CN105385666B - 伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种伪狂犬病病毒双荧光标记5基因缺失株的构建。该病毒株是以自行分离的一株伪狂犬病病毒(SX株)为母本，通过分子生物学手段，缺失伪狂犬病病毒的gE基因、gI基因、US9基因、UL49.5部分基因和TK基因，并以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为标记蛋白代替缺失的基因，获得双荧光标记的5基因缺失病毒株(rPRV/gE‑/gI‑/US9‑/△UL49.5/TK‑/GFP+/RFP+)。本发明建立了一套伪狂犬活病毒载体系统；双荧光蛋白标记便于今后基因工程操作的筛选和鉴定；可同时插入多种外源基因，较一般活载体系统更加高效。该双荧光标记缺失病毒作为活载体的成功构建，为研制重组伪狂犬病基因工程疫苗奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一株双荧光标记5基因(gE、gI、US9、UL49.5、TK)缺失伪狂犬病病毒(或称伪狂犬病毒)的构建，属于生物技术和动物病毒学领域。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR；又名Aujeszky’s disease，AD)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病，可感染多种家畜、伴侣动物及野生动物。猪是感染后可以存活的唯一物种，也是病毒贮存宿主。感染猪主要表现为神经症状、流涎、呼吸困难、母猪繁殖障碍、仔猪高死亡率等，给养猪业造成巨大的经济损失。
PRV是疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、水痘病毒属的成员。PRV基因组为线性双股DNA，约145Kb，由长独特区(UL)和短独特区(US)及US两侧的末端倒转重复(TR)与内部重复(IR)组成，可编码70-100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白。在上述基因产物中，UL区段中的gC、TK及US区段中的PK、gG、gI、gE、11K和28K为病毒增殖的非必需成份，一般认为，TK、gC、gE、PK和CP(衣壳蛋白)等与PRV毒力相关。另外，疱疹病毒基因组中，UL49.5编码的囊膜蛋白gN能抑制TAP介导的多肽转运到内质网，在病毒感染的细胞内阻断MHC I类复合体的装配，从而下调MHC I类分子在细胞表面的表达，使得病毒有可能逃避宿主CD8+T细胞的识别，并在宿主鼻腔及上呼吸道上皮细胞中复制，引起化脓性反应或组织溃烂，进而导致细菌二次感染及严重的肺炎。
疫苗免疫接种是防制伪狂犬病的主要策略。伪狂犬疫苗主要分为三种：一是常规疫苗，即灭活疫苗和弱毒活疫苗，如目前应用较多的Bartha-K61株活疫苗；二是基因缺失疫苗，即通过分子生物学方法，人工缺失某些基因，使其毒力减弱的同时又保留其免疫原性。目前构建的伪狂犬病病毒基因工程疫苗大多为TK、gI、gE、gG基因的单基因缺失或多基因缺失突变株。
PRV作为基因工程载体具备相当的优势：(1)PRV不感染人，具有很好的安全性。现有的活疫苗株Bartha-K61或‘783’等在世界上已应用了几十年，未发生重大的安全事故。(2)基因组容量大：在PRV长达145Kb的基因组中，约一半基因被认为是非必需的，如gI、gE、gM、TK、PK、gC和dUTPase等，在这些区域可先后或同时插入和表达多种外源基因而不显著影响其繁殖及免疫原性。(3)生产原材料来源方便，生产成本低：PRV疫苗可以接种SPF鸡胚成纤维细胞及PK15、ST等传代细胞生产，原材料充足，生产工艺成熟，且PRV病毒滴度很容易达到免疫要求，大大降低了生产成本。(4)免疫期长：PRV以细胞免疫为主，病毒可以较长时间感染，外源基因可以在体内持续表达。(5)宿主范围广，多种家畜、经济动物(如狐和貂)、伴侣动物及野生动物均可感染PRV，可研制针对不同动物的活载体疫苗。
发明内容
本发明的目的是将自行分离并经鉴定命名为伪狂犬病毒SX株作为亲本毒，经基因工程方法构建缺失gE、gI、US9、部分UL49.5基因和TK基因并插入GFP和RFP标记的重组病毒；并以该重组病毒作为疫苗候选毒株或伪狂犬活病毒载体系统，用于基因工程疫苗的开发和应用。
本发明的技术方案
1.一种伪狂犬病病毒株，其特征在于所述该病毒株为伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus)rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11493。
2.一种伪狂犬病毒株，其特征在于该伪狂犬病毒株同时缺失了gE基因、gI基因、US9基因、TK基因和部分UL49.5基因五种伪狂犬病毒基因，在基因缺失的部位通过同源重组分别插入绿色荧光蛋白(GFP)基因和红色荧光蛋白(RFP)基因作为标记物。
3.如权利要求1所述伪狂犬病毒株，其特征在于缺失的UL49.5部分基因包括其所表达的gN蛋白的胞外域37～40氨基酸所对应的12个核苷酸序列及胞质尾区(CT)全部51个核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的伪狂犬病毒株的构建方法，其特征在于该毒株构建的步骤为：
(1)亲本毒株：用自主分离和鉴定并命名为伪狂犬病毒(PRV)SX株作为亲本毒株；
