CN101457215B

CN101457215B - 重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株及应用

Info

Publication number: CN101457215B
Application number: CN2008102278514A
Authority: CN
Inventors: 肖少波; 徐凤琴; 方六荣; 江云波; 陈焕春
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2008-12-01
Filing date: 2008-12-01
Publication date: 2010-11-17
Anticipated expiration: 2028-12-01
Also published as: CN101457215A

Abstract

本发明属于动物病毒基因工程技术领域，具体涉及重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株构建、疫苗制备及应用。获得一株重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株E001，缺失了伪狂犬病毒主要毒力基因TK、糖蛋白基因gG、gE和gI，不表达伪狂犬病毒的功能性糖蛋白gG和gE/gI；能同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株的GP5m/M蛋白抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒国内变异株GP5蛋白及猪圆环病毒的ORF2蛋白。该毒株可刺激猪产生抗伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒攻击的保护性免疫反应，有效防止伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的感染。还公开了三价基因工程疫苗的制备与应用。

Description

重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株及应用

技术领域

本发明属于动物病毒基因工程技术领域。具体涉及一种重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株的制备，用该基因工程毒株制备的基因工程疫苗及应用。

背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus，简称PrV)感染猪、牛、羊、犬、猫、家兔、小白鼠、水貂、狐等多种家畜和野生动物引起的急性传染病，猪是该病毒的贮存者和传播者(Mettenleiter等，Comp Immunol Microbiol Infect Dis.1991，14：151-163)。除猪以外的其它动物呈散发形式，发病后通常具有发热、奇痒及脑脊髓炎等症状，均为致死性感染。该病对猪呈爆发流行，主要导致母猪繁殖障碍和新生仔猪大量死亡。PrV一般经鼻咽部感染动物，并在感染局部的粘膜内增殖，然后经淋巴循环或神经纤维移行，一般认为病毒经神经通路到达脑而引起中枢神经功能紊乱，或在嗅球，三叉神经中建立潜伏感染。

伪狂犬病毒的基因组为线状双链DNA，长约150kb，G+C含量高达74％，整个基因组至少编码70-100个蛋白，其中胸苷激酶(Thymidine Kinase，TK)基因位于UL区，全长963bp，编码320个氨基酸，催化脱氧胸苷磷酸化。TK基因与是伪狂犬病毒的一个主要毒力基因，也与病毒的潜伏感染有关(Kit S等，Am J Vet Res.1985，46：1359-1367；Nunberg等，J Virol.1989，63：3240-3249)。除了TK基因外，与伪狂犬病毒毒力有关的基因还有gG、gE等。TK、gG、gE和gI基因都是病毒增殖所非必需的，缺失这些基因的病毒株与野毒株一样能正常增殖，而且不存在毒力返强的危险(Yokyama等，Virol.1991，185：55-65)。但突变病毒株仍具有很好的免疫原性，接种动物后可产生有效的保护性免疫反应，但是不产生抗gG、gE、gI糖蛋白的抗体，因此可以作为区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的一个标志，有利于建立无伪狂犬病感染的猪群，为最终根除该病提供有用的工具。华中农业大学在自主分离鉴定的伪狂犬病病毒强毒Ea株(陈焕春等，畜牧兽医学报，1998，29(2)，151-156)的基础上，通过DNA重组技术将主要毒力基因TK、非必需糖蛋白基因gG或gE、gI缺失，构建了一系列的重组突变毒株用于伪狂犬病的根除(刘正飞等，微生物学报，2002，42(3)，370-374；刘正飞等，畜牧兽医学报，2004，35(1)，70-73；徐晓娟等，生物工程学报，2004，20(4)，532-535)。

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，简称PRRSV)引起的一种新的传染病，主要以母猪发热、厌食、早产、流产、死胎、弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸系统疾病和高死亡率为特征。由于该病目前危害严重，并且没有很好的防制措施而引起全球养猪业和研究者越来越多的注意。

