CN106834236A - 猪伪狂犬病毒变异株TK、gE和gI基因缺失毒株及其应用 - Google Patents

猪伪狂犬病毒变异株TK、gE和gI基因缺失毒株及其应用 Download PDF

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白娟
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Abstract

本发明涉及一种猪伪狂犬病毒(PRV)变异株ZJ01的TK/gE/gI基因缺失毒株及其应用，所述毒株为PRV ZJ01毒株的TK/gE/gI基因缺失毒株ZJ01ΔTK/gE/gI(简称ZJ01R)，体外传代试验结果显示，重组病毒ZJ01R和PRV ZJ01毒株的gE/gI基因缺失毒株ZJ01ΔgE/gI与亲本病毒ZJ01产生的细胞病变一致，病毒滴度与ZJ01毒株相仿；重组病毒ZJ01R目的基因缺失区持续稳定存在，没有出现回复性突变，猪体免疫及攻毒保护试验表明，重组病毒ZJ01R免疫后，猪体无临床症状及病理变化产生，免疫21天后即可产生较高水平的PRV中和抗体，能够抵御致死性PRV变异毒株ZJ01的攻击感染。

Description

猪伪狂犬病毒变异株TK、gE和gI基因缺失毒株及其应用
技术领域：
本发明涉及一种用于制备疫苗的猪伪狂犬病毒变异毒株，特别涉及一种猪伪狂犬病毒变异毒株TK、gE和gI基因缺失的毒株。
背景技术：
猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种猪的重要传染病，主要临床症状包括：新生仔猪中枢神经系统紊乱、断奶仔猪和育肥猪表现出呼吸道症状、妊娠母猪繁殖障碍，已经给世界生猪养殖业造成巨大经济损失 [1-3]。目前，该病防控主要依靠疫苗免疫，美国与部分欧洲国家已宣布通过基因缺失疫苗免疫和净化技术，根除了该病在家猪中的流行[4]。近30年来，我国广泛使用PRV基因缺失弱毒疫苗，该病得到有效控制并逐步净化[5-6]。但是，2011年以来，我国许多免疫PRV活疫苗的猪场再次暴发该病，主要表现为仔猪神经症状及死亡，生长猪呼吸道症状，妊娠母猪流产、死胎、弱仔等，对该病防控提出新挑战。
gE基因在PRV入侵宿主神经系统(包括三叉神经节和嗅神经)的扩散发挥重要作用，是PRV主要毒力基因，同时也是病毒复制的非必须基因。gE与gI是以非共价键形式结合成gE/gI复合物。最新研究表明gE/gI复合物与病毒顺轴突传播相关。gE/gI基因的缺失并不影响病毒的增殖滴度。敲除PRV TK和gE会导致一些PRV毒株毒力的显著下降，并可用于研制PRV弱毒活疫苗。
本发明选择一种PRV变异强毒株ZJ01，成功构建ZJ01株的感染性细菌人工染色体克隆，并获得TK、gE和gI基因缺失毒株ZJ01ΔTK/gE/gI(简称ZJ01R)和ZJ01ΔgE/gI。体外连续传代培养试验证明，该两个重组病毒的滴度和遗传特性稳定。仔猪接种该病毒后体温平稳，无组织损伤，接种7日后即产生较高的gB抗体，21日时能够产生较高的中和抗体。以大剂量变异强毒株进行攻毒，对照组全部死亡，重组病毒ZJ01R免疫组猪不发生死亡，无体温升高和组织病变，肺脏及脑组织中未检测到病毒，证明该重组病毒对猪体具有良好的免疫保护效 果，且对猪体不产生病理损伤，是理想的基因缺失疫苗候选对象，为研制PRV新型疫苗奠定了重要基础。
发明内容：
本发明提供一种猪伪狂犬病毒变异株TK/gE/gI基因缺失毒株，其保藏编号为：CGMCC No.10397，分类命名：猪伪狂犬病毒，PRV-ZJ01R。本发明所述的毒株，结构为ZJ01TK-/gE-/gI-。
本发明所述的毒株，其中，ZJ01TK-/gE-/gI-的DNA序列为将ZJ01序列去除序列表1-2的序列所述序列后所得序列。
本发明所述的毒株，其中，ZJ01的GeneBank DNA序列号为KM061380.1。
本发明所述的毒株，其中，TK的DNA序列为序列表1的序列。
本发明所述的毒株，其中，gE的DNA序列为序列表2的序列。
本发明所述的毒株，其中，gI的DNA序列为序列表2的序列。
序列表2的序列为gE/gI基因序列融合在一起的序列。
本发明所述的毒株，以PRV ZJ01株为原始毒株经过基因结构改造得到，其中PRVZJ01株由本实验室于2012年2月分离自浙江某规模猪场发病仔猪，属高致病性毒株，为BHK-21细胞F8代适应毒。本发明以PRV ZJ01毒株为亲本构建的毒株为TK、gE和gI基因缺失病毒，为BHK-21细胞F10代适应毒。
本发明的毒株已经保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCCNo.10397，保藏日期2015年02月3日，分类命名：猪伪狂犬病毒，PRV-ZJ01R，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的病毒毒株，其制备方法的设计方案为：
使用含有PRV变异强毒株ZJ01的US7和US8(gE/I)及UL23(TK)基因序列的PCR引物，从pHA2质粒DNA扩增获得含携带细菌人工染色体(BAC)载体和gfp表达盒的基因片段，构建转移载体pHA2-pUC19-BAC-H1-H2和pHA2-pUC19-UL23-H1-H2。先将pHA2-pUC19-BAC-H1-H2与ZJ01毒株全基因组共转染BHK-21细胞，通过同源重组，获得重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI。提取该重组病毒基因组DNA，转化至大肠杆菌宿主菌DH 10B，筛选获得含有mini-F序列的PRV感染性BAC克隆(pZJ01)。将pZJ01转染BHK-21细胞可以重新启动病毒的生产性感染。该质粒与pUC19-BAC-H1-H2或gE/gI基因片段全长共转 染BHK-21细胞，通过同源重组删除mini-F序列，构建获得gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔgE/gI。
