CN103952379A - 重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组猪伪狂犬病毒毒株，重组猪伪狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCCNO：V201345。本发明是在伪狂犬病毒载体的基础上加入了绿色荧光蛋白标签，构建了表达绿色荧光蛋白gG缺失的通用转移载体PG，含有伪狂犬病病毒自身晚期基因gG启动子、CMV启动子、SV40Poly(A)且上下游侧翼分别为0.8kb和l.7kb，完全可以满足同源重组的需要。EGFP不仅可以作为基因表达的指示剂，而且在其上所带有的多克隆位点内插入了猪IL-18基因，实现了将不同表达框通过一个共同的载体相连而构建，是作为两个表达框单独表达的，其外源基因的表达量与两个表达框连接的方向关系密切。

Description

重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法

技术领域

本发明涉及病毒学技术领域，具体涉及一株表达猪圆环病毒2型ORF2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒及其制备方法。 

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今为止发现的最小动物病毒之一。可根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列将PCV分为PCV1和PCV2两个基因型。PCV1广泛存在于猪体内及猪源细胞系中，无致病性，不能引起细胞病变；PCV2具有致病性，主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)。猪由PCV2感染而引起的各种疾病已遍布世界各地，给世界养猪业带来巨大损失。猪圆环病毒2型有两个主要的开放阅读框ORF1和ORF2，其中ORF2基因是PCV2的主要结构蛋白基因，编码病毒的衣壳蛋白，可自我装配成病毒样粒子，并且ORF2蛋白中含有可中和病毒的中和抗原表位，已成为目前PCV2疫苗研究的主要候选基因。PCV2疫苗的研究，目前已有PCV2灭活疫苗、PCV2DNA疫苗、亚单位疫苗和嵌合病毒疫苗，但有关病毒活载体疫苗的报道相对较少。 

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。其危害主要表现为母猪流产，产死胎、木乃伊胎及新生仔猪死亡等综合征，临床以产死胎为主。该病毒基因组庞大，其容量可高达40kb，具有足够的空间允许外源基因的稳定插入，并且重组病毒在增殖的同时可稳定表达外源基因，从而提供对伪狂犬病毒和其它相应传染病的抵抗力，具有一个优良活病毒载体的基本特征。其中最引人注目的是表达猪瘟病毒主要保护性抗原E2基因的重组伪狂犬病毒，目前此疫苗株的遗传稳定性，外源基因对病毒增殖的影响以及生物安全性均已得到论证，有望投入生产使用。 

白细胞介素18(Interleukin-18，IL-18)是从被热灭活痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)感染和脂多糖(LPS)诱发的中毒性休克小鼠肝脏提取液中获得的一种由应激诱生的蛋白，其诱生IFN-γ的能力很强，因而最初被称为IFN-γ诱生因子(Interferon gamma inducing factor，IGIF)。1996年成功从鼠cDNA库中筛选到人的IGIF基因，并在大肠杆菌中表达，因其序列与所有已知的细胞因子不同，且生物活性多样，故将其正式命名为白细胞介素18。IL-18能诱导IFN-γ大量分泌表达，促进T细胞增殖及Th1细胞的免疫应答，增强NK细胞的杀伤活性，抑制Th2类细胞因子的生成，具有广泛的生物学效应，在免疫调节、 抗肿瘤、抗病原微生物感染中具有十分重要的作用。 

绿色荧光蛋白(GFP)存在于发光水母体内，是一种吸收蓝光或紫外光后发出绿色荧光的天然蛋白质。同以往常用的报告基因LacZ、CAT、荧光素酶基因以及其它抗生素基因相比，GFP不需要任何外源性底物和辅助因子，无毒、无污染、稳定，当受到紫外光或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。因此其被广泛应用于分子生物学研究。 

发明内容

本发明的目的是提供一种重组猪伪狂犬病毒毒株，分类命名：表达PCV2 ORF2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒PRV-PCV2-IL18 PGO18 

，拉丁文学名：Herpesviridae。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期：2013年11月18日，保藏编号CCTCC NO：V201345。

本发明的技术方案是：一种重组猪伪狂犬病毒毒株，重组猪伪狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCC NO：V201345。 

所示的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，以pGEMT-IL-18为模板，扩增猪IL-18基因，利用重组技术插入到含有PCV2ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒转移质粒PGO中，构建载体PGO18，将猪伪狂犬病毒弱毒株感染ST细胞后，再转染重组质粒PGO18，经蚀斑纯化得到重组猪伪狂犬病毒。 

所述构建载体PGO18的步骤如下： 

①根据重组质粒pGEMT-IL-18中猪IL-18基因片段设计1对引物，所述引物序列为： 

上游引物序列：5’-TAAGATCTATGGCTGCTGAACCGGA-3’， 

下游引物序列：5’-CGCCAGATCTCTAGTTCTTGTTTTG-3’； 

②猪IL-18的PCR扩增 

以pGEMT-IL-18为模板进行PCR扩增，体系如下： 

反应条件：94℃5min；95℃1min；55℃1min；72℃1min共进行30个循环，72℃延伸10min，扩增产物用0.8％琼脂糖进行电泳检测； 

③将回收纯化的猪IL-18产物用BglII酶切，体系如下： 

混合物瞬时离心后置37℃水浴酶切8h，产物用0.8％琼脂糖电泳后，用凝胶回收试剂盒对产物进行回收； 

④PGO质粒用BglII进行酶切并用碱性磷酸酶(CIAP)对酶切产物进行去磷酸化处理，体系如下： 

上述混合物振荡均匀，37℃水浴中作用30min后置4℃冰箱过夜，之后用凝胶回收试剂盒对产物进行回收； 

⑤载体PGO与外源片段猪IL-18的连接 

将步骤④得到的回收产物与经过BglII酶切处理的猪IL-18进行连接，在16℃连接槽中连接12～16h，得到的连接产物转化入DH5α感受态细胞，转化后提取重组质粒，得到阳性质粒为PGO18。 

所述转染重组质粒PGO18的步骤如下：用BIOMIGA无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒PGO18至1μg/μL备用，复苏细胞，转染前24h将ST细胞传至第3代，将细胞悬液加到6孔板中，先用PRV疫苗株接种至90％的ST细胞，吸附1.5h后，将质粒PGO18进行转染，置37℃、5％CO₂下培养5h后，吸弃孔内培养液，每孔加入1.5mL细胞维持液，于37℃、5％CO₂下继续培养36h，收获病变细胞，反复冻融3次用于重组病毒的筛选。 

所述蚀斑纯化的步骤如下：将转染获得的病毒液按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6进行稀释，各取400μL接种到ST细胞长至单层的6孔板中，置于37℃细胞培养箱内吸附1.5h后，每孔加入2mL低熔点营养琼脂糖，培养48h，此时在荧光显微镜的蓝光(波长420～490nm)下能观察到绿色和无特殊荧光颜色的两种病毒蚀斑，在荧光显微镜下用巴氏吸管 吸取绿色蚀斑，加入DMEM维持液于-20℃反复冻融3次，然后将收获的病毒液接种到含单层ST细胞的24孔细胞培养板内至90％以上的细胞发生病变时收毒，将每孔收集的病毒提取DNA并进行PCR扩增，选择PCR阳性的病毒进行下一轮的蚀斑纯化，直至获得纯净的重组病毒PGO18。 

附图说明

图1为PGO18重组质粒构建策略图； 

图2为猪IL-18基因的PCR与酶切鉴定，M.DNAMarker DL2000；1.PCR产物；2.阴性对照图3为重组质粒PGO18中IL-18基因的PCR与酶切鉴定，M.DNA Marker Tans15K；1.Digestion by Bgl II；2.PCR product；m.DNA Marker DL2000； 

图4为重组质粒PGO18与PRV疫苗株共转染细胞图片，A.PGO18与PRV疫苗株共转染后12h观察到的荧光；B.A图片对应的细胞形态图；C.PGO18与PRV疫苗株共转染后24h观察到的荧光；D.C图片对应的细胞形态图； 