(2)转移载体的构建：以pMD-18T克隆载体为骨架载体，构建四种转移载体：第一种转移载体为pMD-US6-GFP-US2，插入伪狂犬病毒gI、gE和US9两端的US6和US2部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入GFP基因；第二种转移载体为pMD-UL50-UL49.5-△37～40-CT-RFP-UL49，插入UL49.5基因CT序列两端部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因；第三种转移载体为pMD-UL50-UL49.5-△37～40-CT-UL49，插入UL49.5基因CT基因两端部分基因序列作为同源臂，将第二种转移载体引入的RFP基因敲除；第四种转移载体为pMD-UL24-RFP-UL22，插入伪狂犬病毒TK基因两端的UL24和UL22部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因；
(3)双荧光标记缺失病毒的构建：首先将(2)中的pMD-US6-GFP-US2转移载体与亲本株PRVSX株共转染PK15细胞，通过克隆筛选，获得含GFP标记蛋白的缺失病毒株(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+株)；第二步将上一步缺失株与pMD-UL49.5-△37-40-CT-RFP转移载体共感染PK15细胞，筛选出缺失株(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+/RFP+株)后，再通过同源重组将RFP标记基因敲除；第三步将筛选的rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5缺失株再与pMD-UL24-RFP-UL22转移载体共转染PK15细胞，通过克隆筛选获得双荧光标记缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株。
5.权利要求1所述的伪狂犬病毒株的应用，其特征在于rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株作为候选毒株，敲除其中GFP和RFP后作为疫苗生产毒株用于制备伪狂犬病活疫苗。
6.权利要求1所述的伪狂犬病毒株的应用，其特征在于rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株作为活载体病毒插入一种和/或多种动物病原抗原基因，以获得表达外源基因的重组病毒，制备基因工程活载体疫苗，达到同时防制多种疾病的目的。
本发明技术路线如下：
1.通过基因克隆技术以PRV(SX株)部分US6和US2基因序列作为同源臂，以及绿色荧光蛋白基因GFP作为筛选标记构建转移载体pMD-US6-GFP-US2，将PRV(SX株)病毒和转移载体共转染PK15细胞获得缺失gE、gI和US9基因，同时插入GFP标记的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+。
2.以PRV SX株的UL49.5基因为模板，构建两个克隆载体pMD18T-△37-40和pMD18T-CT-null，分别缺失UL49.5中胞外域37-40氨基酸基因序列和胞质尾区(CT)80-96氨基酸，并将缺失了这两部分的基因片段通过引入酶切位点AflII进行连接，构建含有CT基因两端部分基因序列的同源臂的转移载体pMD-UL50-UL49.5-△37～40-CT-RFP-UL49，将rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+病毒和转移载体共转染PK15细胞获得缺失gE、gI、US9、部分UL49.5基因(37-40氨基酸基因序列和CT基因序列)的缺失病毒，获得同时插入RFP标记的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+/RFP+。再通过同源重组将RFP缺失，最终筛选rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+缺失病毒。
3.以TK基因两测的UL24和UL22部分基因序列为同源臂，以红色荧光蛋白基因(RFP)作为筛选标记构建转移载体pMD-UL24-RFP-UL22，将其与rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+病毒共转染PK15细胞获得缺失TK基因同时插入RFP标记的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+。
4.对重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+进行生物特性分析，试验结果表明该重组病毒能在PK15细胞上稳定遗传，对小鼠安全，与未缺失UL49.5部分基因序列的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+相比，在PK15细胞上出现病变的时间提前8小时左右
具体实施方式
1.载体
pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有GFP基因的载体pU-EGFP和含有RFP基因的载体pU-ERFP，均由专利申请人所在实验室保存。
2.引物设计
根据GenBank上发表的PRV序列设计合成以下引物：
(1)扩增gI基因左同源臂：
US6F：5’-GACTTAAGGATCTCCGACCCGCAGGTGG-3’(序列1)
US6R：5’-GACTTAAGGGAGCCGGGTCACGTCGCGC G-3’(序列2)
(2)US9基因右同源臂：
US2F：5’-GACTAGTATGGGGGTGACGGCCATCAC-3’(序列3)
US2R：5’-GACTAGTCGGAGAGATCCTGCCGTCTAGG-3’(序列4)
(3)GFP基因：
EGFP-F：5’-GGTATACGGATCCAAGGAGATATAACA-3’(序列5)
EGFP-R：5’-GACTAGTGAGCTCTTAAAGCTCATCAT-3’(序列6)
(4)US9基因：
PUS9-F：5’-AGAAACCGGAAGTGACGAATGG-3’(序列7)
