂犬病病毒Ea株gG基因缺失重组病毒的构建[D].河南农业大学，2008)的方法进行蚀斑筛选与纯化过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo，直至所有出现的病毒蚀斑均为绿色。提取过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组DNA，用PmeI和PacI限制性内切酶进行酶切。参照X-tremeGENE HP DNA转染试剂说明书将转移载体pOK-LR质粒与酶切处理后的rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo DNA共转染单层Vero细胞。72h后，37℃/-80℃条件下反复冻融共转染产物，以相同 的方法进行蚀斑筛选与纯化缺失病毒rPRVTJ-delgE，直至所有出现的病毒蚀斑均没有绿色荧光。

1.3PCR检测

按OMEGA Tissue DNA Kit(批号D3396-01)说明书提取过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo和缺失病毒rPRVTJ-delgE的DNA，利用扩增左右同源重组臂之间片段的引物P4S/P4R(表1)及扩增gE基因的引物P5S/P5R(表1)对所获得的两株重组病毒分别进行PCR检测。

2、实验结果

将Vero细胞接种PRV TJ株并转染转移载体pOKLR-EGFP-Neo24h后，在倒置荧光显微镜下观察到了大量的细胞病变，并且有少量病变细胞具有绿色荧光。冻融该接毒转染产物后经有限稀释法和20轮蚀斑纯化，得到了过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo，荧光显微镜下观察到的病变细胞全部带有绿色荧光(图2)。提取rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo DNA，分别用引物P5R/P5S和P6R/P6S(表1)扩增其gE和gB基因，PCR结果鉴定正确(图3)。

提取过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo的基因组DNA，经限制性内切酶PmeI和PacI酶切处理并用无水乙醇沉淀后，与转移载体pOK-LR共转染Vero细胞，72h后在倒置荧光显微镜下观察到了散在的绿色荧光点和极少的病变细胞。冻融该共转染产物，经有限稀释法接种细胞后，在荧光显微镜下观察到了有细胞病变但没有绿色荧光的细胞。将rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组用PmeI和PacI双酶切后再与转移载体pOK-LR共转染细胞，转染后有病变但没有荧光的细胞所占的比例约为80％(目的病毒引起的病变细胞)，故从其中筛选不表达绿色荧光的重组缺失病毒蚀斑较为容易，有效提高了缺失病毒的筛选与纯化效率。而未经PmeI和PacI双酶切处理的rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo基因组DNA与转移载体pOK-LR共转染细胞后，视野中绝大部分细胞均发绿色荧光，比例约为90％以上，目的病毒引起病 变的细胞不到10％，从其中筛选重组病毒蚀斑的难度很大。

经过5轮蚀斑筛选，纯化获得能产生细胞病变但没有绿色荧光的缺失病毒rPRVTJ-delgE(图2中B1、B2)。以该病毒DNA为模板，分别用引物P4S/P4R、P5S/P5R和P6S/P6R扩增其左右同源重组臂之间的序列、gE和gB基因(图3)，回收左右同源重组臂之间的扩增片段进行测序鉴定，结果表明得到的缺失病毒rPRVTJ-delgE已正确缺失gI和gE基因，缺失的片段长2298bp，该缺失片段位于TJ株基因组的第122804-125101位。

实验例1缺失病毒株rPRVTJ-delgE的鉴定

1、实验方法

1.1间接免疫荧光试验(Immunofluorescence assay，IFA)

将rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo，rPRV-delgE株及亲本病毒PRV TJ株以1MOI(multiplicity of infection，MOI))感染PK-15细胞，24h后过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo接种细胞直接放置在荧光显微镜下进行观察，rPRVTJ-delgE及亲本毒PRV TJ株接种的细胞用冷的无水乙醇固定，20min后加入PRV gB(IDEXX，USA，批号DJ358)和gE单克隆抗体(IDEXX，USA，批号CJ291)，37℃作用2h后用PBS洗涤细胞5次，加入1:80稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG(Sigma公司)，置于湿盒中37℃作用45min，用PBS洗涤5次后，置于倒置荧光显微镜下观察。

1.2一步生长曲线

rPRVTJ-delgE株、rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo株与亲本病毒PRV TJ株以1MOI的量接种24孔细胞培养板中长成单层的PK-15细胞，感作1h后换成含2％胎牛血清的细胞维持液进行培养。分别于接种病毒后2h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h收取细胞及培养上清，并于37℃/-80℃条件下反复冻融2次后进行毒价测定，绘制一步生长曲线，分析不同病毒在生长动力学上是否存在差异。

1.3蚀斑试验

将培养于6孔板中并长成单层的PK-15细胞以1MOI的量接种rPRVTJ-delgE株、rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo株与亲本病毒PRV TJ株，感作1h后弃掉培养液，加入1％的琼脂糖凝胶，4℃放置10min凝固后转至37℃CO₂培养箱中继续培养。16-20h后于荧光显微镜下观察蚀斑大小，并进行蚀斑大小比较。

