ES2231884T3 - Vacuna de herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBE UNA VACUNA QUE COMPRENDE UN HERPESVIRUS CON DEFICIENCIA DE ENSAMBLAJE. EL HERPESVIRUS MUTANTE ES CAPAZ DE INFECTAR O DE SUFRIR LA REPLICACION DEL ADN DE LAS CELULAS DE UN MAMIFERO SUSCEPTIBLE, PERO ES DEFECTUOSO EN EL MONTAJE DE CAPSIDOS Y EN LA FORMACION DE PARTICULAS MADURAS DE VIRION. EL HERPESVIRUS DEFICIENTE EN EL MONTAJE ES AVIRULENTO Y ES CAPAZ DE GENERAR UNA RESPUESTA PROTECTORA INMUNE EN UN MAMIFERO VACUNADO.

Description

Vacuna de herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de vacunas virales y, específicamente, se refiere a la generación de herpesvirus mutantes con deficiencias en el ensamblaje, a vacunas que comprenden herpesvirus mutantes con deficiencias en el ensamblaje, y a métodos para la producción y fabricación de vacunas de herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje.

Antecedentes de la invención

Existe una gran necesidad de terapias para el tratamiento de enfermedades virales. Aunque en el tratamiento de infecciones producidas por herpesvirus se usan fármacos antivirales tales como zidovudina, usada en el tratamiento del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y fármacos tales como ganciclovir, aciclovir y foscarnet, a menudo los efectos secundarios significativos limitan su eficacia. La selección y propagación de virus resistentes a fármacos también limita la eficacia de fármacos antivirales de pequeño peso molecular. Esto es un problema particularmente significativo en el caso de fármacos dirigidos contra virus de ARN tales como VIH, que tienen una tasa de mutación relativamente alta en comparación con la mayoría de los virus de ADN.

Las vacunas antivirales son una alternativa viable a los tratamientos con fármacos antivirales después de la infección. Idealmente, las vacunas antivirales protegen contra la enfermedad primaria y las infecciones recurrentes. La eficacia contra una enfermedad particular es crucial para el desarrollo de una estrategia de vacuna. También deben considerarse los aspectos reguladores, particularmente relacionados con la seguridad de las vacunas destinadas para uso profiláctico en individuos sanos.

Aunque las vacunas de herpesvirus han sido un área activa tanto de interés académico como de interés comercial, ha sido un reto la introducción de una buena respuesta inmune protectora en seres humanos [R. L. Burke, Current Status of HSV Vaccine Development, en The Human Herpesviruses, 367-379, (B. Roizman, R. J. Whitley y C. Lopez, eds. 1993)]. Las vacunas de virus vivos tienen el riesgo de establecer latencia y reactivación. Las vacunas de virus vivos también tienen la posibilidad de recombinarse con aislados naturales.

Se han investigado virus recombinantes atenuados y vacunas de subunidad para evitar estos riesgos. Meignier et al. describen un virus recombinante resultante de la eliminación de una región del virus del herpes simple de tipo 1 (HSV-1) requerida para la virulencia y la inserción de genes de glicoproteína del virus del herpes simple de tipo 2 (HSV-2) [J. Infect. Dis., 158:602-614, (1988)]. Los virus tenían una patogenicidad reducida e inducían inmunidad en varios modelos animales.

Más recientemente, se han descrito virus del herpes simple recombinantes con deleciones en genes tempranos o tempranos inmediatos esenciales. Estos virus recombinantes se describen como agentes eficaces para inducir inmunidad y para reducir la replicación aguda y el establecimiento de la latencia del virus de tipo silvestre al que se han expuesto ratones. Nguyen et al. describen mutantes de HSV-1 con defectos de replicación que tienen mutaciones en los genes esenciales que codifican la proteína 8 de células infectadas ("ICP8") o ICP27 [J. Virol. 66:7067-7072 (1992)]. El mutante de ICP8 (d301) expresa los productos de los genes \alpha y \beta, mientras que el mutante de ICP27 (n504) expresa los productos de los genes \alpha, \beta y \gamma_{1} en las células que los virus pueden infectar. Los dos virus inducían respuestas de anticuerpos que eran menores que las de los virus parentales (KOS 1.1), pero el nivel inducido por el mutante ICP27 era mayor que el inducido por infección con el mutante de ICP8. Morrison y Knipe posteriormente demostraron que la inyección de estos virus protegía a los ratones contra el desarrollo de encefalitis y queratitis, y reducían la replicación primaria del virus de exposición virulento [J. Virol. 68:689-696 (1994)]. El documento WO95/18852 describe mutantes de herpesvirus con defectos de replicación similares y el documento WO94/03207 describe vacunas basadas en estos mutantes.

Se ha descrito otro virus recombinante que tiene una deleción en la región codificante de la glicoproteína H (gH) [Forrester et al, J. Virol. 66:341-348 (1992); documento WO92/05263]. Este virus forma viriones después de la infección de células no adyuvantes, pero los virus no pueden infectar en una vuelta posterior. La inoculación en ratones del virus de deleción de gH dio como resultado una eliminación más rápida del virus de exposición de tipo silvestre en comparación con la vacunación con virus inactivado químicamente [Farrell et al, J. Virol. 68:927-932 (1994)]. La inoculación de cobayas con el virus recombinante con deleción de gH dio como resultado una reducción de la enfermedad vaginal primaria y una reducción de las recurrencias [McLean et al, J. Infect. Dis. 170:1100-1109 (1994)].

La mayoría de los virus codifican proteinasas que funcionan en el procesamiento de proteínas virales durante la infección [W. G. Dougherty y B. L. Semler, Microbiological Reviews, 57:781-822 (1993)]. Ciertos estudios biológicos y bioquímicos han demostrado que HSV-1 posee una proteinasa que puede procesar otra proteína viral, la proteína del ensamblaje de la cápsida (también conocida como P-40, ICP35 y VP22a). En el genoma de otros miembros de la familia Herpesviridae se codifican proteinasas similares. Esta familia de virus de ADN incluye HSV-1, HSV-2, citomegalovirus humano y de simio (HCMV, SCMV), virus varicella-zoster (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV), herpesvirus humanos de tipos 6, 7 y 8 (HHV-6, HHV-7 y HHV-8), virus de la pseudorrabia (PRV), herpesvirus bovino (PHV), herpesvirus equino (EHV), y virus de la rinotraqueítis, entre otros.