图5为重组病毒PGO18的纯化荧光图片； 

图6为重组病毒PGO18中ORF2基因的PCR鉴定，M.DNAMarker DL2000；1-10.PCR产物；C.阴性对照； 

图7为重组病毒PGO18中猪IL-18基因的PCR鉴定；M.DNA Marker DL2000；1-11.PCR产物；12.阴性对照； 

图8为重组病毒PGO18的Western blot鉴定，M.Protein Marker；1.PG载体；2.PGO18重组病毒； 

图9为重组病毒PGO18中ORF2与IL-18基因的PCR鉴定，M.DNA Marker DL2000；1.ORF2PCR产物；2.IL-18PCR产物；3.阴性对照； 

图10为重组病毒PGO18的IPMA鉴定。 

具体实施方式

试验一表达猪圆环病毒II型ORF2基因和猪IL-18基因重组猪伪狂犬病病毒转移质粒的构建 

1材料与方法，1.1材料，1.11质粒、病毒、细胞与菌株 

含有PCV2ORF2基因的重组伪狂犬病毒转移质粒PGO、含有猪IL-18基因的重组质粒pGEMT-IL-18购自河南省动物性食品安全重点实验室。猪伪狂犬PRV TK^-/gG^-/gE^-疫苗株购自武汉科前生物制品公司。猪睾丸(ST)细胞购自中国兽药监察所(冻存)；大肠杆菌(E.coli)JM109购自GibcoBRL公司。 

1.1.3主要试剂DNA Markerλ-EcoT14I、DNA Marker Tans15K、DNA Marker DL2000、Premix Ex Taq DNA聚合酶和限制性内切酶BglII、BamHI、HindIII等购自宝生物工程(大连)有限公司；碱性磷酸酶(CIAP)和T₄DNA连接酶购自Promega公司；DNA 凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司(V-gene)；质粒DNA小量制备试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。 

1.1.4主要仪器 

CO₂培养箱、PCR仪、紫外微量分光光度计，购自美国Thermo Forma公司；电泳仪购自北京市六一仪器厂；微量加样器购自Eppendorf公司；超净工作台购自苏净集团安泰公司；HH-2恒温水浴锅购自国华电器有限公司；小型台式离心机购自德国Sigma公司；SHA-C水浴恒温振荡器购自金坛市恒丰仪器厂；尼康TS100荧光倒置显微镜购自购自德国莱卡公司；数控低温连接槽购自宁波新芝科器研究所；紫外凝胶成像系统购自美国SIM公司。 

1.2方法1.2.1重组质粒PGO18的构建策略如图1所示。 

1.2.2引物设计与合成 

根据重组质粒pGEMT-IL-18中猪IL-18基因片段设计1对引物，上、下游引物的5’包含有BglII酶切位点(下划线部分)，扩增目的基因片段长度约0.6kb。引物由上海生物工程有限公司合成。 

上游引物序列：5’-TAAGATCTATGGCTGCTGAACCGGA-3’， 

下游引物序列：5’-CGCCAGATCTCTAGTTCTTGTTTTG-3’。 

1.2.3猪IL-18的PCR扩增 

以pGEMT-IL-18为模板进行PCR扩增，体系如下： 

反应条件：94℃5min；95℃1min；55℃1min；72℃1min共进行30个循环，72℃延伸10min，扩增产物用0.8％琼脂糖进行电泳检测； 

将回收纯化的猪IL-18产物用BglII酶切，体系如下： 

混合物瞬时离心后置37℃水浴酶切8h，产物用0.8％琼脂糖电泳后，用凝胶回收试剂盒对产物进行回收。 

1.2.4PGO18转移质粒的构建 

1.2.4.1PGO质粒的酶切和去磷酸化 

PGO质粒用BglII进行酶切并用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理，体系如下： 

上述混合物振荡均匀，37℃水浴中作用30min后置4℃冰箱过夜，之后用凝胶回收试剂盒对产物进行回收。 

1.2.4.2载体PGO与外源片段猪IL-18的连接 

将1.2.4.1得到的回收产物与经过BglII酶切处理的猪IL-18进行连接，在16℃连接槽中过夜。得到的连接产物转化入DH5α感受态细胞，转化后提取重组质粒，经酶切与测序鉴定后，命名阳性质粒为PGO18。 

2结果与分析 

2.1猪IL-18的PCR及酶切结果鉴定 

用合成的引物对pGEMT-IL-18质粒进行PCR扩增，电泳结果表明扩增出了约579bp的条带，如图2所示，与预期结果相符。 

2.2重组质粒PGO18的PCR及酶切鉴定 

用合成的猪IL-18特异性引物对重组质粒PGO18进行PCR扩增，电泳检测结果显示在约0.6kb处有一清晰条带，与预期结果相符。重组质粒PGO18用BglII酶切后，出现了2条 带，其中1条为插入的目的条带，大小约为0.6kb，另1条为载体条带，位置约为7.8kb，与预期结果相符，如图3所示。 

2.3测序 

将重组质粒PGO18送上海生工进行测序鉴定，测序的IL-18序列如SEQ ID NO：1所示，与猪IL-18基因序列(序列号为：DQ499825)进行比对，完全相同。表明成功构建携带猪IL-18基因的重组质粒PGO18。 

3结论与讨论 

3.1伪狂犬病毒gG基因表达外源基因 

PRV作为基因工程载体具备很多的优势：(1)安全性好：PRV不感染人。现有的活疫苗株Bartha-K61已在世界上应用了几十年，一些国家通过该疫苗的使用消灭和根除了伪狂犬病。因此以PRV疫苗株为载体在其非必需基因上插入外源基因获得的重组病毒具有高度的安全性。(2)外源基因容量大：PRV基因组长达145Kb，其中大约有一半基因是非必需的，在多个非生长必需区内插入、表达一种或数种外源基因不会影响其生长繁殖，能够重组出具有各种应用潜能的多价基因工程疫苗。(3)生产工艺简单：PRV疫苗以接种SPF鸡胚成纤维细胞生产，利用PRV为载体表达其它外源基因生产重组疫苗克服了许多病原的生产工艺和原材料难关，避免了使用传代细胞系或原代细胞来培养。(4)免疫期长：PRV以细胞免疫为主，病毒可以潜伏感染，外源基因可以在体内持续表达。(5)生产成本低：由于PRV免疫原性好，5000TCID₅₀的毒量就足以抵抗PRV强毒的攻击，而其病毒滴度往往高于10^5.5TCID₅₀，大大降低了生产成本，也减少了外源物质对机体的刺激。(6)宿主范围广：牛、山羊、绵羊、猪、猫、狗等家畜和经济动物(如狐和貂)以及鹿等多种野生动物都可感染PRV，可以研制针对不同动物的活载体疫苗。 

伪狂犬病病毒表达外源基因必须具备两个条件：非必需基因的克隆和功能强大的启动子。PRV gG基因是PRV的非必需基因，启动子强大，属于β级启动子，可用于外源基因的表达。已被武汉大学丁建华、华中农大周复春、方六荣等试验证明。在试验一中成功构建的PG重组质粒序列已被测定，酶切位点已经十分清楚，非常容易在多克隆位点内进行外源基因的插入与表达鉴定。 