2、实验结果

2.1间接免疫荧光试验

为了进一步鉴定所获得的重组病毒是否真正缺失了目的基因，将PRV TJ株、rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo株和rPRVTJ-delgE株以1MOI剂量接种PK-15细胞，24h后进行IFA检测。结果表明，三种病毒株感染的PK-15细胞均产生了细胞病变，且均检测到了gB蛋白的表达，而仅在亲本病毒PRV TJ株感染的PK-15细胞上检测到了表达的gE蛋白(图4)。

2.2一步生长曲线

一步生长曲线结果显示，过渡病毒rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo和缺失病毒rPRVTJ-delgE株具有与亲本毒PRV TJ株相类似的生长动力学。只是在感染细胞10h后，rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo和rPRVTJ-delgE株的增殖速度较亲本毒PRV TJ株缓慢，毒价上略低于亲本毒(图5)。

2.3蚀斑试验

在rPRVTJ-delgE株、rPRVTJ-delgE-EGFP-Neo与亲本毒PRV TJ株三种病毒接种PK-15细胞后所产生的蚀斑形态和大小上未见有明显差异。

实验例2缺失病毒株rPRVTJ-delgE在猪体上的安全性及免疫原性检测实验

1、实验方法

1.1免疫与攻毒

选取PRV抗体及抗原均为阴性的35日龄健康仔猪21头，随机分成5组。其中A组和E组各3头，B、C和D组各5头。A组接种商品化伪狂犬病Bartha-K61株弱毒疫苗(购于哈尔滨维科生物技术有限公司，生产批号2012002)，接种剂量为10⁵TCID₅₀/头；B、C和D组接种rPRVTJ-delgE株，接种剂量分别为10⁵TCID₅₀/头、10⁴TCID₅₀/头和10³TCID₅₀/头；E组接种PBS，接种剂量1mL/头。所有猪的接种部位为左侧颈部肌肉。免疫后1周，所有猪用PRV TJ株进行攻击，接种剂量为10⁵TCID₅₀/头，接种部位为右侧颈部肌肉。免疫前、免疫后及攻毒后每天对所有猪进行体温测定，并对所有猪的临床反应进行观察。

表2 免疫分组

1.2ELISA和病毒中和试验

免疫前、免疫后及攻毒后每隔3天，对所有猪前腔静脉采血，分离血清。应用PRV gB(IDEXX，USA，批号DJ358)和gE(IDEXX，USA，批号CJ291)抗体检测试剂盒进行抗体检测，具体操作方法见说明书。同时用病毒中和试验检测各时间点血清的中和抗体。具体操作如下：(1)用无血清的DMEM将56℃灭活30min后的血清进行2倍系列稀释，每个血清稀释度取100μL加入100μL的PRV TJ株病毒(含100TCID₅₀)，37℃条件下作用1h。(2)将病毒与血清的混合液加入到事先铺于96孔板的PK15细胞中，吸附1h后弃掉混合液，加入含有2％胎牛血清的DMEM细胞培养液，37℃，5％CO₂培养2d。(3)显微镜下观察细胞病变情况，按照公式计算血清抗体的中和效价。

1.3免疫及攻毒后排毒检测

于免疫前、免疫后及攻毒后每天采集所有猪的鼻拭子和肛拭子，用PBS稀释后，按每毫升加入1000IU青霉素和1000μg链霉素，置于4℃冰箱过夜。次日，分别将经0.45μm过滤后的样品接种于PK-15细胞，观察细胞病变，如果第一代没有细胞病变则盲传3代，然后用OMEGA Tissue DNA Kit提取基因组后，用扩增gE基因的特异性引物(表1)检测PRV的存在。

1.4剖检变化及组织病理学检测

攻毒后15d对所有猪进行剖杀，观察各组织脏器(脑、心、肝、脾、肺、肾、膀胱、淋巴结)的剖检变化，并作组织病理切片，经HE染色后观察组织病理学变化。

1.5统计学分析

应用SAS统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异。其中，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。

2、实验结果

2.1缺失病毒rPRVTJ-delgE对猪的安全性

接种免疫缺失病毒株rPRVTJ-delgE和PRV Bartha-K61疫苗株后，所有猪体温正常，未见其他如食欲降低、接种部位炎症等副反应。

免疫后1周，对所有猪用PRV TJ株进行攻击；缺失病毒rPRVTJ-delgE免疫猪均未出现伪狂犬病临床症状，而PRV Bartha-K61疫苗株免疫组中2/3猪出现了发热、食欲减退和精神沉郁现象，PBS对照组的全部猪在攻毒后第1天就出现了高热(40.5–42℃)、食欲不振、颤抖、瘙痒、共济失调等典型的伪狂犬病临床症状，并于攻毒后4-5天有2头猪死亡。