Un trabajo previo realizado por Preston et al, [J. Virol. 45:1056-1064 (1983)] demostró que un mutante sensible a la temperatura (ts) de HSV-1 (ts1201) era incapaz de escindir la proteína de ensamblaje de la cápsida hasta sus formas de menor peso molecular a la temperatura no permisiva. Este mutante tampoco fue capaz de empaquetar el ADN viral. Por medio de rescate con marcador, el defecto se localizó en una región del genoma que ahora se conoce como la fase de lectura abierta (ORF) de UL26 [McGeoch et al, J. Gen. Virol. 69:1531-1574 (1988)]. Un análisis posterior demostró en la región UL26 se inician dos transcritos, un transcrito primario de aproximadamente 2,1 kb que codifica una proteína de 635 aminoácidos, y un transcrito más abundante que se inicia dentro de la ORF de UL26, aproximadamente a 1000 nucleótidos en posición 3' con respecto al inicio del transcrito primario. Este transcrito más pequeño codifica una proteína prevista de 329 aminoácidos y es 3' coterminal con la ORF de 80 kDa más larga codificada por el transcrito más grande [F. Y. Liu y B. Roizman. J. Virol. 65:206-212 (1991)]. El defecto del mutante ts1201 se localiza en la región 5' del transcrito más grande que, como se ha demostrado, codifica una actividad proteinasa en HSV-1 [F. Y. Liu y B. Roizman. J. Virol. 65:5149-5156 (1991)] o en el citomegalovirus de simio [Welch et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:10792-10796 (1991)].

Los estudios de superinfección/expresión transitoria [F. Y. Liu y B. Roizman. J. Virol. 65:5149-5156 (1991), expresión transitoria [Welch et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:10792-10796 (1991)], e infección [Preston et al, Virol. 186:87-98 (1992)] con el dominio proteasa y el dominio de proteína de ensamblaje de la cápsida demostraron que la proteinasa escinde la proteína de ensamblaje de la cápsida cerca de su extremo carboxilo terminal. Otros estudios con las proteínas producidas en E. coli confirmaron que la proteína de longitud completa de la ORF de UL26 es capaz de escindirse por sí misma en dos sitios, así como de escindir la proteína de ensamblaje de la cápsida [Deckman et al, J. Virol. 66:7362-7367 (1992)]. DiIanni et al posteriormente localizaron los sitios de escisión entre los aminoácidos 247/248 y 610/611 de la ORF de UL26 [J. Biol. Chem. 268:2048-2051 (1993)].

Aunque los resultados con ts1201 sugieren que el defecto en el virus está en su capacidad de escindir la proteína de ensamblaje de la cápsida y la posterior encapsidación del ADN, no se sabe si este fenotipo es el resultado de un defecto en la actividad proteasa per se, o si la región 5' de la ORF de UL26 codifica alguna otra función necesaria para el ensamblaje de la cápsida y la maduración. El dominio proteinasa procesado del precursor de 80 kDa (designado "VP24" o "N_{o}" se ha identificado en cápsidas B [Davison et al, J. Gen. Virol. 73:2709-2713 (1992)] y se retiene en cápsidas A y en cápsidas C [F. J. Rixon, Structure and Assembly of Herpesviruses, en Seminars in Virology, vol. 4, 135-144, (A. J. Davison, ed. 1993)] lo que sugiere un papel estructural para este dominio. Las cápsidas B son cápsidas inmaduras en el núcleo de la célula infectada que contienen la proteína de ensamblaje de la cápsida, pero no ADN viral. Se cree que estas cápsidas son los precursores de las cápsidas A que no pueden empaquetar el ADN y las cápsidas C que empaquetan el ADN con una pérdida asociada de la proteína de ensamblaje de la cápsida [B. Roizman y A. Sears, Herpes Simplex Viruses and Their Replication, en Human Herpesviruses, 11-68 (B. Roizman, R. J. Whitley, y C. Lopez, eds. 1993)]. Gao et al construyeron y caracterizaron un virus mutante nulo ("m100") que contiene una deleción dentro del dominio proteasa del gen UL26 de HSV-1 [J. Virol. 68:3702-3712 (1994)]. El virus mutante podía propagarse en una línea de células de complementación pero no en células Vero sin complementación, lo que indica que el dominio proteasa de UL26 es esencial para la replicación viral en cultivos celulares. La replicación de ADN se producía a niveles próximos a los del tipo silvestre, pero el ADN viral no se procesaba hasta la longitud del genoma unitario ni se encapsidaba.

Hemos generado un virus recombinante para investigar adicionalmente el papel de este dominio con respecto a los efectos in vivo. El virus recombinante es avirulento in vivo e induce inmunidad ante la exposición a HSV-1 de tipo silvestre.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la construcción de cuatro plásmidos. (A) El plásmido pMON15839a contiene un fragmento KpnI de 3,4 kb de HSV-1 ("KOS") cadena arriba de la señal de poliadenilación de SV40. (B) El plásmido pMON15840 tiene una ORF de UL26 cadena bajo de la región promotora de ICP6 del herpesvirus. La traducción de UL26 empieza en la metionina 10. (C) Secuencia del sitio de clonación múltiple insertado en pMON27005 digerido con BspEI/BclI. (D) El plásmido pMON15835 contiene un cassette de ICP6-\beta-glucuronidasa insertado en el sitio BclI de pMON27005. La ORF de UL26 se muestra como el recuadro punteado, la región promotora de ICP6 se muestra como el recuadro rayado. Los plásmidos no están dibujados a escala. Abreviaturas: "K", KpnI; "B", BsgI; "S", SmaI.

La figura 2 muestra el análisis de transferencia de Southern de virus recombinantes. Se digirió ADN viral con NotI o KpnI, se transfirió a nitrocelulosa y se hibridó con un fragmento KpnI de 3,4 kb marcado con \alpha-32P-dGTP mostrado en la figura 1A. Los esquemas muestran los mapas de restricción de los virus. La región rayada en el esquema de deleción de UL26 es la inserción de ICP6-\beta-glucuronidasa en el dominio proteasa. Calle 1, HSV-1 ("17"); Calle 2, HSV/UL26/\beta-gluc; Calle 3, HSV/UL26/res. Abreviaturas: "n", NotI; "k", KpnI.

La figura 3 es una representación gráfica que muestra las curvas de crecimiento escalonadas de virus mutantes. Se infectaron células BHK/UL26 adyuvantes o células BHK/C2 a una MOI de 0,1. Las células se recogieron a diversos puntos de tiempo y los virus se titularon en células BHK/UL26 adyuvantes. Los círculos representan virus procedentes de células BHK/UL26 adyuvantes y los cuadrados representan virus procedentes de células BHK/C2. Las barras de error representan los intervalos de determinaciones por duplicado.