已有商品化猪繁殖与呼吸综合征减毒疫苗问世，但存在安全性问题。而灭活疫苗的免疫效力不尽人意，同时由于猪繁殖与呼吸综合征病毒具有抗体依赖增强(ADE)效应(仇华吉等，中国兽医科技，1999，29(7)，19-20)，使得常规疫苗难以奏效(仇华吉等，中国兽医学报，2000，20(1)，100-103)，因此有必要开发新型疫苗。猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因编码的糖蛋白GP5是PRRSV中最主要的保护性抗原，可诱导体液免疫和细胞免疫，因此是设计PRRS新型疫苗的首选目标基因(Dea S等，Arch Virol，2000a，145，659-688)。但单独基于天然ORF5基因构建的疫苗难以诱发较高的免疫应答(Pirzadeh B等，J Gen Virol，1998a，79，989-999；Ostrowski M等，J Virol，2002，76，4241～4250)，江云波等对ORF5基因进行修饰，即将人工合成的编码辅助性T淋巴细胞表位的核苷酸插入GP5的中和表位和覆盖表位间，构建的修饰型ORF5M基因具有更好的免疫原性(江云波等，中国兽医学报，2005(1)，1-3)。Balasuriya R等(Balasuriya R等，J Virol，2000，74，10623-10630)在研究与PRRSV同属的马动脉炎病毒(EAV)活病毒载体疫苗时发现，EAV的E蛋白在体外表达时其短肽-MHC复合体从内质网向高尔基体转运的效率很低，因此难以激发很高的抗体，而当ORF5与ORF6基因共表达时，二者编码的蛋白形成异源二聚体，这种异源二聚体的存在极大地促进了E蛋白短肽-MHC复合体从内质网向高尔基体转运，有利于诱发机体产生很强的免疫反应。但目前PRRSV相关方面的研究尚未见报道。

猪圆环病毒II型(PCV 2)是新发现的一种重要病原微生物，可引起断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合症(PDNS)、PCV2相关繁殖障碍、先天性震颤(CT)等疾病。我国也于2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50％，给我国的养猪业也造成了严重的打击。目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗非常困难，因此，研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点，但目前的试验性疫苗诱发的免疫原性均不够理想，使得对于PCV2的新型疫苗的研究进展一直比较缓慢。

与本发明相关的一些专利申请，例如伪狂犬病的专利申请，有华中农业大学提出的申请号为ZL 03156706.1专利(一种伪狂犬病TK^-/gE^-/gI^-基因缺失标志活疫苗及制备方法)，该专利公开了一种基因缺失突变株是在人工构建的伪狂犬病TK^-/gE^-/LacZ⁺突变株中缺失LacZ基因，获得的一株没有外源基因插入的伪狂犬病毒三基因缺失的突变株TK^-/gE^-/gI^-，该专利只涉及该毒株制备伪狂犬病基因标记疫苗在防制伪狂犬病单一疾病上的应用。

与本发明相关的另一些专利申请，例如猪繁殖与呼吸综合征的专利申请见于下列文献：华中农业大学提出的专利号为ZL 200410000238.0(一种猪繁殖与呼吸综合征的“自杀性”DNA疫苗)和专利号为ZL 200410009838.3(一种修饰的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因及应用)的专利申请，上述两项专利申请只涉及对猪繁殖与呼吸综合征的单一疾病的防制。

与本发明密切相关的一篇专利申请是：华中农业大学提出的申请号为200510012147.3专利申请(一种重组伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株及应用)。这项专利申请只涉及对非变异猪繁殖与呼吸综合征病毒的防制，对变异猪繁殖与呼吸综合征病毒的防制效果则不太理想。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，研制一种免疫原性更好和安全性更强的重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒(rPRV-PRRSV-PCV2)基因工程毒株。

本发明的第二个目的是利用重组的猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株制备猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒三价基因工程疫苗。

本发明的第三个目的是制备的猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程疫苗的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人制备了一种重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒毒株(Pseudorabies virus-Porcine reproductive and respiratory syndrome virus-Porcinecircovirus)E001，于2008年8月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号：CCTCC NO：V200808。

本发明的基本构建方法是：将华中农业大学动物病毒室从患“高热症”的病猪体内分离到的猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株即Nsp2基因部分缺失的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，即PRRSV)毒株WuH3(该WuH3毒株已于2008年11月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号是CCTCC NO：V200810)的主要免疫原性基因ORF5基因和猪圆环病毒2型(PCV-2)主要免疫原性基因ORF2基因的修饰型(ORF2m)(Fan H等，Immunogenicity ofporcine circovirus type 2 capsid protein targeting to different subcellular compartments.MolImmunol，2008，45：653-660.)，分别以完整的独立表达盒的形式(包含人巨细胞病毒CMV强启动子和polyA信号，即CMV-ORF5-polyA和CMV-ORF2m-polyA)通过同源重组方法将其插入到能够同时表达猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株的GP5和M蛋白的重组伪狂犬病毒rPRV-GP5-M疫苗株(Jiang等，Immunogenicity and protective efficacy of recombinantpseudorabies virus expressing the two major membrane-associated proteins of porcine reproductiveand respiratory syndrome virus.Vaccine，2007，25：547-560)的基因组gG基因位点中，构建重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株。