按上述相同方法，将pHA2-pUC19-UL23-H1-H2与ZJ01ΔgE/gI重组病毒全基因组DNA共转染BHK-21细胞，通过同源重组，获得重组病毒ZJ01-GFPΔTK/gE/gI，然后删除mini-F序列，构建获得TK/gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔTK/gE/gI(简称ZJ01R)。
体外传代试验结果显示，本发明的病毒毒株ZJ01R和ZJ01ΔgE/gI产生的细胞病变与亲本病毒ZJ01一致，病毒滴度与ZJ01毒株相仿；重组病毒目的基因缺失区持续稳定存在，没有出现回复性突变。猪体免疫及攻毒保护试验表明，重组病毒ZJ01R免疫后，猪体无临床症状及病理变化产生，免疫21天后即可产生较高水平的PRV中和抗体，能够抵御致死性PRV变异毒株PVR-ZJ01的感染。
附图说明：
图1pHA2质粒经同源重组插入PRV ZJ01病毒基因组示意图
(A)PRV ZJ01基因组示意图(大小约为140Kbp)及US7与US8所在区域(B)转移载体构建示意图(C)重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI基因组构成的示意图
图2pUC19-BAC-H1-H2的构建与鉴定
(A)同源重组臂BAC-H1与BAC-H2基因片段扩增产物((泳道1和2分别为BAC-H1与BAC-H2基因)；(B)pUC19-BAC-H1重组质粒酶切鉴定(泳道1，泳道2为PCR产物对照)；(C)pUC19-BAC-H1-H2重组质粒PacI线性化DNA。泳道M：DSTM 5000标准分子量。
图3重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI的噬斑纯化与鉴定
图3(A)荧光显微镜下的噬斑(上图ZJ01-GFPΔgE/gI拯救病毒、下图细胞对照)。(B)病毒PCR鉴定产物电泳图.泳道1-3：PRV-gE-632-for/rev引物PCR扩增产物；泳道4-6：PRV-HOMO1-for/rev引物PCR扩增产物；泳道1、4：ZJ01；泳道2、5：ZJ01ΔgE/gI；泳道3、6：ZJ01gE/gI-R毒株；泳道M：DSTM 5000bp标准分子量。
图4PRV ZJ01BΔC克隆的遗传稳定性鉴定
(A)BAC质粒拯救病毒DNA的BamHI酶切图谱(1：F1代病毒、2：F20代质粒拯救出的病毒，M：DSTM 2000bp marker.)。(B)BAC克隆质粒PCR鉴定(1、2、3泳道分别为F5、F10和F20代质粒，M：1Kb DNA Ladder Marker。(C)拯救病毒荧光空斑(左：F1病毒，右：F20病毒)。
图5转移载体转染BHK-21细胞后荧光的鉴定
图6重组病毒PRV ZJ01ΔTK/gE/gI的纯化与鉴定
（A） 重组病毒鉴定：病毒接种细胞后进行免疫荧光试验显示PRV特异性荧光， （B）重组病毒PCR检测结果（泳道1：ZJ01，泳道2：ZJ01ΔTK/gE/gI毒株，M：1Kb DNA LadderMarker）。
图7重组病毒在BHK-21细胞上的生长曲线
图8重组病毒遗传稳定性鉴定
图9重组病毒ZJ01R免疫后猪体体温
图10重组病毒ZJ01R免疫后猪体gB抗体水平
图11重组病毒ZJ01R免疫后猪体中和抗体水平
图12重组病毒ZJ01R免疫21天后猪组织切片
图13PRV-ZJ01攻毒后猪体存活率
图14PRV-ZJ01攻毒后猪体体温变化
图15PRV-ZJ01攻毒后猪体病毒分布
图16PRV-ZJ01攻毒后猪体组织病理切片
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
1材料与方法
1.1主要材料
1.1.1病毒与细胞
PRV ZJ01株病毒，由本实验室于2012年2月分离自浙江某规模猪场发病仔猪，属高致病性毒株，为BHK-21细胞F8代适应毒；PRV ZJ01ΔgE/gI毒株为本实验室以PRV ZJ01毒株为亲本构建的获得的gI、gE双基因缺失病毒，为BHK-21细胞F10代适应毒。BHK-21细胞由本实验室保存，细胞生长液为含10％胎牛血清(Gibco)的DMEM(Gibco)，维持液为含2％胎牛血清的DMEM。
1.1.2质粒与菌株
pHA2质粒(包含BAC载体序列、真核细胞中表达gfp表达盒、大肠杆菌中表达氯霉素抗性基因与大肠杆菌mini-F质粒)由国家兽用生物制品工程技术研究中心王继春博士惠赠：pUC19载体购自Invitrogen公司。
1.1.3工具酶与试剂
限制性内切酶、T4DNA连接酶与碱性磷酸酶均购自NEB公司；AccuPrimeTM pfx DNAPolymerase购自Invitrogen公司；AxyPrep DNA片段回收试剂盒购自AxyGEN公司；平末端克隆载体pEASYTM-Blunt Simple购自TransGen公司；质粒提取试剂盒Miniprep购自Qiagen公司；酚氯仿、蛋白酶K、RNase购自Sigma公司；转染试剂LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司；其余试剂均为分析纯。
