CN111117974B

CN111117974B - 一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法

Info

Publication number: CN111117974B
Application number: CN201911328787.3A
Authority: CN
Inventors: 张桂红; 易和友; 于之清; 马俊
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2022-02-22
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN111117974A

Abstract

本发明公开了一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法，所述可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒为：在伪狂犬病毒的次要骨架蛋白VP24的Met‑1/Gly‑2之间插入有荧光蛋白。本发明利用CRISPR/Cas9技术，将荧光蛋白EGFP引入PRV基因组，这样产生的重组病毒自身带有绿色荧光标签，无需抗体或者荧光素标记，便可在荧光下观测到单个病毒粒子的定位和运动，从而可以利用绿色荧光追踪病毒粒子的行踪。该重组PRV病毒为研究PRV病毒侵袭宿主的详细感染进程创造了条件。

Description

一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法

技术领域

本发明涉及病毒技术领域，更具体地，涉及一种可视化绿色荧光伪狂犬病毒及其构建方法。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是一种由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的多种家畜和野生动物共患的急性、热性传染病，其主要临床症状以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为特征。近年来，PRV给我国养猪业造成了巨大经济损失。

PRV为疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科猪疱疹病毒1型病毒，其基因组为线性双股DNA，大小约150kb，G+C含量高达73％，由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的末端重复序列(TR)与内部重复序列(IR)所组成，可编码70～100种蛋白，其中gB、gD、gH、gL、gK是病毒增殖所必需的，gE、gL、gG、gC、gM和gN与PRV毒力相关。

高效的基因编辑操作技术，是对病毒进行深入基础研究的必要手段，但对于大基因组病毒(基因组超过30Kb)来说，如疱疹病毒、腺病毒以及痘病毒，若使用常规技术如限制性内切核酸酶等对其进行基因突变、替换几乎是无法实现的。一般来说，对大病毒基因组编辑主要采用标记基因的插入删除或以细菌人工染色体(BAC)反向遗传操作系统为基础，实现对病毒基因组的突变、替换、缺失等。这两种方法均较为繁琐，涉及步骤较多，标记基因的插入删除过程中需构建多个转化子同时需多轮筛选和纯化，BAC操作系统的构建和筛选也较为困难。CRISPR-Cas9系统提供了一种宝贵的工具，以高效、特异性靶向和修饰基因组序列。该系统由RNA引导的核酸酶(Cas9)和与靶序列互补的指导RNA(gRNA)组成，能够对基因组的靶基因座进行序列特异性切割。

2011年起，我国多数地区的不同规模猪场新爆发猪伪狂犬病，即使是免疫猪群也可以发生，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。目前在中国流行的PRV毒株与之前的流行株相比，在传播方式、毒力和致病性等方面发生了很大改变，使我国PRV的防治面临更严峻的挑战。但是到目前为止PRV的毒力增强机制还不清楚，因此，非常有必要建立高效经济的PRV操作平台，PRV作为病毒疫苗载体应用的经济意义十分重大。但是，当前用于研究PRV的基础材料在应用过程中不便于观察，对于深入研究PRV带来了不便。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种带有荧光标记的猪伪狂犬病毒的构建方法，该方法可以构建出可视化的猪伪狂犬病毒，为猪伪狂犬病毒的深入研究提供便捷。

本发明的第一个目的是提供一种可视化绿色荧光伪狂犬病毒。

本发明的第二个目的是提供一种可视化绿色荧光伪狂犬病毒的构建方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明要求保护一种可视化绿色荧光伪狂犬病毒，在伪狂犬病毒的次要骨架蛋白VP24的Met-1/Gly-2之间插入有含有荧光蛋白的片段，即在次要骨架蛋白VP24序列的第一个氨基酸Met和第二个氨基酸Gly间插入有荧光蛋白。

优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白为EGFP。

优选地，所述荧光蛋白上游还有设置有Thr-Thr-Ser-Ala-Thr。

优选地，插入的含有荧光蛋白的片段的氨基酸序列的如SEQ ID NO.10所示。

SEQ ID NO.10：

5’-VSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKTTSAT-3’

优选地，插入的含有荧光蛋白的片段的氨基酸序列对应的编码核苷酸序列如SEQID NO.9所示。

SEQ ID NO.9：

5’-GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGACCACCTCCGCCACC-3’

本发明还要求保护一种可视化绿色荧光伪狂犬病毒的构建方法，在伪狂犬病毒的次要骨架蛋白的Met-1/Gly-2之间插入有荧光蛋白。

优选地，利用CRISPR/Cas9技术。

优选地，包括以下步骤：

S1.设计sgRNA靶标序列，并根据其合成互补引物序列，退火后连接入pCRISPR/Cas9载体，得到识别剪切UL26(VP24)的CRISPR/Cas9质粒pCas9-VP24；

S2.以克隆载体为骨架载体，插入伪狂犬病毒UL26(VP24)的Met-1/Gly-2两端的序列作为左右同源臂，左右同源臂间插入Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因，构建重组载体pBSK-UL26-EGFP-UL25；

S3.将重组载体pBSK-UL26-EGFP-UL25、伪狂犬病毒和CRISPR/Cas9质粒pCas9-VP24转染PK-15细胞，通过克隆筛选，获得含EGFP标记蛋白的病毒株PRV-VP24-EGFP。

所述Thr-Thr-Ser-Ala-Thr对应的序列为ACCACCTCCGCCACC。

优选地，所示克隆载体为pBlueScript SK(+)，

更优选地，插入的位点为平末端酶切位点EcoRⅤ。

更优选地，步骤S1中，互补引物序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。

更优选地，步骤S2中，在pBlueScript SK(+)克隆载体中插入的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步更优选地，步骤S2中，具体包括以下步骤：

S21.分别使用核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示和核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示引物，以伪狂犬病毒DNA为模板，扩增同源左臂和同源右臂；

S22.使用核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示引物，以携EGFP基因的质粒为模板，扩增同源左右臂间插入的Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因序列；

S23.线性化pBlueScript SK(+)克隆载体；

S24.将S21、S22、和S23的产物混合反应，得到重组载体M-pBSK-UL26-EGFP-UL25。

再进一步更优选地，所述质粒为PCAGGS。

再进一步更优选地，扩增同源左臂和同源右臂的反应条件为：95℃5min，98℃10s，68℃1min30s，循环32次；72℃延伸10min。

再进一步更优选地，扩增同源左右臂间插入的Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因序列的反应条件为：95℃5min，98℃10s，68℃1min，循环32次；72℃延伸10min。

再进一步更优选地，线性化pBlueScript SK(+)克隆载体的反应条件为：95℃5min,98℃10s，68℃3min，循环32次；72℃延伸10min。

再进一步更优选地，步骤S24中，将S21、S22、和S23的产物混合的质量比为：50～20ng：50～200：50～200：25～100。

更进一步优选地，步骤S24中，将S21、S22、和S23的产物混合的质量比为：2：2：2：1。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用CRISPR/Cas9技术，将荧光蛋白EGFP引入PRV基因组，这样产生的重组病毒自身带有绿色荧光标签，无需抗体或者荧光素标记，变可在荧光下观测到单个病毒粒子的定位和运动，从而可以利用绿色荧光追踪病毒粒子的行踪。该重组PRV病毒为研究PRV病毒侵袭宿主的详细感染进程创造了条件。

附图说明

图1为sgRNA分别靶向HeN1 VP24基因的3’端的M site和5’端的P site附近区域。

图2为重组病毒PRV-VP24-EGFP转染细胞出现细胞病变和荧光。

图3为病毒引起的细胞病变比较。

图4为病毒空斑形态比较。

图5为重组病毒PRV-VP24-EGFP一步生长曲线的绘制。

图6为不同滴度的病毒的小鼠生存曲线。

图7为存活小鼠的脑组织、肺脏和脾脏进行病理组织切片分析。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

在本发明的下述实例中，使用的实验材料如下：

病毒和细胞：PRV HeN1毒株由本实验分离并保存。PK-15细胞由本实验室保存。

质粒与菌株：pBlueScript SK(+)购自Invitrogen，lentiCRISPRv1来自亓文宝实验室；大肠杆菌DH5α感受态购自北京天根生物技术公司。

其他试剂：T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自ThermoFish公司；PCR所用高保真DNA聚合酶