本发明的主要优点是：

1、本发明通过同源重组的方法使伪狂犬病毒的gG基因插入失活，从而使得重组病毒株不能表达伪狂犬病毒的gG和gE蛋白，与目前市场上普遍采用的伪狂犬病毒gG或gE鉴别诊断方法相互配合，为伪狂犬病的净化奠定基础。

2、本发明针对目前国内主要流行的PRRSV变异株，将其主要免疫原性基因ORF5引入表达PRRSV经典毒株GP5和M蛋白的重组伪狂犬病毒中，从而达到可以同时预防PRRSV经典毒株和国内当前流行的变异毒株的目的。

3、本发明针对当前猪圆环病毒2型(PCV2)对养猪业的危害及缺乏安全有效疫苗的现状，将PCV2的主要保护性抗原基因ORF2修饰后(ORF2m)引入重组病毒中，从而达到同时预防猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒感染的目的。

为深入评价用该重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株制备的猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒疫苗在防制猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒感染中的应用，用制备的疫苗在试验动物(Balb/C小鼠)进行了免疫效果的评价。

更详细的发明方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表1是本发明所述的三价jiyingongcheng

图1：是本发明的pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut转移质粒构建的流程图。

图2：是本发明的pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut转移质粒图谱。

图中CMV i.e.为人巨细胞病毒立即早期启动子，polyA为牛生长激素转录终止信号，gG、gD和PK为来自伪狂犬病病毒基因组的同源臂序列。

图3：是本发明pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut转移质粒鉴定结果。

图中M为DNA marker(DL 15000)，1为pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut/SalI。

图4：是本发明的重组PrV病毒rPRV-PRRSV-PCV2构建流程。

图5：是本发明的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2经PCR扩增截去前41个氨基酸的ORF2基因的鉴定电泳图。

图中1-20：重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2 21：PK-15细胞对照22：H₂O对照23：质粒pgG-CMVt-ORF2m-ORF5mu对照；M：DL2000DNA分子量对照。

图6：是本发明的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2经PCR扩增包含ORF5mut基因的片段的鉴定电泳图。

图中1-20：重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2 21：PK-15细胞对照；22：H₂O对照23：质粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut对照；M：DL2000DNA分子量对照。

图7：是本发明的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2的Southern-blotting分析结果。

1：Sal I酶切rPRV-PRRSV-PCV2株的基因组；

2：Sal I酶切rPRV-GP5-M亲本株的基因组；

3：SphI+NotI双酶切rPRV-PRRSV-PCV2株的基因组；

4：SphI+NotI双酶切rPRV-GP5-M亲本株的基因组。

图8：是本发明的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2经RT-PCR检测截去前41个氨基酸的ORF2基因mRNA的电泳图。

图中M是M：DL2000 DNA分子量对照1：重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2；2：重组病毒rPRV-PCV2；3：重组病毒rPRV-GP5-M；4：质粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut对照；5：H₂O对照

图9：是本发明的重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2免疫小鼠后产生的特异性针对PCV2的ELISA抗体。

具体实施方式

实施例1

以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。

1、引物设计(用于基因克隆和分子检测)

根据分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株WuH3(保藏号为CCTCCNO：V200810)的ORF5基因序列设计引物Porf5F和Porf5R，扩增片段大小约为603bp，并且其两端分别设计EcoR I、EcoR V酶切位点。同时根据GenBank上猪圆环病毒II型PCV2豫A株(曹胜波，猪II型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析，病毒学报，2002，18(2)：137-141)ORF2的基因序列设计引物Porf2F和Porf2R，扩增片段大小约为580bp(截去ORF2基因的前41个氨基酸)，另外还设计了一对引物P5、P6用于扩增串联的两个表达盒CMV-ORF5mut-polyA和CMV-ORF2m-polyA之间的ORF5mut-polyA-CMV片段，约2.0kb，用于对重组病毒中插入的ORF5mut进行鉴定。上述引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。设计的引物序列如下：

