CZ17999A3

CZ17999A3 - Vakcína s nekomplexním herpesvirem

Info

Publication number: CZ17999A3
Application number: CZ99179A
Authority: CZ
Inventors: Paul J. Hippenmeyer; Anne M. Renkin; Verne A. Luckow
Original assignee: G. D. Searle & Co.
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 1999-07-14
Also published as: BR9710604A; EP0956045A2; CN1230893A; EP0956045B1; DE69730993T2; ATE277634T1; US5972666A; DK0956045T3; WO1998004286A2; CA2261071A1; PT956045E; ES2231884T3; JP2000516597A; WO1998004286A3; AU3977997A; DE69730993D1

Description

Vynález se týká oblasti vakcin proti virům a zejména se týká přípravy nekomplexních mutantních herpesvirů, vakcin, které obsahují nekomplexní mutantní herpesviry a způsobů výroby a přípravy vakcin s nekomplexním herpesvirem. Dosavadní stav techniky

Existuje velká potřeba léčení virových nemocí. Zatímco protivirové léky jako zidovudin, využívané pro léčení viru lidské imunodeficience (HIV) a léků jako ganciclovir, acyclovir a foscarnet se používají pro léčení infekcí herpesvirem, významné vedlejší účinky často omezují jejich účinnost. Selekce a rozšíření virů odolných lékům také omezuje účinnost protivirových léků s malou molekulovou hmotností. To je zvláště významný problém pro léky zacílené proti RNA virům, jako HIV, které mají relativně vysokou rychlost mutace ve srovnání s většinou DNA virů.

Protivirové vakciny jsou schůdnou alternativou k protivirovému léčení léky po infekci. Protivirové vakciny ideálně chrání proti primární infekci a souběžným infekcím. Účinnost proti určité nemoci je zásadní pro vývoj strategie vakciny. Musí se též uvažovat regulační obavy, zejména vztažené k bezpečnosti vakcin zamýšlených pro profylaktické použití u zdravých jednotlivců.

Zatímco vakciny proti herpes virům byly aktivní oblastí jak akademického, tak komerčního zájmu, zavedení dobré chránící imunitní odpovědi u lidí bylo výzvou (R.

L. Burke, Současný stav vývoje HSV vakciny, v The Human Herpesviruses, 367-379, (B. Roizman, R. J. Whitley a C. Lopez, eds., 1993). Živé virové vakciny mají riziko vyvolání latence a reaktivace. Živé virové vakciny také mají potenciál rekombinace s přírodními izoláty.

Aby se předešlo těmto rizikům, byly vyvinuty oslabené rekombinantní virové a podjednotkové vakciny.. Meignier aj. popisují rekombinantní virus vzniklý odstraněním oblasti herpes simplex viru typu 1 (HSV-1) potřebné pro virulenci vložení glycoprotein genů herpes simplex viru typu 2 (HSV-2) (J. Infect. Dis., 158: 602-614 (1988)). Viry měly sníženou pathogenicitu a indukovaly imunitu v řadě zvířecích modelů.

• · f* 4 · 4444 44 44

4444 44 4 4··»

4444 44 4 4444

4 444 444 44 444 444

44444 4 4

Nověji se popisují rekombinantní herpes simplex viry s odstraněnými základními bezprostředními časnými nebo časnými geny. Přičemž tyto rekombinantní viry se popisují jako účinné při indukování imunity a zmenšení akutní replikace a vytvoření latence studovaného divokého typu viru u myší. Nguyen aj. popisují mutanty HSV-1 s defektní replikací, které mají mutace v rozhodných genech kódujících protein 8 nakažené buňky (ICP8)nebo IPC27 (J. Virol. 66:7067-7072 (1992)). ICP8 mutant (d301) exprimuje produkty a a β genů, zatímco ICP27 mutant (n504) exprimuje produkty α, β a γι genů v buňkách, které mohou být viry infikovány. Oba viry vyvolávaly tvorbu protilátek, která byla nižší než původního viru (KOS 1.1), avšak hladina vyvolaná infekcí ICP27 mutantem byla vyšší než ta, která byla vyvolaná infekcí ICP8 mutantem. Morrison a Knipe později ukázali, že injekce těchto virů chránily myši proti rozvinutí encefalitidy a keratitidy a zmenšily primární replikaci virulentního viru (J. Virol. 68:689-696 (1994)). WO95/18852 popisuje podobné mutanty herpes virů s defektní replikací a W094/03207 popisuje vakciny založené na těchto mutantech.

Byl popsán jiný rekombinantní virus, který má odstraněnou kódující oblast glycoproteinu H (gH) (Forrester aj., J. Virol. 66:341-348 (1992), WO92/05263). Tento virus tvoří po infekci nepomocných buněk viriony, avšak viry nemohou infikovat v dalším kole. Očkování myší virem s odstraněnou gH vedlo k rychlejšímu odstranění divokého typu viru ve srovnání s očkováním s chemicky desaktivovaným virem (Farrell aj., J. Virol. 68:927-932 (1994)). Očkování morčat rekombinantním virem s odstraněnou gH vedlo k snížení primární vaginální choroby a snížení jejího opakování (McLean aj., J. Infect. Dis., 170: 1100-1109 (1994)).

Většina virů kóduje proteinázy, které působí při zpracování virových proteinů během infekce (W. G. Dougherty a B. L. Semler, Microbiological Reviews, 57: 781822 (1993)). Biologické a biochemické studie ukázaly, že HSV-1 má proteinázu, která může zpracovat jiný virový, kapsidový komplexní protein (také známý jako p40, IPC35 a VP22a). Podobné proteinázy jsou zakódovány v genomu jiných členů Herpesviridae. Tato skupina DNA virů zahrnuje mezi jinými HSV-1, HSV-2, lidský a opičí cytomegalovirus (HCMV, SCMV), varicella-zoster virus (VZV), virus EpsteinBarr (EBV), lidský herpesvirus typů -6, -7 a -8 (HHV-6, HHV-7 a HHV-8), virus pseudovztekliny (PRV), hovězí herpesvirus (BHV), koňský herpesvirus (EHV), a virus rhinotracheitidy.