1.2ZJ01gE/gI基因缺失毒株的构建与鉴定
1.2.1病毒纯化与基因组提取
取1L PRV ZJ01 F5代病毒液，反复冻融3次，8000g离心30min除去细胞碎片，150000g超速离心2h，所得沉淀经适量灭菌PBS重悬，用酚氯仿法在重悬液中提取PRV ZJ01基因组DNA(gDNA)。
1.2.2引物设计与同源重组臂的PCR扩增
根据GenBank公布的PRV Becker株基因组序列(GenBank收录号为JF797219)，在US6与US9位置设计2对引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2F/R，引物序列为：PRV BAC H1 F：ATTGAATTC EcoR IGTACCCGTACACCGAGTCGT，PRV BAC H1 R：ACTGAGCTC Sac IGGTTAATTAA Pac ITCATCATCGACGCCGGTACT；BAC H1基因片段长度为1135bp；PRV BACH2 F：CAACTGCAG Pst ICGTTAATTAA Pac IGCCGACATGGACACGTTCGA，PRVBAC H2 R：TCGAAGCTT HindIIITTGTGGACCCGCGAACAT，BAC-H2基因片段长度为1163bp；PRV-gE-632-for：TCCACTCGCAGCTCTTCT，PRV-gE-632-rev：GCACGTCATCACGAAGGA，扩增的基因片段长度为632bp。斜体划线部分为酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。
采用上述PRV ZJ01基因组DNA作为模板，扩增同源重组臂BAC-H1与BAC-H2，反应体系为：10×AccuPrimeTM pfx Buffer 2.5μL、引物各1.0μL、模板DNA 2μL、AccuPrimeTMpfxDNA Polymerase 0.5μL、DMSO 1μL、dd H2O 18μL。反应程序如下：95℃5min；95℃30s，62℃30s，68℃70s进行32个循环，最后68℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶回收纯化，连接克隆入平末端克隆载体pEASYTM-Blunt Zero，转化TOPO10大肠杆菌感受态细胞， 涂布含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单个菌落培养，提取质粒，进行PCR和PstI酶切鉴定，阳性克隆送Invitrogen公司测序。
1.2.3转移载体的构建
提取测序正确的重组H1与H2质粒分别用EcoRI/SacI与PstI/HindIII酶切，回收酶切H1片段与pUC19线性化(EcoRI/SacI)片段连接，构建重组质粒pUC19-H1，回收酶切H2片段与pUC19-H1线性化(PstI/HindIII)片段连接构建重组质粒pUC19-H1-H2。pHA2与pUC19-H1-H2均以PacI线性化，线性化片段经碱性磷酸酶处理后用T4连接酶连接。连接产物转化TOPO10感受态细胞，最后在含氨苄与氯霉素抗性的平板上筛选。挑取的单克隆经引物PRVBAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R鉴定，选取阳性克隆用Qiagen Miniprep方法提取质粒，获得转移载体pHA2-pUC19-H1-H2。取2ug转移载体，采用LipofectamineTM 2000转染BHK-21细胞，5％CO2温箱继续培养16h，荧光显微镜下观察所构建的转移载体中gfp表达盒是否表达。图1显示了携有大肠杆菌F(Mini-F)质粒的BAC载体pHA2通过同源重组插入PRV ZJ01 US7与US8(gI与gE)基因内的示意图。
图1pHA2质粒经同源重组插入PRV ZJ01病毒基因组示意图
(A)PRV ZJ01基因组示意图(大小约为140Kbp)及US7与US8所在区域(B)转移载体构建示意图(C)重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI基因组构成的示意图
1.2.4重组病毒拯救与噬斑纯化
取转移载体pHA2-pUC19-H1-H2与PRV ZJ01gDNA各1.5μg采用LipofectamineTM2000共转染BHK-21细胞，共转染48h后，弃去维持液，覆盖含有1％低熔点琼脂糖、10％胎牛血清的DMEM，37℃，5％CO2继续培养24h，在荧光显微镜下可见绿色荧光的空斑(为重组病毒形成空斑)，挑取显示绿色荧光的单个空斑，在BHK-21细胞上进行空斑纯化。经6次亚克隆纯化后，获得重组病毒命名为ZJ01-GFPΔgE/gI。
1.2.5重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI株BAC的克隆与鉴定
将ZJ01-GFPΔgE/gI病毒接种BHK-21细胞，37℃培养16h后，在荧光显微镜下观察病变达到70％左右，用预冷的PBS洗涤1次，2000g，4℃离心5min，沉淀以100μL TE分散重悬后，经酚氯仿法提取重组病毒基因组，取出2μL DNA电转化(1500V 200Ω25uF)至E.coli DH10B感受态细胞，涂布于含34μg/mL氯霉素的LB平板，37℃培养72h，挑取单菌落至液体培养基后培养48h，用引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R进行PCR鉴定。选取10个PCR阳性的克隆，Miniprep方法提取质粒命名为pZJ01/G1-10，提取的质粒DNA用BamHI酶切以进行RFLP分析，脉冲场电泳程序为：电压6V/cm；电泳时间10h；脉冲 角度120°；起始脉冲时间1s，终止脉冲时间35s。鉴定正确的阳性克隆命名为pZJ01质粒。