PUS9-R：5’-AGGAGCACCTGGTCGCAGAG-3’(序列8)
(5)UL49.5基因(扩增含37-40aa基因片段)：
PUL50F：5’-GCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3’(序列9)
PUL50R：5’-TGGCGAGCGAGTGGGGTC-3’(序列10)
(6)缺失△37-40aa基因的UL49.5部分基因(引入AflII酶切位点，用于UL49.5基因的连接)：
rPUL50F2：5’-TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCGGAGA-3’(序列11)
rPUL50R2：5’-ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAGGGCgAC-3’(序列12)
(7)UL49.5基因(扩增缺失了CT的UL49.5部分基因片段)：
rPUL49F：5’-TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGC-3’(序列13)
rPUL49R：5’-AGAATTCGCAGCGTGGACACGAAG-3’(序列14)
rPUL49F2：5’-ACTTAAGATCGATCCGCACGCGC-3’(引入AflII酶切位点，用于UL49.5基因的连接)(序列15)
(8)UL49.5基因左同源臂：
UL50F：5’-TAAGCTTGCCTGCAAGATGTAGCCG-3’(序列16)
UL50R:5’-ACTTAAGTTAGGCGTAACCCAG-3’(序列17)
(9)UL49.5基因右同源臂：
UL48F:5’-TACTAGTAGATCGATCCGCACGCGCCCG-3’(序列18)
UL48R:5’-AGAATTCGCAGCGTGGACACGAA-3’(序列19)
(10)TK基因左同源臂：
UL24F：5’-GGTATACCCGTGGTCGTCACGCCCATGAA-3’(序列20)
UL24R：5’-G GTATACATGCGCATCCCGGCGCGCTTC-3’(序列21)
(11)TK基因右同源臂：
UL22F：5’-GACTAGTATGCCCGCGTCGTCCGTGCGC-3’(序列22)
UL22R：5’-GACTAGTGCGGTACGCCTCGGCGACGGT-3’(序列23)
(12)RFP基因：
RFP-F：5’-GGTATACATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’(序列24)
RFP-R：5’-GACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(序列25)
3.含GFP标记的伪狂犬缺失病毒(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+)的构建
(1)转移载体pMD-US6-GFP-US2的构建
以PRV SX株(中国兽医药品监察所由山西某猪场采集的病死猪脑组织病料中自主分离、鉴定而获得，图1、2)的基因组为模板，采用引物US6F/R(序列1、2)和US2F/R(序列3、4)分别扩增gE、gI、US9缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-EGFP为模板，用引物EGFP-F/EGFP-R(序列5、6)扩增GFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/AflII双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-GFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-US6-GFP-US2。
(2)同源重组
将转移载体pMD-US6-GFP-US2与PRV(SX株)亲本株共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书(见附件1)进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+。
(4)重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+的鉴定
采用gE、gI、US9和GFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI和US9片段，扩增出GFP片段。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI和US9三段基因，并成功插入了GFP标记基因。
4.伪狂犬病毒双荧光标记缺失病毒(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+/RFP+)的构建
(1)转移载体的构建
通过基因克隆技术以PRV(SX株)UL49.5基因为模板，构建两个克隆载体pMD18T-△37～40和pMD18T-CT-null(序列11、12、13、14、15、16、17、18、19)，分别缺失UL49.5中胞外域37～40氨基酸基因序列和胞质尾区(CT)80～96氨基酸，并将缺失了这两部分的基因片段通过引入酶切位点AflII进行连接，构建含有CT基因两端部分基因序列的同源臂的转移载体pMD-UL50-UL49.5-△37～40-CT-RFP-PU49。
(2)同源重组
将rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+病毒和上述转移载体共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功，获得缺失gE、gI、US9、部分UL49.5基因(37～40氨基酸基因序列和CT基因序列)的缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+/RFP+。