·· ·· ·· · 4 4» · ·· ··

3«··· 9 · · 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 999 9 9 9 99 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9

Dřívější práce Prestona aj. (J. Virol. 45:1056-1064 (1983)) ukázaly, že mutant HSV-1 (tsl201) citlivý na teplotu (ts) nebyl schopný štěpit kapsidový komplexní protein na jeho formy s nižší molekulovou hmotností při nepermisivní teplotě. Tento mutant také nebyl schopný sbalit virovou DNA. Pomocí signálního znaku se defekt mapoval do oblasti, která je známá jako otevřený čtecí rámec UL26 (ORF) (McGeoch aj. (J. Gen. Virol. 69:1531-1574 (1988)). Následná analýza ukázala, že dva transkripty začínají v oblasti UL26, primární transkript asi 2,1 kb, který kóduje protein s 635 aminokyselinami, a hojnější transkript, který začíná v UL26 ORF s asi 1000 nukleotidy 3' iniciace primárního transkriptu. Tento menší transkript kóduje předpovězený protein s 329 aminokyselinami a je 3' koterminální s větším 80 kDa ORF kódovaným větším transkriptem (F. Y. Liu a B. Roizman, J. Virol. 65:206-212 (1991)). Defekt mutantu tsl201 se mapuje v 5' oblasti většího transkriptu, který kóduje aktivitu proteinázy v HSV-1 (F. Y. Liu a B. Roizman, J. Virol. 65:5149-5156 (1991)) nebo v opičím cytomegaloviru (Welch aj., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:10792-10796 (1991)).

Studie superinfekce/doěasné exprese (F. Y. Liu a B. Roizman, J. Virol. 65:5149-5156 (1991)) nebo dočasné exprese (Welch aj., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:10792-10796 (1991)) a infekce (Prestonaj. J. Virol. 186:87-98 (1992)) s doménou proteázy a doménou kapsidového komplexního proteinu ukázaly, že proteináza štěpí kapsidový komplexní protein blízko jeho karboxylového konce. Další studie s proteiny produkovanými v E. coli potvrdily, že protein UL26 ORF s úplnou délkou je schopný se sám štěpit na dvou místech a také štěpit kapsidový komplexní protein (Deckman aj. J. Virol. 66:7362-7367 (1992)). Dilanni aj. později lokalizovali místa štěpení mezi aminokyselinami 247/248 a 610/611 UL26 ORF (J. Biol. Chem. 268:2048-2051 (1993)).

Ačkoliv výsledky s tsl201 naznačují, že defektem viru je jeho schopnost štěpit kapsidový komplexní protein a následné enkapsidace DNA, není známo, zda tento fenotyp je výsledkem defektu aktivity protenázy per se, nebo zda 5' oblast UL26 ORF kóduje některé další funkce potřebné pro komplexaci a maturaci kapsidu. Zpracovaná oblast proteinázy v 80 kDa prekursoru (označený jako VP24 nebo No) se identifikovala v B-kapsidech (Davidson aj., J. Gen. Virol. 73:2709-2713 (1992)) a je zachována v A-kapsidech a C-kapsidech (F. J. Rixon, Struktura a komplexnost herpesvirů, v Seminars in Virology, svazek 4, 135-144 (A. J. Davidson, ed., 1993)), • 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4

444 444

4 4

4 · · · · • · · · · · · · 4 · · • 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 » což naznačuje strukturní úlohu této domény. B-kapsidy jsou nezralé kapsidy v jádře infikované buňky, která obsahuje protein komplexního kapsidu, nikoliv však virovou DNA. Tyto kapsidy se považují za prekursory A-kapsidů, které nejsou schopné balit DNA a C-kapsidů, které balí DNA se současnou ztrátou kapsidového komplexního proteinu (B. Roizman a A. Sears, Herpes simplex viry a jejich replikace v The Human Herpesviruses, 11-68, (B. Roizman, R. J. Whitley a C. Lopez, eds., 1993)). Gao aj. konstruovali a charakterizovali nulový mutantní virus (ml00), který obsahuje deleci v doméně genu proteázy UL26 HSV-1 (J. Virol. 68:3702-3712 (1994)). Mutantní virus by se mohl šířit na komplementm buněčnou linii, nikoliv však na nekomplementní Věro buňky, což naznačuje, že doména proteázy UL26 je důležitá pro replikaci v buněčné kultuře. K replikaci DNA došlo na hladinách blízkých divokým typům, avšak virová DNA nebyla zpracována na délku jednotkového genomu nebo enkapsulována.

Generovali jsme rekombinantní virus, abychom dále prostudovali úlohu této domény s ohledem na účinky in vivo. Rekombinantní virus není in vivo virulentní a vyvolává imunitu vůči divokému typu HSV-1.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje vakcinu obsahující nekomplexní herpesvirus. Herpesvirus obsahuje s výhodou dezaktivovanou formu hlavního genu proteázy. Výhodněji je proteáza potřeba pro zpracování a komplexaci nezralých neinfekčních kapsidových částic.

Gen proteázy se může inaktivovat způsobem vybraným z delece, inserce, substituce a jakákoliv kombinace nebo delece, inserce nebo substituce. S výhodou se gen proteázy inaktivuje deleci virové DNA a insercí nebo substitucí nevirové (heterologní) DNA. Výhodněji se hlavní gen proteázy inaktivuje deleci virové DNA a insercí nevirové (heterologní) DNA.

S výhodou se inaktivovaný gen proteázy vybere z HSV-1 UL26, HSV-2 UL26 a HCMV UL80. Výhodněji se proteáza kóduje HSV-1 UL26.

Vynález zahrnuje herpesviry vybrané z HSV-1, HSV-2, HCMV, SCMV, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8, PRV, BHV a EHV. S výhodou je virem HSV-1 nebo • · • · • · · · • ·

HSV-2. Nejlépe je virem HSV-1. S výhodou vakcína obsahuje nekomplexní mutantní virus HSV/UL26/p-gluc.

S výhodou vakcína obsahuje dávku asi mezi 10 a 10 6 jednotek tvořících plak uvedeného nekomplexního herpesviru.