取Qiagen Midi Kit试剂盒提取pZJ01质粒DNA 2μg，采用LipofectamineTM2000转染BHK-21细胞。置37℃，5％CO2条件下培养4d，每隔12h在荧光显微镜下观察，待细胞病变达到80％时，将细胞培养物冻融3次以收获重组病毒，即为拯救的重组病毒。
筛选出的阳性克隆在含有CAM的LB平板上连续传20代，32℃条件下培养，选择F5、F15与F20接种LB液体培养基，采用Qiagen Miniprep方法提取BACDNA，用PRV BAC H1 F/R引物进行PCR检测；或提取BAC DNA以BamHI进行RFLP分析；并采用LipofectamineTM 2000转染BHK-21细胞，鉴定是否可以拯救出重组病毒。
1.2.6gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔgE/gI的构建与鉴定
取转移载体pHA2-pUC 19-H1-H2与pZJ01各2μg采用LipofectamineTM 2000共转染BHK-21细胞，共转染48h后，弃去维持液，覆盖含有1％低熔点琼脂糖、10％胎牛血清的DMEM，37℃，5％CO2继续培养24h，在荧光显微镜下可见绿色荧光的空斑与无荧光空斑，挑取显示无绿色荧光的单个空斑，在BHK-21细胞上进行空斑纯化。经6轮纯化后，获得重组病毒命名为ZJ01ΔgE/gI。提取重组病毒DNA，分别以引物PRV-gE-632-for/rev与PRV BAC H1 F/PRVBAC H2 R验证gE/gI基因与载体片段的删除。
1.3ZJ01TK/gE/gI基因缺失毒株(ZJ01R)的构建与鉴定
1.3.1ZJ01gE/gI基因缺失病毒基因组提取
取500mL PRV ZJ01ΔgE/gI F10代病毒液，按1.1.4.1方法提取病毒基因组DNA。
1.3.2引物设计与同源重组臂的PCR扩增
根据PRV ZJ01毒株UL23位置设计2对引物PRV UL23-H1F/R与PRVUL23-H2F/R，引物序列为：PRV UL23-H1F：GCAGAATTC EcoR ICGTCGTTCTTGGCGATCTGC；PRV UL23-H1 R：GATGGTACC Kpn ICTTTAATTAA Pac IAAATACCGGCCACCGTGTCC；PRV UL23-H2 F：GGCGCTGCAG Pst IAGTTAATTAA Pac ITGTGCGCCTTCACGTCGGAGAT；PRVUL23-H2 R：GACAAGCTT Hind IIIAGAAGACGAAGGCGGCCACG，斜体划线部分为酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。按1.1.4.2方法，提取PRV ZJ01gE/gI-基因组DNA，作为模板，扩增同源重组臂UL23-H1与UL23-H2，克隆至pEASYTM-Blunt Simple载体，获得含UL23-H1与UL23-H2重组质粒。
1.3.3转移载体的构建
按1.1.4.4方法，将重组UL23-H1与UL23-H2质粒中的UL-23-H1和UL-23-H2基因片段分别克隆至pUC19载体，构建重组质粒pUC19-UL23-H1-H2。pHA1与pUC19-UL23-H1-H2均以Pac I线性化，线性化片段经碱性磷酸酶处理后用T4连接酶连接。连接产物转化TOPO10感受态细胞，最后在含氨苄与氯霉素抗性的平板上筛选。挑取的单克隆经引物PRV UL23-H1 F/R与PRV UL23-H2 F/R鉴定，获得转移载体pHA1-pUC19-UL-23-H1-H2。取2μg转移载体，采用LipofectamineTM2000转染BHK-21细胞，在荧光显微镜下观察转移载体中gfp表达盒是否表达。
1.3.4重组病毒ZJ01R拯救与噬斑纯化
按1.1.5.4方法，取转移载体pHA2-pUC19-UL23-H1-H2与PRV rZJ01gE/gI-基因组DNA各1.5μg采用LipofectamineTM 2000共转染BHK-21细胞，继续培养24h，在荧光显微镜下可见绿色荧光的空斑(为重组病毒形成空斑)，挑取显示绿色荧光的单个空斑，在BHK-21细胞上进行空斑纯化。经6轮纯化后，获得重组病毒命名为ZJ01-GFPΔTK/gE/gI。
将所得重组病毒ZJ01-GFPΔTK/gE/gI增殖500ml，采用1.1.4.1方法，差速离心浓缩后提取基因组DNA，按1.1.4.6方法，将该重组病毒基因组DNA与中间载体pUC19-UL-23-H1-H2共转染BHK-21细胞，获得敲除GFP荧光标签的病毒空斑。通过空斑纯化，获得PRV ZJ01ΔTK/gE/gI(ZJ01R)。
1.3.5PRV ZJ01ΔTK/gE/gI(ZJ01R)的鉴定
将PRV ZJ01ΔTK/gE/gI毒株(ZJ01R)在BHK-21细胞上进行增殖，提取DNA用PRV TKdel F/R进行PCR检测，确定目的基因的删除，引物序列为：PRV TK del F：5‘-CACCACGGCCCGGGTGATGGCGCTC-3’；PRV TK del R：5‘-AACTTTATTGGGATGACATACACAT-3‘。