Porf5F：5′--GTAGAATTCATGTGGGGGAAATGCTTG--3′

Porf5R：5′--AGTGATATCCTAGAGACGACCCCATTG--3′

Porf2F：5′--CATGGTACCAATGGCATCTTCAACACCCGC--3′

Porf2R：5′--TATGCGGCCGCCTTAGGGTTAAGTGGGGG--3′

P5：5′--AACGCCAGCAACAACAACAGC--3′

P6：5′--GCGGGTGTTGAAGATGCCATT--3′

2、pgG-CMV-ORF2m-ORF5m转移质粒的构建(见附图1、2、3所示)

以提取的Nsp2基因部分缺失的PRRSV毒株WuH3(保藏号是CCTCC NO：V200810)的RNA(提取病毒RNA方法参见江云波，猪繁殖与呼吸综合征病毒新型疫苗研究，博士论文，2007年，中国知网)为模板，Porf5F/Porf5R为引物对ORF5基因进行RT-PCR扩增，ORF5基因的扩增条件为：50℃反转录30min，95.0℃预变性5min后进入循环，循环参数为：95.0℃1min，56.0℃1min，72.0℃1min，35个循环后72.0℃延伸10min。反应结束后获得大小约为603bp的ORF5基因片段(ORF5mut)。

将获得的ORF5mut基因克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)上构建质粒pMD18-ORF5mut测序，测序结果证实构建正确后以EcoR I和EcoRV酶切pMD18-ORF5mut，回收603bp大小的ORF5mut基因片段，插到华中农业大学动物病毒室构建的真核表达载体pCMVPA(江云波，猪繁殖与呼吸综合征病毒新型疫苗研究，博士论文，2007年，中国知网)中的EcoR I和Sma I酶切位点，得到pCMVPA-ORF5mut质粒。用Bgl II和BamH I酶切质粒pCMVPA-ORF5mut，回收约2.0kb的片段插入通用转移载体pgG-Uni(方六荣等，伪狂犬病病毒gG基因缺失通用转移载体的构建，华中农业大学学报，2001，20(4)：306-309)中，构建转移质粒pgG-CMV-ORF5mut。用Bgl II和Xhol I酶切质粒pCDNA-ORF2m(樊慧英，猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究，博士论文，2007年，中国知网)回收1.7kb左右的片段将其插入pCI-neo(购自Promega公司)的Bgl II和Xhol I位点之间，构建质粒pCI-ORF2m；然后将pCI-ORF2m用BglII和Sma I酶切回收约1.58kb的CMV-ORF2m基因片段插入pgG-CMV-ORF5mut的BamH I和Stu I位点构建质粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut，其构建流程如图1所示，pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut转移质粒图谱如图2所示，其酶切鉴定如图3所示。

3、重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2(E001)的构建

在PK-15细胞上增殖rPRV-GP5-M亲本株，提取病毒基因组DNA(提取方法参照王柳等，人巨细胞病毒的分子克隆及其特异性DNA探针的制备，生物技术，1994，4(4)：33-35)。应用脂质体介导转染技术(方法参照周复春等，伪狂犬病病毒鄂A株gG-/LacZ+突变株的构建，畜牧兽医学报，2001，32(2)，129-133)将其与pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut转移载体共转染PK-15细胞，通过同源重组交换将CMV-ORF5mut-polyA和CMV-ORF2m-polyA两个独立的完整表达盒导入到rPRV-GP5-M基因组的gG基因位点(图4)，待产生细胞病变后收毒。将病毒液接种于PK-15细胞，用含1％低熔点琼脂糖的DMEM(美国GIBCO公司产品)维持液覆盖，于37℃5％CO₂的条件下培养，当出现细胞病变时，用0.01％的中性红染色1h，由于病变细胞不能着色，而正常细胞被染成红色，从而出现圆点状空斑，挑取单个空斑接种PK-15细胞扩大培养，通过PCR扩增ORF5mut和ORF2m基因的鉴定阳性重组病毒(PCR结果见图5和图6)，如此进行三次纯化，直到阳性率为100％，从而确定病毒液中只含有重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2，而没有亲本毒株的污染。其构建流程如图4。

4、重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2(E001)的鉴定及其生物学特性

重组伪狂犬病毒株(rPRV-PRRSV-PCV2，即本发明已按专利程序送交中国典型培养物保藏中心保藏的生物材料样品，即E001)的mRNA水平检测：

以重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2(E001)的mRNA(提取病毒RNA方法参见江云波，猪繁殖与呼吸综合征病毒新型疫苗研究，博士论文，2007年，中国知网)为模板扩增插入的外源基因，结果表明rPRV-PRRSV-PCV2病毒株可以扩增到插入的目的基因，而亲本株rPRV-GP5-M则检测不到，说明目的基因已经插入到了亲本株基因组gG基因位点中。