以上结果说明，缺失病毒rPRVTJ-delgE被致弱，对猪只安全，攻毒后rPRVTJ-delgE免疫猪得到完全保护。

表3 免疫及攻毒后所有接种猪排毒情况检测

2.2ELISA和病毒中和试验

免疫后6天，在rPRVTJ-delgE和Bartha-K61弱毒疫苗免疫组中，检测到了gB特异性抗体的产生。攻毒后gB特异性抗体进一步升高，并持续到试验结束(图6)。至攻毒后9天，rPRVTJ-delgE和Bartha-K61免疫猪均没有产生gE抗体，但在攻毒后12天，Bartha-K61弱毒疫苗免疫组中有两头猪产生了gE抗体(0.49±0.03)，10³TCID₅₀rPRVTJ-delgE免疫组中有1头猪产生了较低水平的gE抗体(图7)。

病毒中和试验检测结果显示，攻毒前10⁵TCID₅₀rPRVTJ-delgE免疫组检测到低水平的中和抗体(2.5±0.58)，其它所有免疫猪均没有产生中和抗体。至攻毒后3天，rPRVTJ-delgE不同剂量免疫组均产生了中和抗体，抗体滴度分别为10⁵TCID₅₀免疫组(7.75±1.75)，10⁴TCID₅₀免疫组(6.25±1.67)，10³TCID₅₀免疫组(5.25±0.53)，均高于Bartha-K61疫苗免疫组(5.00±0.00)，各组间抗体滴度差异显著，表明本发明所构建的缺失病毒株rPRVTJ-delgE保持良好免疫原性。

2.3免疫及攻毒后排毒检测

免疫后至攻毒前，在接种猪的鼻拭子和肛拭子样品中均未检测到缺失病毒rPRVTJ-delgE和PRV Bartha-K61疫苗株病毒基因组。攻毒后，接种rPRVTJ-delgE猪的鼻拭子和肛拭子样品中均未检测到缺失病毒rPRVTJ-delgE基因组，而接种PRV Bartha-K61疫苗株组和PBS组中分别有2/3和3/3猪检测到了病毒基因组(表4)。

表4 攻毒后临床症状统计

2.4剖检变化及组织病理学检测

于攻毒后15天，剖杀所有存活猪，观察剖检病变。PBS对照组猪出现了脑出血、淋巴结出血肿大等典型的伪狂犬病病理变化。PRV Bartha-K61疫苗免疫组个别猪脑及淋巴结也出现了病变，而缺失病毒rPRV-delgE免疫组的猪只均未出现任何病理变化。

Claims (10)

1.一株伪狂犬病病毒（pseudorabies virus）TJ株双基因缺失毒株，其特征在于：缺失了伪狂犬病病毒TJ株的gI和gE基因，所缺失的序列位于伪狂犬病病毒TJ株基因组的第122804-125101位核苷酸，片段大小为2298bp。

2.按照权利要求1所述的伪狂犬病病毒TJ株双基因缺失毒株，其特征在于：其微生物保藏编号为CGMCC.No.8786；

3.一种构建权利要求1或2所述伪狂犬病病毒TJ株双基因缺失毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建含有伪狂犬病病毒TJ株病毒DNA的左右同源重组臂L和R、EGFP以及Neo基因完整表达盒的转移载体；

（2）将构建的转移载体转染于接种伪狂犬病病毒TJ株后的Vero细胞，经蚀斑筛选与纯化获得过渡病毒；

（3）将过渡病毒基因组酶切处理后与只含有左右同源重组臂L和R的转移载体共转染细胞，经蚀斑纯化，即得。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的转移载体的构建方法包括：以伪狂犬病病毒TJ株病毒DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQID No.2所示的引物对1和SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物2为扩增引物，分别扩增左右同源重组臂L和R，将扩增得到的左右同源重组臂L和R克隆于pOK12载体上，获得转移载体pOK-LR；扩增含有EGFP、Neo基因的完整表达盒；将含有EGFP、Neo基因的完整表达盒克隆于pOK-LR的L和R片段之间获得转移载体pOKLR-EGFP-Neo。

5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的细胞是Vero细胞。

6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：将过渡病毒基因组用PmeI和PacI进行酶切处理后与转移载体pOK-LR共转染细胞。

7.权利要求1或2所述的伪狂犬病病毒TJ株双基因缺失毒株在制备防治由伪狂犬病病毒所引起的动物传染病药物中的应用。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的伪狂犬病病毒是伪狂犬病病毒变异株或伪狂犬病病毒经典强毒株。

9.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的动物传染病是动物伪狂犬病。

10.一种预防或治疗动物伪狂犬病的疫苗组合物，其特征在于：包括预防或治疗上有效量的权利要求1或2所述的伪狂犬病病毒TJ株双基因缺失毒株以及药学上可接受的载体或辅料。