HS DNA Polymerase购自宝生物工程(大连)有限公司；凝胶DNA小量回收试剂盒购自Magen公司；质粒提取试剂盒Endo-free Plasmid Mini KitⅡ购自OMEGA公司；酚氯仿、蛋白酶K、RNase与低熔点琼脂糖购自Sigma公司；转染试剂Lipofactamine 3000购自Invitrogen公司；DMEM细胞营养液与胎牛血清购自Biological Industries公司；Gibson Assembly Master Mix试剂盒购自NEB公司。

在本发明的实例中，PK-15细胞的培养方法为：PK-15细胞在含有10％FBS DMEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后，弃去细胞培养瓶中培养基，用PBS洗三次，然后加入1mL 0.25％的胰酶，待细胞消化完全后，加入新的含有10％FBS的DMEM培养基，用枪轻轻吹打，以1：3的比例分装于细胞瓶中。

实施例1重组病毒PRV-VP24-EGFP的构建及鉴定

一、实验方法

(一)伪狂犬病毒UL26(VP24)基因sgRNA靶标序列的设计与合成

根据PRV HeN1株的(GenBank Accession no.KP098534.1)基因组序列，进行sgRNA设计，共设计了4条sgRNA(如下表1)，合成互补引物对M-VP24-sgRNA1-F/M-VP24-sgRNA1-R、M-VP24-sgRNA2-F/M-VP24-sgRNA2-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示)、P-VP24-sgRNA3-F/P-VP24-sgRNA3-R、和P-VP24-sgRNA4-F/P-VP24-sgRNA4-R，分别靶向HeN1 VP24基因的3’端的M site和5’端的P site附近区域(图1)。

表1

参照lentiCRISPRv1质粒的构建说明书，利用磷酸化酶(T4 PNK)对以上互补引物对进行磷酸化，随即高温(95℃5min)对T4 PNK灭活和引物变性，然后逐步降温复性使引物互补形成双链，获得M-VP24-gRNA1、M-VP24-gRNA2、P-VP24-gRNA1、P-VP24-gRNA2。

以Bsm BI酶切pCRISPR/Cas9载体，凝胶电泳回收大的载体片段。利用T4DNA连接酶将M-VP24-gRNA1、M-VP24-gRNA2、P-VP24-gRNA1、P-VP24-gRNA2分别连入上述Bsm BI酶切回收的载体中，转化DH5α感受态，提取质粒，以NotI和Bam HI作双酶切鉴定，并将酶切阳性克隆进行测序分析,获得克隆质粒命名为pCas9-VP24-M1、pCas9-VP24-M2、pCas9-VP24-P1、pCas9-VP24-P2。

(二)同源重组供体质粒pBSK-UL26-EGFP-UL25的构建

1、针对在PRV VP24基因的Met-1/Gly-2(M site)之间插入EGFP设计的供体质粒：

根据PRV HeN1株的(GenBank Accession no.KP098534.1)基因组序列，用设计了4对引物：M-dpL-F/M-dpL-R、M-dpR-F/M-dpR-R、M-dpEGFP-F/M-dpEGFP-R、和PBSK-F/PBSK-R(见表2)，分别以PRV基因组为模板扩增PRV VP24基因编码区上游区域UL26、下游区域UL25，以PCSGGS-EGFP质粒(携带有EGFP基因的PCAGGS质粒)为模板扩增EGFP基因，以pBlueScriptSK(+)质粒为模板将其线性化。

表2重组病毒供体质粒构建以及筛选所需引物名称及序列：

利用M-dpL-F/M-dpL-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示)与M-dpR-F/M-dpR-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示)两对引物，以PRV病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μl，反应条件为：95℃5min，98℃10s，68℃1min30s，循环32次；最后于72℃延伸10min。获得与pBlueScript SK(+)质粒部分同源的同源左臂(L-arm)和同源右臂(R-arm)的片段，命名为M-L-arm、M-R-arm。

利用引物M-dpEGFP-F/M-dpEGFP-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示)，以EGFP基因为模板进行PCR扩增，反应体系为50μl，反应条件为：95℃5min，98℃10s，68℃1min，循环32次；最后于72℃延伸10min，获得与L-arm和R-arm部分同源的EGFP，命名为M-EGFP-C。

利用引物PBSK-F/PBSK-R，以pBlueScript SK(+)质粒为模板进行PCR扩增，反应体系为50μl，反应条件为：95℃5min,98℃10s，68℃3min，循环32次；最后于72℃延伸10min，获得线性化载体，命名为M-pBSK-L。