3.2猪圆环病毒II型ORF2基因重组猪伪狂犬活载体病毒 

猪圆环病毒可引起猪呼吸道综合征、仔猪断奶后多系统衰竭综合征、猪增生和坏死性肺炎、猪皮炎与肾病综合征、先天性震颤、繁殖障碍等多种疾病，现阶段我国大多数地区的各类猪群中也普遍存在PCV2感染。PCV2有2个主要的阅读框：ORF1和ORF2。其中ORF1开放 阅读框架位于正链(病毒基因组链)上并以顺时针方向排列，该阅读框编码与病毒复制相关的Rep蛋白；ORF2开放阅读框架位于负链(病毒基因组互补链)上以逆时针方向排列，该阅读框编码病毒的结构蛋白(Cap蛋白)，该蛋白为PCV2囊膜的主要成分，目前对ORF2的研究已成为PCV2研究的热点。McNeilly等^[163]研究结果表明ORF2表达的蛋白中含有PCV2病毒的中和抗原表位。Nawagitgul等^[164]将PCV2的ORF2基因进行克隆并使其在昆虫细胞中表达，电镜观察结果表明其表达产物能够自动组装为病毒核衣壳样粒子，此研究进一步证实了ORF2基因能够编码病毒核衣壳蛋白。PCV2全病毒能够在PK-15细胞上进行增殖，但增殖滴度较低，毒价测定须借助间接免疫荧光试验(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)进行，因此使用全病毒来制备灭活疫苗，技术难度大、操作繁琐、成本较高。基于此，利用基因工程方法获得的疫苗(DNA疫苗、亚单位疫苗及病毒活载体疫苗)将成为防控该病的重要方向。目前已有PCV2DNA疫苗、亚单位疫苗和嵌合病毒疫苗的研究报道，这些疫苗虽对PCV2有较好的免疫效果，但由于DNA疫苗的安全隐患、亚单位疫苗的高成本以及嵌合病毒疫苗的低增殖滴度限制了这些疫苗的广泛应用，因此病毒活载体疫苗研究具有重要的现实意义。 

3.3猪IL-18基因重组猪伪狂犬活载体病毒 

猪IL-18是一种细胞因子，在多种器官、组织和细胞中都可检测到IL-18的mRNA。IL-18能够参与启动细胞免疫反应，可以大量诱导INF-γ的分泌，促进T和B淋巴细胞的分化，增强NK细胞的活性等。IL-18在抗微生物感染和肿瘤免疫治疗等方面具有广阔的应用前景。目前，国内外用伪狂犬病毒为载体表达单个外源基因的报道已经很多，且有一部分已经开发为二联基因工程重组疫苗并进入临床试验阶段。田志军等用PRV为载体表达PRRSV GP5基因构建PRV-PRRSV二联基因工程疫苗和金梅林等用PRV为载体表达FMDV VP1基因构建的PRV-FMDV二联基因工程疫苗已进入临床试验阶段。但用PRV为载体共表达两个基因或以上的报道较少，洪琦等以PRV为载体共表达了PPV VP2基因和FMDV VP1基因，构建TPPV-PRV-FMDV三联基因工程疫苗。 

本研究是在伪狂犬病毒载体的基础上加入了绿色荧光蛋白标签，构建了表达绿色荧光蛋白gG缺失的通用转移载体PG，含有伪狂犬病病毒自身晚期基因gG启动子、CMV启动子、SV40Poly(A)且上下游侧翼分别为0.8kb和1.7kb，完全可以满足同源重组的需要。EGFP不仅可以作为基因表达的指示剂，而且在其上所带有的多克隆位点内插入了猪IL-18基因，实现了将不同表达框通过一个共同的载体相连而构建，是作为两个表达框单独表达的，其外源基因的表达量与两个表达框连接的方向关系密切。本研究将猪IL-18基因插入到 PGO中，构建了PGO18重组质粒，为下一步研究猪IL-18对细胞、病毒等的生物学活性影响提供了基础。 

3.4重组DNA分子的构建策略 

DNA分子的重组构建是是分子克隆技术中的核心，我们获得了目的DNA基因片段，又选择了合适的载体，并以适当的限制性内切酶将载体分子切开，然后将两个不同来源的DNA分子连接起来构建成人工重组分子。在分子生物学研究中，DNA末端的连接是一项极为常用的基本操作，分为粘端连接和平端连接。从克隆策略来看，粘性末端的连接效率比平端的连接效率要高得多，不过采用粘性末端进行连接时，如果是用单酶切将载体分子切开，往往需要对线型的载体分子进行去磷酸化处理，以此来尽量避免其自身的环化或寡聚连接，进而提高重组子的数量。本研究采用了单酶切载体分子和粘端连接的方法，虽然加了一步去磷酸化的处理，但大大提高了连接效率。 

试验二表达猪圆环病毒2型ORF2基因与猪IL-18基因重组猪伪狂犬病病毒重组质粒PGO18在ST细胞上的转染与纯化 

1材料与方法，1.1材料，1.11病毒与细胞 

伪狂犬疫苗株PRV TK^-/gG-/gE^-购自武汉科前生物制品公司；E.coli JM109购自GibcoBRL公司；ST细胞、VERO细胞(非洲绿猴肾细胞系)、PK-15细胞(猪肾细胞系)、IBRS-2细胞(猪肾细胞系)购自河南省动物性食品安全重点实验室。 

1.1.2主要试剂 

DNA Markerλ-EcoT14I、DNA Marker Tans15K、DNA Marker DL2000和Premix Ex Taq DNA聚合酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒DNA小量制备试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；BIOMIGA无内毒素质粒提取试剂盒购自郑州赛斯生物科技有限公司；DMEM培养液、胎牛血清购自美国Hyclone公司；OPTI-MEM无血清培养液、Lipofectamine^TM2000Reagent购自Invitrogen公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG、羊抗鼠IgG均为SBA公司产品。 

1.1.3主要仪器 

CO₂培养箱、PCR仪、紫外微量分光光度计，购自美国Thermo Forma公司；电泳仪购自北京市六一仪器厂；微量加样器购自Eppendorf公司；超净工作台购自苏净集团安泰公司；HH-2恒温水浴锅购自国华电器有限公司；小型台式离心机购自德国Sigma公司；SHA-C水浴恒温振荡器购自金坛市恒丰仪器厂；尼康TS100荧光倒置显微镜购自购自德国莱卡公司；数控低温连接槽购自宁波新芝科器研究所；紫外凝胶成像系统购自美国SIM公司。 

1.2方法 

1.2.1PRV TK-/gG^-/gE^-疫苗株TCID₅₀的测定 

将PRV TK^-/gG^-/gE^-疫苗株病毒液接种到已长成单层的、生长良好的ST细胞的96孔板上。病毒液用无血清的DMEM进行10倍系列稀释，即向每支EP管中加入900μL无血清的DMEM，向1号管中加入100μL病毒液，振荡混匀，再从1号管中取100μL稀释液依次10倍系列稀释至10^-10。 

取细胞培养板，用加样器吸去96孔板中的培养液，再吸取无血清DMEM加在每孔中再轻轻吹打1次，然后吸出孵育液(此步目的是去除血清，因为血清会干扰病毒的吸附)。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μL，每个稀释度做8个重复(即1竖排)。同时设置正常的细胞对照16孔(即2竖排)。37℃CO₂培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液(从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔)，加入2％DMEM维持液200μL，继续在37℃CO2培养箱中培养72h后取出，比较对照观察不同稀释度的细胞病变(CPE)，有细胞病变的判定阳性，无细胞病变的判定阴性，记录不同稀释度阳性和阴性孔数，用Reed-Muench法计算TCID₅₀。 

1.2.2重组质粒PGO18无内毒素质粒的提取 

按照BIOMIGA无内毒素质粒提取试剂盒要求进行重组质粒的提取，步骤如下： 

(1)将重组质粒的菌液接种于5mL LB、Amp培养液中，37℃摇床培养12～16h；(2)取1.0～5.0mL的菌液，室温下10000×g离心1min收集菌液；(3)倒弃培养基。加入250μLSolution I/RNaseA混合液，漩涡振荡使细胞完全悬浮；(4)往重悬混合液中加入250μLSolution II，轻轻颠倒混匀4～6次。此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5min；(5)加入125μL冰浴的Buffer N3，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。室温下，大于或等于10000×g离心10min；(6)转移上清液至干净的收集管中，加入1/10体积的ETR Solution；(7)冰浴20～30min(8)42℃水浴5min，10000×g离心3min；(9)转移上清液至干净的收集管中，加入1/2体积的无水乙醇，温和颠倒数次；(10)将上述液体转移到套有2mL收集管的Hi Bind DNA结合柱中，室温下，10000×g离心1min，倒去收集管中的滤液；(11)把柱子重新装回收集管，加入500μL Buffer HB，室温下，10000×g离心1min，倒去收集管中的滤液(12)把柱子重新装回收集管，加入700μL DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液(13)弃去滤液，重复第12步骤一次；(14)加入30～50μL洗脱液，进行DNA的洗脱，并进行浓度测定。 

