CN1230893A - 包装缺陷的疱疹病毒疫苗 - Google Patents

包装缺陷的疱疹病毒疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN1230893A
CN1230893A CN97198119A CN97198119A CN1230893A CN 1230893 A CN1230893 A CN 1230893A CN 97198119 A CN97198119 A CN 97198119A CN 97198119 A CN97198119 A CN 97198119A CN 1230893 A CN1230893 A CN 1230893A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hsv
virus
vaccine
gene
herpesvirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN97198119A
Other languages
English (en)
Inventor
P·J·希普彭梅耶尔
A·M·兰金
V·A·卢科夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GD Searle LLC
Original Assignee
GD Searle LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GD Searle LLC filed Critical GD Searle LLC
Publication of CN1230893A publication Critical patent/CN1230893A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明描述一种含有包装缺陷的疱疹病毒的疫苗。突变的疱疹病毒能够进行感染并且能够在易感哺乳动物的细胞中进行DNA复制,但是在衣壳包装和形成成熟病毒颗粒方面却是有缺陷的。该包装缺陷的疱疹病毒是无毒性的并且能够在疫苗接种的哺乳动物体内产生保护性免疫反应。

Description

包装缺陷的疱疹病毒疫苗
                        发明领域
本发明属于病毒疫苗领域，并且尤其涉及产生包装缺陷的突变疱疹病毒，含有包装缺陷的突变疱疹病毒的疫苗，以及制备和生产包装缺陷的疱疹病毒的方法。
                        发明背景
对治疗病毒性疾病的各种疗法方面有很大的要求。尽管齐多夫定等用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗病毒药物，以及诸如更昔洛韦，阿昔洛韦，和膦甲酸等药物已用于治疗疱疹病毒的感染，但是明显的副作用常常限制了它们的效果。耐药病毒的选择性存活与传播也限制了小分子量抗病毒药物的功效。对于抗RNA病毒的药物来说，这是一个尤其值得注意的问题，RNA病毒例如HIV，它与大多数DNA病毒相比具有相对高的突变率。
抗病毒疫苗是感染后抗病毒药物治疗的可行替代物。理想的情况是：抗病毒疫苗保护原发病和复发的感染。针对一种特定疾病的治疗功效是开发一种疫苗策略的关键方面。调节功能也必须考虑到，尤其是与在健康个体中预防应用的疫苗的安全性相关的方面。
尽管疱疹病毒疫苗一直是学术和商业关注的活跃领域，但是在人体内诱导良性的保护性免疫反应一直是具有挑战性的〔R.L.Burke，HSV疫苗开发的现状(Current Status of HSV VaccineDevelopment)，见于《人疱疹病毒》(The Human Herpesviruses)，367-369，(B.Roizman，R.J.Whitley和C.Loopez，eds.1993)〕。活病毒疫苗具有造成潜伏和再激活的危险。活病毒疫苗也具有与天然病毒株重组的潜在可能。
已经有人研究减毒重组病毒和亚单位疫苗以避免这些危险。Meignier等人描述了一种重组病毒，该病毒是由于删除了I型单纯疱疹病毒毒性所需的区域并插入II型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白基因而获得的〔《传染病杂志》(J.Infect.Dis.)，158：602-614(1988)〕。该病毒在许多动物模型中具有降低的致病性并且能够诱导免疫。
最近，已有人报导了必需的立即早期或早期基因有缺失的重组单纯疱疹病毒。在小鼠体内这些重组病毒能够有效地诱导免疫力和降低急性复制以及减少免疫攻击的野生型病毒的潜伏。Nguyen等人描述了编码感染细胞蛋白8(“ICP8”)或ICP27的必需基因上有突变的HSV-1的复制缺陷突变体〔《病毒学杂志》(J.Virol.)66：7067-7072(1992)〕。在病毒能够感染的细胞中，ICP8突变体(d301)表达α和β基因，而ICP27突变体(n504)表达α、β和γ1基因。这两种病毒均能诱导比亲本病毒(KOS 1.1)低的抗体反应，但是ICP27突变体诱导的水平高于ICP8突变体感染所诱导的水平。Morrison和Knipe后来证实注射这些病毒可以保护小鼠免于形成脑炎和角膜炎，并且能够减少毒性免疫攻击病毒的原发复制〔《病毒学杂志》(J.Virol.)68：689-696(1994)〕。WO 95/18852描述了相似的复制缺陷的疱疹病毒突变体，WO 94/03207描述了基于这些突变体的疫苗。
另一株在糖蛋白H(gH)编码区有缺失的重组病毒已被报导〔Forrester等，《病毒学杂志》(J.Virol.)66：341-348(1992)；WO 92/05263〕。该病毒感染了非辅助细胞之后形成病毒颗粒，但是在随后的生活周期中不能再感染。与化学灭活病毒的疫苗接种相比，给小鼠接种gH缺失的病毒导致更快的清除野生型的免疫攻击病毒〔Farrell等，《病毒学杂志》(J.Virol.)68：924-932(1994)〕。给豚鼠接种gH缺失的重组病毒减少原发的阴道疾病和复发〔McLean等，《传染病杂志》(J.Infect.Dis.)170：1100-1109(1994)〕。
大多数病毒在感染过程中编码加工病毒蛋白的蛋白酶〔W.G.Dougherty和B.L.Semler，《微生物综述》(MicrobiologicaiReviews)，57：781-822(1993)〕。生物学和生化方面的研究表明HSV-1包含一种能加工另外的病毒蛋白，衣壳包装蛋白(也称为p40，ICP35和VP22a)，的蛋白酶。相似的蛋白酶编码于疱疹病毒的其它成员的基因组中。该DNA病毒家族包括HSV-1，HSV-2，人和猿巨细胞病毒(HCMV，SCMV)，水痘-带状疱疹病毒(VZV)，Epstein-Barr病毒(EBV)，人疱疹病毒-6，-7和-8型(HHV-6，HHV-7和HHV-8)，假性狂犬病病毒(PRV)，牛疱疹病毒(BHV)，马疱疹病毒(EHV)，以及鼻气管炎病毒等。