Mimoto vynález popisuje způsob výroby vakciny obsahující nekomplexní herpesvir, přípravou zásob viru v rekombinantní buněčné linii schopné tvořit správně sestavený virus. S výhodou způsob výroby vakciny používá virus vybraný z HSV-1, HSV-2, HCMV, SCMV, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8, PRV, BHV a EHV. S výhodou je virem HSV-1 nebo HSV-2. Výhodněji způsob výroby vakciny používá virus vybraný z HSV-1, HSV-2. Nejlépe způsob výroby vakciny používá virus odvozený z HSV-1.

Vynález dále popisuje použití nekomplexního herpesviru pro výrobu vakciny.

Mimoto vynález popisuje způsob imunizace citlivého savce proti herpesviru podáváním vakciny obsahující nekomplexní herpesvirus. S výhodou se citlivý savec vybere z lidí, opic, krav, koní, ovcí a prasat. Výhodněji je savcem člověk.

Vynález také popisuje mutant herpesviru obsahující inaktivovanou formu hlavního genu proteázy potřebnou pro zpracování a komplexaci nezralých neinfekěních kapsidových částic na zralé neinfekění kapsidové částice. Tento hlavní gen proteázy se inaktivuje tak, že se zbaví virové DNA a vloží se nevirová (heterologní) DNA.

S výhodou se hlavní gen proteázy se inaktivuje delecí části hlavního genu proteázy a insercí nevirového (heterologního) DNA segmentu obsahujícího reportér gen pod kontrolou indukovatelného promotoru. Výhodněji je hlavním genem proteázy gen HSV-1 UL26. Výhodněji je indukovatelným promotorem promotor HSV-1 ICP6 (UL39). Ještě výhodněji nevirový (heterologní) segment DNA obsahuje gen gusA kódující beta-glukuronidázu E.coli pod kontrolou HSV-1 ICP6 (UL39) promotoru.

Vynález také popisuje způsob přípravy mutantního herpesviru zavedením viru do rekombinantní hostitelské buněčné linie a sklizní zralých virových částic obsahujících mutantní virový genom.

• · · · • * • · «··· * · · · · · · «··· · · « ·«·· • · ··· · · · « · ··· ··· « · · · · · · · ·

Fráze nekomplexní má znamenat, že virus je schopný replikovat svou DNA, ale není schopný ukončit kroky štěpit tuto DNA do kusů v délce genomu a sbalit tuto j DNA do virových kapsidů.

Fráze zralý virion má znamenat, že virová částice je schopná infekce v citlivém hostiteli nebo buněčném typu. Fráze nevirová (heterologní) DNA má znamenat DNA, která není odvozena od genomu herpesviru. Fráze nepodstatný gen má znamenat gen, který může být přerušen delecí, insercí, substitucí nebo kombinací delece, substituce a inserce jiné DNA, a že rekombinantní virus obsahující tento přerušený gen se může šířit do kultivovaných buněk, které neexprimují neporušené kopie stejného genu. Fráze podstatný gen má znamenat gen, který není nepodstatným genem. Fráze podstatný gen virové proteázy má znamenat podstatný gen, který kóduje virovou proteázu.

Krátký popis obrázků

Obr. 1 ukazuje konstrukci čtyř plasmidů. (A) Plasmid pMON15839a obsahuje

3,4 kb KpnI fragment HSV-1 (KOS) proti směru SV40 polyadenylačního signálu. (B) Plasmid pMON15840 má UL26 ORF po směru promotorové oblasti ICP6 herpesviru. Translace UL26 začíná u methioninu 10. (C) Řetězec mnohonásobného klonovacího místa vloženého do BspEI/BclI-štěpeného pMON27005. (D) Plasmid pMON15835 obsahuje ICP6-p-glukuronidázovou kazetu vloženou do Bell místa pMON27005. UL26 ORF je označen jako tečkovaný box, oblast ICP6 promotoru je označen jako čárkovaný box. Plasmidy nejsou nakresleny v měřítku. Zkratky: K, KpnI, B, Bsgl, S, Smál.

Obr. 2 ukazuje Southern blot analýzu rekombinantních virů. Virová DNA se štěpila s Notl nebo s KpnI, přenesla na nitrocelulózu a hybridizovala se na a-32PdGTP-značený 3,4 KpnI fragment ukázaný na obr. 1A. Schéma ukazuje restrikční mapu virů. Čárkovaná oblast v deleci UL26 schématu je inserce β-glukuronidázy v domémě proteázy. Linie 1, HSV-1 (17), linie 2, HSV/UL26/p-gluk, linie 3 HSV/UL26/res. Zkratky: N, Notl, K, KpnI.

Obr. 3 je grafické znázornění, které ukazuje mnohastupňové růstové křivky mutantních virů. BHK/UL26 pomocné nebo BHK/C2 buňky se infikovaly MOI 0,1.

·· ·· • · · · · • · · · • « ··· · ·· *· ·· • · · · · · • · · · · · • · ····· ·

Buňky se sklízely v různých časových bodech a virus se titroval na BHK/UL26 pomocných buňkách. Kroužky představují virus z BHK/UL26 pomocných buněk a čtverečky představují virus z BHK/C2 buněk. Chybové sloupce představují rozmezí opakovaných stanovení.

Obr. 4 ukazuje výsledky zpracování kapsidového komplexního proteinu. BHK/C2 a BHK/UL26 pomocné buňky se infikovaly s ΜΌΙ 5 po dobu 18 hodin. Buňky se sklidily a proteiny se oddělily na 14% denaturujícím polyakrylamidovém gelu, přenesly se na Immobilon membránu a zkoušely se s antiséry vytvořenými proti peptidu HSV-1 kapsidového komplexního proteinu (HSVAs-414). Nevyplněná hvězda ukazuje hlavní nezpracovaný protein a plná hvězda ukazuje zpracovanou formu. Linie 1, napodobené infikované buňky, linie 2, divoký typ HSV-1, linie 3, HSV/UL26/p-gluc, linie 4, HSV/UL26/res.

Obr. 5 je grafické znázornění, které ukazuje virové vyvolání odezvy u myší. Myši se očkovaly intraperitoneálně (i.p.) s 6 x 10$ pfu každého viru a hodnotily se na mortalitu. Přežilé myši a kontrolní myši (souhlasný věk a pohlaví) se podrobili jiné dávce divokého typu viru 32. den.