1.2.3转染细胞准备 

复苏ST细胞，按常规方法将ST细胞传至三代以后，转染前24h将细胞悬液加到6孔板中，转染前3h更换新鲜的生长培养基，待细胞长至90％左右时进行转染。 

1.2.4转染 

参照脂质体Lipofectamine^TM2000试剂盒转染说明书进行共转染，按以下步骤进行： 

(1)取PRV弱毒株病毒液100μL接种到6孔板中，置于37℃细胞培养箱内吸附1.5h，期间每隔半小时进行轻摇混匀，使病毒在细胞上能够均匀吸附；(2)取1支Eppendorf离心管，加入4μg PGO18质粒，并用OPTI-MEM无血清培养液补至250μL，轻轻混匀；(3)在管(2)中依次加入240μL OPTI-MEM无血清培养液和10μL脂质体并轻弹混匀(注意静置时间不宜超过5min)；(4)将(3)液体逐滴加入到(2)中，静置25min，中间轻弹以混合均匀；(5)弃去6孔板内培养液，用PBS重复洗涤3次，并加入2mL OPTI-MEM无血清培养液备用；(6)轻轻吹打(4)，以使管内的混合物沉淀重悬，将悬液逐滴接种到含有单层ST细胞的6孔板内，置37℃、5％CO₂培养箱内培养4～6h，之后吸弃孔内培养液，每孔加入1.5mL细胞维持液，放入37℃、5％CO₂培养箱内培养36h，在荧光显微镜下观察细胞病变与荧光情况；(7)将病变细胞反复冻融3次，收获重组病毒液；(8)同时设立无PRV疫苗株病毒吸附的PGO18重组质粒作为转染对照。 

1.2.5重组病毒PGO18的蚀斑筛选与纯化 

当接种有PGO18的细胞出现80％病变后收获病毒液，反复冻融3次，按2uL/孔接种于24孔板长成单层的ST细胞，置于37℃细胞培养箱内吸附1.5h，吸弃孔内培养液，用PBS液清洗3次，铺上0.8％的低熔点琼脂糖，放入细胞培养箱中培养2天，在荧光显微镜下挑取荧光蚀斑，放入无菌的离心管中。冻融3次后8000r/min4℃离心10min，取上清，按10倍系列稀释接种于96孔板长至单层的ST细胞，待最大稀释孔的细胞开始出现病变时，铺上低熔点琼脂糖，荧光显微镜下继续挑取荧光蚀斑(最好挑取最大稀释孔的荧光蚀斑)。如此反复接种于96孔板细胞，纯化病毒，直至所有蚀斑均显示绿色荧光，得到重组病毒命名为PGO18。 

1.2.6重组病毒的PGO18的鉴定 

1.2.6.1PCR扩增 

将阳性病毒液反复冻融3次，吸取100μL做10倍系列稀释至10^-6，待6孔板中的ST细胞长至单层时，分别取10 ^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释度病毒液400μL进行接种，放置于细胞培养箱中吸附2h，吸弃孔内培养液并用PBS反复清洗3遍，再加入低熔点营养琼脂糖溶液，待琼脂糖凝固后放至细胞培养箱中进行培养，36h后在荧光显微镜下进行挑斑， 之后将挑起的斑反复冻融后再重复上述操作，结合PCR目的基因扩增进行筛选，直到蚀斑纯化第三轮所有的蚀斑PCR扩增的ORF2目的基因与IL-18目的基因阳性率达到100％，表明重组病毒已经纯化完全，将孔内病毒在瓶中ST细胞上扩大培养，48h～72h之间观察细胞，待80％以上细胞发生病变时收毒，反复冻融3次后，贮存到-70℃冰箱备用。 

1.2.6.2SDS-PAGE电泳与Western blot  

将重组病毒PGO18接种单层ST细胞，待病变后收集细胞液，进行SDS-PAGE电泳。具体操作步骤如下： 

(1)夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板，将制好的12％的SDS丙烯酰胺分离胶约5mL迅速灌入两玻板的间隙中，在分离胶上加入一层异丁醇；(2)分离胶聚合后，倾出异丁醇，用去离子水洗凝胶顶部数次，用纸巾吸净残留液体；(3)将新配制的5％浓缩胶灌入分离胶上，立即插入梳子；(4)待浓缩胶全部聚合后移出梳子，用水洗去加样槽的残留液体；(5)固定电泳装置，加电泳缓冲液，每孔上20μL样品，将电泳装置与电源相接；(6)待溴酚蓝跑到分离胶时，将电压调到120V～150V，等溴酚蓝跑到分离胶底部时，取出聚丙烯酰胺凝胶；(7)在考马斯亮蓝染料中染色4h以上，之后取出放入脱色液中脱色数次，每次30～60min。脱色完全后，取出观察分析。 

将SDS-PAGE电泳得到的凝胶进行Western blot，具体操作步骤如下： 

(1)电转：当SDS-PAGE电泳结束时，从电泳槽上取下凝胶，在去离子水中略漂洗一下，然后精确平放于处理好的硝酸纤维素滤膜上，排除气泡。将靠上方的电极(阴极)放于夹层物上，连接电源，根据凝胶面积按0.65mA～1.0mA/cm²接通电流，电转移0.5～2h；(2)染色：断开电源，逐一掀去各层，把凝胶转移至丽春红染色液中，染色至膜上出现蛋白带。用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，其间换水数次；(3)封闭：把硝酸纤维素滤膜放入可加热封接的塑料袋中，以滤膜面积0.1～0.15mL/cm2的量加入封闭液(含1％BSA的TBST)，尽可能排除气泡后密闭袋口，平放于摇床上室温温育0.5～1h，剪开塑料袋，弃去封闭液；(4)第一抗体和靶蛋白结合：把硝酸纤维素滤膜放入一新的塑料袋中，按0.1～0.15mL/cm²的量加入用TBST以1∶100稀释的一抗，排除气泡后密闭袋口，平放于摇床上室温温育1h。剪开塑料袋口，将硝酸纤维素滤膜用TBST洗3遍，每次5～10min；(5)第二抗体与硝酸纤维素滤膜的温育：把硝酸纤维素滤膜放入一新的塑料袋中，按0.1～0.15mL/cm²的量加入用TBST以1∶2500稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，排除气泡后密闭袋口，平放于摇床上室温温育0.5～1h，剪开塑料袋口，将硝酸纤维素滤膜用TBST洗3遍，每次5～10min，再用TBS洗2遍，每次5～10min；(6)加入底物显色：把硝酸纤维素滤膜放入10mL底物液中，显色 1～15min，一旦出现蛋白带，立即用去离子水终止，即可观察。 

1.2.6.3淋巴细胞增殖试验 

无菌取6月龄健康猪脾脏，在PBS液中将其剪碎，120目尼龙网中磨碎过滤，用淋巴细胞分层液分离，并用DMEM培养液作100倍稀释，计数后，加不含细胞因子的培养液调整细胞密度为1～5×10⁴细胞/mL，加入PGO18纯化病毒，使终浓度为200μg/mL，灭活小牛血清5.0％，双抗100IU/mL。转移到96孔细胞培养板中，每孔100μL细胞悬液。第1行每孔的淋巴细胞加入含有重组病毒的细胞培养液，第2、3行设为阴性和空白对照。将96孔板置于37℃5％CO₂培养箱培养48h；每孔加入20μL MTT(5.0mg/mL)，再置于37℃5％CO₂培养箱中培养3～4h；每孔加入100μL20％SDS-0.01moL/L HCL溶液，混匀，37℃5％CO₂培养箱继续培养3～4h。以空白对照孔调零，波长570nm测每个孔的OD值。样品做10个重复后取OD₅₇₀的平均值。 