Preston等人的早期工作〔《病毒学杂志》(J.Virol.)45：1056-1064(1983)〕表明，在非允许温度HSV-1的温度敏感(ts)突变株(ts1201)不能裂解衣壳包装蛋白成为它的小分子量形式。该突变株也不能包装病毒DNA。通过标记获救，该缺陷被定位于现在被称为UL 26开放阅读框架(ORF)的基因组区域〔McGeoch等，《普通病毒学杂志》(J.Gen.Virol.)69：1531-1574(1988)〕。随后的分析表明两个转录子起始于UL26区域，大约2.1kb的初级转录子编码635个氨基酸组成的蛋白质，另一个表达更丰的转录子起始于UL26ORF，距初级转录子起始位点3′大约1000核苷酸。该较小的转录子编码预计329个氨基酸组成的蛋白质并且与较大的转录子所编码的较大的80kDa  ORF具有共同的3′末端〔 F.Y.Liu和B.Roizman.《病毒学杂志》(J.Virol.)65：206-212(1991)〕。ts1201突变株中的缺陷定位于较长转录子的5′区域，该转录子已经被证实是在HSV-1〔F.Y.Liu和B.Roizman，J.Virol.65：5149-5156(1991)〕或猿巨细胞病毒中编码一种蛋白酶活性〔Welch等，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88：10792-10796(1991)〕。
用蛋白酶区域和衣壳包装蛋白区域进行的超感染/瞬时表达〔F.Y.Liu和B.Roizman《病毒学杂志》(J.Virol.)65：5149-5156(1991)〕，瞬时表达〔Welch等，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，88：10792-10796(1991)〕，和感染〔Preston等，《病毒学》(Virol.)186：87-98(1992)〕研究表明蛋白酶在接近羧基末端裂解衣壳包装蛋白。进一步用大肠杆菌所合成的蛋白质进行的研究证实了UL26 ORF的全长蛋白质能够在两个位点裂解它本身以及裂解衣壳包装蛋白〔Deckman等，《病毒学杂志》(J.Virol.)66：7362-7367(1992)〕。Dilanni等人后来将裂解位点定位于UL26ORF的氨基酸247/248和610/611之间〔《生物与化学杂志》(J.Biol.Chem.)268：2048-2051(1993)〕。
尽管用ts1201所得的结果表明病毒的缺陷在于其裂解衣壳包装蛋白的能力以及随后的DNA包装，但是现在仍不知道这种表型在本质上是蛋白酶活性缺陷的结果，还是UL26 ORF的5′区是否编码衣壳包装和成熟所必须的其它功能。80kDa前体(被称为“VP24”或“No”)的蛋白酶作用区已在B-衣壳中鉴定出〔Davison等，《普通病毒学》(J.Gen.Virol.)73：2709-2713(1992)〕并且保留在A-衣壳和C-衣壳中〔F.J.Rixon，《疱疹病毒的结构和包装》(Structure andAssembly of Herpesviruses)，见于《病毒学论坛》(Seminars inVirology)，4卷，135-144，(A.J.Davison，编辑1993)〕，这表明该区的结构作用。在已感染细胞的细胞核中B-衣壳是含有衣壳包装蛋白，但不含有病毒DNA的不成熟衣壳。这些衣壳被认为是不能包装DNA的A-衣壳和伴随衣壳包装蛋白缺失的能够包装DNA的C-衣壳的前体〔B.Roizman和A.Sears，《单纯疱疹病毒与其复制》(Herpes Simplex Viruses and Their Replication)，见于《人疱疹病毒》(Human Herpesviruses)，11-68(B.Roizman，R.J.Whitley和C.Lopez，编辑，1993)〕。Gao等人构建并鉴定了在HSV-1 UL26基因的蛋白酶区有缺失的无感染力的突变病毒(“m100”)〔《病毒学杂志》(J.Virol.)68：3702-3712(1994)〕。该突变病毒在互补细胞系中能够增殖，但在非互补Vero细胞中却不能，这表明在细胞培养中UL26的蛋白酶区域对于病毒的复制是必要的。DNA复制以接近野生型的水平进行，但是病毒DNA不能被加工成单位基因组长度或者被包装。
我们已经制备了重组病毒以进一步在体内研究该区域的作用。该重组病毒在体内是无毒的，并且对野生型HSV-1的免疫攻击能诱发免疫力。
                      附图简述
图1表明了四种质粒的结构。(A)质粒pMON15839a在SV40多聚腺苷酸信号的上游含有3.4kb的HSV-1的KpnI片断(“KOS”)。(B)质粒pMON15840在疱疹病毒ICP6启动子区的下游含有UL26OFR。UL26的翻译起始于Met 10。(C)被插入到BspEI/BclI酶切的pMON27005中的多克隆位点的序列。(D)质粒pMON15835含有插入到pMON27005的BclI位点的ICP6-β-葡萄糖醛酸酶序列。UL26 ORF以画点的框表示，ICP6启动子区以画斜线的框表示。质粒未按比例尺表示。缩写：“K”，KpnI；“B”，BsgI；“S”，SmaI。
图2表示重组病毒的Southern杂交分析。病毒DNA用NotI或KpnI酶切，转移到硝酸纤维素膜上并与图1A所示的α-32P-dGTP标记的3.4kb的KpnI片断杂交。简图表示病毒的限制性酶切图谱。在UL26缺失的简图中画线的区域是ICP6-β-葡萄糖醛酸酶在蛋白酶区的插入。泳道1，HSV-1(“17”)；泳道2，HSV/UL26/β-gluc；泳道3，HSV/UL26/res，缩写：“N”，NotI；“K”，KpnI。
图3是表明突变病毒多步生长曲线的图表。以MOI为0.1的水平感染BHK/UL26辅助细胞或BHK/C2细胞。在各种时间点收集细胞并且用BHK/UL26辅助细胞滴定病毒滴度。圆代表来自BHK/UL26辅助细胞的病毒，方块代表来自BHK/C2细胞的病毒。误差线代表重复测定的区间。
图4表明加工衣壳包装蛋白的结果。在MOI为5的情况下感染BHK/C2和BHK/UL26辅助细胞18小时。收集细胞并且在14％的变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离出蛋白质。转移到Immobilon膜上，然后用针对HSV衣壳包装蛋白的一段多肽(HSVAs-414)所产生的抗血清来检测。空白星号表示主要的未加工的包装蛋白，实心星号表示已加工的形式。泳道1，对照感染的细胞；泳道2，野生型HSV-1；泳道3，HSV/UL26/β-gluc；泳道4，HSV/UL26/res。