再通过同源重组将RFP缺失，最终筛选出rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+缺失病毒。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于1ml DMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+。
(4)重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+的鉴定
采用gE、gI、US9、UL49.5和GFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI和US9片段，扩增出缺失了相应大小片段的UL49.5，扩增出GFP片段。并经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI、US9、UL49.5的37～40氨基酸对应的核苷酸和CT基因，并含有GFP标记基因。
5.伪狂犬病毒双荧光标记缺失病毒株(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+)的构建
(1)转移载体的构建
以PRV SX株的基因组为模板，采用引物UL24F/R(序列20、21)和UL22F/R(序列22、23)分别扩增TK缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-RFP为模板，用引物RFP-F/RFP-R(序列24、25)扩增RFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/BstZ17I双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-RFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-UL24-RFP-UL22。
(2)同源重组
将转移载体pMD-UL24-RFP-UL22与rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察荧光，挑选同时表达了绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化4次，将获得的重组病毒命名为伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株(简称伪狂犬病毒双荧光标记5基因缺失株)，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11493。
(4)重组伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株的鉴定
采用gE、gI、US9、GFP、UL49.5、TK和RFP基因特异性引物进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI、US9、TK基因片段，扩增出GFP、RFP基因片段，扩增出缺失了相应大小片段的UL49.5基因。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI、US9、TK基因，成功缺失了UL49.5的37-40氨基酸对应碱基和CT基因，并成功插入了GFP、RFP标记基因(见附图3)。
(5)重组伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株生物学特性
1)病毒含量测定 对重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒进行病毒含量测定。结果发现重组病毒含量可达107.0TCID50/ml。
2)遗传稳定性试验 重组伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒在PK15细胞上传代10代，绿色和红色荧光蛋白均能稳定表达，通过PCR鉴定每个代次的病毒液，可检测到插入的GFP基因和RFP基因及插入点两侧的病毒基因序列，表明所获得的重组伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒能稳定遗传。在传代过程中发现，该重组毒株在PK15细胞上出现病变的时间要比重组毒株rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+早8个小时。
3)对小鼠安全性试验 将rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+及亲本株SX株分别以106.0TCID50病毒量接种Balb/c小鼠，每组6只，观察14天，结果rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒接种的小鼠在14天均表现正常，而接种SX株PRV的小鼠全部死亡，取两组小鼠脑组织，病料处理后接种PK15细胞，伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒组小鼠的脑组织中均能检测到红色荧光和绿色荧光。由此说明，重组伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株毒力较亲本株明显下降，且高剂量攻击小鼠，对小鼠是安全的。
附图说明
图1是发病猪脑组织样品gI基因PCR鉴定结果图图中：M.DNAMarker2000；1.脑组织样品；2.阳性对照(PRV疫苗)；3.灭菌水阴性对照。
图2是分离病毒在PK15细胞上的病变情况图图中：A.分离病毒接种PK15细胞20小时后细胞开始脱落，出现空泡；B.正常细胞对照。