1.4重组病毒ZJ01R体外培养生长特性测定
1.4.1不同代次重组病毒ZJ01R TCID50测定
将F3、F10、F20代重组病毒ZJ01R、PRV ZJ01ΔgE/gI及ZJ01毒株分别用维持液(含2％胎牛血清的DMEM)按10倍系列稀释，即10-1，10-2～10-8，10-9等。将100μL不同稀释度的病毒液接种刚长满单层BHK-21细胞的96孔细胞板中，每个滴度设置8个重复，置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。4d后记录 细胞病变孔，按Reed-Muench法计算TCID50。
1.4.2重组病毒ZJ01R生长曲线测定
将F10代重组病毒ZJ01R、ZJ01ΔgE/gI及ZJ01毒株病毒液以1MOI接种于24孔细胞板中长满单层的BHK21细胞，先置于4℃吸附1h，然后于37℃孵育1.5h，灭菌PBS(pH7.2)洗2遍后用柠檬酸盐缓冲液(CBS)处理3min，以除去细胞表面的病毒。再用灭菌PBS(pH7.2)洗2遍后再加入含有2％胎牛血清的DMEM。在感染后4，8，12，16，20，24，28，32h分别收集培养物，-70℃反复冻融3次后测定各毒株的病毒滴度，重复3次，按统计学方法处理数据，绘制病毒在体外培养条件下的生长曲线。
1.5重组病毒ZJ01R遗传稳定性鉴定
将重组病毒ZJ01R在BHK21细胞上连续传代20代，取F3、F10、F20代病毒提取DNA作为模板，以PRV TK del F/R进行PCR鉴定，确定其目的片段稳定缺失。
1.6重组病毒ZJ01R缺失基因与亲本毒株基因重组可能性测定
将重组病毒ZJ01R与其亲本毒株ZJ01等量混合后接种于BHK21细胞，待出现病变后连续传代10代，收获F10代病毒提取DNA，以PRV TK del F/R进行PCR鉴定。
1.7重组病毒ZJ01R免疫后猪体指标监测
选取20头35～40日龄仔猪，平均分为2组，实验组滴鼻免疫重组病毒ZJ01R，2×107TCID50/头，对照组以MEM营养液滴鼻作为对照，免疫后，观察记录猪体每日体温情况、临床症状、向周围排毒情况。免疫后每隔7天，检测gB抗体水平；21天检测PRV中和抗体水平。免疫后21天，每组剖杀3头猪，检测病毒在体内的分布情况并观察组织病理变化。
1.8重组病毒ZJ01R免疫保护力试验
1.7中所述试验猪免疫21天后，每头以2×107TCID50PRV-ZJ01强毒进行滴鼻，观察重组病毒ZJ01R对猪体的免疫保护力。攻毒后，观察记录猪体每日体温情况、临床症状、向周围排毒情况。攻毒后14天，将存活猪全部剖杀，检测病毒在体内的分布情况并观察组织病理变化。
2结果
2.1ZJ01gE/gI基因缺失毒株的构建与鉴定
2.1.1中间载体构建与鉴定
以PRV ZJ01gDNA为模板，分别以PRV BAC-H1 F/R与PRV BAC-H2F/R为引物PCR扩增两个同源重组臂BAC-H1与BAC-H2，目的片段长度均为1135bp和1163bp。中间载体pUC19-BAC-H1-H2经PacI线性化大小约为5Kb(图2)。
图2pUC19-BAC-H1-H2的构建与鉴定
(A)同源重组臂BAC-H1与BAC-H2基因片段扩增产物((泳道1和2分别为BAC-H1与BAC-H2基因)；(B)pUC19-BAC-H1重组质粒酶切鉴定(泳道1，泳道2为PCR产物对照)；(C)pUC19-BAC-H1-H2重组质粒PacI线性化DNA。泳道M：DSTM 5000标准分子量。
2.1.2转移载体构建与vZJ01-GFPΔgE/gI重组病毒拯救
将中间载体pUC19-BAC-H1-H2与pHA2质粒经PacI线性化以T4连接酶连接构建转移载体pHA2-pUC19-BAC-H1-H2。转移载体经PCR与测序鉴定，两个同源臂核苷酸组成正确。将转移载体pHA2-pUC19-BAC-H1-H2转染BHK21细胞，在荧光显微镜下可见发出绿色荧光的噬斑（图3A），挑取噬斑继续传代纯化，经6轮噬斑纯化，获得的重组病毒命名为ZJ01-GFPΔgE/gI。提取纯化ZJ01-GFPΔgE/gI病毒基因组DNA为模板，以PRV-gE-632-for/rev为引物未扩增出约700bp的gE基因片段，说明gE已经被载体序列替换，经6轮噬斑纯化的重组病毒无野毒污染，可用于后续BAC构建。
图3重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI的噬斑纯化与鉴定
图3(A)荧光显微镜下的噬斑(上图ZJ01-GFPΔgE/gI拯救病毒、下图细胞对照).(B)病毒PCR鉴定产物电泳图.泳道1-3：PRV-gE-632-for/rev引物PCR扩增产物；泳道4-6：PRV-HOMO1-for/rev引物PCR扩增产物；泳道1、4：ZJ01；泳道2、5：ZJ01ΔgE/gI；泳道3、6：ZJ01gE/gI-R毒株；泳道M：DSTM 5000bp标准分子量。
2.1.3PRV ZJ01BAC克隆的筛选与鉴定
ZJ01-GFPΔgE/gI环状DNA电转化E.coli DH 10B感受态细胞后，得到氯霉素抗性克隆，Qiagen Miniprep方法提取质粒，经限制性内切酶BamHI酶切分析，筛选出1个疑似包含病毒完整基因组的克隆。PRV ZJ01的感染性BAC克隆命名为pZJ01。提取病毒亲本毒ZJ01的gDNA与pZJ01质粒DNA，经BamHI RFLP分析(图4A)，结果表明重组毒的RFLP带型与亲本毒一致，并且长约8kbp的mini-F片段已经插入US7与US8区域之间。