重组伪狂犬病毒株(rPRV-PRRSV-PCV2，即本发明已按专利程序送交中国典型培养物保藏中心保藏的生物材料样品，即E001)Southern-blotting鉴定：

主要方法如下：提取重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2(即E001，保藏编号：CCTCC NO：V200808)的基因组DNA(参考文献：王柳等，人巨细胞病毒的分子克隆及其特异性DNA探针的制备，生物技术，1994，4(4)，33-35)分别用Sal I和SphI+NotI酶切后，在0.8％的琼脂糖凝胶上30伏电泳6小时后，按常规方法(萨姆布鲁I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著，《分子克隆实验指南》第二版.金冬雁等译校，科学出版社，1998)进行Southern-blotting鉴定。将酶切后电泳的重组毒株的基因组DNA转移到硝酸纤维素膜上，80℃烤膜后备用。PCR扩增截去前41个氨基酸的ORF2基因的DNA片段，按DNA回收试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限公司)操作说明书回收目的DNA后，用地高辛标记(具体方法按Roch公司的地高辛标记试剂盒说明书操作)，作为DNA探针，置于-20℃保存备用。最后将DNA探针与备用的硝酸纤维素膜杂交，结果如图7所示。试验结果表明，Sal I和SphI+NotI酶切的rPRV-PRRSV-PCV2病毒株基因组DNA泳道有明显的特异性杂交带，大小与预期相符，而rPRV-GP5-M病毒株基因组DNA泳道则没有，证实CMV-ORF5-PolyA和CMV-ORF2m-PolyA表达盒已正确插入到了亲本株基因组gG基因位点中。

本发明构建的重组伪狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2在细胞上的增殖特点与其亲本株rPRV-GP5-M没有明显差异。在PK-15细胞上的增殖滴度可以达到10^-7.5TCID₅₀/mL以上，在PK-15细胞上传20代，其增殖滴度没有明显的变化，并均可稳定的扩增出插入的外源基因。

5、伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒三价基因工程疫苗的制备

将鉴定构建正确、增殖滴度高、遗传稳定，并具有良好生物学活性的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2种毒按1/10的体积比接种鸡胚成纤维细胞，收集增殖滴度达10^6.8TCID₅₀/mL以上的病毒液，按病毒液∶明胶为7∶1的体积比加入明胶作保护剂，充分混匀后按2.5mL/瓶分装于灭菌冻干瓶中，置冷冻干燥机中冻干，压盖后置4℃保存备用。

6、伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒三价基因工程疫苗的安全性评价

将50只伪狂犬病毒抗体阴性的健康Balb/C小鼠随机分为五组，其中一组接种10⁶TCID₅₀的rPRV-PRRSV-PCV2重组三价基因工程疫苗，另外两组分别接种同样剂量的亲本株rPRV-GP5-M和重组伪狂犬病毒-猪圆环病毒2型rPRV-PCV2(Ju等，Immunogenicity of arecombinant pseudorabies virus expressing ORF 1-ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2.VetMicro.2005，109：179-190.)作为本发明中的重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2的对照。一组接种同样剂量的PRV野毒鄂A强毒株(华中农业大学分离鉴定的伪狂犬病病毒强毒Ea株或称为鄂A株，两者为同一毒株(见陈焕春等，畜牧兽医学报，1998，29(2)，151-156)作为病毒毒性对照，余下一组作为不免疫空白对照组，观察14天。结果接种本发明中的三价重组基因工程疫苗和对照组的小白鼠精神食欲均正常，无异常表现；而接种强毒(PRV野毒鄂A株)的小自鼠，从接种后72小时开始死亡，到144小时全部死亡，表明该重组三价基因工程疫苗对小白鼠是安全的(表1)。

表1本发明的rPRV-PRRSV-PCV2重组三价基因工程疫苗对Balb/C小鼠的安全性

将rPRV-PRRSV-PCV2重组基因工程疫苗按10^7.0TCID₅₀的病毒量接种25日龄的仔猪，部分出现轻度的发热反应，两天后恢复正常，在此期间仔猪的精神食欲正常，未见异常变化，可以检测到伪狂犬病毒中和抗体。PRV野毒鄂A株(来源同上)接种的仔猪，第二天全部呈现发热反应，持续一周，并有一头死亡，解剖发现具有典型的伪狂犬病病理变化，而空白对照组既没有体温升高，也没有异常临床表现。按10^7.0TCID₅₀的病毒量接种rPRV-PRRSV-PCV2疫苗的妊娠母猪和未接种疫苗的妊娠母猪，窝产仔数基本相当，均没有出现死胎、木乃伊胎等。结果简明该疫苗对仔猪和妊娠母猪均是安全的。