图3图是重组病毒rPRV-gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株PCR鉴定电泳图图中：M.DNAMarkerIV；1、2、3、4依次为重组病毒gE、gI、US9、GFP扩增结果；5、6、7、8依次为亲本毒伪狂犬病毒SX株gE、gI、US9、GFP扩增结果。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的微生物为：伪狂犬病毒SX株，系中国兽医药品监察所由山西某猪场采集的病死猪脑组织病料中自主分离、鉴定而获得；并对此分离病毒经分子生物技术，缺失gE基因、gI基因、US9基因、UL49.5部分基因和TK基因，并以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为标记蛋白代替缺失的基因，获得双荧光标记的缺失病毒，命名为伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11493。
本发明的积极意义
本发明涉及一种伪狂犬病毒双荧光标记5基因缺失株的构建。该病毒株是以自行分离的一株伪狂犬病毒SX株为母本，通过分子生物学手段，缺失伪狂犬病毒的gE基因、gI基因、US9基因、UL49.5部分基因和TK基因，并以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)作为标记蛋白代替缺失的基因，获得双荧光标记的5基因缺失的伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株。本发明建立了一套伪狂犬活病毒载体系统；双荧光蛋白标记便于今后基因工程操作的筛选和鉴定；可同时插入多种外源基因，较一般活载体系统更加高效。该双荧光标记缺失病毒作为活载体的成功构建，为研制重组伪狂犬病基因工程疫苗奠定了基础。
实施例
以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。
实施例1
——伪狂犬病毒双荧光标记基因(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+)缺失株的构建
1.载体
pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有GFP基因的载体pU-EGFP和含有RFP基因的载体pU-ERFP，均由本实验室保存。
2.引物设计
根据GenBank上发表的PRV序列设计合成以下引物(见表1)：
表1本发明构建所涉及的相关引物信息
3.伪狂犬病毒双荧光标记缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+/RFP+株的构建
(1)转移载体的构建
通过基因克隆技术以PRV SX株的UL49.5基因为模板，构建两个克隆载体pMD18T-△37～40和pMD18T-CT-null，分别缺失UL49.5中胞外域37～40氨基酸基因序列和胞质尾区(CT)80-96氨基酸，并将缺失了这两部分的基因片段通过引入酶切位点AflII进行连接，构建含有CT基因两端部分基因序列的同源臂的转移载体pMD-UL49.5-△37-40-CT-RFP。
(2)同源重组
将rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+病毒和上述转移载体共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书(见附件1)进行转染。具体步骤如下：
(以6孔板一个孔的用量为例，其他细胞板各试剂用量配比及对应步骤见附件1附表)
1)细胞培养至长成70-90％细胞单层；
2)取适宜体积的2000脂质体(6、9、12或15μl)加入到150μlOpti-营养液中，混合均匀；
3)取14μg待转染的质粒(DNA含量应达到0.5～5μg/μl)加入到700μlOpti-营养液中，混合均匀；
4)将稀释好的质粒分别与步骤2中稀释好的2000脂质体各150μl等量混合；
5)室温作用5分钟；
6)取250μl混合液加入到准备好的细胞6孔板中，应保证每孔DNA最终含量达到2500ng，每孔脂质体的用量在5～12.5μl。
7)37℃培养箱中培养1～3天后，对转染细胞进行检测。
转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功，获得缺失gE、gI、US9、部分UL49.5基因(37-40氨基酸基因序列和CT基因序列)的缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+/RFP+。
再通过同源重组将RFP缺失，最终筛选出rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+缺失病毒株。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+株。
(4)重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+株的鉴定
采用gE、gI、US9、UL49.5和GFP基因特异性引物(序列3/4、序列1/2、序列15/16、序列7/8、序列13/14)进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI和US9片段，扩增出缺失了相应大小片段的UL49.5，扩增出GFP片段。并经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI、US9、UL49.5的37-40氨基酸对应的核苷酸和CT基因，并含有GFP标记基因。
4.伪狂犬病毒双荧光标记缺失病毒株(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+)的构建