小量提取F5、F15与F20的LB液体培养物BAC DNA，以PRV BAC-H1F/R为引物进行PCR检测，结果20代内的BAC克隆均能检测出目的条带(图4B)；将F20代的BAC DNA进行RFLP分析，结果显示其特征性条带未发生变化(图4A)；将F5与F20代的BAC DNA转染BHK-21细胞后均能成功地拯救出病毒。 被拯救的重组病毒细胞病变、形成的空斑大小均一致(图4C)。以上结果均表明，PRV ZJ01BAC克隆的遗传稳定性良好。
图4PRV ZJ01BAC克隆的遗传稳定性鉴定
(A)BAC质粒拯救病毒DNA的BamHI酶切图谱(1：F1代病毒、2：F20代质粒拯救出的病毒，M：DSTM2000bp marker.)。(B)BAC克隆质粒PCR鉴定(1、2、3泳道分别为F5、F10和F20代质粒，M：1Kb DNA Ladder Marker。(C)拯救病毒荧光空斑(左：F1病毒，右：F20病毒)。
2.1.4mini-F载体序列删除与gE/gI基因缺失病毒筛选
以脂质体介导将转移载体pHA2-pUC19-BAC-H1-H2与pZJ01共转染BHK-21细胞后，成功筛选到删除mini-F载体序列的在荧光显微镜下不显绿色的gE/gI基因缺失病毒。将挑取的无荧光的病毒空斑纯化6次。提取纯化ZJ01ΔgE/gI病毒基因组DNA为模板，以PRV-gE-632-for/rev为引物扩增gE/gI基因为阴性，而引物PRV BAC-H1F/PRV BAC-H2R扩增片段大小约2000bp，符合预期，说明该病毒gE/gI基因的缺失而且载体序列已被成功删除。
2.2ZJ01TK/gE/gI基因缺失毒株ZJ01R的构建与鉴定
2.2.1中间载体和转移载体的构建与鉴定
按上述相同方法，以PRV ZJ01gE/gI基因缺失毒株gDNA为模板，采用PCR扩增两个同源重组臂UL23-H1与UL23-H2，构建中间载体pUC19-UL23-H1-H2。再将该中间载体与pHA1质粒经Pac I线性化以T4连接酶连接构建转移载体pHA1-UL23-H1-H2，基因序列测定结果正确。将该转移载体DNA转染BHK-21细胞，在荧光显微镜下可见转染细胞表达绿色荧光(图5)，pHA1-H1-H2可作为转移载体进行下一步重组病毒的构建。
图5转移载体转染BHK-21细胞后荧光的鉴定
2.2.3重组病毒ZJ01R拯救与纯化
PRV rZJ01gE/gI-gDNA与转移载体质粒DNA共转染BHK-21细胞后，获得敲除TK基因的重组病毒。在荧光显微镜下观察到发出绿色荧光的噬斑，挑取空斑继续传代纯化，获得重组病毒vZJ01-GFPΔTK/gE/gI。
提取该病毒基因组DNA，与pUC19-UL23-H1-H2质粒共转染BHK-21细胞，挑取无荧光病毒噬斑，获得敲除TK基因且敲除荧光标签的重组病毒PRV ZJ01ΔTK/gE/gI。采用间接免疫荧光试验，证明该病毒为PRV。采用PRV TK del F/R引物进行PCR鉴定，仅检测到250bp左右的条带(图6B)，对照野生毒株PRV ZJ01可检测到1030bp左右的条带，说明该病毒株中TK基因已被成功且稳定敲 除。鉴此，我们成功构建获得TK、gE、gI基因缺失重组PRV ZJ01ΔTK/gE/gI毒株，命名为ZJ01R毒株。
图6重组病毒PRV ZJ01ΔTK/gE/gI的纯化与鉴定
A. 重组病毒鉴定：病毒接种细胞后进行免疫荧光试验显示PRV特异性荧光。B重组病毒PCR检测结果（泳道1：ZJ01，泳道2：ZJ01ΔTK/gE/gI毒株, M：1Kb DNA LadderMarker）。
2.3重组病毒体外增殖稳定性
将重组病毒ZJ01ΔTK/gE/gI、ZJ01ΔgE/gI和ZJ01分别在BHK21细胞上连续传代20代。分别取F3、F10、F20代病毒液测定其滴度，结果见表1，证明重组病毒ZJ01ΔTK/gE/gI、ZJ01ΔgE/gI滴度与同代次野生毒株PRV ZJ01相仿，但病变出现时间也略迟于野生型毒株PRV ZJ01。
表1重组病毒体外增殖滴度比较
病毒生长曲线结果见图7，重组病毒ZJ01ΔTK/gE/gI与ZJ01ΔgE/gI生长规律基本一致，但与ZJ01毒株在BHK-21细胞中增殖速度存在一定差异。亲本毒ZJ01在接种后24h病毒滴度即可达到最高107.8TCID50/mL，而ZJ01ΔTK/gE/gI与ZJ01ΔgE/gI在接毒后28h才达到最高滴度，分别为107.3TCID50/mL与107.5TCID50/mL。说明ZJ01ΔTK/gE/gI与ZJ01ΔgE/gI在体外增殖速度比亲本毒要略慢一些，但对病毒最高滴度几乎无影响。
图7重组病毒在BHK-21细胞上的生长曲线
2.4重组病毒遗传稳定性
TK基因检测结果见表2。取F3、F10、F20代重组病毒ZJ01ΔTK/gE/gI，以PRV TK delF/R进行PCR鉴定，可得到大小为250bp的单一条带，ZJ01毒株PCR产物大小为1030bp。采用PRV-gE-632-for/rev引物PCR检测gE/gI基因，结果显示，两个重组病毒均为阴性，而ZJ01毒株扩增结果为阳性，大小为632bp(表2)。该结果表明，两个重组病毒缺失的目的基因片段持续稳定，未因传代发生突变。
表2重组病毒体外传代后遗传稳定性测定结果(PCR检测目的基因)
-表示PCR结果为阴性，-表示PCR结果为阳性，*表示PCR产物大小
2.5重组病毒缺失基因回复突变可能性测定