7、rPRV-PRRSV-PCV2重组三价基因工程疫苗的免疫效力检测

1)小鼠的免疫程序

将重组病毒rPRV-PRRSV-PCV2制成的冻干活疫苗经颈部肌肉注射6-8周龄Balb/c小鼠，每组6只，每只接种剂量为10⁵TCID₅₀，共免疫2次，间隔3周；同时设亲本株rPRV-GP5-M、重组病毒rPRV-PCV2对照，并设置一组不免疫阴性对照(negative control)。所有免疫小鼠于首免后3周通过尾静脉采血，6周眼眶放血，分离血清后分别进行特异性针对PRV的ELISA抗体和中和抗体检测(方法参照Jiang等，Immunogenicity and protective efficacy of recombinantpseudorabies virus expressing the two major membrane-associated proteins of porcine reproductiveand respiratory syndrome virus.Vaccine，2007，25：547-560.)，针对PRRSV的中和抗体水平检测(方法参照方六荣等，表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的构建及其生物学特性初步探讨，病毒学报，2004，20(3)：249-254)，以及针对猪圆环病毒的ELISA抗体水平检测(方法参照Ju等，Immunogenicity of a recombinantpseudorabies virus expressing ORF1-ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2.Vet Micro.2005，109：179-190)。

2)伪狂犬病毒抗体水平检测

重组三价基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)首免后3周可以检测到特异性针对PRV的ELISA抗体和中和抗体，并于二免后3周达到最高，其抗体滴度达到1∶20480，而中和抗体达到32.6±17.6，和亲本株rPRV-GP5-M免疫组所表现出的趋势和实际值均无显著性差异(表2)，表明重组三价基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)可以较好地诱导特异性针对PRV的免疫应答。

表2重组三价基因工程疫苗免疫小鼠诱发特异性针对PRV的抗体水平

说明：a：SN指中和抗体；

b：PRV的ELISA抗体效价是指针对PRV全病毒粒子的ELISA抗体滴度。

3)猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体检测

采用文献(Pirzadeh B等，J Gen Virol，Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNAencoding ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus，1998，79：989-999)报道的PRRSV中和抗体检测方法，检测血清中特异性针对PRRSV的中和抗体水平。结果表明，重组三价基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)免疫组在首免后3周可以检测到特异性针对变异和非变异PRRSV的中和抗体(＞＝1∶4)，并随着免疫时间的延长而上升，于首免后6周达到最高。重组三价基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)诱发的特异性针对非变异PRRSV的中和抗体与亲本株(rPRV-GP5-M)免疫组相比差异不显著(P＞0.05，t-test)，而亲本株(rPRV-GP5-M)免疫组诱发的针对变异PRRSV的中和抗体水平却很低。表明本发明中的重组三价基因工程疫苗不紧能够较好地诱发免疫小鼠产生特异性针对非变异PRRSV的中和抗体也能诱发免疫小鼠产生特异性针对变异PRRSV的中和抗体。重组病毒rPRV-PCV2和空白对照组在整个实验过程中都未检测到特异性针对变异和非变异PRRSV的中和抗体，试验结果如表3、表4。

表3重组三价基因工程疫苗免疫小鼠诱发特异性针对非变异PRRSV的中和抗体水平

Time after primary

Vaccine

＜1∶8^a 1∶8 1∶16 1∶32

vaccination

3W 5^b 1 0 0

rPRV-PRRSV-PCV2

6W 1 1 3 1

3W 6 0 0 0

rPRV-GP5m-M

6W 2 0 3 1

3W 6 0 0 0

Neg control

6W 6 0 0 0

3W 6 0 0 0

rPRV-PCV2

6W 6 0 0 0

^a中和抗体效价.^b达到一定中和抗体效价的免疫小鼠数量.