(1)转移载体的构建
以PRV SX株基因组为模板，采用引物UL24F/R(序列28/序列29)和UL22F/R(序列30/序列31)分别扩增TK缺失的同源重组左同源臂和右同源臂；以pU-RFP为模板，用引物RFP-F/RFP-R(序列32/序列33)扩增RFP基因。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒。以SbfI/BstZ17I双酶切左臂，以SpeI/EcoRI双酶切右臂，回收相应片段后依次与pMD-RFP质粒相应酶切后的片段连接，获得转移载体pMD-UL24-RFP-UL22。
(2)同源重组
将转移载体pMD-UL24-RFP-UL22与rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+共转染PK15细胞，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。操作步骤：
(以6孔板一个孔的用量为例，其他细胞板各试剂用量配比及对应步骤见附件1附表)
1)细胞培养至长成70-90％细胞单层；
2)取适宜体积的2000脂质体(6、9、12或15μl)加入到150μlOpti营养液中，混合均匀；
3)取14μg待转染的质粒(DNA含量应达到0.5～5μg/μl)加入到700μlOpti营养液中，混合均匀；
4)将稀释好的质粒分别与步骤2中稀释好的2000脂质体各150μl等量混合；
5)室温作用5分钟；
6)取250μl混合液加入到准备好的细胞6孔板中，应保证每孔DNA最终含量达到2500ng，每孔脂质体的用量在5～12.5μl。
7)37℃培养箱中培养1～3天后，对转染细胞进行检测。
转染24小时后，观察细胞病变及荧光蛋白表达情况。转染细胞裂解后盲传两代，仍有绿色和红色双色荧光表达，初步判断重组病毒拯救成功。
(3)重组病毒的蚀斑纯化
将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的PK15细胞6孔细胞板，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察荧光，挑选同时表达了绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的单个荧光蚀斑于1mlDMEM营养液中，冻融1次后，如此进行蚀斑纯化4次，将获得的重组病毒命名为伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)双荧光标记缺失株(rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+)，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.11493。
(4)重组伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ//△UL49.5TKˉ/GFP+/RFP+株的鉴定
采用gE、gI、US9、UL49.5、GFP、TK和RFP特异性引物(序列3/序列4、序列1/序列2、序列15/序列16、序列7/序列8、序列13/序列14、序列5/序列6、序列32/序列33)进行PCR扩增鉴定，结果发现未扩增出gE、gI、US9、TK基因片段，扩增出GFP、RFP基因片段。经测序证实，重组病毒缺失了gE、gI、US9、TK基因，UL49.5基因缺失了37～40氨基酸对应碱基和CT基因，并成功插入了GFP、RFP标记基因(见附图3)。
实施例2
——重组伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株生物学特性测定
1.病毒含量测定对重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒进行病毒含量测定。结果发现重组病毒含量可达107.0TCID50/ml。
2.遗传稳定性试验重组伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒在PK15细胞上传代10代，绿色和红色荧光蛋白均能稳定表达，通过PCR鉴定每个代次的病毒液，可检测到插入的GFP基因和RFP基因及插入点两侧的病毒基因序列，表明所获得的重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒能稳定遗传。在传代过程中发现，该重组毒株在PK15细胞上出现病变的时间要比重组毒株rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+早10～24个小时。
3.对小鼠安全性试验将伪狂犬病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株及亲本株SX株分别以106.0TCID50病毒量接种Balb/c小鼠，每组6只，观察14天，结果rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒接种的小鼠在14天均表现正常，而接种SX株PRV的小鼠全部死亡，取两组小鼠脑组织，病料处理后接种PK15细胞，rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/TKˉ/GFP+/RFP+株病毒组小鼠的脑组织中均能检测到红色荧光和绿色荧光。由此说明，重组病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株毒力较亲本株明显下降，且高剂量攻击小鼠，对小鼠是安全的。
表2 rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+对小鼠安全性试验结果
附件1
LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书