Obr. 6 je grafické znázornění, které ukazuje i.p. nebo podkožní (s.q.) očkování myší očkovaných mediem 10², 10^ nebo 10^ pfu HSV/UL26/p-gluc. Myši se očkovaly 1. den buď i.p. (A), nebo s.q. (B). 31. den se u myší vyvolala odezva k 10²pfu divokého typu HSV-1 podanou i.p.

Příklady provedení vynálezu

Mladé buňky ledvin křečků (BKH-21) se získaly z American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) a kultivovaly se v Dulbeccově modifikovaném Eaglově mediu obohaceném 10% fetální hovězím sérem (JRH Biosciences, Lexena, Ks), 2 mM dalšího L-glutaminu (JRH Biosciences) a 0,100 mg-jednotek/ml penicilin/streptomycinu (JRH Biosciences). HSV-2 kmen MS se získal z ATCC a HSV-1 kmen 17 se získal od dr. R. Lausche, University of South Alabama. Virová DNA se izolovala a čistila podle D'Aquily a Summerse (J. Virol. 61:1291-1295 (1987) pro zásobní množství a podle DeLuca aj. (J. Virol. 52:767-776 (1984)) a Rader aj. (J. Gen. Virol. 74:1858-1869 (1993)) pro rychlé vyhodnocení Southern blotu.

•4 4444 «444 44 4 4444 • 444 44 4 4444

4 444 444 4 4 444 ··· • 4 44444 4 4

Aby se generovaly buněčné linie, které komplementují defekt UL26 genu, BHK-21 buňky se kotranfektovaly s 0,010 mg plasmidové DNA obsahující komplementující sekvence (viz níže) a 0,001 mg SV2neo (P. J. Southern a P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341 (1982) s použitím reagentu LipofectAmine (GIBCO/BRL/Life Technologies, lne., Grand Island, NY) podle instrukcí výrobce. Po dvou dnech se buňky ošetřily a zředily se do media obsahujícího 0,400 mg/ml G418 (Geneticin, GIBCO/BRL/Life Technologies, lne.). Jednotlivé kolonie se isolovaly a expandovaly se pro stanovení pomocné funkce.

Dva plasmidy se připravily pro engineering buněčné linie, která by doplňovala HSV-1 s defektní proteázou. Nejprve se 3,4 kb KpnI fragment HSV-1 (KOS) (od P. Olivo, Washington University) obsahující celou UL26 promotorovou oblast a otevřený čtecí rámec (ORF) se subklonoval na KpnI místo pMON3327 (Highkin aj., Poultry Science 70:970-981 (1991)), takže SV40 polyadenylační signál je 3' k UL26 ORF. Tento plasmid se označil pMON15831a (obr. 1). Druhý plasmid se skládá z UL26 ORF pod kontrolou HSV-1 ICP6 (UL39) promotorové oblasti. Tento plasmid se syntetizoval v několika krocích. Nejprve se 320 bp Cmal fragment obsahující 5' konec UL26 ORF vycházející z nukleotidu 18 se subklonoval na Smál místo pUC18, což vedlo k pMON15838. 1642 bp Bsgl-KpnI fragment z pMON27005 se vložil do Bsgl/KpnI štěpeného pMON15838, což dalo pMON15839. pMON27010 má 3,4 kb KpnI fragment z HSV-1 (kmen 17) v pUC18. 1956 bp EcoRI-HindlII fragmentu se isolovalo z pMON15839 a konce se doplnily s použitím Klenowovy polymerázy před ligací na pMON15834, který byl štěpen s BamHl a doplněn, jak je uvedeno výše. Vzniklý plasmid je štěpený pMON15840 (obr. 1). Plasmid pMON15834 se doplnil do 633 kb Xhol-SnaBI fragmentu z HSV-1 (kmen 17), který řídí expresi ICP6 ORF v Smál místě pMON15827.

β-glukuronidázová kazeta se vložila do UL26 ORF následovně: βglukuronidázová kazeta pod kontrolou HSV-1 ICP6 promotorové oblasti se konstruovala isolací 633 kb Xhol-SnaBI fragmentu z pMON27002. pMON27002 má 16 191 bp Sse8387I D fragment z HSV-1 (kmen 17) v pUC193 (New England Biolabs, Beverly, MA). Xhol místo se vyplnilo s použitím Klenowovy polymerázy a spojilo se s vyplněným Ncol místem v pMON14327 (Luckow aj., J. Virol. 67:45664579 (1993)), které obsahuje gen β-glukuronidázy. Nový plasmid se štěpil pMON15833 (obr. 1). Notl H fragment (6542 bp) obsahující HSV-1 (kmen 17) se do • ft ftft·· • ftftft ftft · ftftftft • ftftft ·· · ftftftft • · ftftft ftftft ftft ftftft ftftft ·· ····· · ·

UL26 ORF subklonoval na Notl-štěpený pBS2SKP (Stratagene, La Jolla, Ca) za vzniku plasmidu pMON27005. pMON27005 se štěpil BspEI a Bell. Vložil se polyspojovník obsahující mnohonásobná klonovací místa a komplementární konce, aby vznikl plasmid pMON27026 (obr. 1). Ke konstrukci kazety pro rekombinací s divokým typem HSV-1 (kmen 17) se 2871 bp IPC6-P-glukuronidázové sekvence odstranily z pMON15833 štěpením s BamHI a ligo vály se do BclI-štěpeným pMON27026. Nový vektor se označil pMON15835 (obr. 1).

BHK buňky se vysely při 4 x 10^ buněk na 60 mm misku jeden den před transfekcí. Jeden mikrogram genomické virové DNA a ekvimolámí množství linearizováného plasmidu obsahujícího žádané změny sekvence se smíchaly s 0,035 mg LipofectAmine v OptiMem mediu (GIBCO/BRL/Life Technologies) a přidaly se na 4 hodiny k buňkám. Medium se odsálo a nahradilo se růstovým mediem. Transfektované buňky se úplně lyžovaly před odebráním supernatantu. Vyčeřený, postupně zředěný supernatant (0,8 ml) se dal na 60 mm misky s pomocnou buněčnou linií při 37 °C na 60 minut. Inokulum se odstranilo a buňky se překryly 1% agarózou (JRH Biosciences)/ 10% FBS/EMEM (BioWhitaker, Walkersville, MD). Po vzniku viditelných cytopatických jevů se přidaly 4 ml Dulbeccovy solanky pufrované fosfátem (JRH Biosciences) obsahující 0,300 mg/ml X-gluc (BioSynth AG, Švýcarsko) a 0,080 mg/ml neutrální červeně (Sigma, St. Louis, MO) a plak se sebral pomocí Pasteurovy pipety. Pro viry obsahující gen β-glukorinidázy se vybraly modré plaky. Pro zachráněné viry (viz níže) se vybraly čiré plaky. Viry se čistily od plaků třikrát, nebo se čistily postupným ředěním. Vyčištěný virus se isoloval a DNA se analyzovala analýzou restrikčním enzymem a Southern blotem (Maniatis aj., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982)).

Analýza čirého plaku viru v zásobě modrého plaku viru se uskutečnila řetězovou reakcí polymerázy (PCR) (Saiki aj., Science, 239:487-491 (1991)). Dva oligonukleotidy, které lemují jediné Bsgl místo HSV-1 (kmen 17) UL26 ORF se syntetizovaly (Genosys, The Woodlands, TX). Původní primer byl identický s nukleotidy 50,913 až 50,932 HVS genomu (5'-GGGCGAGTTGGCATTGGATC-3'), McGeoch a kol., J.Gen.Virol. 69:1531-1574 (1988)). Reverzní primer byl komplementární k sekvencím 51, 195 aže 51, 175 HSV-1 genomu (5AGACCGAGGGCAGGTAGTT-3). Virus se extrahoval fenohchloroformem a virová DNA se srážela ethanolem. PCR se vynesl pomocí GeneAmp PCR soupravy ·· ·· » · · 4 > · · 4 (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT). Produkty reakce se analyzovaly na 5% polyakrylamidových gelech.

Peptidické protilátky se imunizovaly v králících proti oblastem odpovídajícím aminokyselinám 414 až 428. Peptid HSVAs-414 (C-PAAGDPGVRGSGKR) byl syntetizován v Chiron Minotopes Pty. Ltd. (Raleigh, NC) a čistil se na čistotu větší než 95 %. HSVAs-414 se mapoval na centrální oblast komplexního kapsidu genů UL26 a UL26.5. Peptid měl na C-konci volnou kyselinu a byl konjugován k toxoidu diťtérie na N-konci. Králíci se očkovali s 0,100 ml z 0,001 mg/ml proteinu smíchaného se stejným objemem Freudova úplného adjuvantu, přičemž ve čtyř týdenních intervalech počínaje 2. týdnem se přidával stejný materiál ve Freudově neúplném adjuvantu a krev se brala 10. a 17. den po přidávání.

Buňky se nasadily do jamek misek s šesti jamkami při 5x10^ buněk na jamku. Příští den se buňky infikovaly s mnohonásobnou infekcí (MOI) při 5 pfu/jamku na 60 minut při 37°C za současného jemného kolébání. Inokulum se odsálo a přidalo se růstové médium. Při 18. hodině po infekci se media odsály a přidalo se 0,400 ml IX ústoje rozbíjejícího proteiny (Novex, San Diego, CA) obsahujícího 10% βmerkaptoethanol. Proteiny se rozdělily na 14% Tris-glycin SDS-polyakrylamidových gelech (Novex) 1,5 hodiny při 125 voltech. Gely se inkubovaly 10 minut v IX přenosovém ústoji (Novex) a nanesly se na Immobilon-P membrány (Novex) na 1-2 hodiny při 30 voltech. Membrány se inkubovaly v solance pufrované IX Tris, obsahující Tween 80 (TTBS) obohacené 5% práškového mléka alespoň jednu hodinu (obyčejně přes noc). Blot se propláchl dvakrát 15 minut s TTBS a inkubovala se s primární protilátkou jednu hodinu při zředění 1/1000. Blot se propláchl dvakrát 15 minut s TTBS před inkubací se sekundární protilátkou (kozí protilátka proti králíkům konjugovaná s alkalickou fosfatázou, Promega, Madison, WI) jednu hodinu při zředění 1/4000. Alkalická fosfatáza se zviditelnila inkubací skvrny v nitro modři Tetrazolium (NBT)/ 5-brom-4-chlor-3-indolyl fosfát (Promega) po 5 až 15 minut a reakce se zastavila hojným promytím vodou.

Replikace viru se zjišťovala mnohastupňovou růstovou analýzou pomocné linie BHK/UL26 a BHK buněk, které neobsahovaly pomocnou funkci, ale byly resistentní proti G-418 (BHK/C2). Buňky (1 x 10^) se nasadily do jamek misek s 24 jamkami a infikovaly se s MOI 0,1 jednotek tvořících plak (pfu) na jamku. V různých časech po • · ··· ·

4··· 44 4 4 · 4 4

9 494 9 9 4 4 · 944 444 • 4 44444 4 4 infekci se infikované buňky podrobily třem kolům zmrazení-tání (Tengelsen aj. J. Virol. 67:3470-3480 (1993)) a lyzáty se titrovaly na pomocnou linii BHK/UL26.

Aby se vytvořily buněčné linie schopné podporovat replikaci rekombinantních virů s delecí a insercí uvnitř otevřeného čtecího rámce UL26, buňky BHK se kotranfektovaly s pMONl 5 831 a, který mé 3,4 kb Kpnl fragment HSV-1 (KOS) 5' k SV40 polyadenylačnímu signálu (obr. 1) a SV2neo. Buňky resistentm proti G-418 se isolovaly a zviditelnilo se Souther blot analýzou, zda obsahují Kpnl fragment HSV-1. Aby se určilo, která buněčná linie by exprimovala produkty genu UL26, buněčné linie se infikovaly s HSV-2 (MS), čímž se stimuloval UL26 promotor v buňce. HSV-1specifická anti-peptidová antiséra, vyvolaná očkováním králíků peptidem HSVAs-414 konjugované k toxinu diftérie, se použila k identifikaci exprese produktů genu UL26 (údaje nejsou ukázány). Tato buněčná linie, označená BHK/UL26/8 se použila pro generaci rekombinantních virů. Buňky resistentní proti G-418, které se kotranfektovaly s pMON3327 a SV2neo, slouží jako kontrola a je označena BHK/C2. Další pomocná buněčná linie (BHK/UL26/pomocná) se isolovala po zjištění, že se generovala významná množství zachráněných virů v důsledku rekombinace s Kpnl fragmentem přítomným v BHK/UL26/8. Tato druhá linie se transfektovala s plasmidem pMON15840, který má UL26 ORF za ICP6 promotorem a chybí mu velké množství HSV DNA 5' k UL26 ORF obsažené v pMONl 5831a. Přeložení z tohoto integrovaného plasmidu začalo při methioninu u přirozené amino kyseliny 10. Kandidátní buněčné linie se testovaly na jejich schopnost podporovat růst fenotypu rekombinantního viru s modrým plakem (viz níže). Buněčné linie isolovaná z tohoto testování, která podporuje růst UL26 mutantního viru, se označila BHK/UL26 pomocná buněčná linie.