1.2.7重组病毒PGO18中ORF2基因和IL-18基因在细胞中的转录检测 

将纯化的重组病毒液接种到处于生长期的ST单层细胞中，待80％以上细胞出现病变时收毒，反复冻融3次，参照RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的抽提，反转录后进行PCR扩增以检测ORF2基因与猪IL-18基因在ST细胞中的转录。 

1.2.8重组病毒PGO18中ORF2基因的表达检测 

采用免疫过氧化物酶单层细胞试验法(Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)对重组病毒PGO18中ORF2基因的表达进行检测。 

将PK15细胞传至96孔板上，待细胞长成单层后，每孔加入10倍稀释的重组病毒100μL，同时设未接毒细胞空白对照。细胞培养箱中吸附2h后加入含2％胎牛血清的DMEM维持液。培养24h后，吸弃培养液并用PBS液清洗3遍，置37℃温箱干燥10min。再用4℃预冷的4％甲醛液固定10min，PBS清洗3遍。将阳性血清用PBST-BSA液按1∶50稀释，并设阴性血清对照孔，每孔加培养液100μL，37℃湿盒孵育1h，再用PBST洗5次。加入用PBST-BSA1∶200稀释的HRP-SPA，同样每孔加100μL，再置37℃湿盒孵育1h，取出后用PBST洗5次。每孔加入50μL AEC显色液，避光作用15min，用PBST洗涤两次后用显微镜观察结果。 

1.2.9遗传稳定性评价 

将获得的单克隆重组病毒在ST细胞中传至第15代，观察其在细胞中绿色荧光表达情况，待细胞出现80％病变时进行收毒，反复冻融3次后，提取重组病毒DNA，进行PCR扩增鉴定，并对PCR产物进行基因克隆，测序工作由华大基因科技有限公司完成。 

2结果与分析 

2.1PRV疫苗株TCID₅₀与质粒浓度的测定在ST细胞上对PRV疫苗株进行了TCID₅₀的测定，两次测定结果取平均值，PRV疫苗株的TCID₅₀为1×10⁶。对通过无内毒素质粒提取试剂盒提取的重组质粒PGO18用分光光度计测定DNA浓度和纯度为：PGO18质粒浓度为1520ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.87，满足了转染要求。 

2.2重组病毒共转染 

将重组质粒PGO18在脂质体的介导作用下，转染至经PRV疫苗株吸附处理过的ST细胞，24h后在倒置荧光显微镜蓝光(波长范围为420～490nm)下观察，出现细胞病变。由于绿色荧光蛋白标签的存在，应观察到绿色荧光。结果表明，PGO18与PRV疫苗株共转染24h后，可以观察到大量绿色荧光，且多存在于存活的贴壁细胞内，如图4所示，具备了在细胞内与PRV发生同源重组的必要条件。 

2.3重组病毒PGO18的纯化 

将PGO18与PRV疫苗株共转染ST细胞，24h开始出现细胞病变，荧光显微镜下观察到带绿色荧光的蚀斑，初步判断为重组病毒。72h后细胞全部脱落，反复冻融3次作为种毒，-70℃保存。将转染后收获的种毒倍比稀释，进行蚀斑纯化，直至所有的细胞病变部位均可以观察到绿色荧光，如图5所示。 

2.4重组病毒PGO18的PCR鉴定 

采用脂质体介导法将PGO18质粒与PRV弱毒株基因组共转染ST细胞，发生细胞病变后收集病毒液，在倒置荧光镜下进行蚀斑纯化。经过三轮蚀斑纯化，在倒置荧光镜下随机挑取20个蚀斑，利用PCR方法从重组病毒中能分别扩增出PCV2ORF2基因与IL-18基因，表明已成功构建了重组病毒PGO18，如图6、图7所示。 

2.5重组病毒PGO18的Western blot鉴定 

取重组病毒PGO18接种ST细胞，病变后收集细胞处理，12％SDS-PAGE电泳后进行Western blot检测，结果表明，PGO18在大小约为28kDa处出现特异性条带，与预期的分子量相当，证实重组病毒能正确表达PCV2ORF2蛋白，如图8所示。 

2.6淋巴细胞增殖试验结果 

从表1可以看出PGO18能明显提高猪淋巴细胞的转化率，说明PGO18重组病毒与对照组的平均OD值差异显著(P＜0.01)，具有一定的生物学活性。 

表1猪淋巴细胞转化试验结果(OD₅₇₀) 

2.7重组病毒PGO18在细胞中的转录检测 

将纯化的重组病毒液接种ST细胞后，得到的病毒液经反复冻融3次后，提取RNA，反转录后分别进行PCR扩增，检测到ORF2基因与猪IL-18基因，如图9所示。 

2.8IPMA对重组病毒PGO18中ORF2基因的表达检测 

采用IPMA方法对重组病毒中的PCV2进行检测，结果如图10所示。 

2.9遗传稳定性评价 

通过将获得的单克隆重组病毒连续传代后，提取重组病毒DNA，进行PCR扩增鉴定，经测序，证明得到的确实为重组病毒，说明其已在细胞内稳定存在。 

3结论与讨论 

3.1关于共转染方法的选用 

目前主要的转染方法有电穿孔法、磷酸钙共沉淀法及脂质体法等，其中脂质体与生物膜有较 大的相似性及组织相容性，具有毒性小、高效、操作相对简单、无污染的优点，并且同其它转染方法相比，其转染效率提高了十多倍，故本试验采用脂质体法转染。但由于脂质体对细胞膜有一定的损伤作用，故转染时间不宜太长，以4～6h为宜，时间过长会导致ST细胞大批脱落和死亡，从而导致转染失败。 

查阅国内外相关报道，大都是采用提取PRV病毒基因组DNA，与重组质粒同时转染的方法进行共转染。提取病毒基因组需要大量增殖病毒，此外要保证提取的PRV亲本株基因组的完整性，因为只有完整的基因组转染细胞后才能引起细胞病变，因此在提取基因组时要特别小心，以防基因组发生断裂。整个过程费时费力，非常繁琐。本研究创新性的使用了一种新的共转染方法，即借鉴禽痘病毒转移载体的同源重组方法，将PRV疫苗弱毒株先对转染用的ST细胞进行吸附，使部分病毒基因组进入到活细胞内，再通过脂质体介导将重组病毒进行转染，从而使重组质粒与病毒在活细胞内进行同源重组。这种改进大大降低了工作量，将试验从繁琐的病毒培养与DNA提取中解放出来，提高了工作效率。 

3.2关于转染条件的优化 

在试验中影响转染效率的因素很多，包括细胞的状态、细胞的密度、重组质粒的浓度与质量、疫苗株的吸附剂量与时间等等，都会直接影响到转染的效果。通常情况下，在转染前6h内要进行培养液的更换，使细胞在转染时达到较好的生长状态，通常密度在80～90％时转染效果较好，且从接种到转染时间不要超过48h，时间过长会使细胞处于老化状态，非常影响转染的效果。对于转染用的重组质粒，必须去除内毒素后才可以使用，因为如果提取的质粒中含有大肠杆菌内毒素或者质粒的纯度不高均会大大降低转染效率，甚至导致转染失败，所以我们使用BIOM IGA无内毒素质粒小提试剂盒进行质粒的提取，并通过洗脱方法的改进使质粒的终浓度达到1000ng/μL以上，使得加入极少的质粒就达到了要求的浓度，降低了质粒对细胞的毒性，保证了转染的顺利进行。PRV疫苗株的吸附剂量也是一个重要的影响因素，剂量过大，会导致细胞的快速死亡，从而使同源重组来不及进行细胞就已经脱落了；剂量过小，PRV的基因组含量太低，不利于高效的同源重组发生。因而必须寻找一个恰当的剂量来进行吸附。此外，还要考虑脂质体与重组质粒之间的比例等因素，经过试验的反复摸索，最终确定本研究中6孔板转染体系中三者的最优比例为PRV疫苗株：PGO18质粒：Lipofectamine^TM2000为20μL∶4μg∶10μL。 