将上述获得的DNA片段进行胶回收，按照Gibson Assembly Master Mix试剂盒说明书进行操作，将M-pBSK-L、M-L-arm、M-R-arm、M-EGFP-C按1：1：1：1比例加入反应试剂(Gibson Assembly Master Mix NEB公司的，货号E2611S)中，50℃反应1h。随后取2μL转化感受态细胞DH5α，经菌液PCR、测序分析等获得阳性质粒M-pBSK-UL26-EGFP-UL25。

2、针对在PRV VP24基因的Ala-233/Lys234(P site)之间插入EGFP设计的供体质粒：

根据PRV HeN1株的(GenBank Accession no.KP098534.1)基因组序列，用Oligo6.0软件设计了3对引物P-dpL-F/P-dpL-R，P-dpR-F/P-dpR-R，P-dpEGFP-F/P-dpEGFP-R(见表3)，分别以PRV基因组为模板扩增PRV VP24基因编码区上游区域UL26.5、下游区域UL26，以PCAGGS-EGFP质粒(携带有EGFP基因的PCAGGS质粒)为模板扩增EGFP基因。

表3重组病毒供体质粒构建以及筛选所需引物名称及序列：

利用P-dpL-F/P-dpL-R与P-dpR-F/P-dpR-R两对引物，以PRV病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μl，反应条件为：95℃/5min，98℃/10s，68℃/1min30s，循环32次；最后于72℃延伸10min。获得与pBlueScript SK(+)质粒部分同源的同源左臂(L-arm)和同源右臂(R-arm)的片段，命名为P-L-arm、P-R-arm。

利用引物P-dpEGFP-F/P-dpEGFP-R，以EGFP基因为模板进行PCR扩增，反应体系为50μl，反应条件为：95℃/5min,98℃/10s,68℃/1min，循环32次；最后于72℃延伸10min，获得与L-arm和R-arm部分同源的EGFP，命名为P-EGFP-C。

将上述获得的DNA片段进行胶回收，按照Gibson Assembly Master Mix试剂盒说明书进行操作，将M-pBSK-L、P-L-arm、P-R-arm、P-EGFP-C按比例加入反应试剂中，50℃反应1h。随后取2μL转化感受态细胞DH5α，经菌液PCR、测序分析等获得阳性质粒P-pBSK-UL26-EGFP-UL25。

三、重组病毒PRV-VP24-EGFP的构建

以1MOI的剂量接种PRV于PK-15细胞，待肉眼观察到70％病变时，弃去培养基，刮取细胞，使用酚氯仿法提取总基因组DNA。

A组：按照说明书进行操作，使用

3000Transfection Reagent(Thermo Fisher)转染试剂，将上述1μg M-pBSK-UL26-EGFP-UL25、1μg pCas9-VP24-M1和2μg PRV基因组共转染PK-15细胞。

B组：按照说明书进行操作，使用

3000Transfection Reagent(Thermo Fisher)转染试剂，将上述1μg M-pBSK-UL26-EGFP-UL25、1μg pCas9-VP24-M2和2μg PRV基因组共转染PK-15细胞。

C组：按照说明书进行操作，使用

3000Transfection Reagent(Thermo Fisher)转染试剂，将上述1μg P-pBSK-UL26-EGFP-UL25、1μg pCas9-VP24-P1和2μg PRV基因组共转染PK-15细胞。

D组：按照说明书进行操作，使用

3000Transfection Reagent(Thermo Fisher)转染试剂，将上述1μg P-pBSK-UL26-EGFP-UL25、1μg pCas9-VP24-P2和2μg PRV基因组共转染PK-15细胞。

二、实验结果

上述四组转染试验，只有B组出现细胞病变和荧光，试验结果图2所示。

将B组收取上清接种6孔细胞培养板中的PK-15细胞，1h后，弃去上清，覆盖含有2％FBS和1％低熔点琼脂糖(1％)的MEM，室温凝固后，37℃CO₂培养箱中培养。60h后，结合荧光和细胞病变挑取单个空斑，吹打入500μl DMEM溶解，放入-80℃储存备用。取50μl病毒空斑溶液接种PK-15细胞，进行3次空斑纯化获得的阳性毒株进行测序鉴定，将获得重组病毒命名为PRV-VP24-EGFP。其在伪狂犬病毒的次要骨架蛋白VP24的Met-1/Gly-2之间插入有含有荧光蛋白的片段，插入的含有荧光蛋白的片段的氨基酸序列的如SEQ ID NO.10所示，插入的含有荧光蛋白的片段的氨基酸序列对应的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