将重组病毒ZJ01ΔTK/gE/gI与其亲本毒株ZJ01等量混合，接种于BHK21细胞，传代10次，收获F10代病毒，并采用空斑纯化方法挑选单个克隆，培养后分别提取DNA，以PRV TKdel F/R引物PCR，扩增TK基因片段，结果见图4，F10代病毒液中能检测到约250bp及1030bp的条带，克隆1和克隆2病毒扩增结果只有一条条带，大小为1030bp及250bp，表明混合传代10代后，PRV ZJ01ΔTK/gE/gI与亲本毒株PRV ZJ01独立存在，重组病毒与亲本毒株没有发生重组性回复性突变，其基因缺失持续而稳定。
图8重组病毒遗传稳定性鉴定
M：1Kb DNA Ladder Marker，1，混合传代F10代次病毒液，1、2：克隆1、克隆2病毒
2.6重组病毒ZJ01R免疫后猪体指标监测
2.6.1重组病毒ZJ01R免疫后猪体体温变化
如图9所示，重组病毒ZJ01R免疫后，猪体未出现发热情况，体温与MEM对照组不存在显著差异。
图9重组病毒ZJ01R免疫后猪体体温
2.6.2重组病毒ZJ01-gE/gI/TK-免疫后猪体gB抗体水平
ELISA检测结果(图10)表明，重组病毒ZJ01R免疫后7天，免疫猪gB抗体即达到阳性水平并稳定维持，对照MEM免疫组则一直为阴性。
图10重组病毒ZJ01R免疫后猪体gB抗体水平
2.6.3重组病毒ZJ01R免疫21天后猪体中和抗体水平
由图11可见，免疫后21天，重组病毒ZJ01R免疫组猪中和抗体滴度达到 约106log2/ml水平，且对变异毒株ZJ01和传统毒株LA的抗体滴度基本相当，表明该重组病毒免疫21天后，对变异毒株和传统毒株感染均能够提供足够的保护力。
图11重组病毒ZJ01R免疫后猪体中和抗体水平
2.6.4重组病毒ZJ01R免疫21天后猪组织病变情况
免疫21天后，各组取3头猪进行剖杀，取脑及肺脏组织制作切片(图12)，可见重组病毒免疫组与MEM对照组并无显著差异，均表现正常组织形态，证明该重组病毒对免疫动物不存在组织损伤。
图12重组病毒ZJ01R免疫21天后猪组织切片
2.7重组病毒ZJ01R免疫保护力试验
2.7.1PRV-ZJ01攻毒后重组病毒ZJ01R免疫组猪体存活率
由图13可知，攻毒后2-3天，MEM免疫组猪只陆续表现典型的PRV感染症状，包括高热、咳嗽、奇痒、震颤等，后逐步表现为共济失调、角弓反张直至死亡。重组病毒ZJ01R免疫组则一直存活直至试验结束，且不表现任何临床症状。
图13PRV-ZJ01攻毒后猪体存活率
2.7.2PRV-ZJ01攻毒后重组病毒ZJ01R免疫组猪体体温情况
由图14可知，攻毒后1天，MEM免疫组体温即开始上升，最高可达41.5℃，并维持高热直至死亡。重组病毒ZJ01R免疫组猪自攻毒后稳定维持在39℃左右，未出现明显升高。
图14PRV-ZJ01攻毒后猪体体温变化
2.7.3PRV-ZJ01攻毒后重组病毒ZJ01R免疫组猪体组织病毒含量
攻毒后，对MEM免疫组死亡猪只及时进行剖检，采集脑、肺脏组织，并于14天观察期结束后对所有猪进行剖杀，采集脑、肺脏组织，以Real-time PCR检测组织中野毒含量，可见MEM免疫组猪只脑、肺脏中均检测到较高含量的病毒，而ZJ01R免疫组猪脑、肺脏组织中未检测到病毒(图15)，表明该重组病毒能够 对猪提供足够的免疫保护，避免猪体出现野毒感染。
图15PRV-ZJ01攻毒后猪体病毒分布
2.7.4PRV-ZJ01攻毒后重组病毒ZJ01R免疫组猪组织病变情况
取MEM免疫组死亡猪及重组病毒免疫组剖杀猪脑、肺脏组织制作病理切片，可见MEM免疫组肺脏中肺泡壁肿胀、有大面积出血，脑组织有明显的炎性细胞浸润和“血管套”现象(图16)；而重组病毒ZJ01R免疫组肺脏及脑组织均与攻毒前形态一致，表明重组病毒免疫组猪只未受到野毒攻击。
图16PRV-ZJ01攻毒后猪体组织病理切片。

Claims (10)

1.一种猪伪狂犬病毒变异强毒株TK/gE/gI基因缺失毒株，其特征在于，保藏编号为：CGMCC No.10397。
2.根据权利要求1所述的毒株，其特征为2012年于临床发病猪分离到的高毒力猪伪狂犬病病毒，其中，ZJ01的GeneBank DNA序列号为KM061380.1。
3.根据权利要求1所述的毒株，其特征为以ZJ01病毒基因组为基础，敲除其TK、gE、gI基因后所得的人工致弱毒株，结构为ZJ01 TK-/gE-/gI-。
4.根据权利要求1所述的毒株，其特征为以ZJ01病毒基因组为基础，敲除其TK、gE和gI基因后所得的人工致弱毒株，其中，ZJ01 TK-/gE-/gI-的DNA序列为将ZJ01序列去除本权利要求书中第5、6、7条所述序列后所得序列。
5.根据权利要求1所述的毒株，其中，TK的DNA序列为序列表1的序列。
6.根据权利要求1所述的毒株，其中，gE的DNA序列见序列表2的序列。
7.根据权利要求1所述的毒株，其中，gI的DNA序列见序列表2的序列。
8.权利要求1所述的毒株的制备方法，其特征在于，步骤如下：