图5表示病毒对小鼠的免疫性攻击试验。每种病毒以6×105pfu腹腔接种(i.p.)小鼠并计算出死亡率。存活者和对照小鼠(年龄和性别配对的)于32天时用野生型病毒的另一剂量进行免疫性攻击试验。
图6表示分别用培养基或102，104，或106pfu  HSV/UL26/β-gluc腹腔或皮下(s.q.)接种小鼠。于第1天时或者i.p.(A)或者s.q.(B)接种小鼠。于31天时用107pfu野生型HSV-1腹腔接种小鼠进行免疫攻击试验。
                        发明概述
本发明描述含有一种包装缺陷的疱疹病毒的疫苗，优选，疱疹病毒含有灭活形式的必需蛋白酶的基因。更优选，该蛋白酶是将不成熟的非感染性的衣壳颗粒加工并包装成成熟的感染性衣壳颗粒所需要的。
选自缺失、插入、替代和缺失、插入或替代任意组合的方法可以灭活蛋白酶基因。优选，通过病毒DNA的缺失和非病毒(异源性的)DNA的插入或替代来灭活蛋白酶基因。更优选，通过病毒DNA缺失和非病毒(异源性的)DNA的插入来灭活必需的蛋白酶基因。
优选，灭活的蛋白酶基因选自HSV-1 UL26，HSV-2UL26，和HCMV UL80。更优选，蛋白酶由HSV-1 UL26编码。
本发明包括选自HSV-1，HSV-2，HCMV，SCMV，VZV，EBV，HHV-6，HHV-7，HHV-8，PRV，BHV和EHV的疱疹病毒。优选，病毒是HSV-1或HSV-2。更优选，病毒是HSV-1。优选，疫苗包含被称为HSV/UL26/β-gluc的包装缺陷的突变病毒。
优选，疫苗包含大约10～106噬斑形成单位的所用的包装缺陷的疱疹病毒的剂量。
另外，本发明描述了制备包含包装缺陷疱疹病毒的疫苗的方法，通过在能够产生正确包装的病毒的重组细胞系中制备病毒原种，优选，制备疫苗的方法使用选自HSV-1，HSV-2，HCMV，SCMV，VZV，EBV，HHV-6，HHV-7，HHV-8，PRV，BHV和EHV的病毒。更优选，制备疫苗的方法使用选自HSV-1和HSV-2的病毒。甚至更优选，制备疫苗的方法采用HSV-1衍生的病毒。
本发明也描述了在制备疫苗的过程中，包装缺陷的疱疹病毒的应用。
另外，本发明描述了针对疱疹病毒通过使用含有包装缺陷的疱疹病毒的疫苗免疫易感哺乳动物的方法。优选，易感哺乳动物选自人、猴、牛、马、羊、和猪。更优选，该哺乳动物为人。
本发明也描述了含有灭活形式的必需蛋白酶基因的一种突变疱疹病毒，该蛋白酶基因是将不成熟的非感染性的衣壳颗粒加工并包装成成熟的感染性衣壳颗粒所需要的，它是由病毒DNA的缺失和非病毒(异源性)DNA的插入来灭活的。
优选，必需的蛋白酶基因由必需蛋白酶基因的部分缺失和包含受可诱导启动子调控的报告基因的非病毒(异源性)DNA的插入来灭活。更优选，必需的蛋白酶基因是HSV-1 UL26基因。更优选，可诱导的启动子是HSV0-1 ICP6(UL39)启动子。甚至更优选，非病毒(异源性的)DNA片断包含HSV-1 ICP6(UL39)启动子调控的编码大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶的 gusA基因。
另外，本发明描述了在可诱导启动子的调控下表达一种必需蛋白酶基因的重组宿主细胞系。优选，重组宿主细胞系来自哺乳动物。更优选，重组宿主细胞系来源于啮齿动物。甚至更优选，重组宿主细胞系是BHK-21。优选，可诱导的启动子是疱疹病毒启动子。更优选，可诱导的启动子是HSV-1 ICP6(UL39)启动子。
本发明也描述了通过将病毒导入重组宿主细胞系并回收含有突变病毒基因组的成熟病毒颗粒来制备突变疱疹病毒的方法。
                        定义
术语“包装缺陷”是指病毒能够复制其DNA，但是不能够完成裂解该DNA成为基因组长度的序列以及将该DNA包装入病毒衣壳的步骤。
术语“成熟病毒颗粒”是指能够感染易感宿主或细胞的病毒颗粒。术语“非病毒(异源性的)DNA”是指非来源于疱疹病毒基因组的DNA。术语“非必需基因”是指能够通过缺失、插入、替代，或者缺失、替代，和其它DNA的插入的某种组合被破坏的基因，并且含有该已破坏的基因的重组病毒能够在不表达未被破坏的相同基因的培养细胞中增殖。术语“必需基因”是指不是非必需基因的基因。术语“必需病毒蛋白酶基因”是指编码蛋白酶的必需病毒基因。
                     实验
幼小仓鼠的肾细胞(BHK-21)购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(Rockville，MD)并且培养于补充了10％胎牛血清(JRH生物科学，Lenexa，KS)，2mM另外的L-谷氨酰胺(JRH Biosciences)以及100μg-单位/ml的青霉素-链霉素(JRH Biosciences)的Dulbecco’s  改良Eagle’s培养基。HSV-2  MS株来自ATCC，HSV 17株来自R.Lausch博士，South Alabama大学。根据O’Aquila和Summers的方法〔《病毒学杂志》(J.Virol.)  61：1291-1295(1987)〕分离并纯化病毒DNA至储备量，根据Deluca等人〔《病毒学杂志》(J.Virol.)52：767-776(1984)〕以及Rader等人〔《普通病毒学》(J.Gen.Virol.)74：858-1869(1993)〕的方法分离纯化病毒用于快速Southern杂交分析。
为了获得补充UL26基因缺陷的细胞系，按照制造商的说明，用LipofectAmine试剂(GIBCO/BRL/Life Technologies，Inc.，GrandIsland，NY)，将10μg含有互补序列(见下面)的质粒DNA与1μgSV2neo〔P.J.Southern和P.Berg.《应用分子遗传学》(J.Mol.Appl.Genet)1：327-341(1982)〕共转染BHK-21细胞。两天后，用胰酶消化细胞并稀释到含400μg/ml G418(新霉素，Gibco/BRL/LifeTechnologies，Inc.)的培养基中。分离出单个的菌落并扩增以用于测定其辅助功能。