表4重组三价基因工程疫苗免疫小鼠诱发特异性针对变异PRRSV的中和抗体水平

Time after primary

Vaccine

＜1∶8^a 1∶8 1∶16 1∶32

vaccination

3W 4^b 2 0 0

rPRV-PRRSV-PCV2

6W 1 1 4 0

3W 6 0 0 0

rPRV-GP5m-M

6W 2 4 0 0

3W 6 0 0 0

Neg control

6W 6 0 0 0

3W 6 0 0 0

rPRV-PCV2

6W 6 0 0 0

^a中和抗体效价.^b达到一定中和抗体效价的免疫小鼠数量

3)猪圆环病毒抗体检测

采用文献(樊慧英，猪圆环病毒2型基因工程疫苗的研究，博士论文，2007年，中国知网)报道的抗PCV2的ELISA抗体检测方法，检测血清中特异性针对PCV2的ELISA抗体水平。结果表明，重组三价基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)和重组病毒rPRV-PCV2两个免疫组在首免后3周可以检测到特异性针对PCV2的ELISA抗体，并趋于上升，两组之间差异不显著(P＞0.05，t-test)，表明本发明中的重组三价基因工程疫苗能够较好地诱发免疫小鼠产生特异性针对PCV2的ELISA抗体。亲本株rPRV-GP5-M和空白对照组在整个实验过程中都都未检测到PCV2特异性抗体(OD630nm＜0.4)，试验结果如图9所示。

SEQUENCELISTING

<110>华中农业大学

<120>重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株及应用

<130>

<141>2009-02-17

<160>4

<170>PatentInversion3.1

<210>1

<211>603

<212>DNA

<213>猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(603)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(603)

<223>

<400>1

atgttggggaaatgcttgaccgcgtgctgttgctcgcgattgctttttttgtggtgtatcgtgccgttctatcttgctgtgctcgtcaacgccagcaacaacaacagctctcatattcagttgatttataacttaacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggcacaaaaatttgactgggcagtggagacttttgtcatcttccccgtgttgactcacattgtttcctatggggcacttaccaccagccatttccttgatacagttggtcttgccactgtgtccaccgccggatattatcgcgggcggtatgtcttgagtagcatttacgcagtctgtgctctggctgcgctgacttgctttgtcattaggcttgcgaagaactgcatgtcctggcgctactcttgtaccagatataccaacttccttctggacactaagggcagactctatcgttggcggtcgcccgtcattgtggagaaagggggtaaggttgaggtcgaaggtcacctgatcgacctcaagagagttgtgcttgatggttccgcggcaacccctttaaccagagtttcagcggaacaatggggtcgtctctagatgttggggaaatgcttgaccgcgtgctgttgctcgcgattgctttttttgtggtgtatcgtgccgttctatcttgctgtgctcgtcaacgccagcaacaacaacagctctcatattcagttgatttataacttaacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggcacaaaaatttgactgggcagtggagacttttgtcatcttccccgtgttgactcacattgtttcctatggggcacttaccaccagccatttccttgatacagttggtcttgccactgtgtccaccgccggatattatcgcgggcggtatgtcttgagtagcatttacgcagtctgtgctctggctgcgctgacttgctttgtcattaggcttgcgaagaactgcatgtcctggcgctactcttgtaccagatataccaacttccttctggacactaagggcagactctatcgttggcggtcgcccgtcattgtggagaaagggggtaaggttgaggtcgaaggtcacctgatcgacctcaagagagttgtgcttgatggttccgcggcaacccctttaaccagagtttcagcggaacaatggggtcgtctctag

<210>2

<211>200

<212>PRT

<400>2

MetLeuGlyLysCysLeuThrAlaCysCysCysSerArgLeuLeuPhe

151015

LeuTrpCysIleValProPheTyrLeuAlaValLeuValAsnAlaSer

202530

AsnAsnAsnSerSerHisIleGlnLeuIleTyrAsnLeuThrLeuCys

354045

GluLeuAsnGlyThrAspTrpLeuAlaGlnLysPheAspTrpAlaVal

505560

GluThrPheValIlePheProValLeuThrHisIleValSerTyrGly

65707580

AlaLeuThrThrSerHisPheLeuAspThrValGlyLeuAlaThrVal

859095

SerThrAlaGlyTyrTyrArgGlyArgTyrValLeuSerSerIleTyr

100105110

AlaValCysAlaLeuAlaAlaLeuThrCysPheValIleArgLeuAla

115120125

LysAsnCysMetSerTrpArgTyrSerCysThrArgTyrThrAsnPhe

130135140

LeuLeuAspThrLysGlyArgLeuTyrArgTrpArgSerProValIle

145150155160

ValGluLysGlyGlyLysValGluValGluGlyHisLeuIleAspLeu

165170175

LysArgValValLeuAspGlySerAlaAlaThrProLeuThrArgVal

180185190

SerAlaGluGlnTrpGlyArgLeu

195200

<210>3

<211>705

<212>DNA

<213>猪圆环病毒（Porcinecircovirus）

<220>

<221>gene

<222>(1)..(705)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(705)