使用含有PRV强毒株ZJ01的US7和US8(gE/I)及UL23(TK)基因序列的PCR引物，从pHA2质粒DNA扩增获得含携带细菌人工染色体(BAC)载体和gfp表达盒的基因片段，构建转移载体pHA2-pUC19-BAC-H1-H2和pHA2-pUC19-UL23-H1-H2，将pHA2-pUC19-BAC-H1-H2与ZJ01毒株全基因组共转染BHK-21细胞，通过同源重组，获得重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI，提取该重组病毒基因组DNA，转化至大肠杆菌宿主菌DH 10B，筛选获得含有mini-F序列的PRV感染性BAC克隆(pZJ01)。将pZJ01转染BHK-21细胞可以重新启动病毒的生产性感染。该pZJ01质粒与pUC19-BAC-H1-H2或gE/gI基因片段全长共转染BHK-21细胞，通过同源重组删除mini-F序列，构建获得gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔgE/gI。将pHA2-pUC19-UL23-H1-H2与ZJ01ΔgE/gI重组病毒全基因组DNA共转染BHK-21细胞，通过同源重组，获得重组病毒ZJ01-GFPΔTK/gE/gI，然后删除mini-F序列，构建获得TK、gE和gI基因缺失病毒ZJ01ΔTK/gE/gI。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，经过以下步骤：
病毒纯化与基因组提取：取PRV ZJ01 F5代病毒液，提取PRV ZJ01基因组DNA。
转移载体的构建：在US6与US9位置设计两对引物PRV BAC H1 F/R与PRV BAC H2 F/R，引物序列为：
序列3，PRV BAC H1 F：ATTGAATTC GTACCCGTACACCGAGTCGT；
序列4，PRV BAC H1 R：
ACTGAGCTCGGTTAATTAATCATCATCGACGCCGGTACT；
序列5，PRV BAC H2 F：
CAACTGCAGCGTTAATTAAGCCGACATGGACACGTTCGA；
序列6，PRV BAC H2 R：TCGAAGCTT TTGTGGACCCGCGAACAT；
序列7，PRV-gE-632-for：TCCACTCGCAGCTCTTCT；
序列8，PRV-gE-632-rev：GCACGTCATCACGAAGGA；
用PRV ZJ01基因组DNA作为模板，扩增同源重组臂BAC-H1与BAC-H2。提取重组H1与H2质粒分别用EcoR I/Sac I与Pst I/Hind III酶切，回收酶切H1片段与pUC19线性化(EcoR I/Sac I)片段连接，构建重组质粒pUC19-H1，回收酶切H2片段与pUC19-H1线性化(Pst I/HindIII)片段连接构建重组质粒pUC19-H1-H2。从pHA2质粒DNA扩增获得含携带细菌人工染色体(BAC)载体和gfp表达盒的基因片段，克隆至pUC19-H1-H2，选取阳性克隆用QiagenMiniprep方法提取质粒，获得转移载体pHA2-pUC19-H1-H2。取转移载体pHA2-pUC19-H1-H2与PRV ZJ01 gDNA共转染BHK-21细胞，在BHK-21细胞上进行空斑纯化，获得重组病毒，命名为ZJ01-GFPΔgE/gI。
重组病毒ZJ01-GFPΔgE/gI株BAC的克隆与鉴定：将ZJ01-GFPΔgE/gI病毒接种BHK-21细胞，提取重组病毒基因组，鉴定正确的阳性克隆命名为pZJ01质粒，提取pZJ01质粒DNA转染BHK-21细胞收获重组病毒，即为拯救的重组病毒。
ZJ01 gE/gI基因缺失病毒ZJ01ΔgE/gI的构建与鉴定：取转移载体pHA2-pUC19-H1-H2与pZJ01共转染BHK-21细胞，通过同源重组删除mini-F序列，进行空斑纯化，获得重组病毒命名为ZJ01ΔgE/gI。
ZJ01 TK/gE/gI基因缺失毒株(ZJ01R)的构建与鉴定
ZJ01 gE/gI基因缺失病毒基因组提取：取PRV ZJ01ΔgE/gI F10代病毒液，提取病毒基因组DNA。
引物设计与同源重组臂的PCR扩增：
根据PRV ZJ01毒株UL23位置设计2对引物
序列9，PRV UL23-H1 F：GCAGAATTC CGTCGTTCTTGGCGATCTGC；
序列10，PRV UL23-H1 R：GATGGTACC
CTTTAATTAAAAATACCGGCCACCGTGTCC；
序列11，PRV UL23-H2 F：GGCGCTGCAG AGTTAATTAA
TGTGCGCCTTCACGTCGGAGAT；
序列12，PRV UL23-H2 R：GACAAGCTTAGAAGACGAAGGCGGCCACG；
斜体划线部分为酶切位点，引物由Invitrogen公司合成。
提取PRV ZJ01ΔgE/gI基因组DNA，作为模板，扩增同源重组臂UL23-H1与UL23-H2，克隆至pEASYTM-Blunt Simple载体，获得含UL23-H1与UL23-H2重组质粒。
转移载体的构建：将重组UL23-H1与UL23-H2质粒中的UL-23-H1和UL-23-H2基因片段分别克隆至pUC19载体，构建重组质粒pUC19-UL23-H1-H2。从pHA2质粒DNA扩增获得含携带细菌人工染色体(BAC)载体和gfp表达盒的基因片段，克隆至pUC19-UL23-H1-H2，选取阳性克隆用Qiagen Miniprep方法提取质粒，获得转移载体取转移载体pHA2-pUC19-UL23-H1-H2。
重组病毒ZJ01R拯救与噬斑纯化：取转移载体pHA2-pUC19-UL23-H1-H2与PRV ZJ01Δ/gE/gI基因组DNA共转染BHK-21细胞，进行空斑纯化，获得重组病毒命名为vZJ01-GFPΔTK/gE/gI，将该重组病毒基因组DNA与中间载体pUC19-UL-23-H1-H2共转染BHK-21细胞，获得敲除GFP荧光标签的病毒空斑，通过空斑纯化，获得PRV ZJ01ΔTK/gE/gI(ZJ01R)。
10.权利要求1所述的毒株在制备疫苗中的应用。
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