3.3关于PGO18的转染 

本研究对PGO18重组质粒进行了转染，在荧光显微镜下观察发现PGO18的荧光量是很大的，经过蚀斑纯化3次后，得到了重组病毒。但是相比之前的PGO重组质粒的转染与纯 化，虽然只在PGO重组转移质粒的基础上增加了一个基因片段IL-18，但是对整个转染条件的影响是非常大的。运用之前的转染条件，PGO18的荧光表达量非常低，分析原因，推测可能是因为IL-18插入的位点为荧光蛋白所带的多克隆位点，是利用加入的SV40启动子进行表达的，也就是说SV40启动子要负责绿色荧光蛋白标签和IL-18两个基因的启动表达，相比PRV gG基因自身所带的启动子负责ORF2基因的表达要弱一些，所以影响了转染效率。也可能是由于外源基因猪IL-18的插入，导致绿色荧光蛋白标签自身的表达受到抑制，导致荧光数量的明显减少。但通过不断地摸索条件与反复验证，发现使用PGO18重组质粒转染时，相同条件下细胞的病变情况比PGO重组质粒要少一些。猜测可能与IL-18基因有关，因为前期的研究表明，IL-18在细胞上能够明显使细胞的生长速度加快，且细胞状态很好。 

3.4关于蚀斑纯化 

对于共转染发生病变的细胞需通过蚀斑纯化来筛选重组病毒。一般对于第一轮蚀斑获得的阳性重组子需经过3～4次蚀斑纯化，即可使重组病毒的阳性率达到100％。但对阳性蚀斑再次进行下一轮纯化时，有时可能出现用PCR方法检测不到外源基因的情况，这可能是由于用样品缓冲液处理的病变细胞作为模板时杂质含量较多，影响PCR反应，从而导致外源基因扩增不到。这时可以改用终浓度为0.5mmol/L EDTA(pH8.0)和0.05％SDS处理病变细胞，并用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提后作为模板，进行PCR扩增鉴定。 

试验三表达猪圆环病毒2型ORF2基因与猪IL-18基因重组猪伪狂犬病病毒的部分免疫原性研究 

1材料与方法，1.1材料，1.11试验动 

6周龄雌性昆明小鼠60只，购自河南省试验动物中心。 

1.1.2疫苗及毒种 

猪伪狂犬PRV TK^-/gG^-/gE^-疫苗株购自武汉科前生物制品公司；伪狂犬闽A强毒株、ST细胞购自中国兽药监察所(冻存)。猪圆环病毒2型强毒LY株、重组病毒PGO和PGO18购自河南省动物性食品安全重点实验室。 

1.1.3主要试剂 

DMEM细胞培养液、新生胎牛血清购自Hyclone公司；淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司、猪圆环病毒II型ELISA检测试剂盒购自武汉科前生物制品公司、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG抗体购于北京博奥森生物技术发展公司；Premix Ex Taq酶，SYBR Premix Ex Taq TM，dNTP Mixture购于大连宝生物公司；Tris平衡酚购于天津灏洋公 司；SPRD、FITC、PE标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体购自Southern Biotech公司；206溶血素购自BD公司；Rotor Gene3000实时定量PCR为Gene公司；FACS Aria 流式细胞仪为BD公司；四甲基联苯胺(TMB)显色液购自金斯瑞生物科技有限公司；PEG12000购自Amresco公司；蔗糖、柠檬酸等有关试剂均为国产分析纯试剂。 

1.2方法 

1.2.1病毒TCID₅₀的测定 

在96孔细胞板上培养ST细胞；取新鲜的重组病毒PGO、PGO18、伪狂犬闽A强毒株、猪圆环病毒2型强毒株病毒液，分别按10倍梯度稀释。弃去培养液，用无抗生素无血清的DMEM培养液清洗细胞3次，每个病毒稀释液按100μL/孔接种细胞，每个滴度重复10孔，同时设正常细胞对照，置37℃CO₂培养箱中培养。每日观察并记录细胞病变孔数，按Reed-Muench氏法计算病毒TCID₅₀。计算公式为： 

距离比例＝(大于50％的病变率-50％)/(大于50％的病变率-小于50％的病变率) 

TCID₅₀＝大于50％病变的病毒最高稀释度的对数+距离比例 

1.2.2动物分组免疫 

将60只6周龄雌性小鼠随机分为3组，每组20只。其中A组为PGO重组病毒免疫组，B组为PGO18重组病毒免疫组，C组为DMEM培养液免疫对照组。免疫途径均采用两后肢胫骨前肌多点注射300μL/只。并于一免后第3周开始(即首免后第14d)每周尾静脉采血，分离血清，检测PRV、PCV2血清抗体水平。首次免疫第56d分别用圆环病毒与伪狂犬病毒强毒株进行攻毒保护试验，以10⁵TCID₅₀的剂量接种各试验组及对照组，采用后肢肌肉注射，接种病毒后连续观察14d。 

1.2.3血清中和试验检测PRV抗体 

一免后第2、3、5、7、8、9周每组随机抽取5只小鼠断尾采血，分离的血清，56℃水浴灭活30min，用含双抗的DMEM营养液2倍系列稀释血清为1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64稀释液，然后将稀释的血清分别加入到96孔细胞培养板中，每个稀释度作4个重复，每孔50μL。然后在加有血清的培养孔中，加入用DMEM稀释为200TCID₅₀的伪狂犬病毒液。每孔50μL，同时设血清对照孔、病毒对照孔和细胞对照孔，于37℃含5％CO₂的培养箱中作用1h，然后每孔中滴加细胞悬液50μL(细胞含量为10⁹个细胞/mL)，轻轻摇匀后，继续培养4～6d，每天观察细胞病变情况，按Reed-Muench氏法计算被检血清中的半数保护量PD₅₀。首先计算出各稀释度血清液保护50％细胞不引起细胞病变和不保护细胞引起细胞病变的累积孔数，按下述公式计算出距离比： 

距离比＝(高于保护50％细胞的百分数-50％)/(高于保护50％细胞的百分数-低于保护50％细胞的百分数) 

血清的PD₅₀＝高于50％保护率血清稀释度的对数+距离比×稀释系数的对数 

1.2.4PCV2间接ELISA抗体水平检测 

一免后第3、4周每组随机抽取5只小鼠断尾采血，二次免疫(一免后第五周)后1、2、3、4周及攻毒(一免后第九周)后1、2周每组抽取5只小鼠断尾采血，分离的血清用圆环病毒II型ELISA检测试剂盒检测小鼠的抗体水平。 

1.2.5淋巴细胞增殖试验 

1.2.5.1淋巴细胞的提取 

一免后第八周，A-C组各取5只小白鼠，脱臼处死，用75％酒精消毒后迅速移至无菌操作台；用剪刀和镊子无菌取脾脏并在研钵中研磨，加入2毫升PBS，用120目尼龙网过滤到小烧杯中；在离心管中加入2mL淋巴细胞分离液，并在其上部沿管壁缓慢加入脾细胞悬液，用水平离心机2000转/分离心10min；将中间层的淋巴细胞转移到干净离心管中；再用PBS 液洗两次，1500转/分离心5min，弃去上清即得浓缩的淋巴细胞。 

1.2.5.2淋巴细胞增殖反应的检测(MTT比色法) 