<223>

<400>3

atgacgtatccaaggaggcgtttccgcagacgaagacaccgcccccgc48

MetThrTyrProArgArgArgPheArgArgArgArgHisArgProArg

151015

agccatcttggccagatcctccgccgccgcccctggctcgtccacccc96

SerHisLeuGlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuValHisPro

202530

cgccaccgttaccgctggagaaggaaaaatggcatcttcaacacccgc144

ArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePheAsnThrArg

354045

ctctcccgcaccttcggatatactgtcaagaaaaccacagtcagaacg192

LeuSerArgThrPheGlyTyrThrValLysLysThrThrValArgThr

505560

ccctcctgggcggtggacatgatgagatttaatattaacgatttcctt240

ProSerTrpAlaValAspMetMetArgPheAsnIleAsnAspPheLeu

65707580

cccccaggagggggctcaaaccccctcactgtgccctttgaatactac288

ProProGlyGlyGlySerAsnProLeuThrValProPheGluTyrTyr

859095

agaataagaaaggttaaggttgaattctggccctgctccccaatcacc336

ArgIleArgLysValLysValGluPheTrpProCysSerProIleThr

100105110

cagggtgacaggggagttggatccactgctgttattctagatgataac384

GlnGlyAspArgGlyValGlySerThrAlaValIleLeuAspAspAsn

115120125

tttgtaacaaaggccacagccctgacttatgatccctatgtaaactac432

PheValThrLysAlaThrAlaLeuThrTyrAspProTyrValAsnTyr

130135140

tcctcccgccataccataacccagcccttctcctaccactcccggtac480

SerSerArgHisThrIleThrGlnProPheSerTyrHisSerArgTyr

145150155160

tttaccccgaaacctgttcttgattccactattgattacttccaacca528

PheThrProLysProValLeuAspSerThrIleAspTyrPheGlnPro

165170175

aataacaaaaggaatcagctttggctgaggctacaaacctctgcaaat576

AsnAsnLysArgAsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGlnThrSerAlaAsn

180185190

gtggaccacgtaggcctcggcactgcgttcgaaaacagtatatacgac624

ValAspHisValGlyLeuGlyThrAlaPheGluAsnSerIleTyrAsp

195200205

caggactacaatatccgtgtaaccatgtatgtacaattcagagaattt672

GlnAspTyrAsnIleArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPhe

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AsnLeuLysAspProProLeuAsnProLys

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<210>4

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<212>PRT

<213>猪圆环病毒（Porcinecircovirus）

<400>4

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151015

SerHisLeuGlyGlnIleLeuArgArgArgProTrpLeuValHisPro

202530

ArgHisArgTyrArgTrpArgArgLysAsnGlyIlePheAsnThrArg

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LeuSerArgThrPheGlyTyrThrValLysLysThrThrValArgThr

505560

ProSerTrpAlaValAspMetMetArgPheAsnIleAsnAspPheLeu

65707580

ProProGlyGlyGlySerAsnProLeuThrValProPheGluTyrTyr

859095

ArgIleArgLysValLysValGluPheTrpProCysSerProIleThr

100105110

GlnGlyAspArgGlyValGlySerThrAlaValIleLeuAspAspAsn

115120125

PheValThrLysAlaThrAlaLeuThrTyrAspProTyrValAsnTyr

130135140

SerSerArgHisThrIleThrGlnProPheSerTyrHisSerArgTyr

145150155160

PheThrProLysProValLeuAspSerThrIleAspTyrPheGlnPro

165170175

AsnAsnLysArgAsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGlnThrSerAlaAsn

180185190

ValAspHisValGlyLeuGlyThrAlaPheGluAsnSerIleTyrAsp

195200205

GlnAspTyrAsnIleArgValThrMetTyrValGlnPheArgGluPhe

210215220

AsnLeuLysAspProProLeuAsnProLys

225230

Claims

1.一种重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株(Pseudorabies virus-Porcine reproductive and respiratory syndrome virus-Porcinecircovirus)E001，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：V200808。

2.包含权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒毒株的基因工程疫苗。

3.权利要求1所述的一种重组猪伪狂犬病毒-猪繁殖与呼吸综合征病毒-猪圆环病毒基因工程毒株在制备伪狂犬病-猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病基因工程疫苗上的应用。