实施例2重组病毒PRV-VP24-EGFP生物学特性

一、病毒引起的细胞病变比较

1、实验方法

1.以1MOI病毒(亲本毒PRV和实施例1制备的重组伪狂犬病毒PRV-VP24-EGFP)感染PK-15细胞，感染后20h在光镜下拍摄，比较重组毒和亲本毒的细胞病变。

2、实验结果

结果显示(图3)，实施例1制备的重组毒PRV-VP24-EGFP与PRV感染PK-15后，呈现较为一致的细胞病变，感染细胞出现细胞肿胀、空泡等现象。

二、病毒空斑形态比较

1、实验方法

将实施例1制备的重组病毒PRV-VP24-EGFP和亲本毒PRV接种6孔板中的单层PK-15细胞后，加入覆盖层(含有2％FBS，1％低熔点琼脂糖的MEM)。37℃培养48h后用5％(W/V)结晶紫染色。

2、实验结果

结果显示(图4)，实施例1制备的重组病毒PRV-VP24-EGFP与亲本毒PRV的空斑大小与形态均相近。

实施例3重组病毒PRV-VP24-EGFP病毒一步生长曲线的绘制

一、实验方法

以1MOI病毒(亲本毒PRV和实施例1制备的重组伪狂犬病毒PRV-VP24-EGFP)感染PK-15细胞，在感染后每隔4h收取400μl细胞上清液进行病毒滴度测定，收取的每个时间点病毒用半数感染量(TCID₅₀/ml)计算滴度，根据不同时间点病毒的滴度绘制病毒一步生长曲线。

病毒毒价测定具体方法如下：参照文献用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定(殷震等，1997)。将待检样品用维持液也作10倍系列稀释后，将连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的PK-15单层细胞。每稀释度接种8孔，设8孔对照(用维持液代替病毒液)，置37℃5％CO₂培养箱中培养，每天观察感染细胞，记录出现CPE的孔数，停止出现CPE时终止观察。根据结果按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

二、实验结果

结果显示(图5)，亲本毒和实施例1制备的重组病毒分别在感染后24小时和28小时复制水平达到高峰，之后进入平台期，实施例1制备的重组病毒PRV-VP24-EGFP的病毒滴度大约比亲本毒PRV低10倍，表明实施例1制备的重组PRV-VP24-EGFP与其亲本毒PRV在病毒滴度相比略有下降。

实施例4重组病毒PRV-VP24-EGFP对小鼠的神经毒力试验

一、实验方法

将实施例1制备的重组病毒PRV-VP24-EGFP与亲本毒PRV接种于小鼠，结果显示，实施例1制备的重组毒PRV-VP24-EGFP与亲本毒PRV的神经毒力相一致。具体过程如下：

将70只8周龄SPF级别的KM小鼠随机分为7组，设立阴性对照组，每组10只。将亲本毒PRV和实施例1制备的重组伪狂犬病毒PRV-VP24-EGFP分别以10⁵、10⁴、10³TCID₅₀病毒量通过腹股沟皮下接种KM小鼠，攻毒后观察记录临床表现和死亡率持续14天。攻毒14天后，采集存活小鼠的脑组织、肺脏和脾脏进行病理组织切片分析，判断亲本毒与重组毒的神经毒力情况。

在攻毒后第14天分别采集PRV 10³、PRV 10⁴组和PRV-VP24-EGFP 10³、PRV-VP24-EGFP 10⁴组存活小鼠的脑组织、肺脏和脾脏进行病理组织切片分析，二、实验结果

亲本毒PRV组和实施例1制备的重组伪狂犬病毒PRV-VP24-EGFP组在攻毒后第2天出现临床症状，主要表现为抓挠、啃咬接种部位等，两组接毒量为10⁵TCID₅₀攻毒后第3天均出现大批量死亡，攻毒后第4天小鼠全部死亡；两组接毒量为10⁴、10³TCID₅₀攻毒后第3、4天均出现大批量死亡，攻毒后6天趋于稳定。