构建两个质粒以基因工程制备能够补充蛋白酶缺陷的HSV-1的细胞系。首先，来自HSV-1(KOS)(来自华盛顿大学的P.Olivo)的含有全长UL26启动子区和开放阅读框架(ORF)的3.4kb长的KpnI片断被亚克隆进pMON3327〔Highkin等，《家禽科学》(PoultryScience)70：970-981(1991)〕的KpnI位点，这样SV40的多聚腺苷酸信号位于UL26 ORF的3′端。该质粒被称为pMON15831a(图1)。第二个质粒包含HSV-1 ICP6(UL39)启动子区调控的UL26ORF。该质粒通过几个步骤进行构建。首先，含有起始于核苷酸18的UL26  ORF的5′端的320 bp长的SmaI片断被亚克隆进pUC18的SmaI位点，获得pMON15838。来自pMON27010的1642bp的BsgI-KpnI片断被插入到BsgI-KpnI酶切的pMON15838中以获得pMON15839。pMON27010具有来自pUC18中HSV-1(17株)的3.4kb长的KpnI片断。从pMON15839中分离出1956bp长的EcoRI-HindIII片断并且在与已用BamHI酶切并用Klenow聚合酶补平的pMON15834连接之前用Klenow片断补平末端。所获得的质粒称为pMON15840(图1)。质粒pMON15834具有HSV-1(17株)的末端补平的633bp的XhoI-SnaBI片断，该片断指导pMON3327中SmaI位点的ICP6  ORF的表达。
按下列步骤将β-葡萄糖醛酸酶编码框插入到UL26 ORF中：通过从pMON27002中分离633bp的XhoI-SnaBI片断来构建HSV-1ICP6启动子区调控的β-葡萄糖醛酸酶编码框。pMON27002具有来自pNEB193(New England Biolabs，Beverly，MA)中HSV-1的16，191bp长的Sse 8387ID片断。XhoI位点用Klenow聚合酶补平并连接于含有β-葡萄糖醛酸酶基因的pMON14327〔LuckoW等，《病毒学杂志(J.Virol.)67：4566-4579(1993)〕中已补平的NcoI位点。该新的质粒被称为pMON1 5833(图1)。含有HSV-1(17株)UL26 ORF的NotI  H片断(6542bp)被亚克隆进NotI酶切的pBS2SKP(Stratagene，La Jolla，CA)以获得质粒pMON27005。pMON27005用BspEI和BclI酶切。将含有多个克隆位点和互补末端的多连接子插入以获得质粒pMON27026(图1)。为了构建与野生型HSV-1(17株)重组的编码框，用BamHI从pMON15833中切去2871bp的ICP6-β-葡萄糖醛酸酶序列并将该片断与BclI酶切的pMON27026连接。该新的载体被称为pMON15835(图1)。
在转染前的一天以每个60mm的培养皿4×105个细胞的密度接种BHK细胞。1微克基因组病毒DNA和等摩尔的含所需序列改变的线性质粒于OptiMem培养基中与25μg的LipofectAmine(Gibco/BRL/LifeTechnologies)混合，然后加入到细胞中共育4小时。吸去培养基并用生长培养基替换。在收集上清之前已感染的细胞已完全裂解。澄清的系列稀释的上清(0.8ml)加到60mm培养皿中的辅助细胞系上，于37℃孵育60分钟。移去接种上清，然后细胞用1％琼脂糖(JRHBiosciences)/10％FBS/EMEM(BioWhitaker，Walkersville，MD)覆盖。当形成可见的细胞病理效果(cytopathic effects)后，加入4ml含有300μg/ml X-gluc(BioSynth AG，瑞士)和80μg/ml中性红(Sigma，St.Louis，MO)的Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液(JRHBiosciences)，然后用巴斯德吸管挑出噬斑。对含有β-葡萄糖醛酸酶基因的病毒来说，选出蓝斑。对于获救病毒(见下)来说，选出无色斑(clear plaques)。病毒通过噬斑纯化三次或者通过有限稀释来纯化。分离出纯化的病毒并且用限制性酶分析和Southern杂交对其DNA进行分析〔Maniatis等，《分子克隆》(Molecular Cloning)，实验室手册(1982)〕。
通过聚合酶链反应(PCR)，在蓝斑病毒贮备物中分析无色斑病毒〔Saiki等，《科学》(Science)，239：487-491(1988)〕。合成两段位于HSV-1(17株)UL26 ORF中BsgI位点旁侧的寡核苷酸序列(Genosys，The Woodlands，TX)。正向引物等同于HSV基因组中核苷酸50，913至50，932之间的序列〔5′-GGGCGAGTTGGCATTGGATC-3′，McGeoch等，《普通病毒学杂志》(J.Gen.Virol.)69：1531-1574(1 988)〕。反向引物互补于HSV-1基因组中51，195至51，175之间的序列(5′-AGACCGAGGGCAGGTAGTT-3′)。用酚：氯仿抽提病毒并且乙醇沉淀病毒DNA。采用GeneAmp PCR试剂盒(Perkin-Elmer-Cetus，Norwalk，CT)进行PCR。反应产物于5％聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。
抗相应于氨基酸414到428区域的多肽抗体制备于家兔。由ChironMimotopes  Pty有限公司(Raleigh，NC)合成多肽HSVAs-414(C-PAAGDPGVRGSGKR)并且纯化到95％以上的纯度。HSVAs-414定位于UL26和UL26.5基因中衣壳包装区的中央区。该多肽在羧基端有游离酸并且在氨基端能与白喉类毒素结合。100μl与等体积弗氏完全佐剂混合的1μg/ml的蛋白质接种家兔，从第2周开始在间隔4周时用混合于弗氏不完全佐剂中的相同材料进行加强免疫，然后饲养10到17天。
细胞接种于6孔板的孔中，每孔5×105个细胞。次日，于37℃以5pfu/细胞的感染复数(MOI)感染细胞60分钟，其间偶尔轻轻摇晃。吸出感染上清并加入生长培养基。感染后18小时，吸出培养基并加入400μl含10％疏基乙醇的1×蛋白质裂解缓冲液(Protein DisruptionBuffer)(Novex，San Diego，CA)。14％Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Novex)以125伏的电压电泳1.5小时分离出蛋白质。该凝胶在1×转移缓冲液(Transfer Buffer)(Novex)中孵育10分钟，然后在30伏电压下转移到Immobilon-P膜(Novex)上1-2小时。该膜在含吐温80的1×Tris-缓冲盐溶液(TTBS)中孵育至少1小时(典型情况是过夜)，该缓冲液补充了5％的奶粉。用TTBS冲洗印迹2次各15分钟，然后在1/1000的稀释度下与第一抗体孵育1小时。与第二抗体(碱性磷酸酶偶联的羊抗兔抗体，Promega，Madison，WI)以1/4000的稀释度共育1小时之前，用TTBS冲洗印迹2次各15分钟。印迹于四唑氮蓝(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)(Promega)中孵育5～15分钟，使碱性磷酸酶可见，然后在H2O中充分冲洗以终止反应。