La figura 4 muestra los resultados del procesamiento de la proteína de ensamblaje de la cápsida. Se infectaron células BHK/C2 y BHK/UL26 adyuvantes con una MOI de 5 durante 18 horas. Las células se recogieron y las proteínas se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida desnaturalizante al 14%, se transfirieron a una membrana Immobilon, y se sondearon con antisueros generados contra un péptido de la proteína de ensamblaje de la cápsida de HSV-1 (HSVAs-414). La estrella abierta indica la proteína de ensamblaje no procesada principal y la estrella cerrada indica la forma procesada. Calle 1, células infectadas de forma simulada; Calle 2, HSV-1 de tipo silvestre; Calle 3, HSV/UL26/\beta-gluc; Calle 4, HSV/UL26/res.

La figura 5 es una representación gráfica que muestra la exposición viral de ratones. En ratones se inocularon por vía intraperitoneal (i.p.) 6 x 10^{5} pfu de cada virus y se evaluó la mortalidad. Los supervivientes y los ratones de control (agrupados por edad y sexo) se expusieron a otra dosis de virus de tipo silvestre en el día 32.

La figura 6 es una representación gráfica que muestra la inoculación i.p. o subcutánea (s.c.) de ratones inoculados con medio o 10^{2}, 10^{4} o 10^{6} pfu de HSV/UL26/\beta-gluc. Los ratones se inocularon en el día 1 i.p. (A) o s.c. (B). En el día 31, los ratones se expusieron a 10^{7} pfu de HSV-1 de tipo silvestre administrado i.p.

Descripción de la invención

La presente invención describe una vacuna que comprende un herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje. Preferiblemente, el herpesvirus contiene una forma inactivada de un gen de proteasa esencial. Más preferiblemente, la proteasa se requiere para el procesamiento y ensamblaje de partículas de cápsida inmaduras y no infeccionas en partículas de cápsida maduras e infecciosas.

El gen de la proteasa puede inactivarse por un método seleccionado entre deleción, inserción, substitución y cualquier combinación de deleción, inserción o substitución. Preferiblemente, el gen de proteasa se inactiva por deleción de ADN viral e inserción o substitución de ADN no viral (heterólogo). Más preferiblemente, el gen de proteasa esencial se inactiva por deleción de ADN viral e inserción de AND no viral (heterólogo).

Preferiblemente, el gen de proteasa inactivado se selecciona entre UL-26 de HSV-1, UL26 de HSV-2 y UL80 de HCMV. Más preferiblemente, la proteasa se codifica por UL26 de HSV-1.

La invención incluye herpesvirus seleccionados entre HSV-1, HSV-2, HCMV, SCMV, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8, PRV, BHV y EHV. Preferiblemente, el virus es HSV-1 o HSV-2. Más preferiblemente, el virus es HSV-1. Preferiblemente, la vacuna comprende el virus mutante con deficiencias en el ensamblaje denominado HSV/UL26/\beta-gluc.

Preferiblemente, la vacuna comprende una dosis comprendida entre aproximadamente 10 y aproximadamente 10^{6} unidades formadoras de placas de dicho herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje.

Además, la presente invención describe un método para fabricar una vacuna que comprende un herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje, por medio de la preparación de soluciones madre del virus en una línea celular recombinante capaz de generar virus ensamblados de manera apropiada. Preferiblemente, el método de fabricación de una vacuna usa un virus seleccionado entre HSV-1, HSV-2, HCMV, SCMV, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8, PRV, BHV y EHV. Más preferiblemente, el método de fabricación de una vacuna usa virus seleccionados entre HSV-1 y HSV-2. Incluso más preferiblemente, el método de fabricación de una vacuna usa un virus derivado de HSV-1.

La presente invención también describe el uso de un herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje en la preparación de una vacuna.

Además, la presente invención describe un método para inmunizar un mamífero susceptible contra un herpesvirus por medio de la administración de una vacuna que comprende un herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje. Preferiblemente, el mamífero susceptible se selecciona entre ser humano, mono, vaca, caballo, oveja y cerdo. Más preferiblemente, el mamífero es un ser humano.

La presente invención también describe un herpesvirus mutante que contiene una forma inactivada de un gen de proteasa esencial requerido para el procesamiento y ensamblaje de partículas de cápsida inmaduras y no infecciosas en partículas de cápsida maduras e infecciosas, inactivándose dicho gen de proteasa esencial por deleción de ADN viral e inserción de ADN no viral (heterólogo).

Preferiblemente, el gen de proteasa esencial se inactiva por deleción de una porción del gen de proteasa esencial e inserción de un segmento de ADN no viral (heterólogo) que comprende un gen indicador bajo el control de un promotor inducible. Más preferiblemente, el gen de proteasa esencial es el gen de UL26 de HSV-1. Más preferiblemente, el promotor inducible es el promotor de ICP6 (UL39) de HSV-1. Incluso más preferiblemente, el segmento de ADN no viral (heterólogo) comprende el gen gusA que codifica la beta-glucuronidasa de E. coli bajo el control de un promotor de ICP6 (UL39) de HSV-1.

La presente invención describe además una línea de células hospedadoras recombinante que expresa un gen de proteasa esencial bajo el control de un promotor inducible. Preferiblemente, la línea de células hospedadoras recombinante procede de una fuente de mamífero. Más preferiblemente, la línea de células hospedadoras recombinante procede de un roedor. Incluso más preferiblemente, la línea de células hospedadoras recombinante es BHK-21. Preferiblemente, el promotor inducible es un promotor de herpesvirus. Más preferiblemente, el promotor inducible es el promotor de ICP-6 (UL39) de HSV-1.

La presente invención también describe un método para obtener herpesvirus mutantes por medio de la introducción del virus en una línea de células hospedadoras recombinante y la recuperación de las partículas virales maduras que llevan el genoma viral mutante.

Definiciones

La frase "con deficiencias en el ensamblaje" pretende hacer referencia a que el virus es capaz de replicar su ADN, pero no puede completar las etapas de escisión de ese ADN en piezas de longitud del genoma ni empaquetar ese ADN en cápsidas virales.