取提取的淋巴细胞用1640溶液配成每毫升1×10⁶单细胞悬液，然后于96孔板中每孔加入200μL，每只小鼠做3个孔，第1孔为PCV2灭活病毒刺激组，第2孔细胞不添加任何刺激物，第3孔只加培养液作为空白孔，置5％CO₂37℃培养箱培养36h后进行测定。测定前4h时每孔加入MTT20μL(5mg/mL)继续培养，测定时每孔加入200μL的DMSO，充分震荡10min(动作要轻柔，使结晶物溶解即可)，5min内用酶联免疫检测仪测定OD₅₇₀。结果用刺激指数(Stimulation index，SI)表示。SI＝(刺激物OD值-空白OD值)/(细胞OD值-空白OD值)。比较各组间的统计学差异。 

1.2.6小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定 

每组随意取5只小鼠，利用流式细胞仪检测首免疫后35d时小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化。取专用上样管，编号，取各组试验鼠抗凝血各100μL，加入荧光标记的抗CD3、CD4、CD8抗原的单克隆抗体1μL，轻轻混匀，室温孵育20min；2mL/管溶血素混匀，室温作用15min；200×g离心5min；按2mL/管加入2％FBS-PBS，200×g离心5min，重复3次；最后用400μL PBS定容，流式细胞仪检测。用Excel和SPSS统计软件处理数据。 

1.2.7攻毒保护试验 

在首免后56d，各组试验小鼠取10只，再将每组中的10只一分为二。分别用10⁷TCID₅₀ PCV2LY强毒、PRV闽A强毒通过腹腔注射途径进行攻击(500μL/只)。对PRV闽A强毒攻击的小鼠观察2周，每隔12h观察小鼠的发病、死亡情况。用PCV2LY强毒攻毒后的小鼠，于第3周处死，取肺脏、脾脏组织提取DNA并进行PCV2病毒的PCR检测。 

2结果与分析 

2.1病毒TCID₅₀的测定 

按Reed-Muench氏法计算病毒TCID₅₀，在ST细胞上进行了两次判定，得到的平均结果如下：重组病毒PGO为1×10^6.5TCID₅₀，PGO18为1×10⁷TCID₅₀，猪伪狂犬病毒弱毒株为1×10⁶TCID₅₀，伪狂犬闽A强毒株1×10⁸TCID₅₀，猪圆环病毒2型强毒株病毒液1×10⁸TCID₅₀。 

2.2血清中和试验检测PRV抗体结果 

试验小鼠抗PRV的测定结果见表2。结果表明，重组病毒PGO18免疫组和重组病毒PGO免疫组在首免后3周均产生了PRV中和抗体，且二者之间差异不显著；在第4周加强免疫后，两组的抗体水平都得到显著的提高，首免后7周与首免后3周相比，差异极显著(P＜0.01)，在首免后7周及8周，重组病毒PGO18诱导产生的PRV中和抗体水平为5.50±0.54和5.65±0.21，重组病毒PGO同期诱导产生的PRV中和抗体水平为5.20±0.35和5.43±0.55，经t检验，差异不显著(P＞0.05)。对照组无论首次免疫还是加强免疫都检测不到PRV中和抗体。该结果表明重组病毒PGO18免疫组和重组病毒PGO免疫组都能在小鼠体内得到有效的增殖，并诱导产生一定的中和抗体，在加强免疫后，中和抗体水平显著升高，且在首免后第8周左右抗体水平达到高峰，但重组病毒PGO18诱导产生的PRV中和抗体比重组病毒PGO同期诱导产生的PRV中和抗体水平要略高，表明IL-18在免疫增强方面表现出一定的作用。 

表2PRV中和抗体效价水平(log2) 

2.3PCV2间接ELISA抗体水平检测结果 

用PCV2间接ELISA方法检测不同时期采集的小鼠血清中的PCV2抗体，如表3所示，重组病毒免疫组在首免后抗体水平与DMEM免疫组相比无明显变化；在首免后第5周开始，重组病毒免疫小鼠发生抗体阳转，至首免后8周，抗体水平达到高峰。而DMEM培养液对照组在免疫后不同时间PCV2抗体均为阴性。结果表明重组病毒PGO18与重组病毒PGO在提高猪圆环病毒抗体水平方面有较好的作用，但起效较慢，二次免疫后抗体水平才有显著地提高，且PGO18诱导产生的抗体水平要高于PGO同期诱导的抗体水平。 

表3ELISA检测PCV2抗体 

2.4淋巴细胞增殖测定结果 

二免后第四周每组取5只小鼠处死采集脾脏并分离淋巴细胞，并将经紫外线照射灭活的PCV2作为特异性抗原，用以检测小鼠体内淋巴细胞的特异性增殖情况。淋巴细胞增殖反应试验结果显示，重组病毒PGO18与PGO免疫组表现出明显的淋巴细胞增殖反应，其刺激指数分别为3.30、2.95(表4)，表明重组病毒PGO18与PGO具有良好的诱导细胞免疫反应的能力，且PGO18的诱导能力更为强烈，而DMEM培养液免疫组无细胞增殖反应。 

表4特异性淋巴细胞增殖效应结果 

2.5小鼠外周血淋巴细胞亚群的测定 

利用流式细胞仪检测小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化，结果表明(表5)，重组病毒免疫组中小鼠T淋巴细胞亚类CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺的细胞数量均高于DMEM对照组，差异极显著(P＜0.01)。 

表5小鼠外周血中CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺淋巴细胞数量的测定 

2.6攻毒保护试验 

在首免后56d，将试验小鼠，一半用10^6.0TCID₅₀的PRV MinA株强毒对免疫小鼠进行攻毒保护试验，每隔12h观察小鼠的发病、死亡情况，以及平均死亡时间，共观察2周。结果PRV 攻毒小鼠中，免疫DMEM培养液的空白对照组小鼠在攻毒后72h出现典型的伪狂犬病发病症状，表现为兴奋性增高，病毒注射部位搔痒，发病动物在12h内死亡，而重组病毒组及相应的亲本株疫苗免疫组小鼠未发生任何死亡，并且在观察的2周内均表现正常。试验结果见表6。 

另一半小鼠进行PCV2强毒攻毒，于第三周处死，无菌取其脏器进行研磨及反复冻融后离心取上清，提取DNA后进行PCV2全基因PCR特异性扩增。结果如下：DMEM组中的5只小鼠PCR结果均为阳性，表明其体内存在PCV2病毒；重组病毒PGO免疫组中只有2只扩出目的基因，其余3只结果为阴性；重组病毒PGO18免疫组中只有2只扩出目的基因，其余3只结果为阴性。表明重组病毒能够有效抵抗PCV2强毒的攻击。 

表6疫苗免疫小鼠对致死剂量PRV攻击的保护效果 

3结论与讨论 

伪狂犬病毒具有宿主范围广，但是不感染人，分子背景清楚，可插入外源基因等特点，因此将PRV改造为病毒表达载体已成为目前常用的一种分子生物学方法。近年来国内已用PRV 作为病毒载体表达了猪细小病毒的VP2基因、乙脑病毒的NS1基因、猪瘟病毒的E2蛋白、口蹄疫的P1基因等多种基因，目前PRV基因缺失疫苗已经是推广应用非常成功的动物标志疫苗，并且其对PRV的根除计划也发挥着很大的作用。这种疫苗免疫动物后，能够利用血清学方法将野毒感染猪和疫苗免疫猪进行区分，这就为PRV的根除提供了有利条件。宋云峰将获得的TK^-/gE^-/ORF2+重组病毒进行猪体免疫试验，结果表明，重组病毒PCV2特异性淋巴细胞增殖效应明显高于DMEM培养液对照组及伪狂犬基因缺失疫苗免疫组。 

目前，有关PCV2疫苗研制的报道较少。PCV2在PK-15细胞上可以增殖，但增殖滴度不高，毒价测定须借助免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)，因此使用全病毒来制备灭活疫苗，操作繁琐，成本高。基于此，利用基因工程方法获得的疫苗(DNA疫苗、亚单位疫苗及病毒活载体疫苗)将成为防控该病的重要方向。目前已有PCV2DNA疫苗、亚单位疫苗和嵌合病毒疫苗的研究报道^[174-176]，这些疫苗虽对PCV2有较好的免疫效果，但由于DNA疫苗的安全隐患、亚单位疫苗的高成本以及嵌合病毒疫苗的低增殖滴度限制了这些疫苗的广泛应用，因此病毒活载体疫苗研究具有重要的现实意义。 

研究表明，小鼠本身不感染PCV2，接种PCV2后的小鼠不会产生病毒血症，也不会导致小鼠产生可观察到的临床症状和组织损伤，小鼠不是PCV2感染的敏感动物。但是小鼠接种PCV2或者相关抗原后可以检测到相应的血清抗体，因此在PCV2疫苗的研究试验中，小鼠可以作为疫苗质量评价的动物模型。有文献报道认为，PCV2病毒可以在小鼠体内复制，并且可以导致小鼠产生在显微镜下可以观察到的病变，利用PCR方法在淋巴结中可以检测到病毒核酸。对于PCV2疫苗的免疫学功能评价研究来讲，小鼠是一种理想的动物模型，具有有着其它动物无法替代的诸多优点。本试验在前期成功构建重组病毒的基础上，将重组病毒PGO18株、PGO株、DMEM培养液同时免疫小鼠，通过进行抗体检测、淋巴细胞 增殖试验、外周血T淋巴细胞亚群的测定及攻毒保护试验，结果表明重组病毒对小鼠安全有效，可诱导小鼠产生针对PRV和PCV2的特异性免疫应答，首免后四周内抗体的产生量很少，与对照组差别不大，第5周有明显的抗体产生，至第8周达到高峰。并且对致死剂量PRV闽A株和PCV2强毒的攻击具有很好的免疫保护效果。 

机体免疫应答的最终免疫效果与细胞水平的T、B淋巴细胞的免疫功能及多种免疫活性细胞的相互作用密切相关，在抗原、有丝分裂原ConA及LPS的刺激下，淋巴细胞转化为淋巴母细胞的效率是考察机体免疫功能状态的重要指标之一。从脾淋巴细胞增殖试验结果来看，用重组病毒免疫小鼠后，在不同时间小鼠脾淋巴细胞对ConA有明显的反应性，说明该疫苗诱发了机体细胞的免疫反应。这可能是因为宿主细胞加工疫苗DNA后得到的蛋白质拥有更佳的天然构象，除了线性抗原表位保持着构象型抗原表位的活性外，疫苗DNA诱导宿主细胞加工蛋白的方式类似于天然病毒增殖过程，有利于宿主免疫系统识别。 

脾淋巴细胞转化试验(MTT)是检测细胞活力的重要方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此常被用来检测细胞的增殖情况。本研究中的MTT试验结果表明该重组疫苗可刺激免疫小鼠脾淋巴细胞迅速增殖，且增殖幅度和活性均高于商业化疫苗，这可能是因为除了诱导Th细胞增殖外重组质粒还具备诱导Tc细胞增殖的能力，这也是重组疫苗较灭活疫苗或亚单位疫苗优越的原因。 

本研究构建的重组质粒PGO18与PGO在注射后能诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答，抗体监测、淋巴细胞亚群分析和脾淋巴细胞转化试验的结果均表明二者具备良好的免疫原性，且平行数据测定PGO18要略优于PGO，为成功构建新型的PRV-PCV2二联苗奠定了基础。 

<110> 河南农业大学

 

<120> 重组猪伪狂犬病毒毒株及其制备方法

 

<160> 1

 

<210> 1

<211>

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<221> gene

<222> (1)...(576)

 

<400> 1

 

ctcggctcgt atgttgtgtg gattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat    60

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cggtgcgatc tgtacagcta cctgaccatg cgggacgggc cgctggacat gcgcgacgcc    240

gggcgcgtga tccggtccgt gctccgcggg ctcgcctacc tgcacgggat gcgcatcatg    300

caccgcgacg tcaaggcgga gaacatcttc ctcgaggacg tggacacggt gtgcctgggg    360

gacctcgggg ccgcgcgctg caacgtggct gcgcccaact tttacgggct cgccgggacc    420

atcgagacca acgcccccga ggtgctcgcg cgcgaccgct acgacaccaa ggtcgacgtc    480

tggggcgcgg gggtggtgct cttcgagacg ctggcctacc ccaagacgat caccagcggg    540

gacgagcccg cgatcaacgg ggagatgcac ctgatc                              576                   

 

 

Claims (5)

1.一种重组猪伪狂犬病毒毒株，其特征在于：重组猪伪狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCC NO：V201345。

2.如权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，其特征在于：以pGEMT-IL-18为模板，扩增猪IL-18基因，利用重组技术插入到含有PCV2 ORF2基因的重组猪伪狂犬病毒转移质粒PGO中，构建载体PGO18，将猪伪狂犬病毒弱毒株感染ST细胞后，再转染重组质粒PGO18，经蚀斑纯化得到重组猪伪狂犬病毒。

3.根据权利要求2所述的所述的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，其特征在于：所述构建载体PGO18的步骤如下：

① 根据重组质粒pGEMT-IL-18中猪IL-18基因片段设计1对引物，所述引物序列为：

上游引物序列：5’- TAAGATCTATGGCTGCTGAACCGGA-3’，

下游引物序列：5’- CGCCAGATCTCTAGTTCTTGTTTTG -3’；

② 猪IL-18的PCR扩增

以pGEMT-IL-18为模板进行PCR扩增，体系如下：

                                                                   

反应条件：94℃ 5min；95℃ 1min；55℃1min；72℃ 1min共进行30个循环，72℃延伸10min；

扩增产物用0.8%琼脂糖进行电泳检测；

③ 将回收纯化的猪IL-18产物用BglⅡ酶切，体系如下：

       

             

混合物瞬时离心后置37℃水浴酶切8h，产物用0.8%琼脂糖电泳后，用凝胶回收试剂盒对产物进行回收；

④ PGO质粒用BglⅡ进行酶切并用碱性磷酸酶（CIAP）对酶切产物进行去磷酸化处理，体系如下：

         

上述混合物振荡均匀，37℃水浴中作用30min后置4℃冰箱过夜，之后用凝胶回收试剂盒对产物进行回收；

⑤ 载体PGO与外源片段猪IL-18的连接

将步骤④得到的回收产物与经过BglⅡ酶切处理的猪IL-18进行连接，在16℃连接槽中连接12~16h，得到的连接产物转化入DH5α感受态细胞，转化后提取重组质粒，得到阳性质粒为PGO18。

4.根据权利要求2所述的所述的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，其特征在于：所述转染重组质粒PGO18的步骤如下：用BIOMIGA无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒PGO18至1μg/μL备用，复苏细胞，转染前24h将ST细胞传至第3代，将细胞悬液加到6孔板中，先用PRV疫苗株接种至90％的ST细胞，吸附1.5h后，将质粒PGO18进行转染，置37℃、5％CO₂下培养5h后，吸弃孔内培养液，每孔加入1.5mL细胞维持液，于37℃、5％CO₂下继续培养36h，收获病变细胞，反复冻融3次用于重组病毒的筛选。

5.根据权利要求2所述的所述的重组猪伪狂犬病毒毒株的制备方法，其特征在于：所述蚀斑纯化的步骤如下：将转染获得的病毒液按10^﹣1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6进行稀释，各取400μL接种到ST细胞长至单层的6孔板中，置于37℃细胞培养箱内吸附1.5h后，每孔加入2mL低熔点营养琼脂糖，培养48h，此时在荧光显微镜的蓝光(波长420~490nm)下能观察到绿色和无特殊荧光颜色的两种病毒蚀斑，在荧光显微镜下用巴氏吸管吸取绿色蚀斑，加入DMEM维持液于-20°C反复冻融3次，然后将收获的病毒液接种到含单层ST细胞的24孔细胞培养板内至90％以上的细胞发生病变时收毒，将每孔收集的病毒提取DNA并进行PCR扩增，选择PCR阳性的病毒进行下一轮的蚀斑纯化，直至获得纯净的重组病毒PGO18。