多步生长分析BHK/UL26辅助细胞以及不具有辅助功能但能抗G418的BHK细胞(BHK/C2)来检测病毒的复制。细胞(1×105)接种至24孔培养板的培养孔中并以每个细胞0.1噬斑形成单位(pfu)的感染复数进行感染。在感染后各种时间，对感染的细胞进行三次冻融〔Tengelsen等《病毒学杂志)》(J，Virol.)67：3470-3480(1993)〕，然后用BHK/UL26辅助细胞滴定裂解物。
为了制备能够支持在UL26开放阅读框架区有缺失和插入的重组病毒复制的细胞系，  BHK细胞用pMON15831a和SV2neo共转染，pMON15831a具有HSV-1(KOS)5′到SV40多聚腺苷酸信号之间3.4kb的KpnI片断(图1)。分离出G418抗性细胞并通过Southern杂交分析显示是否含有HSV-1 KpnI片断。为了测定哪一细胞系能表达UL26基因产物，用HSV-2(MS)感染细胞以刺激细胞内的UL26启动子。HSV-1特异的抗多肽血清，用与白喉毒素偶联的HSVAs-414接种家兔而制备的，用于鉴定UL26基因产物的表达(数据未列出)。被称为BHK/UL26/8的这个细胞系用于制备重组病毒。用pMON3327和SV2neo共转染的G418抗性细胞系被用作对照并且称为BHK/C2。当发现因为与BHK/UL26/8中的KpnI片断重组而制备出大量的获救病毒之后，分离出另一辅助细胞系(BHK/UL26辅助细胞)。用质粒pMON15840转染第二细胞系，该质粒在ICP6启动子之后具有UL26ORF并且缺乏pMON15831a所含的UL26 ORF 5′端的大量HSVDNA。该整合质粒的翻译起始于天然氨基酸10的蛋氨酸。筛选候选细胞系以测定它们辅助蓝斑表型重组病毒(见后)生长的能力。从这较后筛选中所分离出的能辅助UL26突变病毒生长的细胞系被称为BHK/UL26辅助细胞系。
用HSV-1(17株)基因组DNA和质粒pMON15835转染细胞系BHK/UL26/8，该质粒含有HSV-1(17株)的NotI片断，在UL26ORF中的蛋白酶区有缺失并且插入HSV-1(17株)ICP6启动子调控的细菌β-葡萄糖醛酸酶基因(图1)。细胞裂解后，上清系列稀释于BHK/UL26/8并于感染4～5天后鉴定出蓝斑。挑出蓝斑并且噬斑纯化3次。重组病毒被称为HSV/UL26/β-gluc。噬斑纯化表明蓝表型重组病毒与似乎具有生长优势的无色斑表型病毒的差异小，即使在辅助细胞系上也一样。
为了测定无色斑病毒的基因型和起源，对来自蓝斑和无色斑表型病毒混合培养的不含细胞的病毒DNA进行DNA扩增。283bp片断的扩增表明在贮备病毒中存在野生型病毒。用BsgI酶切PCR产物，该酶酶切野生型(17株)DNA的片断，但是不能酶切野生型(KOS株)DNA的片断，野生型(KOS株)DNA为辅助细胞DNA的来源(数据未列)。BsgI不能酶切PCR产物表明野生型病毒实际上是蓝斑表型病毒与辅助细胞系中UL26序列重组所产生的返祖病毒。该获救病毒称为BHK/UL26/res。
为了制备更纯的HSV/UL26/β-gluc贮备物，分离出一种新辅助细胞系(BHK/UL26辅助细胞)，该细胞中删去了UL26 ORF 5′端的HSVDNA序列并且用ICP6启动子区片断替代(pMON15840，图1)。HSV/UL26/β-gluc在该细胞系中的增殖只产生蓝斑表型。
用NotI或KpnI酶切野生型(17株)、HSV/UL26/β-gluc和获救病毒的病毒DNA。用含全长UL26阅读开放框架和5′旁侧序列的限制性酶切片断探测之后，通过Southern杂交分析分析被酶切的DNA。该结果表明了预期的酶切模式(图2)。当用NotI(6.3kb)和KpNI(3.4kb)酶切(泳道1和3)时野生型和获救病毒表现出了预期的相同的模式。UL26 ORF的小区域缺失和β-葡萄糖醛酸酶基因的插入导致在HSV/UL26/β-gluc中一个新NotI位点(导致预期的4.8和4.4kb的片断)和一个新KpnI位点(导致4.0和2.1kb的片断)(泳道2)的增加。
在不同的细胞系中测定病毒的生长曲线。感染后各种时间，收集细胞并在加入到BHK/UL26辅助细胞上之前冻融3次。结果表明HSV/UL26/β-gluc不能在BHK/C2细胞中复制，但在BHK/UL26辅助细胞中按野生型动力学生长。野生型(17株)HSV-1和获救病毒在BHK/C2和BHK/UL26辅助细胞中均复制到相同滴度并以相同的速率复制(图3)。
因为哺乳动物细胞、细菌和ts1201中的瞬时转染实验已经表明，细胞和在UL26 5′区的某些突变不能裂解衣壳包装蛋白〔综述于Gao等，J.Virol.68：3702-3712(1994)〕，所以用HSV/UL26/β-gluc在MOI为5的条件下感染BHK/C2、BHK和BHK/UL26辅助细胞。感染后18小时，细胞在SDS-PAGE标本缓冲液中裂解并在14％SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质。当转移到Immobilon P膜上之后，印迹孵育于抗HSV-1衣壳包装蛋白的抗血清。结果示于图4。HSV/UL26/β-gluc感染BHK/C2细胞导致不能加工衣壳包装蛋白至较低分子量的形式。HSV/UL26/β-gluc感染BHK/辅助细胞表明衣壳包装蛋白被适当加工处理。获救重组病毒(HSV/UL26/res)如同野生型HSV-1在两种细胞系中均能加工处理衣壳包装蛋白(泳道2和4)。在感染时辅助细胞和非辅助细胞均以相同水平制备衣壳包装蛋白，但其在非辅助细胞中不能被裂解。HSV/UL26/β-gluc重组体不能加工衣壳包装蛋白并有限制性的生长。
100μl体积病毒腹腔或皮下接种雌性Swiss-Webster小鼠(12-14克，Charles Rivers实验室，Wilmington，MA)。小鼠被短暂CO2/O2处理后，皮下注射物转送到靠近尾基底部的背侧。如果没有指明，病毒均悬浮于含5％FBS的DMEM中。食物和水任意给予小鼠。在小鼠由于瘫痪而奄奄一息时对它们进行安乐死。