对各试验组小鼠攻毒后死亡率统计结果如图6所示，PRV 10⁵、PRV-VP24-EGFP 10⁵组在攻毒后第4天，小鼠全部死亡，死亡率高达100％；PRV10⁴、PRV-VP24-EGFP 10⁴组存活率分别为20％、0％；PRV 10³、PRV-VP24-EGFP10³组存活率分别为40％、80％。这表明本发明实施例1制备的重组伪狂犬病毒PRV-VP24-EGFP的神经毒力与亲本毒基本一致。

如图7所示，在攻毒后第14天分别采集PRV10³、PRV 10⁴组和PRV-VP24-EGFP 10³、PRV-VP24-EGFP 10⁴组存活小鼠的脑组织、肺脏和脾脏进行病理组织切片分析，结果显示，空白对照组(未攻毒)小鼠各组织均正常，无病理变化；重组毒组与亲本毒组小鼠的脑部神经质细胞皱缩、细胞核弥散；肺脏出现大面积肺泡萎缩，肺泡壁增厚，脾脏出现多核巨细胞增生以及淋巴细胞浸润。这表明，重组毒组小鼠攻毒后组织病变程度与亲本毒组一致。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caccgggaca cgtacacggg cccca 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaactggggc ccgtgtacgt gtccc 25

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acggtatcga taagcttgat gctggtgggc gtacatcggc gggtacagcg 50

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cggcatggac gagctgtaca agaccacctc cgccaccggg cccgtgtacg tgtccggct 59

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttgctcacc atggcggcgg cggtggcgac ggcg 34

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgggctgca ggaattcgat gcaccttcat gggcgtgacg accacggcgc tg 52

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agccggacac gtacacgggc ccggtggcgg aggtggtctt gtacagctcg tccatgccg 59

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtcgccaccg ccgccgccat ggtgagcaag ggcgaggagc tgttcac 47

<210> 9

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60

gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120

aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180

gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240

cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300

aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360

aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420

ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480

atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540

cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600

ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660

ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagaccacc 720

tccgccacc 729

<210> 10

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val

1 5 10 15

Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu

20 25 30

Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

35 40 45

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu

50 55 60

Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln

65 70 75 80

His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg

85 90 95

Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val

100 105 110

Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile

115 120 125

Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn

130 135 140

Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly

145 150 155 160

Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

165 170 175

Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro

180 185 190

Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser

195 200 205

Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val

210 215 220

Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Thr Thr

225 230 235 240

Ser Ala Thr

Claims

1.一种可视化绿色荧光伪狂犬病毒的构建方法，其特征在于，在伪狂犬病毒的次要骨架蛋白的Met-1/Gly-2之间插入有荧光蛋白；所述构建方法是利用CRISPR/Cas9技术；

所述方法包括以下步骤：S1 .设计sgRNA靶标序列，并根据其合成互补引物序列，退火后连接入pCRISPR/Cas9载体，得到识别剪切VP24的CRISPR/Cas9质粒pCas9-VP24；S2.以克隆载体为骨架载体，插入伪狂犬病毒VP24的Met-1/Gly-2两端的序列作为左右同源臂，左右同源臂间插入Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因，构建重组载体pBSK-UL26-EGFP-UL25；S3.将重组载体pBSK-UL26-EGFP-UL25、伪狂犬病毒和CRISPR/Cas9质粒pCas9-VP24转染PK-15细胞，通过克隆筛选，获得含EGFP标记蛋白的病毒株PRV-VP24-EGFP；步骤S1中，互补引物序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示；所述左右同源臂间插入Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S2中，具体包括以下步骤：S21 .分别使用核苷酸序列如SEQIDNO.3～4所示和核苷酸序列如SEQIDNO.5～6所示引物，以伪狂犬病毒DNA为模板，扩增同源左臂和同源右臂；S22.使用核苷酸序列如SEQIDNO .7～8所示引物，以携带有EGFP基因的质粒为模板，扩增同源左右臂间插入的Thr-Thr-Ser-Ala-Thr和EGFP基因序列；S23.线性化克隆载体；S24.将S21、S22、和S23的产物混合反应，得到重组载体M-pBSK-UL26-EGFP-UL25。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S24中，将S21、S22、和S23的产物混合的质量比为：50～200：50～200：50～200：25～100g。