La frase "virión maduro" pretende hacer referencia a una partícula viral capaz de infectar a un hospedador o tipo celular susceptible. La frase "ADN no viral (heterólogo)" pretende hacer referencia a un ADN que no procede de un genoma de herpesvirus. La frase "gen no esencial" pretende hacer referencia a un gen que puede romperse por deleción, inserción, substitución o una combinación de deleción, substitución e inserción de otro ADN, y a que un virus recombinante que contiene este gen roto puede propagarse en células cultivadas que no expresan copias no rotas del mismo gen. La frase "gen esencial" pretende hacer referencia a un gen que no es un gen no esencial. La frase "gen de proteasa viral esencial" pretende hacer referencia a un gen viral esencial que codifica una proteasa.

Parte experimental

Se obtuvieron células de riñón de hámster baby (BHK-21) de la American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero bovino fetal al 10% (JRH Biosciences, Lenexa, KS), L-glutamina 2 mM adicional (JRH Biosciences) y 100 \mug-unidades/ml de penicilina-estreptomicina (JRH Biosciences). La cepa MS de HSV-2 se obtuvo de la ATCC y la cepa 17 de HSV-1 se obtuvo a partir del Dr. R. Lausch, University of South Alabama. El ADN viral se aisló y purificó de acuerdo con D'Aquila y Summers [J. Virol. 61:1291-1295 (1987)] para cantidades de reserva y de acuerdo con DeLuca et al [J. Virol. 52:767-776 (1984)] y Rader et al [J. Gen. Virol. 74:1858-1869 (1984)] para la evaluación rápida por transferencia de Southern.

Para generar líneas celulares que complementaran el defecto en el gen UL26, las células BHK-21 se cotransfectaron con 10 \mug de ADN plasmídico que contenía las secuencias de complementación (véase más adelante) y 1 \mug de SV2neo [P. J. Southern and P. Berg. J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341 (1982)] usando el reactivo LipofectAmine (GIBCO/BRL/Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de dos días, las células se trataron con tripsina y se diluyeron en un medio que contenía 400 \mug/ml de G418 (Geneticin, Gibco/BLR/Life Technologies, Inc.). Las colonias individuales se aislaron y se expandieron para determinar la función adyuvante.

Se obtuvieron dos plásmidos para modificar por ingeniería genética una línea celular que complementara un HSV-1 con defectos en la proteasa. En primer lugar, un fragmento KpnI de 3,4 kb procedente de HSV-1 (KOS) (de P. Olivo, Washington University) que contenía la región promotora de UL26 entera y la fase de lectura abierta (ORF) se subclonó en el sitio KpnI de pMON3327 [Highkin et al, Poultry Science 70:970-981 (1991)] de tal forma que la señal de poliadenilación de SV40 estuviera en posición 3' con respecto a la ORF de UL26. Este plásmido se denominó pMON15831a (figura 1). El segundo plásmido consta de la ORF de UL26 bajo el control de la región promotora de ICP6 (UL39) de HSV-1. Este plásmido se sintetizó en varias etapas. En primer lugar, el fragmento SmaI de 320 pb que contenía el extremo 5' de la ORF de UL26 que empezaba en el nucleótido 18 se subclonó en el sitio SmaI de pUC18 dando como resultado pMON15838. El fragmento BsgI-KpnI de 1642 pb de pMON27010 se insertó en pMON15838 digerido con BsgI-KpnI para producir pMON15839. pMON27010 tiene el fragmento KpnI de 3,4 kb de HSV-1 (cepa 17) en pUC18. El fragmento EcoRI-HindIII de 1956 pb se aisló a partir de pMON15839 y los extremos se rellenaron usando polimerasa de Klenow antes de unirse a pMON15834 que se había digerido con BamHI y rellenado como se ha indicado anteriormente. El plásmido resultante se denominó pMON15840 (figura 1). El plásmido pMON15834 tiene el fragmento XhoI-SnaBI de 633 pb de HSV-1 (cepa 17) relleno que dirige la expresión de la ORF de ICP6 en el sitio SmaI de pMON3327.

En la ORF de UL26 se insertó un cassette de \beta-glucuronidasa como se indica a continuación: el cassette de \beta-glucuronidasa bajo el control de la región promotora de ICP6 de HSV-1 se construyó aislando un fragmento XhoI-SnaBI de 633 pb de pMON27002. pMON27002 tiene el fragmento Sse8387I D de 16.191 pb de HSV-1 (cepa 17) en pNEB193 (New England Biolabs, Beverly, MA). El sitio XhoI se rellenó usando polimerasa de Klenow y se unió al sitio NcoI relleno en pMON14327 (Luckow et al, J. Virol. 67:4566-4579 (1993)] que contiene el gen de la \beta-glucuronidasa. El nuevo plásmido se denomina pMON15833 (figura 1). El fragmento NotI H (6542 pb) que contenía la ORF de UL26 de HSV-1 (cepa 17) se subclonó en pBS2SKP digerido con NotI (Stratagene, La Jolla, CA) para generar el plásmido pMON27005. pMON27005 se digirió con BspEI y BclI. Se insertó un polienlazador que contenía múltiples sitios de clonación y extremos complementarios para crear el plásmido pMON27026 (figura 1). Para construir un cassette para la recombinación con el HSV-1 de tipo silvestre (cepa 17), las secuencias de ICP6-\beta-glucuronidasa de 2871 pb se retiraron de pMON15833 por digestión con BamHI y se unieron a pMON27026 digerido con BclI. El nuevo vector se denomina pMON15835 (figura 1).

Se sembraron células BHK a 4 x 10^{5} células por placa de 60 mm un día antes de la transfección. Un microgramo de ADN genómico viral y una cantidad equimolar de plásmido linealizado que contenía los cambios de secuencia deseados se mezclaron con 25 \mug de LipofectAmine en medio OptiMem (Gibco/BRL/Life Technologies) y se añadió a las células durante 4 horas. El medio se aspiró y se reemplazó por medio de crecimiento. Las células transfectadas se lisaron completamente antes de recoger el sobrenadante. El sobrenadante clarificado y diluido en serie (0,8 ml) se cultivó sobre la línea de células adyuvantes en placas de 60 mm a 37ºC durante 60 minutos. El inóculo se retiró y las células se recubrieron con agarosa al 1% (JRH Biosciences)/FBS al 10%/EMEM (BioWhitaker, Walkersville, MD). Después de la formación de efectos citopáticos visibles, se añadieron 4 ml de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (JRH Biosciences) que contenía 300 \mug/ml de X-gluc (BioSynth AG, Switzerland) y 80 \mug/ml de rojo neutro (Sigma, St. Louis, MO) y las placas se repicaron usando una pipeta Pasteur. Para los virus que contenían el gen de la \beta-glucuronidasa, se seleccionaron las placas azules. Para los virus rescatados (véase más adelante), se seleccionaron placas transparentes. Los virus se purificaron en placa 3 veces o se purificaron por dilución limitante. El virus purificado se aisló y el ADN se analizó por análisis con enzimas de restricción y transferencia de Southern [Maniatis et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982)].