Buněčná linie BHK/UL26/8 se transfektovala s genomickou DNA HSV-1 (kmen 17) a plasmidem pMON15835, který obsahuje Notl fragment HSV-1 (kmen 17) s delecí domény proteázy UL26 ORF a insercí genu bakteriální β-glukuronidázy pod kontrolou HSV-1 (kmen 17) ICP6 promotoru (obr. 1). Po lyži buněk se supernatant sériově zředila BHK/UL26/8 a modré plaky se identifikovaly po 4 a 5 dnech po infekci. Modré plaky se vybraly a čistily se třikrát. Rekombinantní vir se označil BHK/UL26/p-gluc. Čistění plaků ukázalo špatné rozdělení mezi modrým fenotypem rekombinantního viru a fenotypem rekombinantního viru s čirým plakem, což se zdálo mít růstovou výhodu i u pomocné buněčné linie.

• · ©· • · · © · © · · · · • · · · · © · • · © · ·· ·· • · · · • · · · ·· · ···

Aby se určil genotyp a zdroj viru s čirým plakem, provedla se amplifikace DNA na virové DNA bez buněk ze smíšené kultury virů s fenotypem s modrým a čirým plakem. Amplifikace 283 bp fragmentu naznačila přítomnost divokého typu viru v zásobě. PCR produkt se strávil s Bsgl, který řeže fragment divokého typu (kmen 17) DNA, ale neřeže fragment divokého typu (kmen KOS) DNA, který je zdrojem DNA v pomocné buňce (údaje nejsou ukázány). Chybějící digesce PCR produktu s Bsgl ukázala, že divoký typ viru byl ve skutečnosti revertant vzniklý rekombinaci mezi virem s fenotypem modrého plaku a UL26 sekvencí v pomocné buněčné linii. Zachráněný virus se označil BHK/UL26/res.

Aby se připravila čistší zásoba BHK/UL26/p-gluc, isolovala se nová pomocná buněčná linie (BHK/UL26/pomocná), ve které se vymazalo množství HSV DNA sekvence 5' k UL26 ORF a nahradilo se ICP6 promotorovou oblastí fragmentu (pMON15840, obrázek 1). Propagace BHK/UL26/p-gluc do této buňky vedla jen k fenotypu s modrým plakem.

Virová DNA z divokého typu (kmen 17), BHK/UL26/p-gluc a zachráněný virus se strávily s Notl nebo KpnI. Strávená DNA analyzovala Southemovou skvrnovou analýzou po testování s restrikčním fragmentem obsahujícím celou délku UL26 otevřeného čtecího rámce a 5' bočné sekvence. Výsledek ukázal očekávaný vzor digesce (Obrázek 2). Divoký typ a zachráněný virus ukázaly stejný vzor, jak se očekávalo jak s digescí s Notl (6,3 kb) tak KpnI (3,4) (pásy 1 a 3). Vymazání malé oblasti UL26 ORF a vložení genu β-glukorinidázy vedlo k přidání nového Notl místa (vedoucího k předpověděným 4,8 a 4,4 kb fragmentům a nového KpnI místa vedoucího k předpověděným 4,0 a 2,1 kb fragmentům (pás 2) v BHK/UL26/p-gluc.

Růstové křivky se pro viry určily na jiné buněčné linii. V různých časech po infekci se buňky sklidily a třikrát se zmrazily- nechaly roztát před nanesením na BHK/UL26 pomocné buňky. Výsledky ukázaly, že BHK/UL26/p-gluc se nereplikovala v BHK/C2 buňkách, ale rostla s kinetikou divokého typu na BHK/UL26 pomocné buněčné linii. Divoký typ (kmen 17) a zachráněný virus se replikovaly stejnou rychlostí na stejné titry a stejné rychlosti na obou BHK/C2 a BHK/UL26 pomocných buněčných liniích (obr. 3).

Protože se pokusy s přechodnou transfekcí v savčích, bakteriálních a tsl201 buňkách ukázalo, že jisté mutace v 5' oblasti UL26 nejsou schopné štěpit kapsidový ·· ·· · 4 4

4 4 4

4 4 4 4 • · 4 4 4·

4 4 4 • 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

44 444 444

4 4 4 4 komplexní protein (shrnuto v Gao aj. J. Virol. 68:3702-3712 (1994)), HSV/UL26/pgluc se použil k infikování BHK/C2, BHK a BHK/UL26 pomocných buněk na MOI

5. 18 hodin po infekci se buňky lyžovaly v SDS-PAGE vzorkovém ústoji a proteiny se dělily na 14% SDS-PAGE gelu. Po nanesení na Immobilon-P membrány se bio ty inkubovaly v antiséru proti kapsidovému komplexnímu proteinu. Výsledky ukazuje obr. 4. Infekce BHK/C2 buněk BHK/UL26/fl-gluc vedla k neschopnosti zpracovat kapsidový komplexní protein na formu s nižší molekulovou hmotností. Infekce BHK/UL26 pomocných buněk pomocí BHK/UL26/p-gluc ukázala, že kapsidový komplexní protein byl správně zpracován. Zachráněný rekombinantní virus (HK/UL26/res) zpracoval kapsidový komplexní protein obou buněčných liniích jako divoký typ (pásy 2 a 4). Kapsidový komplexní protein se během infekce vytvářel na normálních hladinách jak v pomocných, tak v nepomocných buňkách, ale neštěpil se v nepomocných buňkách. BHK/UL26/p-gluc rekombinant není schopný zpracovat kapsidový komplexní protein a má omezený růst.

Samičí myši Swiss-Webster (12-14 g, Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) se očkovaly virem intráperitoneálně (i.p.) nebo podkožně 0,100 ml objemy. Podkožní očkování se dávalo na hřbetní straně blízko základny ocasu po krátkém ošetření myši CO2/O2. Virus se resuspendoval v DMEM obsahujícím 5%

FBS, pokud není poznamenáno jinak. Potrava a voda se podávaly ad libitum. Myši se euthanisovaly, pokud začaly umírat na paralýzu.

Myši se očkovaly i.p. s 6 x 10^ pfu (stanoveno na pomocné buněčné linii) buď divokým typem HSV (kmen 17), BHK/UL26/ft-gluc, nebo zachráněným virem obr. 5, myši infikované divokým typem HSV (kmen 17) nebo zachráněným virem uhynuly 7. den po infekci. Všechny myši infikované BHK/UL26/ft-gluc přežily. U zvířat, která původně dostala BHK/UL26/fl-gluc se podnítila reakce divokým typem HSV-1 (kmen 17) i. p. stejnou dávkou danou původně. Nové myši se souhlasným věkem a pohlavím se také očkovaly. Jedna z myší očkovaných BHK/UL26/ft-gluc byla nalezena mrtvá asi 16 hodin po infekci divokým typem viru. Smrt nebyla pravděpodobně ve vztahu s virem, protože k ní došlo tak rychle po infekci. Dalších 9 myší přežilo vyvolání reakce divokým typem viru. Nové myši byly citlivé k infekci divokým typem viru, ačkoliv vyvolání chorobnosti a úhynu trvalo déle (obr. 5).

4 44

4 4 4

4 4 4 4

4 4

4 4 4

444 444

V druhém pokusu se myši očkovaly i.p. s desetinásobnými sériovými ředěními BHK/UL26/fl-gluc, přičenž se vycházelo ze stejného inokula použitého v počátečním pokusu. 39. den se u myší vyvolala reakce i.p. 6 x ÍCÚ pfu HSV-1 (kmen 17). Tato dávka divokého typu viru byla desetkrát vyšší než v počátečním pokusu a vedla k 90% uhynutí myší, které byly původně očkovány DMEM/5% FBS (tabulka 1, falešně infikovaná množina). Opět se během 16 hodin našlo 6 mrtvých myší. Dvě z nich byly z množiny dříve očkované 10 pfu HSV/UL26/fl-gluc a 4 byly z množiny, která dříve dostala 1x10^ pfu HSV/UL26/p-gluc. Existoval významný rozdíl mezi šesti křivkami přežívání (p < 0,02, test log ranku). Údaje naznačují, že myši, které byly očkované HSV/UL26/fl-gluc přežívaly způsobem závislým na dávce (Tabulka 1). Křivky přežívání myší, které dostaly nejvyšší dávku HSB/UL26/fl-gluc byly statisticky odlišné od falešné skupiny (p < 0,023, test log řady).

Tabulka 1

HSV/UL26/p-gluc	% Přežití*
Kontrola	10
6 x 10^ pfu	12,5
6 x 10^ pfu	30
6 x 10^ pfu	60
6 x 10^ pfu	50
6 x 10$ pfu	83,3

* Přežití se určilo 20. den po i. p. vyvolání reakce 6 x 10^ pfu divokého HSV (kmen 17). N = 10 pro všechny skupiny, mimo 6 x 10^ pfu (N = 8) a 6 x 10$ pfu (N = 6) v důsledku předčasných smrtí.

V třetím pokusu se zásoby viru připravily jako dříve, avšak se znovu suspendovaly v DMEM bez FBS. Množiny 10 myší se očkovaly buď samotným DMEM, nebo rostoucími dávkami BHK/UL26/fl-gluc cestami buď i. p., nebo s. q.. Po jednom měsíci se u všech myší vyvolala reakce pomocí 6x10^ pfu divokého typu

9*

4 4 9 9

9 9 9 9

9 494 9 9

9 9 9 <9 * ♦ · 4 « 9 9 9

49 99 9

4 viru i. p. očkování. Některé kontroly pro rychlou smrt zahrnovaly zvířata, která dostala i. p. medium, a pak byla vyvolána reakce i. p. mediem, HSV/UL26/p-gluc a pak medium, HSV/UL26/p-gluc a pak byla vyvolána reakce HSV/UL26/p-gluc. Žádné z těchto zvířat neuhynulo během pokusu. Žádné z pokusných zvířat neuhynulo během 24 hodin od vyvolám reakce. Z nich 90 zvířat dostalo dvě očkování viru a očekávalo by se, že asi 10-12 % by mělo rychle uhynout. Výsledky této experimentální skupiny se ukazují na obrázcích 6A a 6B. Je významný rozdíl mezi křivkami přežívání jak pro i. p. (p < 0,01), tak pro s. q. (p < 0,01) očkování (test log řady). Regresní analýza ukazuje, že existuje účinek BHK/UL26/p-gluc závislý na dávce (p < 0,05, test Cochran-Armitage) pro obě skupiny.

Očekává se, že tento virus by měl sníženou účinnost a špatně by reaktivoval, jestli vůbec. Fakt, že mutace ovlivňuje pozdní funkce genu naznačuje, že rekombinantní virus může být účinnější při indukování imunity, než viry, které mají delece v bezprostředních časných nebo časných genech. Komplexně neúplný virus HSV/UL26/p-gluc je členem nové třídy kandidátních vakcín s defektem v pozdní aktivitě genu.

Očekává se, že defekt v nezbytném genu popsaný v komplexně neúplném viru lze vložit do jiných mutací podstatných i nepodstatných genů. Takové geny, jako ICP47 z HSV-1 mohou modulovat hostitelovu schopnost zdolat imunní reakci viru (Hill aj., Nátuře 375:411-415 (1995), Frueh aj., Nátuře 375:415-417 (1995)).

Vakciny podle vynálezu mohou mít lyofílizovanou formu nebo mohou být suspendovány ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Vhodné suspenze mohou obsahovat fosfátový ústoj, solanku, glukózu, inaktivované sérum, excipienty a adjuvans. Vakcínu lze připravit a použít podle standardních technik dobře v oboru známých (přehled R. L. Burke, Seminars in Virology, 4, 187-197, (1993)). Účinnou dávku lze také stanovit standardními technikami dobře v oboru známými. Obecně se vakciny formulují ve vhodném sterilovaném ústoji a podávají se intradermálmmi, vnitrosvalovými nebo podkožními injekcemi v dávkách mezi 1(Ú a ÍCÚ píu/kg. Vakcínu lze také formulovat pro orální nebo okulární podávání ve vehiklech v oboru známých.

• · (»··· 4 4 · · · · · • · · 4 4 4 * 4 4 4 · « · ··· * · 4 4 4 ··· ··· • · ····· < · • 4 · · «4 44 44 44

Předcházející podrobný popis je dán jen, aby usnadnil ujasnění a pochopení, a nemají se z něj chápat žádná zbytečná omezení rozsahu, protože modifikace tohoto vynálezu budou odborníkovi zřejmé.

Claims

1. Vakcína obsahující nekomplexní herpesvirus.

2. Vakcína podle nároku 1, kde tento herpesvirus obsahuje inaktivovanou formu nezbytného genu proteázy.

3. Vakcína podle nároku 2, kde nezbytný gen proteázy je potřebný pro zpracování a komplexaci nezralých neinfekčních kapsidových částic do zralých, infekčních kapsidových částic.

4. Vakcína podle nároku 1, kde tento herpesvirus je vybraný z HSV-1, HSV-2, HCMV, SCMV, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8, PRV, BHV a EHV.

5. Vakcína podle nároku 4, kde uvedený herpesvirus je HSV-1 nebo HSV-2.

6. Vakcína podle nároku 4, kde uvedený herpesvirus je HSV-1.

7. Vakcína podle nároku 3, kde uvedený nezbytný gen proteázy je vybraný z HSV-1 UL26, HSV-2 UL26 a HCMV UL80.

8. Vakcína podle nároku 7, kde uvedený nezbytný gen proteázy je HSV-1

UL26.

9. Vakcína podle nároku 2, kde uvedený nezbytný gen proteázy se inaktivuje způsobem vybraným z delece, inserce, substituce a jakékoliv kombinace delece, inserce nebo substituce DNA.

10. Vakcina podle nároku 9, kde uvedený nezbytný gen proteázy se inaktivuje deleci virové DNA a insercí nevirové (heterologní) DNA.

11. Vakcina podle nároku 1 obsahující asi mezi 10 a 10^ jednotek tvořících plak uvedeného nekomplexního herpesviru.

12. Vakcina podle nároku 1, kde uvedený nekomplexní herpesvirus obsahuje kmen označený HSV/UL26/p-gluc.

13. Způsob výroby vakciny podle nároku 1 obsahující nekomplexní herpesvirus přípravou zásob uvedeného viru v rekombinantní buněčné linii schopné tvořit správně sestavený virus a suspendováním uvedeného viru ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

14. Způsob výroby vakciny podle nároku 13, kde uvedený hlavní gen proteázy je gen HSV-1 UL26.

15. Způsob podle nároku 13, kde uvedená vakcina obsahuje kmen HSV/UL26/p-gluc.

16. Způsob podle nároku 13, kde uvedená buněčná linie je savčí.

17. Způsob podle nároku 16, kde uvedená buněčná linie podporuje replikaci uvedeného herpesviru.

18. Způsob podle nároku 17, kde uvedená buněčná linie je označená

BHK/UL26/8.

• 4 • ·

4 4 4 · 4 4 ·

4 4 · 4 4 4 4

4 · 44 444444

4 4 4 4 4 4

44 44 44 44

19. Způsob podle nároku 17, kde tato buněčná linie je označená BHK/UL26/po mocná.

20. Použití nekomplexního herpesviru pro výrobu vakciny.

21. Způsob imunizace savce proti herpesviru podáváním vakciny podle nároku 1 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

22. Způsob podle nároku 21, kde savec se vybere z člověka, opice, krávy, koně, ovce a prasete.

23. Způsob podle nároku 22, kde savcem je člověk.

24. Mutantní herpesvirus obsahující inaktivovanou formu nezbytného genu proteázy potřebnou pro zpracování a komplexaci nezralých neinfekčních kapsidových částic na zralé infekční kapsidové částice s uvedeným nezbytným genem proteázy inaktivovaným delecí virové DNA a insercí nevirové (heterologní) DNA.

25. Mutantní virus podle nároku 24, kde uvedený virus je vybraný z HSV-1, HSV-2, HCMV, SCMV, VZV, EBV, HHV-6, HHV-7, HHV-8, PRV, BHV a EHV.

26. Mutantní virus podle nároku 25, kde uvedený nezbytný gen proteázy je gen HSV-1 UL26.

27. Mutantní virus podle nároku 24, kde část uvedeného nezbytného genu proteázy je odstraněna a nahrazena nevirovým (heterologním) segmentem DNA obsahujícím reportér gen pod kontrolou indukovatelného promotoru herpesviru HSV1.

4 4 4

28. Mutantní virus podle nároku 27, kde uvedený reportér gen je vybraný z gusA kódující beta-glukuronidázu, lacZ kódující beta-galaktosidázu, phoA kódující alkalickou fosfatázu, gfp kódující zelený fluorescentní protein a aegZ kódující aequorin.

29. Mutantní virus podle nároku 28, kde uvedený reportér gen je gusA kódující beta-glukuronidázu E.coli.

30. Mutantní virus podle nároku 27, kde uvedený indukovatelný promotor herpesviru je HSV-1 ICP6 (UL39) promotor.

31. Rekombinantní hostitelská buněčná linie exprimující nezbytný gen proteázy pod kontrolou indukovatelného neproteázového promotoru.

32. Rekombinantní hostitelská buněčná linie podle nároku 31, kde uvedená hostitelská buněčná linie je ze zdroje hlodavců.

33. Rekombinantní hostitelská buněčná linie podle nároku 32, kde uvedená hostitelská buněčná linie je BHK-21.

34. Rekombinantní hostitelská buněčná linie podle nároku 32, kde uvedený indukovatelný neproteázový promotor je HSV-1 ICP6 (UL39) promotor.

35. Způsob přípravy mutantního herpesviru podle nároku 24, zavedením uvedeného viru do rekombinantní hostitelské buněčné linie a sklizní zralých virových částic obsahujících mutantní virový genom.