给小鼠腹腔注射于100μl体积6×105pfu(按辅助细胞系所测定的)或者野生型(17株)HSV，HSV/UL26/β-gluc，或者获救病毒。如图5所示。野生型(17株)或获救病毒所感染的小鼠死于感染后7天。用HSV/UL26/β-gluc感染的小鼠均存活。以最初给予的相同剂量，用野生型HSV-1(17株)腹腔注射来免疫攻击最初用HSV/UL26/β-gluc感染的动物。年龄和性别配对的未接种病毒的小鼠也进行接种。用野生型病毒感染后大约16小时发现1只HSV/UL26/β-gluc感染的小鼠死亡。因为感染后如此快地发生死亡，所以死亡可能不是与病毒有关。其它的9只小鼠在野生型病毒的免疫攻击后存活。尽管病毒需要更长的时间导致未接种小鼠的病态和死亡(图5)，但未接种小鼠易感于野生型病毒的感染。
再一次实验中，起始于最初实验中所用的相同接种病毒，10倍倍比稀释的HSV/UL26/β-gluc腹腔接种小鼠。在39天时，6×106pfuHSV-1(17株)腹腔接种免疫攻击小鼠。这次野生型病毒的量比最初实验中所用量高10倍而导致最初用DMEM/5％FBS接种的小鼠90％死亡(表1，对照感染组)。再者，于16小时之内，发现6只小鼠死亡。其中2只是在10pfu HSV/UL26/β-gluc接种的动物组，而4只是在1×105pfu HSV/UL26/β-gluc接种的动物组。在6条生存曲线之间有显著差异(p＜0.02，log rank test)。数据表明HSV/UL26/β-gluc接种的小鼠以剂量依赖的方式幸存(表1)。最高剂量HSV/UL26/β-gluc接种小鼠的存活曲线与对照组在统计学上有差异(p＝0.023，log rank test)。
                         表1
       HSV/UL26/β-gluc             ％存活*
            对照                      10
          6×101pfu                  12.5
          6×102pfu                  30
          6×103pfu                  60
          6×104pfu                  50
          6×105pfu                  83.3*  6×106pfu野生型HSV-1(17株)腹腔接种进行免疫攻击后20天测定小鼠的存活率。除了6×101(N＝8)和6×105(N＝6)组因为早期死亡之外各组均为N＝10。
第三次实验中，如前所述制备病毒贮备液但是悬浮于不含FBS的DMEM中。每组10只小鼠的实验动物单独用DMEM或用逐渐增加剂量的HSV/UL26/β-gluc通过腹腔或皮下注射途径进行接种。1个月后，通过腹腔接种对所有的小鼠用107pfu野生型病毒进行免疫攻击。一些快速死亡的对照包括腹腔接种培养基然后腹腔接种培养基免疫攻击的动物，或者HSV/UL26/β-gluc接种然后培养基免疫攻击的动物，或者HSV/UL26/β-gluc接种然后HSV/UL26/β-gluc免疫攻击的动物。在实验过程中这些实验动物没有死亡。其中，90只动物受到病毒的两次接种，可以预期10-12％的动物快速死亡。同实验组的结果一起示于图6A和6B。对于腹腔注射(p＜0.01)和皮下注射(p＜0.01)来说，存活曲线之间均有显著差异(log rank test)。回归分析表明，对两组来说，HSV/UL26/β-gluc对存活均有剂量依赖效应(p＜0.05Cochran-Armitage test)。
预期该病毒具有减低的效能并且易再激活。突变影响晚期基因功能的事实表明重组病毒在诱导免疫力方面比在立即早期或早期基因中有缺失的病毒更加有效。包装缺陷的HSV/UL26/β-gluc病毒是新一类在晚期基因活性方面有缺陷的疫苗候选者中的成员。
预期在包装缺陷病毒中所述的必需基因中的缺陷能整合至在必需或非必需基因中有其它突变的病毒中。诸如HSV-1的ICP47等基因可以调整宿主增强对病毒产生免疫反应的能力〔Hill等，《自然》(Nature)375：411-415(1995)；Fruh等，《自然》(Nature)375：415-417(1995)〕。
本发明的疫苗可为冻干的形式或者悬浮于制药学上可接受的载体中。适合的悬浮液包括磷酸缓冲液，盐溶液，葡萄糖液，灭活的血清，赋形剂，和佐剂。可以根据本领域中熟知的标准技术制备和使用该疫苗〔综述于R.L.Burke，Seminar in Virology，4：187-197(1993)〕。有效剂量也可通过本领域中熟知的标准技术进行确定。总之，疫苗制备于适当的无菌缓冲液中并以103～109pfu/kg的剂量通过皮内、肌肉内，或皮下注射进行使用。该疫苗也可制备于本领域中已知的载体中以口服或眼部用药。
前面给予详细描述仅为有利于清晰的理解，因此不应有不必要限制的理解。因为本发明范围内的修改对于本领域中的那些技术人员来说将是明白易懂的。

Claims (35)

1.含有一种包装缺陷的疱疹病毒的疫苗。
2.权利要求1的疫苗，其中所说的疱疹病毒含有必需蛋白酶基因的灭活形式。
3.权利要求2的疫苗，其中所说的必需蛋白酶基因是将不成熟、非感染性的衣壳颗粒加工并包装成成熟、感染性衣壳颗粒所需要的。
4.权利要求1中的疫苗，其中疱疹病毒选自HSV-1，HSV-2，HCMV，SCMV，VZV，EBV，HHV-6，HHV-7，HHV-8，PRV，BHV和EHV。
5.权利要求4的疫苗，其中所述的疱疹病毒是HSV-1或HSV-2。
6.权利要求4的疫苗，其中所述的疱疹病毒是HSV-1。
7.权利要求3的疫苗，其中所述的必需蛋白酶基因选自HSV-1UL26、HSV-2 UL26、和HCMV UL80。
8.权利要求7的疫苗，其中所述的必需蛋白酶基因是HSV-1UL26。
9.权利要求2的疫苗，其中所述的必需蛋白酶基因通过选自缺失、插入、DNA的替代、和缺失、插入、或DNA替代的任一组合的方法来进行灭活。
10.权利要求9的疫苗，其中所述的必需蛋白酶基因通过病毒DNA的缺失和非病毒(异源性的)DNA插入来进行灭活。
11.包含大约10～106噬斑形成单位的所述疱疹病毒的权利要求1的疫苗。
12.权利要求1的疫苗，其中所述的包装缺陷的疱疹病毒包括称为HSV/UL26/β-gluc的病毒株。
13.制备含有包装缺陷疱疹病毒的权利要求1的疫苗的方法，通过在能够产生正确包装的病毒的重组细胞系中制备所述疱疹病毒的贮备物，然后将该病毒悬浮于制药上可接受的载体中。
14.权利要求13的制备疫苗的方法，其中所述的必需蛋白酶基因是HSV-1 UL26基因。
15.权利要求13的方法，其中所述的疫苗包含HSV/UL26/β-gluc病毒株。