El análisis del virus de la placa transparente en la solución madre de virus de placa azul se realizó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al, Science. 239:487-491 (1988)]. Se sintetizaron dos oligonucleótidos que flanqueaban el sitio BsgI único en la ORF de UL26 de HSV-1 (cepa 17) (Genosys, The Woodlands, TX). El cebador de avance era idéntico a los nucleótidos 50.913 a 50.932 del genoma de HSV [5'-GGGCGAGTTGGCATTGGATC-3', McGeoch et al, J. Gen. Virol. 69:1531-1574 (1988)]. El cebador inverso era complementario a las secuencias 51.195 a 51.175 del genoma de HSV-1 (5'-AGACCGAGGGCAGGTAGTT-3'). El virus se extrajo con fenol:cloroformo y el ADN viral se precipitó con etanol. La PCR se realizó usando el kit de PCR de GeneAmp (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT). Los productos de reacción se analizaron en geles de poliacrilamida al 5%.

Se indujeron anticuerpos peptídicos en conejos contra regiones correspondientes a los aminoácidos 414 a 428. El péptido HSVAs-414 (C-PAAGDPGVRGSGKR) se sintetizó por Chiron Mimotopes Pty. Ltd. (Raleigh, NC) y se purificó hasta una pureza mayor del 95%. HSVAs-414 se localizó en la región central de la región de ensamblaje de la cápsida de los genes UL26 y UL26.5. El péptido tenía un ácido libre en el extremo C y se conjugó con el toxoide diftérico en el extremo N. Se inocularon conejos con 100 \mul de proteína a una concentración de 1 \mug/ml mezclada con un volumen igual de adyuvante completo de Freund, los conejos se reforzaron con el mismo material en adyuvante incompleto de Freund a intervalos de 4 semanas empezando en la semana 2, y se extrajeron muestras de sangre 10 y 17 días después del refuerzo.

Se sembraron células en pocillos de placas de seis pocillos a 5 x 10^{5} células/pocillo. Al día siguiente, las células se infectaron con una multiplicidad de infección (MOI) de 5 pfu/célula durante 60 minutos a 37ºC con una agitación suave ocasional. El inóculo se aspiró y se añadió medio de crecimiento. Dieciocho horas después de la infección, el medio se aspiró y se añadieron 400 \mul de 1X tampón de rotura de proteínas 1X (Novex, San Diego, CA) que contenía \beta-mercaptoetanol al 10%. Las proteínas se separaron en geles de Tris-glicina SDS-poliacrilamida al 14% (Novex) durante 1,5 horas a 125 voltios. Los geles se incubaron durante 10 minutos en tampón de transferencia 1X (Novex) y se transfirieron a membranas Immobilon-P (Novex) durante 1-2 horas a 30 voltios. Las membranas se incubaron en solución salina tamponada con Tris 1X que contenía Tween 80 (TTBS), suplementado con leche en polvo al 5% durante al menos una hora (típicamente durante una noche). La mancha de transferencia se aclaró dos veces con TTBS durante 15 minutos y se incubó con anticuerpo primario durante una hora a una dilución de 1/1000. La mancha de transferencia se aclaró dos veces con TTBS durante 15 minutos antes de incubarse con el anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina, Promega, Madison, WI) durante 1 hora a una dilución de 1/4000. La fosfatasa alcalina se visualizó incubando la mancha de transferencia en nitro azul tetrazolio (NBT)/5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) (Promega) durante un periodo de 5 a 15 minutos, y la reacción se detuvo aclarando minuciosamente en H_{2}O.

La replicación viral se examinó por un análisis del crecimiento escalonado en la línea de células BHK/UL26 adyuvantes y en células BHK que no contenían la función adyuvante pero que eran resistentes a G418 (BHK/C2). Se sembraron células (1 x 10^{5}) en pocillos de una placa de 24 pocillos y se infectaron con una MOI de 0,1 unidades formadoras de placas (pfu) por célula. A diversos tiempos después de la infección, las células infectadas se sometieron a tres vueltas de congelación-descongelación [Tengelsen et al, J. Virol. 67:3470-3480 (1993)] y los lisados se titularon sobre la línea BHK/UL26 adyuvantes.

Para generar líneas celulares capaces de soportar la replicación de virus recombinantes con una deleción e inserción dentro de la fase de lectura abierta de UL26, las células BHK se cotransfectaron con pMON1581a que tiene el fragmento KpnI de 3,4 kb de HSV-1 (KOS) en posición 5' con respecto a la señal de poliadenilación de SV40 (figura 1) y SV2neo. Las células resistentes a G418 se aislaron y, como se demostró por el análisis de transferencia de Southern, contenían el fragmento KpnI de HSV-1. Para determinar la línea celular que expresaría los productos génicos de UL26, las líneas celulares se infectaron con HSV-2 (MS) para estimular al promotor de UL26 en la célula. Se usó antisuero anti-péptido específico de HSV-1, generado por la inoculación en conejos del péptido HSVAs-414 conjugado con la toxina diftérica, para identificar la expresión de los productos génicos de UL26 celulares (datos no mostrados). Esta línea celular, denominada BHK/UL26/8, se usó para la generación de virus recombinantes. Una línea de células resistentes a G418 que se cotransfectó con pMON3327 y SV2neo sirve como control y se denomina BHK/C2. Se aisló una línea de células adyuvantes adicional (BHK/UL26 adyuvante) después del descubrimiento de que se estaban generando cantidades significativas de virus rescatados debido a la recombinación con el fragmento KpnI presente en BHK/UL26/8. Esta segunda línea se transfectó con el plásmido pMON15840 que tiene la ORF de UL26 detrás del promotor de ICP6 y carece de la gran cantidad de ADN de HSV en posición 5' con respecto a la ORF de UL26 contenida en pMON15831a. La traducción de este plásmido integrado comenzaba en la metionina en el aminoácido natural 10. Se seleccionaron líneas de células candidatas con respecto a su capacidad de soportar el crecimiento del virus recombinante de fenotipo de placa azul (véase más adelante). Una línea celular aislada a partir de esta última selección que soporta el crecimiento del virus mutante de UL26 se denominó línea de células BHK/UL26 adyuvantes.

La línea celular BHK/UL26/8 se transfectó con ADN genómico de HSV-1 (cepa 17) y el plásmido pMON15835 que contiene un fragmento NotI de HSV-1 (cepa 17) con una deleción en el dominio proteasa de la ORF de UL26 y una inserción del gen de la \beta-glucuronidasa bacteriana bajo el control del promotor de ICP6 de HSV-1 (cepa 17) (figura 1). Después de la lisis celular, el sobrenadante se diluyó en serie en BHK/UL26/8 y se identificaron placas azules de 4 a 5 días después de la infección. Las placas azules se repicaron y se purificaron en placa tres veces. El virus recombinante se denominó HSV/UL26/\beta-gluc. La purificación en placas indicó una segregación deficiente entre el virus recombinante de fenotipo azul y el virus de fenotipo de placas transparentes que parecía tener una ventaja en el crecimiento, incluso en la línea de células adyuvantes.

Para determinar el genotipo y la fuente del virus de placas transparentes, se realizó una amplificación de ADN sobre ADN viral sin células procedente del cultivo mixto de virus de fenotipo de placa azul y de placa transparente. La amplificación de un fragmento de 283 pb indicó la presencia de virus de tipo silvestre en la solución madre. El producto de PCR se digirió con BsgI, que corta el fragmento de ADN de tipo silvestre (cepa 17), pero no corta el fragmento de ADN de tipo silvestre (cepa KOS) que es la fuente de ADN en la célula adyuvante (datos no mostrados). La ausencia de digestión del producto de PCR por BsgI indicó que el virus de tipo silvestre era realmente un revertiente generado por recombinación entre el virus de fenotipo de placa azul y las secuencias de UL26 en la línea de células adyuvantes. El virus rescatado se denominó HSV/UL26/res.

Para generar una solución madre más pura de HSV/UL26/\beta-gluc, se aisló una nueva línea de células adyuvantes (adyuvante BHK/UL26) en la que se había eliminado la cantidad de secuencia de ADN de HSV en posición 5' con respecto a la ORF de UL26 y se había reemplazado por el fragmento de la región promotora de ICP6 (pMON15840, figura 1). La propagación de HSV/UL26/\beta-gluc en esta línea celular dio como resultado únicamente el fenotipo de placa azul.

El ADN viral procedente del tipo silvestre (cepa 17), HSV/UL26/\beta-gluc y el virus rescatado se digirieron con NotI o KpnI. El ADN digerido se analizó por análisis de transferencia de Southern después del sondeo con un fragmento de restricción que contenía la fase de lectura abierta de UL26 de longitud completa y secuencias flanqueantes 5'. Los resultados mostraron el modelo esperado de digestión (figura 2). Los virus de tipo silvestre y rescatado mostraron el mismo modelo que se esperaba tanto con la digestión con NotI (6,3 kb) como con la digestión con KpnI (3,4 kb) (calles 1 y 3). La deleción de una región pequeña de la ORF de UL26 y la inserción del gen de la \beta-glucuronidasa dio como resultado la adición de un nuevo sitio NotI (dando como resultado fragmentos previstos de 4,8 y 4,4 kb) y un nuevo sitio KpnI (dando como resultado fragmentos de 4,0 y 2,1 kb) (calle 2) en HSV/UL26/\beta-gluc.

Se determinaron las curvas de crecimiento para los virus en diferentes líneas celulares. A diversos tiempos después de la infección, las células se recogieron y se congelaron-descongelaron tres veces antes del cultivo en células BHK/UL26 adyuvantes. Los resultados indicaron que HSV/UL26/\beta-gluc no podía replicarse en células BHK/C2, pero crecía con cinéticas de tipo silvestre en la línea de células BHK/UL26 adyuvantes. El HSV-1 de tipo silvestre (cepa 17) y el virus rescatado se replicaron hasta titulaciones idénticas y a velocidades idénticas tanto en la línea celular BHK/C2 como en la línea celular BHK/UL26 adyuvante (figura 3).

Como se ha demostrado por experimentos de transfección transitoria en células de mamífero, bacterias y ts1201 que ciertas mutaciones en la región 5' de UL26 no pueden escindir la proteína de ensamblaje de la cápsida [revisado en Gao et al, J. Virol. 68:3702-3712 (1994)], se usó HSV/UL26/\beta-gluc para infectar BHK/C2, BHK y células BHK/UL26 adyuvantes a una MOI de 5. Dieciocho horas después de la infección, las células se lisaron en tampón de muestra de SDS-PAGE y las proteínas se separaron en un gel SDS-PAGE al 14%. Después de la transferencia a membranas Immobilon P, las manchas de transferencia se incubaron en antisueros contra la proteína de ensamblaje de la cápsida de HSV-1. Los resultados se muestran en la figura 4. La infección de células BHK/C2 por HSV/UL26/\beta-gluc dio como resultado la incapacidad de procesar la proteína de ensamblaje de la cápsida hasta una forma de menor peso molecular. La infección de BHK/células adyuvantes por HSV/UL26/\beta-gluc demostró que la proteína de ensamblaje de la cápsida se procesaba de manera apropiada. El virus recombinante rescatado (HSV/UL26/res) procesaba la proteína de ensamblaje de la cápsida tanto en las líneas celulares como en HSV-1 de tipo silvestre (calles 2 y 4). La proteína de ensamblaje de la cápsida se obtuvo a niveles normales durante la infección tanto en las células adyuvantes como en las células no adyuvantes, pero no se escinde en las células no adyuvantes. El recombinante HSV/UL26/\beta-gluc no puede procesar la proteína de ensamblaje de la cápsida y tiene un crecimiento restringido.

En ratones Swiss-Webster hembra (de 12-14 gramos, Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) se inocularon virus por vía intraperitoneal o subcutánea con volúmenes de 100 \mul. Las inoculaciones subcutáneas se administraron en el lado dorsal cerca de la base de la cola después de un breve tratamiento con CO_{2}/O_{2} de los ratones. El virus se resuspendió en DMEM que contenía FBS al 5% a menos que se indique otra cosa. El alimento y el agua se administraron ad libitum. Los ratones se eutanizaron si parecían moribundos debido a la parálisis.

En los ratones se inocularon i.p. con 6 x 10^{5} pfu (determinado en la línea de células adyuvantes) del HSV de tipo silvestre (cepa 17), HSV/UL26/\beta-gluc, o el virus rescatado en un volumen de 100 \mul. Como se muestra en la figura 5, los ratones infectados con el tipo silvestre (cepa 17) o con el virus rescatado murieron en el día 7 después de la infección. Todos los ratones infectados con HSV/UL26/\beta-gluc sobrevivieron. Los animales que recibieron originalmente HSV/UL26/\beta-gluc se expusieron a HSV-1 de tipo silvestre (cepa 17) i.p. a la misma dosis administrada inicialmente. También se inocularon ratones sobre los que no se había experimentado anteriormente de edad y sexo similar. Uno de los ratones infectados con HSV/UL26/\beta-gluc se encontró muerto aproximadamente 16 horas después de la infección con el virus de tipo silvestre. Probablemente la muerte no estaba relacionada con el virus, ya que se produjo muy rápido después de la infección. Los otros 9 ratones sobrevivieron a la exposición al virus de tipo silvestre. Los ratones sobre los que no se había experimentado previamente eran susceptibles a la infección por el virus de tipo silvestre, pero llevó más tiempo que el virus produjera morbididad y mortalidad (figura 5).

En un segundo experimento, en los ratones se inocularon i.p. diluciones en serie de 10 veces HSV/UL26/\beta-gluc empezando en el mismo inóculo usado en el experimento inicial. En el día 39, los ratones se expusieron i.p. a 6 x 10^{6} pfu de HSV-1 (cepa 17). Esta dosis de virus de tipo silvestre era 10 veces mayor que la del experimento inicial y ocasionó la muerte del 90% de los ratones que se habían inoculado inicialmente con DMEM/FBS al 5% (tabla 1, serie infectada de forma simulada). De nuevo, en 16 horas, se encontraron 6 ratones muertos. Dos de estos estaban en la serie que previamente se había inoculado con 10 pfu de HSV/UL26/\beta-gluc y 4 estaban en la serie que previamente había recibido 1 x 10^{5} pfu de HSV/UL26/\beta-gluc. Hubo una diferencia significativa entre las 6 curvas de supervivencia (p<0,02, ensayo log rank). Los datos sugieren que los ratones que se inocularon con HSV/UL26/\beta-gluc sobrevivieron de una manera dependiente de la dosis (tabla 1). Las curvas de supervivencia de los ratones que recibieron la máxima dosis de HSV/UL26/\beta-gluc fueron estadísticamente diferentes del grupo simulado (p = 0,023, ensayo log rank).

TABLA 1

HSV/UL26/\beta-gluc		% de supervivencia*
Simulado		10
6 x 10^{1} pfu		12,5
6 x 10^{2} pfu		30
6 x 10^{3} pfu		60
6 x 10^{4} pfu		50
6 x 10^{5} pfu		83,3

* Supervivencia determinada en el día 20 después de la exposición i.p. a 6 x 10^{6} pfu de HSV-1 de tipo silvestre (cepa 17). N = 10 para todos los grupos excepto para 6 x 10^{1} (N = 8) y 6 x 10^{5} (N = 6) debido a la muerte precoz.

En un tercer experimento, se prepararon soluciones madre de virus como se ha indicado previamente pero se resuspendieron en DMEM sin FBS. Se inocularon series de 10 ratones con DMEM solo o con dosis crecientes de HSV/UL26/\beta-gluc por vía i.p. o s.c. Después de un mes, todos los ratones se expusieron a 10^{7} pfu de virus de tipo silvestre por inoculación i.p. Algunos controles para la muerte rápida incluyeron animales que recibieron medio i.p. y después se expusieron a medio i.p., HSV/UL26/\beta-gluc y después medio, o HSV/UL26/\beta-gluc y después se expusieron a HSV/UL26/\beta-gluc. Ninguno de estos animales murió durante el transcurso del experimento. Ninguno de los animales experimentales murió en las 24 horas posteriores a la exposición. De éstos, 90 animales habían recibido 2 inoculaciones de virus y sería de esperar que aproximadamente el 10-12% hubieran muerto rápidamente. Los resultados con los grupos experimentales se muestran en las figuras 6a y 6b. Hubo una diferencia significativa entre las curvas de supervivencia tanto para las inoculaciones i.p (p<0,01) como para las inoculaciones s.c. (p<0,01) (ensayo log rank). El análisis de regresión demuestra que hay un efecto dependiente de la dosis de HSV/UL26/\beta-gluc sobre la supervivencia (p<0,05, ensayo de Cochran-Armitage) para los dos grupos.

Es de esperar que este virus tuviera una eficacia reducida y se reactivara poco, si se reactivaba algo. El hecho de que la mutación afecte a la función de un gen tardío sugiere que el virus recombinante puede ser más eficaz para inducir inmunidad que virus que tienen deleciones en genes tempranos inmediatos o tempranos. El virus HSV/UL26/\beta-gluc con defectos en el ensamblaje es un miembro de una nueva clase de candidatos de vacuna con un defecto en la actividad de un gen tardío.

Es previsible que el defecto en el gen esencial descrito en un virus con deficiencia en el ensamblaje pueda incorporarse en un virus con otras mutaciones en genes esenciales o no esenciales. Tales genes, tales como ICP47 de HSV-1, pueden modular la capacidad del hospedador de inducir una reacción inmune contra el virus [Hill et al, Nature 375:411-415 (1995); Früh et al, Nature 375:415-417 (1995)].

Las vacunas de la presente invención pueden estar en forma liofilizada o suspendidas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las suspensiones adecuadas pueden incluir tampón fosfato, solución salina, glucosa, suero inactivado, excipientes y adyuvantes. La vacuna puede prepararse y usarse de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la técnica [revisado en R. L. Burke, Seminars in Virology, 4:187-197, (1993)]. La dosis eficaz también puede determinarse por técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. En general, las vacunas se formulan en un tampón esterilizado adecuado y se administran por inyección intradérmica, intramuscular o subcutánea a una dosis comprendida entre 10^{3} y 10^{9} pfu/kg. La vacuna también puede formularse para administración oral u ocular en vehículos conocidos en la técnica.

Claims (31)

1. Una vacuna que comprende un herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje, que contiene el genoma viral empaquetado, donde dicho herpesvirus contiene una forma inactivada de un gen de proteasa esencial requerido para el procesamiento y ensamblaje de partículas de cápsida inmaduras y no infecciosas en partículas de cápsida maduras e infecciosas

2. La vacuna de la reivindicación 1, donde dicho herpesvirus se selecciona entre HSV-1, HSV-2, HCMV, SCMV, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8, PRV, BHV y EHV.

3. La vacuna de la reivindicación 2, donde dicho herpesvirus es HSV-1 o HSV-2.

4. La vacuna de la reivindicación 2, donde dicho herpesvirus es HSV-1.

5. La vacuna de la reivindicación 1, donde dicho gen de proteasa esencial se selecciona entre UL26 de HSV-1, UL26 de HSV-2 y UL80 de HCMV.

6. La vacuna de la reivindicación 5, donde dicho gen de proteasa esencial es UL26 de HSV-1

7. La vacuna de la reivindicación 1, donde dicho gen de proteasa esencial se inactiva por un método seleccionado entre el grupo compuesto por deleción de ADN, inserción de ADN, substitución de AND, deleción e inserción de ADN, deleción y substitución de ADN, inserción y substitución de ADN, y deleción, inserción y substitución de ADN.

8. La vacuna de la reivindicación 7, donde dicho gen de proteasa esencial se inactiva por deleción de ADN viral e inserción de ADN no viral heterólogo.

9. La vacuna de la reivindicación 1, que comprende entre aproximadamente 10 y aproximadamente 10^{6} unidades formadoras de placas de dicho herpesvirus, como se determina en una línea de células adyuvantes.

10. La vacuna de la reivindicación 1, donde dicho herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje comprende la cepa denominada HSV/UL26/\beta-gluc, donde dicha cepa de HSV-1 contiene el gen UL26 esencial inactivado no condicionalmente por deleción de ADN viral e inserción de ADN no viral (heterólogo) que contiene el gen gusA, que codifica la beta-glucuronidasa de E. coli bajo el control del promotor (UL39) de HSV-1.

11. Un método para fabricar una vacuna de la reivindicación 1 que comprende un herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje, por medio de la preparación de soluciones madre de dicho herpesvirus en una línea de células recombinante capaz de generar virus ensamblados de manera apropiada, y la suspensión de dicho virus en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Un método para fabricar una vacuna de la reivindicación 1 que comprende un herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje, donde dicho gen de proteasa esencial es un gen UL26 de HSV-1, por medio de la preparación de soluciones madre de dicho herpesvirus en una línea de células recombinante capaz de generar virus ensamblados de manera apropiada, y la suspensión de dicho virus en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. El método de la reivindicación 11, donde dicha vacuna comprende la cepa HSV/UL26/\beta-gluc.

14. El método de la reivindicación 11, donde dicha línea celular es de mamífero.

15. El método de la reivindicación 14, donde dicha línea celular soporta la replicación de dicho herpesvirus.

16. El método de la reivindicación 15, donde dicha línea celular es la línea celular denominada BHK/UL26/8.

17. El método de la reivindicación 15, donde dicha línea celular comprende la línea celular denominada BHK/UL26 adyuvante.

18. Un uso de un herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje que contiene el genoma viral empaquetado, donde dicho herpesvirus contiene una forma inactivada de un gen de proteasa esencial que se requiere para el procesamiento y ensamblaje de partículas de cápsida inmaduras y no infecciosas en partículas de cápsida maduras e infecciosas, en la preparación de una vacuna.

19. Uso de una vacuna de la reivindicación 1 en un vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de un medicamento para inmunizar a un mamífero contra un herpesvirus.

20. Uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde el mamífero se selecciona entre ser humano, mono, vaca, caballo, oveja y cerdo.

21. Uso de acuerdo con la reivindicación 20, donde el mamífero es un ser humano.

22. El herpesvirus mutante que contiene una forma inactivada de un gen de proteasa esencial requerido para el procesamiento y ensamblaje de partículas de cápsida inmaduras y no infecciosas en partículas de cápsida maduras e infecciosas, donde una porción de dicho gen de proteasa esencial se deleciona y se reemplaza por un segmento de ADN no viral heterólogo que comprende un gen indicador bajo el control de un promotor inducible del herpesvirus HSV-1.

23. Un herpesvirus mutante de acuerdo con la reivindicación 22, donde dicho herpesvirus se selecciona entre HSV-1, HSV-2, HCMV, SCMV, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8, PRV, BHV y EHV.

24. El herpesvirus mutante de la reivindicación 23, donde dicho gen de proteasa esencial es UL26 de HSV-1.

25. El herpesvirus mutante de la reivindicación 22, donde dicho gen indicador se selecciona entre gusA que codifica la beta-glucuronidasa, lacZ que codifica la beta-galactosidasa, phoA que codifica la fosfatasa alcalina, gfp que codifica la proteína fluorescente verde, y aeq que codifica aequorin.

26. El herpesvirus mutante de la reivindicación 25, donde dicho gen indicador es el gen gusA que codifica la beta-glucuronidasa de E. coli.

27. El herpesvirus mutante de la reivindicación 22, donde dicho promotor inducible de herpesvirus es el promotor de ICP-6 (UL39) de HSV-1.

28. Una línea de células hospedadoras recombinante que expresa un gen de proteasa de herpesvirus esencial bajo el control de un promotor inducible que no es de proteasa, donde dicha línea de células hospedadoras es capaz de propagar un herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje y dicho herpesvirus contiene una forma inactivada de un gen de proteasa esencial que se requiere para el procesamiento y ensamblaje de partículas de cápsida inmaduras y no infecciosas en partículas de cápsida maduras e infecciosas, y dicha línea de células hospedadoras procede de un roedor.

29. La línea de células hospedadoras recombinante de la reivindicación 28, donde dicha línea de células hospedadoras es BHK-21.

30. La línea de células hospedadoras recombinante de la reivindicación 28, donde dicho promotor inducible que no es de proteasa es el promotor de ICP6 (UL39) de HSV-1.

31. Una línea de células hospedadoras recombinante que expresa un gen de proteasa de herpesvirus esencial bajo el control de un promotor inducible que no es de proteasa, donde dicha línea de células hospedadoras es capaz de propagar un herpesvirus con deficiencias en el ensamblaje, dicho herpesvirus contiene una forma inactivada de un gen de proteasa esencial que se requiere para el procesamiento y ensamblaje de partículas de cápsida inmaduras y no infecciosas en partículas de cápsida maduras e infecciosas, dicha línea de células hospedadoras es BHK-21, y dicho promotor inducible que no es de proteasa es el promotor de ICP6 (UL39) de HSV-1.