操作步骤：
(以6孔板一个孔的用量为例，其他细胞板各试剂用量配比及对应步骤见附表)
1.细胞培养至长成70-90％细胞单层；
2.取适宜体积的2000脂质体(6、9、12或15μl)加入到150μlOpti-营养液中，混合均匀；
3.取14μg待转染的质粒(DNA含量应达到0.5～5μg/μl)加入到700μlOpti营养液中，混合均匀；
4.将稀释好的质粒分别与步骤2中稀释好的2000脂质体各150μl等量混合；
5.室温作用5min；
6.取250μl混合液加入到准备好的细胞6孔板中，应保证每孔DNA最终含量达到2500ng，每孔脂质体的用量在5～12.5μl。
7.37℃培养箱中培养1～3天后，对转染细胞进行检测。
附表不同细胞板各试剂用量配比及对应步骤
Claims (5)
1.一种伪狂犬病病毒株，其特征在于所述该病毒株为伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株，即该伪狂犬病病毒株同时缺失了gE基因、gI基因、US9基因、TK基因和部分UL49.5基因五种伪狂犬病病毒基因，在基因缺失的部位通过同源重组分别插入绿色荧光蛋白(GFP)基因和红色荧光蛋白(RFP)基因作为标记物，该毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11493。
2.如权利要求1所述伪狂犬病病毒株，其特征在于缺失的UL49.5部分基因包括其所表达的gN蛋白的胞外域37～40氨基酸所对应的12个核苷酸序列及胞质尾区(CT)全部51个核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的构建方法，其特征在于该毒株构建的步骤为：
(1)亲本毒株：用自主分离和鉴定并命名为伪狂犬病病毒(PRV)SX株作为亲本毒株；
(2)转移载体的构建：以pMD-18T克隆载体为骨架载体，构建四种转移载体：第一种转移载体为pMD-US6-GFP-US2，插入伪狂犬病病毒gI、gE和US9两端的US6和US2部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入GFP基因；第二种转移载体为pMD-UL50-UL49.5-△37～40-CT-RFP-UL49，插入UL49.5基因CT序列两端部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因；第三种转移载体为pMD-UL50-UL49.5-△37～40-CT-UL49，插入UL49.5基因CT基因两端部分基因序列作为同源臂，将第二种转移载体引入的RFP基因敲除；第四种转移载体为pMD-UL24-RFP-UL22，插入伪狂犬病病毒TK基因两端的UL24和UL22部分基因序列作为同源臂，左右同源臂间插入RFP基因；
(3)双荧光标记缺失病毒的构建：首先将(2)中的pMD-US6-GFP-US2转移载体与亲本株PRVSX株共转染PK15细胞，通过克隆筛选，获得含GFP标记蛋白的缺失病毒株rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/GFP+株；第二步将上一步缺失株与pMD-UL49.5-△37-40-CT-RFP转移载体共感染PK15细胞，筛选出缺失株rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/GFP+/RFP+株后，再通过同源重组将RFP标记基因敲除；第三步将筛选的rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5缺失株再与pMD-UL24-RFP-UL22转移载体共转染PK15细胞，通过克隆筛选获得双荧光标记缺失病毒rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株。
4.权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的应用，其特征在于rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株作为候选毒株，敲除其中GFP和RFP后作为疫苗生产毒株用于制备伪狂犬病活疫苗。
5.权利要求1所述的伪狂犬病病毒株的应用，其特征在于rPRV/gEˉ/gIˉ/US9ˉ/△UL49.5/TKˉ/GFP+/RFP+株作为活载体病毒插入一种和/或多种动物病原抗原基因，以获得表达外源基因的重组病毒，制备同时防治多种疾病的基因工程活载体疫苗。
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| Huiyong Wei et al..Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) mutant lacking UL49.5 luminal domain residues 30–32 and cytoplasmic tail residues 80–96 induces more rapid onset of virus neutralizing antibody and cellular immune responses in calves than the wild-type strain Cooper.《Veterinary Immunology and Immunopathology》.2012,第147卷(第3-4期),标题. * |
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| 猪伪狂犬病病毒gE-/gI-/TK-多基因缺失活疫苗对猪的安全性与免疫效力研究;吕素芳等;《动物医学进展》;20140430;第35卷(第4期);第1-5页 * |
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