16.权利要求13的方法，其中所述的细胞系是哺乳动物的细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述的细胞系支持所述疱疹病毒的复制。
18.权利要求17的方法，其中所述的细胞系是称为BHK/UL26/8的细胞系。
19.权利要求17的方法，其中该细胞系包括称为BHK/UL26辅助细胞的细胞系。
20.包装缺陷的疱疹病毒在疫苗制备中的应用。
21.通过给予权利要求1的悬浮于制药上可接受载体中的疫苗来针对疱疹病毒免疫动物的方法。
22.权利要求21的方法，其中哺乳动物选自人、猴、牛、马、羊和猪。
23.权利要求22的方法，其中哺乳动物是人。
24.含有必需蛋白酶基因灭活形式的突变疱疹病毒，该基因是将不成熟的非感染性的衣壳颗粒加工并包装成成熟的感染性衣壳颗粒所必需的，该必需蛋白酶基因通过病毒DNA的缺失和非病毒(异源性)DNA的插入来灭活。
25.根据权利要求24的突变病毒，其中该病毒选自HSV-1，HSV-2，HCMV，SCMV，VZV，EBV，HHV-6，HHV-7，HHV-8，PRV，BHV和EHV。
26.权利要求25的突变病毒，其中所述必需蛋白酶基因是HSV-1UL26。
27.权利要求24的突变病毒，其中缺失了该必需蛋白酶的部分基因并用含可诱导性疱疹病毒HSV-1启动子调控的报告基因的非病毒(异源性)DNA片断来替代。
28.权利要求27的突变病毒，其中该报告基因选自编码β-葡萄糖醛酸酶的 gusA、编码β-半乳糖苷酶的 LacZ、编码碱性磷酸酶的phoA、编码绿色荧光蛋白的 gfP，和编码水母发光蛋白的 aeq。
29.权利要求28的突变病毒，其中所述的报告基因是编码大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶的 gusA基因。
30.权利要求27的突变病毒，其中该可诱导的疱疹病毒启动子是HSV-1 ICP6(UL39)启动子。
31.在可诱导的非蛋白酶启动子的调控下表达必需疱疹病毒蛋白酶基因的重组宿主细胞系。
32.权利要求31的重组宿主细胞系，其中宿主细胞系来自啮齿动物。
33.权利要求32的重组宿主细胞系，其中该宿主细胞系是BHK-21。
34.权利要求31的重组宿主细胞系，其中该可诱导的非蛋白酶启动子是HSV-1 ICP6(UL39)启动子。
35.通过将所述病毒导入重组宿主细胞系并收集含有突变病毒基因组的成熟病毒颗粒来制备权利要求24中突变疱疹病毒的方法。
CN97198119A 1996-07-26 1997-07-25 包装缺陷的疱疹病毒疫苗 Pending CN1230893A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/687,820 1996-07-26
US08/687,820 US5972666A (en) 1996-07-26 1996-07-26 Assembly-deficient herpesvirus vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1230893A true CN1230893A (zh) 1999-10-06

Family

ID=24761993

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN97198119A Pending CN1230893A (zh) 1996-07-26 1997-07-25 包装缺陷的疱疹病毒疫苗

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5972666A (zh)
EP (1) EP0956045B1 (zh)
JP (1) JP2000516597A (zh)
CN (1) CN1230893A (zh)
AT (1) ATE277634T1 (zh)
AU (1) AU3977997A (zh)
BR (1) BR9710604A (zh)
CA (1) CA2261071A1 (zh)
CZ (1) CZ17999A3 (zh)
DE (1) DE69730993T2 (zh)
DK (1) DK0956045T3 (zh)
ES (1) ES2231884T3 (zh)
PT (1) PT956045E (zh)
WO (1) WO1998004286A2 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111117974A (zh) * 2019-12-20 2020-05-08 华南农业大学 一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE50012015D1 (de) * 1999-02-04 2006-03-30 Joern Bullerdiek Mittel zur prävention und/oder behandlung einer gewebeveränderung mesenchymalen ursprungs
US6291226B1 (en) * 1999-02-25 2001-09-18 National Research Council Of Canada Adenovirus mutants with deleted protease gene
HUP0202738A3 (en) * 1999-09-10 2003-12-29 Akzo Nobel Nv Equine herpes virus temperature sensitive mutant and live vaccine thereof
WO2001078776A1 (en) * 2000-04-13 2001-10-25 Avant Immunotherapeutics, Inc. Herpes virus complementing cell line
AU2002305914A1 (en) * 2001-01-12 2002-10-21 Chiron Corporation Nucleic acid mucosal immunization
US7968298B2 (en) * 2001-03-28 2011-06-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Use of herpesviruses, herpesvirus proteins and nucleic acids encoding the proteins to inhibit CCR5-tropic HIV-1 infection and replication
WO2005021746A1 (ja) * 2003-08-29 2005-03-10 Virus Ikagaku Kenkyusho Inc. Ｈｈｖ−６またはｈｈｖ−７由来の組換ウイルスベクター、その製造方法、それを用いた宿主細胞の形質転換方法、それにより形質転換された宿主細胞およびそれを用いた遺伝子治療方法
US20080089910A1 (en) * 2004-06-29 2008-04-17 Visalli Et Al Attenuated Herpes Simplex Virus Type-2, Vectors Thereof and Immunogenic Compositions Thereof
US7628993B2 (en) 2006-07-20 2009-12-08 Vical Incorporated Compositions and methods for vaccinating against HSV-2

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9102126D0 (en) * 1991-01-31 1991-03-13 Smithkline Beecham Biolog Novel vaccine
JPH05236967A (ja) * 1991-05-07 1993-09-17 Medical Res Council ヘルペスウイルス粒子及びワクチン
WO1996012007A1 (en) * 1994-10-17 1996-04-25 Merck & Co., Inc. Stable recombinant hcmv protease
US5728557A (en) * 1995-06-01 1998-03-17 Merck & Co., Inc. Method of making herpes simplex type 1 mutants and mutants so produced

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111117974A (zh) * 2019-12-20 2020-05-08 华南农业大学 一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法
CN111117974B (zh) * 2019-12-20 2022-02-22 华南农业大学 一种可视化绿色荧光猪伪狂犬病毒及其构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
BR9710604A (pt) 1999-08-17
EP0956045A2 (en) 1999-11-17
EP0956045B1 (en) 2004-09-29
DE69730993T2 (de) 2005-10-06
CZ17999A3 (cs) 1999-07-14
ATE277634T1 (de) 2004-10-15
US5972666A (en) 1999-10-26
DK0956045T3 (da) 2005-01-24
WO1998004286A2 (en) 1998-02-05
CA2261071A1 (en) 1998-02-05
PT956045E (pt) 2005-01-31
ES2231884T3 (es) 2005-05-16
JP2000516597A (ja) 2000-12-12
WO1998004286A3 (en) 1998-05-14
AU3977997A (en) 1998-02-20
DE69730993D1 (de) 2004-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0571410B1 (en) Herpes simplex virus-1 deletion variants and vaccines thereof
US5824318A (en) Avirulent herpetic viruses useful as tumoricidal agents and vaccines
CN1230893A (zh) 包装缺陷的疱疹病毒疫苗
WO1998004286A9 (en) Assembly-deficient herpesvirus vaccine
EP0841943B1 (en) Avirulent herpetic viruses useful as tumoricidal agents and vaccines
JP3727947B2 (ja) ヘルペスウイルスのプレ−（ウイルスｄｎａ複製）包膜粒子
JP3710838B2 (ja) ウマヘルペスウイルス感染からウマを防御するためのワクチン
AU653483B2 (en) Herpesvirus particles and vaccine
US6423528B1 (en) Herpes simplex virus-1 deletion variants and vaccines thereof
RU2777400C2 (ru) Рекомбинантные непатогенные конструкции вируса болезни марека, кодирующие антигены вируса инфекционного ларинготрахеита и вируса инфекционного бурсита
AU6710501A (en) Assembly-deficient herpesvirus vaccine
Bigger et al. Herpesvirus papio 2 encodes a virion host shutoff function
WO1996016164A1 (en) Viral preparations, immunogens, and vaccines
US20020155131A1 (en) Recombinant equine herpesvirus type 1 (EHV-1) comprising a dysfunctional gene 71 region and use thereof as a vaccine
Trilling et al. Genome Plasticity of Herpesviruses: Conservative yet Flexible
Kpn JK. I A EOCB LOE F 1 &# O MN

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication