CN105368796A

CN105368796A - 一种表达ppv vp2基因和猪il-18基因的重组猪伪狂犬病毒株

Info

Publication number: CN105368796A
Application number: CN201510568140.3A
Authority: CN
Inventors: 陈红英; 杨明凡; 王林青; 付朋飞; 乔涵; 杨兴武; 李新生
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2016-03-02

Abstract

本发明公开了一种表达PPV？VP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒株：重组猪伪狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCC？NO：V201347。本发明将构建的重组伪狂犬病毒PGVP218和实验室构建的不含IL-18的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2分别免疫小鼠，同时以DMEM培养液作为阴性对照，PRV？HB98疫苗、PPV灭活苗作为阳性对照组免疫小鼠，通过进行PPV特异抗体检测、PRV抗体中和试验、外周血T淋巴细胞亚群的测定及攻毒保护试验，来考察重组病毒的免疫原性。结果显示，重组病毒PGVP218对小鼠安全有效，可诱导小鼠产生针对PRV和PPV的特异性抗体，CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群数增多。

Description

一种表达PPV VP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒株

技术领域

本发明涉及一种表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒株。

背景技术

猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，可引起胚胎早期死亡，木乃伊胎，死胎，不孕不育和延迟发情，同时还会引起仔猪皮炎症状、非化脓性心肌炎和消瘦性综合征。并常与猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒等其他病原混合感染而加重了其危害，给养猪业带来巨大的经济损失。

猪伪狂犬病毒也是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。其危害主要表现为母猪流产，产死胎、木乃伊胎及新生仔猪死亡等综合征，临床以产死胎为主。伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)基因组庞大，大小为150kb，含TK、gI、gG、gL等多个非必需基因，具有足够的空间允许外源基因的稳定插入，其容量可高达40kb，并且重组病毒在增殖的同时可稳定表达外源基因，从而提供对伪狂犬病毒和其它相应传染病的抵抗力。PRV具有病毒稳定、无致癌性、免疫原性持久，能够同时激发细胞免疫和体液免疫等优点，具有一个优良活病毒载体的基本特征，因此PRV适合基因工程活载体疫苗的研究和开发，已有多种病原利用PRV病毒载体得到表达。

白细胞介素18(IL-18)能诱导IFN-γ大量分泌表达，促进T细胞增殖及Th1细胞的免疫应答，增强NK细胞的杀伤活性，抑制Th2类细胞因子的生成，具有广泛的生物学效应，在免疫调节、抗肿瘤、抗病原微生物感染中具有十分重要的作用。IL-18作为一种新发现的天然免疫调节剂，目前已被公认为是一种可以替代传统疗法的新型治疗剂和有效的免疫佐剂，已经成为研究热点。据报道IL-18在猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗、猪圆环病毒2型DNA疫苗、新城疫活疫苗等多种动物疫苗中作为免疫佐剂，起到了一定的免疫增强作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒毒株，分类命名：表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒PRV-PPV-IL18PGVP218，拉丁文学名：Herpesviridae。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2013年11月18日，保藏编号CCTCCNO：V201347。

本发明的技术方案是：一种表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒毒株，其特征在于：重组猪伪狂犬病毒(Herpesviridae)毒株，CCTCCNO：V201347。

本发明的有益效果是：本发明利用猪伪狂犬病毒作为活病毒载体能够携带外源基因的特点，将猪细小病毒的主要抗原基因VP2基因片段插入猪伪狂犬病毒非必需基因区内，使两种引起猪繁殖障碍的病原结合在一起，构建能够同时预防PRV和PPV的重组病毒。同时插入新型细胞因子IL-18作为分子免疫佐剂，以期考察IL-18在重组疫苗中的免疫增强作用效果。为方便筛选重组病毒，需要筛选标记，GFP是一种吸收蓝光或紫外光后发出绿色荧光的天然蛋白质，不需要任何外源性底物和辅助因子，无毒、无污染、稳定，被广泛应用于分子生物学研究，故在构建时插入了绿色荧光蛋白(GFP)基因作为筛选标记。

本发明以PPVHP/104株DNA为模板，PCR扩增PPVVP2蛋白主要抗原基因，连接到18-T载体中，构建了重组质粒pMD-VP2。PCR扩增猪IL-18基因，利用重组技术将猪IL-18基因定向插入到实验室构建的含部分PRV基因，且带EGFP筛选标志的PRV转移质粒pG中，构建重组质粒pG18。从重组质粒pMD-VP2中获取VP2基因片段，将其定向插入到质粒pG18中，得到重组转移质粒pG18-VP2。将pG18-VP2与PRV弱毒株DNA共同转染猪睾丸细胞(ST细胞)，得到能够表达PPVVP2蛋白和IL-18的重组伪狂犬病毒PGVP218。以小鼠为实验动物，评价重组病毒的免疫原性，并与不含IL-18的重组病毒免疫效果进行比较。为在生产上同时预防猪细小病毒病和猪伪狂犬病提供新的思路和试验依据，同时也为探索猪IL-18对重组病毒的免疫增强奠定基础。

本发明将构建的重组伪狂犬病毒PGVP218和实验室构建的不含IL-18的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2分别免疫小鼠，同时以DMEM培养液作为阴性对照，PRVHB98疫苗、PPV灭活苗作为阳性对照组免疫小鼠，通过进行PPV特异抗体检测、PRV抗体中和试验、外周血T淋巴细胞亚群的测定及攻毒保护试验，来考察重组病毒的免疫原性。结果显示，重组病毒PGVP218对小鼠安全有效，可诱导小鼠产生针对诱导小鼠产生针对PRV和PPV的特异性抗体，CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群数增多。PGVP218免疫的小鼠能完全抵抗致死剂量PRV闽A株强毒的攻击，也能部分抵抗对致死剂量PPV强毒的攻击，并且PGVP218优于rPRV-VP2，表明IL-18作为新型的免疫佐剂，在重组病毒中起到了加强免疫效果的作用，为预防猪细小病毒病和猪伪狂犬病新型二联活苗的开发奠定了基础。

附图说明

图1为重组质粒pG18的构建流程图，重组质粒pIRES-IL18含猪IL-18基因，pG为伪狂犬通用转移质粒，含有PRV自身基因gG晚期启动子，另外还有CMV启动子、SV40Poly(A)和绿色荧光蛋白基因(GFP)。用BglⅡ酶切重组质粒pIRES-IL18，获得猪IL-18片段，插入到同样处理并去磷酸化的pG中，获得重组质粒pG18；

图2为重组质粒pG18-VP2的构建流程图，重组质粒pMD-VP2含有PPVVP2基因(约1.6kb)。用BamHⅠVP2产物，获得PPVVP2片段，插入到同样处理并去磷酸化的pG18中，获得重组质粒pG18-VP2；

图3为重组质粒pG18中IL-18基因的PCR扩增与酶切鉴定，M.DNAMarkerTans15K；1.BglⅡ酶切pG18产物；2.PCR产物；m.DNAMarkerDL2000；

图4为重组质粒pG18中IL-18基因比对结果；

图5为重组质粒pG18-VP2BamHI酶切鉴定，M.DNAMarkerDL2000；1.BamHⅠ酶切产物；m.DNAMarkerTans15K；

图6为重组质粒pG18-VP2HindIII酶切鉴定，M.DNAMarkerDL2000；1.HindIII酶切产物；m.DNAMarkerTans15K；

图7为重组质粒pG18-VP2中VP2基因序列与重组质粒pMD-VP2中VP2基因序列进行比对结果；

图8为pG载体结构；

图9为转染24h后ST细胞病变,A.转染后24h产生的蚀斑；B.荧光显微镜下的绿色蚀斑；

图10为蚀斑筛选纯化后的重组病毒引起的ST细胞病变,A.荧光显微镜下的细胞病变；B.普通光对照；

图11为重组病毒中VP2基因的PCR与RT-PCR鉴定,M.DNAMarkerDL2000；1-4.蚀斑PCR产物；5-6.RT-PCR结果；C.阴性对照；

图12为重组病毒中猪IL-18基因的PCR和RT-PCR鉴定,M.DNAMarkerDL2000；1-4.PCR产物；5-6.RT-PCR结果；C.阴性对照；

图13为重组病毒SDS-PAGE电泳,M.蛋白Marker；1.重组病毒rPRV-VP2；2.PRV弱毒株；3.重组病毒PGVP218；

图14为重组病毒的Westernblot鉴定,A.猪IL-18鉴定结果，1.PRV对照；2.重组病毒PGVP218；B.PPVVP2鉴定结果，1.PRV对照；2.重组病毒PGVP218；

图15为重组病毒接种Vero细胞8h；

图16为重组病毒接种Vero细胞12h；

图17为重组病毒接种Vero细胞24h；

图18为重组病毒接种Vero细胞36h；

图19为重组病毒接种Vero细胞48h；

图20为重组病毒接种ST细胞8h；

图21为重组病毒接种ST细胞12h；

图22为重组病毒接种ST细胞24h；

图23为重组病毒接种ST细胞36h；

图24为重组病毒接种ST细胞48h；

图25为重组病毒接种PK-15细胞12h；

图26为重组病毒接种PK-15细胞24h；

图27为重组病毒接种PK-15细胞36h；

图28为重组病毒接种PK-15细胞48h；

图29为重组病毒接种IBRS-2细胞12h；

图30为重组病毒接种IBRS-2细胞24h；

图31为重组病毒接种IBRS-2细胞36h；

图32为重组病毒接种IBRS-2细胞48h；

图33为重组病毒在不同细胞上的生长曲线；

图34为重组病毒在ST细胞传代15次后；

图35为重组病毒在ST细胞传代15次后VP2基因的PCR,M.Trans2KPlusIIDNAMarker；1.纯化的重组病毒；2.重组病毒传代15次后；3.阴性对照；

图36为重组病毒在ST细胞传代15次后猪IL-18基因的PCR,M.Trans2KPlusIIDNAMarker；1.纯化的重组病毒；2.重组病毒传代15次后；3.阴性对照；

图37为PPV抗体检测结果；

图38为淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+测定结果；

图39为淋巴细胞CD4+:CD8+测定结果。

具体实施方式

一种表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒毒株，分类命名：表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒PRV-PPV-IL18PGVP218，拉丁文学名：Herpesviridae。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2013年11月18日，保藏编号CCTCCNO：V201347。

一、表达PPV河南株VP2基因和猪IL-18基因重组PRV转移质粒构建

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒、菌株与病毒

通用转移载体pG含PRVgG启动子及插入的hCMV基因、SV40Poly(A)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因，购自河南省动物性食品安全重点实验室；含猪IL-18基因的重组质粒pIRES-IL18购自河南省动物性食品安全重点实验室；E.coliDH5αCompetentCells、18-TVector(LotCK6101B)购自TaKaRa公司；PPVHP/104株(CCTCCV201313，中国专利201310235390.6一种猪细小病毒毒株)。

1.1.2工具酶和主要试剂

PremixExTaq^TMHotStarVersionDNA聚合酶、pMD18-TVector、SOCMedium(LotA261A)、限制性内切酶BglⅡ、QuickCutBamHI、QuickCutHindIII、蛋白酶K、DNAMarkerDL2000、DNAMarkerλ-EcoT14I，DNAMarkerTans15K、IPTG、X-gal等购自宝生物工程(大连)有限公司；T₄DNA连接酶和碱性磷酸酶(CIAP)购自Promega公司；十二烷基硫酸钠(SDS)购自上海生物工程有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司；质粒小量提取试剂盒购自北京博大泰克基因技术有限公司；EDTA、饱和酚、氯仿、异戊醇购自上海生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成

根据GenBank中发表的细小病毒VP2基因阅读框架，利用引物设计软件Premier5.0设计1对引物(不包含VP2基因开始那一段高GC含量的片段，但仍具有较好的免疫原性)。上、下游引物的5’端包含有BamHI酶切位点(下划线部分)，扩增目的基因片段长度约1.6kb。引物由上海生物工程有限公司合成。

上游引物序列：5’-ACCGGATCCATGGGGGGGGTTGGTGTGTCTAC-3’(32bp)，

下游引物序列：5’-ATCGGATCCCTAGTATAATTTTCTTGG-3’(27bp)；

根据重组质粒pIRES-IL18中IL18基因片段设计1对引物，上、下游引物的5’包含有BglⅡ酶切位点(下划线部分)，扩增目的基因片段长度约0.6kb。引物由上海生物工程有限公司合成。

上游引物序列：5’-GAAGATCTATGACGTATCCAAGG-3’，

下游引物序列：5’-GCTCTAGACATTCATTAAGGGTTA-3’。

1.2.2重组质粒pG18、pG18-VP2的构建方案

将含猪IL-18基因的质粒pIRES-IL18与PRV转移载体质粒pG分别进行BglⅡ酶切，将pG质粒酶切后用碱性磷酸酶(CIAP)进行去磷酸化处理防止载体自连。之后分别进行胶回收目的片段，利用T₄DNA连接酶进行连接，从而构建重组质粒pG18(图1)。

提取PPVHP/104株DNA，以其为模板，利用PPVVP2基因引物扩增VP2基因，经胶回收目的片断与pMD18-T载体进行连接，构建重组质粒pMD-VP2。将重组质粒pMD-VP2用QuickCutBamHI进行酶切处理，胶回收得到VP2基因片段。将含有IL-18的重组质粒pG18同样用QuickCutBamHI进行酶切处理后胶回收目的片段，再用CIAP进行去磷酸化处理后与VP2基因片段进行连接，得到重组质粒pG18-VP2(图2)。

1.2.3PPVVP2的扩增、克隆及测序

取分离保存的PPVHP/104株细胞培养液1mL，经反复冻融3次后，8000rpm离心2min。取上清400μL，加入350μL预热好的SDS，再加入蛋白酶K(终浓度为200μg/mL)，55℃水浴酶切1h～3h，按常规方法提取猪细小病毒DNA。以病毒DNA为模板，利用VP2基因特异引物，进行PCR扩增反应，扩增体系为：PremixEXTaq^TM酶25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板2μL，补ddH₂O至50μL。混匀后于PCR仪上进行扩增，另设无DNA对照。扩增程序为：95℃预变性5min；然后进入94℃25s，55℃45s，72℃2.5min，进行30个循环；最后72℃延伸10min后置16℃保存。反应结束后取5μLPCR产物，以1％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

取经胶回收纯化的VP2基因目的片段，与18-TVector连接，构建重组质粒pMD-VP2。转化到DH5α感受态细胞中，提取重组质粒，进行PCR鉴定及酶切鉴定。选择质粒PCR和酶切鉴定均为阳性的重组质粒送北京华大基因科技股份有限公司进行测序。将测定的序列在NCBI中进行Blast比对，确定其为VP2的序列，证实重组质粒pMD18-VP2构建成功。

1.2.4pG18转移质粒的构建

1.2.4.1pG质粒的酶切和去磷酸化

将重组质粒pG用BglⅡ进行酶切，用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理，体系为10×buffer5μL，酶切后的pG溶液30μL，CIAP1μL，ddH₂O14μL，共50μL。振荡均匀混合，37℃水浴中作用30min后置4℃冰箱过夜，之后用凝胶回收试剂盒对产物进行回收。

1.2.4.2质粒pIRES-IL18的酶切与连接

以pIRES-IL18为模板进行PCR扩增，PCR体系为PremixTaq^TM酶25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板2μL，补ddH₂O至50μL。反应条件:94℃5min；95℃1min；55℃1min；72℃1min共进行30个循环；72℃延伸10min。扩增产物用0.8％琼脂糖进行电泳检测。

回收纯化PCR产物用BglⅡ进行酶切，体系为BglⅡ2μL，10×KBuffer1μL，质粒5μL，ddH₂O2μL，共10μL。混合物瞬时离心后置37℃水浴酶切3h，回收纯化产物与BglⅡ酶切并用CIAP处理的pG回收产物进行连接，构建重组质粒pG18。连接体系为T₄DNA连接酶1μL，Buffer1μL，猪IL-18基因片段6μL，pG载体2μL，共10μL。在16℃连接槽中过夜，转化到DH5α感受态细胞中。提取重组质粒，进行PCR和BglⅡ酶切鉴定，并鉴定其连接方向是否正确。将PCR和酶切鉴定鉴定为阳性并且连接方向正确的重组质粒送去测序。

1.2.5pG18-VP2转移质粒的构建

1.2.5.1VP2片段酶切回收

取50μL重组质粒pMD-VP2于200μL反应管中，加入10×buffer(K)5μL、QuickCutBamHI10μL，加灭菌水至100μL，置30℃水浴中消化30min。电泳切下所需的目的条带，参照V-geneDNA凝胶回收试剂盒说明书，纯化回收特异的DNA条带，电泳观察回收情况。

1.2.5.2pG18质粒的酶切和去磷酸化

将重组质粒pG18用QuickCutBamHI进行酶切，将酶切后的产物用CIAP进行去磷酸化处理，方法体系同1.2.4.1，37℃水浴中作用30min后置4℃冰箱过夜，之后用凝胶回收试剂盒对产物进行回收。

1.2.5.3载体pG18与VP2基因片段的连接

将BamHI酶切并用CIAP处理的pG18回收产物与BamHI酶切回收的VP2基因片段以1:3比例进行连接，在16℃连接槽中过夜，转化入DH5α感受态细胞中，提取重组质粒，进行PCR和BamHI酶切鉴定，并用HindIII酶切鉴定其连接方向是否正确。将连接正确的重组质粒送去测序，将经测序与VP2基因核苷酸序列相同，且连接方向正确的阳性质粒命名为pG18-VP2。

2结果与分析

2.1VP2的扩增、克隆及测序结果

提取PPV细胞培养液DNA，然后利用PCR技术进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳初步检测表明，获得了1条约1600bp的特异带，与预期大小相一致。将回收的PCR产物插入到18-T载体质粒的外源基因插入位点，经PCR扩增、酶切分析及序列测定表明，克隆到的PPVVP2基因序列为1635bp，与预期结果吻合。将该区域序列在NCBI进行比对，结果显示与GenBank登录号为L23427.1、M38367.1、M3278.1等PPVVP2基因100％相同，证明该序列为PPVVP2基因序列，pMD-VP2质粒构建成功。

2.2重组质粒pG18的PCR及酶切鉴定

用合成的猪IL-18特异性引物对重组质粒pG18进行PCR扩增，电泳检测结果显示在约0.6kb处有一清晰条带，与预期结果相符。重组质粒pG18用BglⅡ酶切后，出现了2条带，其中1条为插入的IL-18目的条带，大小约为0.6kb，另1条为pG载体条带，位置约为7.1kb，与预期结果相符(图3)。

将重组质粒送上海生工进行测序鉴定，测序结果证明连接方向正确，用DNAstarMegAlign软件与实验室登录的猪IL-18基因序列进行比对(序列号为：DQ499825)，完全符合(图4)，说明重组质粒pG18构建结果正确。

2.3重组质粒pG18-VP2的PCR、酶切及测序鉴定

用合成的VP2特异性引物对重组质粒pG18-VP2进行PCR扩增，电泳检测结果显示在约1.6kb处有一清晰条带，为VP2基因特异条带，与预期结果相符。重组质粒pG18-VP2用BamHI酶切后，出现了2条带，其中1条为插入的VP2基因目的条带，大小约为1.6kb，另1条为pG18载体条带，位置约为7.8kb，与预期结果相符(图5)。

因为pG18载体和VP2均采用了BamHI单酶切，VP2基因正向、反向均能连接到pG18载体上。为了鉴定VP2基因连接方向是否正确，将重组质粒pG18-VP2再用HindIII进行酶切。如果连接方向正确将会出现位置大小约为0.5kb、2.3kb和6.5kb的3个条带(图6)，与预期结果相符。如果连接方向相反，将会出现7kb、0.1kb和2.1kp的条带。

根据pG18载体BamHI酶切插入位点上游部分序列设计引物，将重组质粒pG18-VP2送华大基因公司进行测序，所测序列与2.1中VP2片段基因序列进行比对(图7)，同源性为100％，并且连接方向正确，表明重组质粒pG18-VP2构建成功。

3结论与讨论

本发明将猪IL-18基因插入到已构建的伪狂犬病毒转移载体pG中，获得重组转移质粒pG18，又将PPVVP2基因插入到重组质粒pG18中，成功构建了含猪IL-18基因和PPVVP2基因的重组伪狂犬病毒载体质粒，为研究能表达PPVVP2蛋白并以IL-18作为免疫佐剂的重组伪狂犬病毒打下了基础。

pG载体结构见图8，全长约7100bp，由本实验室朱前磊、郑兰兰等以PUC19为载体构建，带有扩增的PRV部分gG基因、pK基因和gD基因作为两端同源侧翼(上游侧翼长约800bp，下游侧翼长约1700bp)，可以和PRV基因组进行同源重组，PRV的pK基因长1005bp，gG基因长1500bp，gD基因长1215bp，保证了同源重组的进行。pG质粒携带有EGFP筛选标记，可用于重组病毒的纯化，有gG晚期启动子和hCMV启动子以保证外源基因和EGFP等的表达。载体中间有多克隆位点可供插入外源基因，经改造留下4个酶切位点：HindIII、BamHI、BglII和XbaI。本发明将VP2基因插入到gG晚期启动子后面的BamHI酶切位点，且之后有SV40polyA以保证其表达；将IL-18基因插入到CMV启动子后面的BglII酶切位点，之后有EGFP和SV40polyA以保证IL-18和EGFP的表达，从而成功构建了能够表达PPVVP2蛋白和猪IL-18的转移质粒pG18-VP2，为后面重组病毒的拯救准备了条件。

本发明采用单酶切方式给试验操作造成了不便，主要是因为构建的载体上剩余的酶切位点不多，且一些酶切位点在目的基因片段上也存在，或者其他酶切位点不常见，限制性内切酶价格昂贵所致双酶切较难选择。试验中发现单酶切后的去磷酸化作用大大降低了连接效率。尤其是从挑斑的结果来看，方向连接正确的质粒远少于连接反向的质粒。其具体原因有待于进一步分析。

猪细小病毒VP2蛋白是主要抗原决定区，可中和抗体，在预防和诊断猪细小病毒感染中起着关键的作用，VP2基因是研制新型PPV疫苗的首选基因，因此以VP2基因为目的基因已成为目前研制PPV新型疫苗的热点之一。VP2基因全长为1740bp，实验扩增插入的VP2片段长度为1635bp，缺少VP2基因前面105bp，由于C端是完整的，N端位于二级结构内部，能够保持该衣壳蛋白二级结构，而不影响其免疫原性。

伪狂犬病病毒基因组庞大(约143kb)，便于构建重组病毒疫苗载体，可容纳多个外源基因，生产工艺简单、成本低，免疫期长，安全性好，PRV不感染人，已成功地用于多种病原保护性抗原的表达。为了增强疫苗的免疫保护效果，引入细胞因子作分子免疫佐剂是目前疫苗研究热点之一。IL-18可以大量诱导INF-γ的分泌，促进T和B淋巴细胞的分化，增强NK细胞的活性等，能够参与启动细胞免疫反应^[11]。IL-18作为天然的免疫调节剂和疫苗免疫增强剂，是一种新型免疫调节剂。本研究将PPVVP2基因和猪IL-18基因分别插入到PRV转移质粒pG中，经转染ST细胞成功获得重组病毒rPRV-VP2-18，是猪IL-18在PPVVP2重组PRV方面的初步尝试，为下一步研究能够同时预防PPV和PRV的活载体疫苗奠定了基础。

PRV作为重组病毒疫苗载体表达外源基因时，非必需基因的克隆和具备功能强大的启动子来启动外源基因这两个条件必须具备。PRVgG基因是PRV的非必需基因，启动子强大，属于β级启动子，可用于外源基因的表达。本研究所用的pG质粒基因序列己被测定，酶切位点己经十分清楚，非常容易在多克隆位点内进行外源基因的插入与表达鉴定。因此，本研究成功构建了重组质粒pG18-VP2。

二、重组PRV的拯救与纯化

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒与细胞

PRV弱毒株购自武汉科前生物制品公司；猪睾丸细胞(ST细胞)购自中国兽医药品监察所。

1.1.2主要试剂

DNAMarkerλ-EcoT14I，DNAMarkerTans15K，DNAMarkerDL2000，DNA聚合酶(PremixEXTaq^TMHotStartVersion)等购自TaKaRa公司；2000Reagent(Invitrogen)；UltrapureRNAKit超纯RNA提取试剂盒购自CWBIO公司；FastQuantRTkit(WithgDNase)购自TIANGEN公司。DMEM细胞培养液购自HyClone公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自BIOMIGA公司；PPV阳性血清和猪IL-18阳性血清购自河南省动物性食品安全重点实验室，HRP标记的羊抗猪IgG二抗均购买于Sigma；四季青胎牛血清购自郑州赛斯生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1PRV弱毒株基因组DNA的提取

蛋白酶K法提取PRV弱毒株基因组DNA用于下一步的同源重组。取PRV弱毒株细胞培养液1mL，按照试验一中1.2.3所述的方法进行DNA的提取，得到PRV弱毒株基因组DNA，通过超微量蛋白核酸分析仪检测，使其DNA浓度达到1μg/μL。

1.2.2pG18-VP2无内毒素重组质粒的提取

参照无内毒素质粒提取试剂盒(BIOMIGA)使用说明进行重组质粒的提取。

1.2.3脂质体介导的pG18-VP2与PRV共转染

参照脂质体Lipofectamine^TM2000试剂盒转染说明书进行共转染，具体操作过程如下：

(1)取2支1.5mL的Eppendorf离心管，第1支离心管内加入4μL质粒pG18-VP2(浓度为1μg/μL)和10μLPRV弱毒株基因组DNA(浓度为1μg/μL)，用OPTI-MEM无血清培养液补至250μL，轻轻混匀；同时设立无PRV弱毒株DNA的pG18-VP2重组质粒做为转染对照。

(2)在第2支离心管中依次加入240μLOPTI-MEM无血清培养液和10μL脂质体并用手轻弹混匀，并注意静置时间不宜超过5min；

(3)将第2支离心管内液体逐滴加入到第1支离心管中，静置25min，中间轻弹以混合均匀；

(4)弃去长至90％单层ST细胞的六孔板内的培养液，用PBS重复洗涤3次，并加入2mLOPTI-MEM无血清培养液；

(5)将第1支离心管内的液体轻轻吹打，以使管内沉淀重悬，将悬液逐滴接种到第(4)步准备的含有单层ST细胞的六孔板内，置37℃、5％CO₂培养箱内培养4-6h，之后吸弃各孔内培养液，每孔加入1.5mL细胞维持液，放入37℃、5％CO₂培养箱内培养，期间在荧光显微镜下观察细胞病变与荧光情况，36h后细胞出现约80％病变，将病变细胞反复冻融3次，收获重组病毒液。

1.2.4重组病毒的蚀斑筛选与纯化

将收获的重组病毒液8000r/min4℃离心10min，取上清按10倍系列稀释，接种于ST单层细胞的96孔板中，置于37℃细胞培养箱内吸附1.5h，吸弃孔内培养液，用PBS液清洗3次，加入维持液，放入细胞培养箱中培养，在荧光显微镜下找只含1个蚀斑且发绿色荧光的最大稀释孔，吸取将该孔内的细胞及培养液，离心取上清，加入到初长满ST细胞的35mm细胞培养皿(Costar，美国)中培养增殖，提取病毒DNA进行PCR鉴定；收获PCR鉴定结果正确的病毒感染细胞培养液，离心取上清，再进行10倍系列稀释，接种至长成单层ST细胞的96孔板。荧光显微镜下挑取最大稀释度的单个且发荧光的蚀斑，吸取该孔细胞及培养液，反复冻融3次后，在35mm细胞培养皿中增殖，提取DNA，结合PCR检测扩增VP2基因和猪IL-18基因，鉴定正确，进行新一轮的蚀斑纯化，直至单层ST出现的所有蚀斑均显示绿色荧光，VP2基因和IL-18基因PCR鉴定均正确，纯化结束。将纯化好的重组病毒在细胞培养瓶中扩大增殖培养，收毒保存，将重组病毒命名为PGVP218(PRV-PPV-IL18)。

1.2.5重组病毒PGVP218的鉴定

1.2.5.1重组病毒RT-PCR鉴定

参照UltrapureRNAKit超纯RNA提取试剂盒提取纯化好的重组病毒细胞培养液的总RNA，再反转录为cDNA。利用PPVVP2基因特异引物和猪IL-18特异引物，进行PCR反应，扩增VP2基因与猪IL-18基因在ST细胞中的mRNA转录。

反转录体系和过程如下：1μgRNA，1μLOligo(dT)12-18Primer，1μLdNTP(10mMeach)，补RnasefreeddH₂O至10μL。65℃5min后迅速冰浴2min，加入4μL5×primescriptbuffer，0.5μLRnaseInhibitor(40U/μL)，0.5μLPrimeScriptRerverseTranscriptase，5μLRnasefreeddH₂O。42℃，60min，70℃15min，冰浴冷却，-80℃保存。

VP2基因和猪IL-18基因的扩增按照试验一中所述的扩增体系和反应条件进行。

1.2.5.2重组病毒SDS-PAGE电泳检测

待ST细胞初长满单层后换用无血清DMEM培养基增殖重组病毒，出现病变后收毒，反复冻融3次。取35μL离心后的病毒培养液上清，加入5μLDTT和10μL10×buffer，沸水水浴加热10min，充分变性蛋白。处理好样品，冷却到室温，进行SDS-PAGE电泳。具体操作步骤如下：

(1)按表1配制的12％的SDS丙烯酰胺分离胶约5mL，迅速加在两块1.0mm厚玻板的间隙中，在分离胶上加入一层异丁醇；

表1SDS-PAGE配方表

试剂	12％分离胶(5mL体系)	5％浓缩胶(3mL体系)
			H₂O	1.6mL	2.1mL
30％Acrylamide	2.0mL	0.5mL
			1.5M Tris-HCl(pH 8.8)	1.3mL	0.38mL
10％SDS	0.05mL	0.03mL
			10％过硫酸铵	0.05mL	0.03mL
TEMED	0.002mL	0.003mL

(2)等待分离胶聚合凝固后，倾出上面的异丁醇，用去ddH₂O将凝胶顶部冲洗数次，用纸巾吸干净残留的液体；

(3)按表1配制5％浓缩胶3mL，加在分离胶上，立即插入梳子；待浓缩胶全部聚合后移出梳子；

(4)固定电泳装置，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液(pH8.3)，每孔上20μL样品，开始电压50-80V，待溴酚蓝跑到分离胶时，将电压调到120V～150V，等溴酚蓝跑到分离胶底部时，关闭电泳仪取出聚丙烯酰胺凝胶，切掉浓缩胶部分；

(5)将分离胶放在考马斯亮蓝染料中震荡染色4h以上，之后取出放入脱色液中震荡脱色数次，每次

30～60min。脱色完全后，取出观察分析。

1.2.5.3重组病毒Westernblot鉴定

12％SDS-PAGE电泳后，将SDS-PAGE电泳得到的凝胶电转印至硝酸纤维素膜，分别对PPVVP2蛋白和IL-18进行Westernblot鉴定，具体操作步骤如下：

(1)电转印：用ddH₂O将SDS-PAGE电泳凝胶清洗一下，然后平放于处理好的硝酸纤维素滤膜上，排除气泡。放入转移槽，接通电源，将电泳仪调至150-200mA，冰浴下进行电转移1～2h。结束后，将蛋白膜放入Westernblot洗涤液中漂洗1-2min。

(2)染色：把膜移至丽春红染色液中，染色至膜上出现蛋白带，用ddH₂O漂洗数次。

(3)封闭：甲醇固定后把硝酸纤维素滤膜放入Westernblot封闭液(含2％BSA的TBST)，于摇床上室温温育0.5～1h。

(4)PBS-T洗涤后加入用TBST以1∶100稀释的一抗，37℃于摇床上温育1h。用Westernblot洗涤液洗3遍，每次5～10min，加入用TBST以1∶2500稀释的HRP标记的羊抗猪IgG二抗，37℃于摇床上温育0.5～1h。视染色程度用Western洗涤液洗涤数次，每次5～10min。

(5)显色：把硝酸纤维素滤膜放入10mL底物液中，显色1～15min，一旦出现蛋白带，立即用终止液终止反应，放入凝胶成像系统拍照观察。

2结果与分析

2.1重组病毒的拯救

重组质粒pG18-VP2在脂质体的介导作用下与PRV弱毒株DNA共同转染ST细胞，在ST细胞内可发生同源重组。pG18-VP2中PRV同源臂中间的基因与PRV弱毒株基因组中相应部分发生交换，而得到重组病毒，由于重组质粒带有EGFP标签基因，阳性重组病毒由于表达EGFP，在荧光显微镜蓝光(波长范围为420-490nm)下观察，可看到绿色荧光，随后出现细胞病变，形成蚀斑。转染结果表明，pG18-VP2质粒与PRV弱毒株疫苗株DNA共转染12h后，在紫外线激发下可以观察到大量ST细胞发出绿色荧光；之后约24h出现细胞病变，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑(见图9)。

2.2重组病毒的纯化

结合PCR检测，将重组病毒液进行反复蚀斑筛选，进一步进行纯化，每一次挑斑都选择最大稀释度下的单个绿色蚀斑，每一轮PCR检测结果均为阳性，共进行5轮蚀斑纯化。结果重组病毒感染的所有细胞在紫外线激发下均能发出绿色荧光，荧光显微镜下看到所有形成的蚀斑均发出绿色荧光，成功获得纯化的重组病毒PGVP218(见图10)。

2.3重组病毒的PCR与RT-PCR鉴定

经过5轮蚀斑纯化，在荧光显微镜下可看到重组病毒感染所形成的蚀斑均可发出绿色荧光。在倒置显微镜普通光下随机挑取4个蚀斑，分别进行增殖培养，提取病毒培养液DNA，利用PCR检测方法扩增PPVVP2基因与IL18基因；分别提取总RNA，再反转录为cDNA，利用PCR检测VP2基因与IL-18基因。

从图11PPVVP2基因的PCR和RT-PCR鉴定结果，和图12猪IL-18基因的PCR和RT-PCR鉴定结果可以看出，PCR结果与RT-PCR结果一致，随机挑选的每个蚀斑在约1.6kb处均有VP2基因目的条带，在约560bp处均有IL-18目的条带，表明VP2基因和IL-18基因重组进了重组病毒，且能够在ST细胞内进行正确转录，在转录水平证明重组病毒构建正确。

2.4重组病毒的SDS-PAGE电泳结果

将初长满单层的ST细胞用PBS清洗三次后，然后接种重组病毒PGVP218，加入无血清DMEM培养基进行培养，避免血清蛋白对SDS-PAGE电泳结果的影响。待细胞发生病变后，收获重组病毒。将收获的细胞培养液进行离心，取上清50μL进行SDS-PAGE电泳样品处理，12％SDS-PAGE进行电泳检测。

结果表明，重组病毒PGVP218和rPRV-VP2在大小约为58kDa处均出现1条蛋白带，而PRV弱毒株无此条带；PGVP218重组病毒在24kDa处出现另外一条蛋白带(图13)，与预期的分子量相当。表明重组病毒能正确翻译和表达PPVVP2蛋白和IL-18。

2.5重组病毒Westernblot鉴定

12％SDS-PAGE电泳后，电转印至硝酸纤维素膜，分别对PPVVP2蛋白和猪IL-18进行Westernblot检测，结果表明，重组病毒PGVP218在大小约为58kDa处出现1条特异性抗原-抗体结合带，与VP2蛋白的分子量相符合；在大小约24kDa处出现另外1条特异性抗原-抗体结合带(图14)，与猪IL-18大小相符。说明表达的重组蛋白可被PPV阳性血清和猪IL-18阳性血清所识别，具有良好的免疫反应性。

3结论与讨论

本发明将重组质粒pG18-VP2与PRV弱毒株基因组DNA共转染ST细胞，通过同源重组成功获得了能正确表达PPVVP2蛋白和IL-18的重组伪狂犬病毒PGVP218，为研究能同时预防猪伪狂犬病毒及猪细小病毒感染，并有IL-18细胞因子作为新型免疫佐剂的重组活载体疫苗打下了基础。

重组病毒的纯化是制备重组疫苗的关键步骤之一，纯化程度决定了疫苗的质量，纯化的效率影响着试验的进程。本发明采用有限稀释法在96孔板上筛选，虽然每孔的面积并不小，但对每孔的选择可控，在荧光显微镜下能够准确观察和选择，避免了用低熔点营养琼脂糖法进行空斑筛选时的铺胶、对空斑的标记及标记的准确性不高等缺点，简化了试验操作，提高了纯化效率。

试验中采用伪狂犬三基因缺失疫苗株弱毒株作为同源重组的亲本株，因为该疫苗的种毒为我国地方流行毒株，免疫原性强；该毒株定向缺失了伪狂犬主要毒力基因TK，因此不存在毒力返强，对种猪和仔猪均是安全、有效的。该毒株定向缺失了gG基因，强化猪细小病毒主要免疫蛋白VP2和免疫趋化因子双效作用，增强体液及非特异性免疫反应。伪狂犬病毒三基因缺失疫苗株弱毒株可激发机体产生两种干扰素α和β及其他细胞免疫因子，不仅对猪伪狂犬病毒病具有很好的特异性免疫，而且可针对其它病毒的感染也具有很好的非特异性免疫，可以显著提高猪群对疫病的抵抗力；同时自然缺失了gE基因，可用于伪狂犬病的免疫与自染感染的鉴别诊断，为猪群伪狂犬病的根除与净化提供技术依据。

白细胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)又称为干扰素γ诱生因子。IL-18主要由单核-巨噬细胞系分泌属白细胞介素-1家族，是一种诱导γ干扰素合成的中介分子。能刺激T细胞增殖，增强自然杀伤细胞活性，参与细胞因子的生成等，与白细胞介素-12产生协同作用。白介素-18是一具有多种功能的细胞因子，在抗感染、抗肿瘤及免疫调节中具有重要作用。IL-18是一种作用强大的前炎症细胞因子，最具特征的功能是调节细胞增生，分化及细胞外基质生成，故IL-18在糖尿病肾病(DN)的发生、发展中起重要作用。本发明引入猪IL-18作为细胞因子免疫佐剂以其考查其在重组病毒中的佐剂效应。

三、重组病毒PGVP218的细胞培养特性研究

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1细胞和毒株：ST细胞(猪睾丸细胞系)、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)、PK-15细胞(猪肾细胞系)、IBRS-2细胞(猪肾传代细胞)购自中国兽医药品监察所。

1.1.2主要分子生物学试剂

PremixExTaqDNA聚合酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；Trans2KPlusIIDNAMarker购自北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司；DNA小量制备试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；DMEM培养液、胎牛血清购自美国Hyclone公司。

1.2试验方法

1.2.1重组病毒在不同细胞上的培养特性

待ST、Vero、IBRS-2、PK-15细胞90％长成单层后，将重组病毒冻融3次后，按1％的接毒量分别接种4种细胞，分别吸附作用1.5h后，换成2％的细胞维持液放至37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续培养，在接毒后8h、12h、24h、36h、48h用倒置荧光显微镜观察细胞形态并于荧光显微镜下观察病毒感染细胞后的荧光情况，并在接毒后每隔12h取一次细胞上清液，测定TCID₅₀，测定重组病毒在不同细胞上的生长曲线。

1.2.2遗传稳定性

将重组病毒在ST细胞中连续传代15次后，观察其在ST细胞中绿色荧光表达情况，待细胞出现80％病变时收毒，反复冻融3次后，提取重组病毒DNA，分别用试验一中PPVVP2基因、IL-18基因特异引物、PCR扩增体系及扩增条件进行PCR扩增，并对PCR产物进行基因测序，鉴定VP2基因和IL-18基因在重组病毒中的遗传稳定性。

1.2.3重组病毒的理化特性研究

将200μL重组病毒液分别用5％石炭酸、氯仿、1％胰蛋白酶、2％NaOH处理、平摊到无菌培养皿中用紫外线照射，以不做任何处理作为阳性对照，各取100μL接种到长满ST细胞的细胞培养瓶中，并逐日观察细胞病变情况。

1.2.4重组病毒在多种细胞上毒价的测定

用ST细胞、IBRS-2细胞、PK细胞和Vero细胞增殖的重组病毒进行TCID₅₀测定，将每种细胞接种到96孔微量培养板中，待细胞长至90％单层时进行试验。方法如下：将重组病毒用DMEM培养液在无菌Ep管中作l0倍梯度稀释，即从10^-1-10^-10。将各个稀释梯度的病毒接种到96孔微量培养板，每个稀释度作8孔重复，每孔接种100μL，病毒吸附2h后，每孔再加入100μLDMEM培养液。同时将两纵排孔做为正常细胞对照，置细胞培养箱中培养，逐日观察并且记录结果，数据按照Reed-Muench两氏法进行TCID₅₀效价评定。

1.2.5红细胞凝集试验

采集豚鼠血2mL，制备1％的红细胞悬液，在96孔微量反应板中每孔加50μL生理盐水，将重组病毒在96孔微量反应板上倍比稀释至11孔，第12孔作对照，然后每孔加入50μL1％的新鲜制备的豚鼠红细胞悬液，以PPV全病毒作阳性对照。

2结果与分析

2.1重组病毒在不同细胞上的培养特性

2.1.1重组病毒在Vero细胞上的培养特性

Vero细胞系(非洲绿猴肾细胞)是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的，该细胞系由于是连续的非整倍体细胞，可以经过许多分裂周期而不衰老。与其它普通哺乳动物细胞不同，Vero细胞有干扰素分泌缺陷的特点，故当Vero细胞被病毒感染时，它不能分泌干扰素，但Vero细胞仍然具有α/β-干扰素的受体，所以Vero细胞对于其它来源的干扰素仍有正常的反应。该细胞易于培养，适合大规模生产，WTO推荐为生产人用疫苗的理想细胞基质。

重组病毒接种单层Vero细胞8h表现为细胞内颗粒增多，有病变迹象出现，在荧光显微镜下观测不到荧光(见图15)。

感染12h可观察到出现病变，蚀斑开始出现，在荧光显微镜下几乎看不到荧光。表现为细胞轮廓模糊、圆缩、变亮，但是倒置荧光显微镜下并不能观察到绿色荧光(见图16)。感染24h表现为细胞部分融合、变圆并呈多形性，倒置荧光显微镜下能观察到少量绿色荧光(见图17)。重组病毒感染Vero细胞36h，细胞表现为大部分融合，细胞病变明显，出现多量PRV特征性空泡病变，视野内呈现拉网状，此时用倒置荧光显微镜能够观察到大量的绿色荧光(见图18)。病毒感染48h后，Vero单层细胞剩余岛屿状，并表现为块状脱落，在荧光显微镜下能观察到团块状绿色荧光(见图19)。

2.1.2重组病毒在ST细胞上的培养特性

ST细胞为猪睾丸细胞，能够贴壁生长，成纤维细胞样，该细胞为二倍体，对猪细小病毒、肠道病毒敏感，传代好，培养周期短。将重组病毒接种到长满单层的ST细胞，8h后观察无明显病变，倒置荧光显微镜下不能观察到绿色荧光(见图20)。

病毒感染ST细胞12h后能观察到细胞圆缩，有细胞病变迹象，在倒置荧光显微镜下能观察到轻微的绿色荧光(见图21)。当病毒感染ST细胞24h后，可见ST细胞明显圆缩，病毒蚀斑开始出现，在倒置荧光显微镜视野内能观察到大量绿色荧光(见图22)。重组病毒感染ST细胞36h后，病毒蚀斑明显扩大并出现大量细胞脱落，此时倒置荧光显微镜内能观察到许多漂浮状的绿色荧光(见图23)。重组病毒感染ST细胞48h后，ST细胞脱落达到85％左右，在荧光显微镜下可观察能够晃动的绿色荧光(见图24)。

2.1.3重组病毒在PK-15细胞上的培养特性

PK-15细胞为猪肾上皮细胞，来源于猪肾，建系于1955(Stice,E)，是PK-1a细胞的克隆系，PK细胞形态上皮细胞样，能够贴壁生长，培养条件通常为EMEM+10％Hyclone灭活血清。该细胞系可用于多种病毒的增殖及特性研究，对多种病毒比较敏感，如猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)等，可应用于猪圆环病毒疫苗、猪细小病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗等的制备。重组病毒接种单层PK-15细胞8h后，细胞无明显病变发生，且在倒置荧光显微镜下不能观察到绿色荧光；接种12h后仍无明显病变，荧光显微镜下看不到绿色荧光(见图25)。病毒感染24h后，PK-15细胞圆缩、变亮，细胞间隙变大，在荧光显微镜下能观察到明显大量绿色荧光(见图26)。病毒感染36h后，PK-15细胞大量变形、细胞明显融合并出现PRV特征性空泡病变，细胞面拉网现象明显，倒置荧光显微镜下能观察到大量绿色荧光(见图27)。重组病毒感染PK-15细胞48h后，约80％的细胞发生脱落，观察到的绿色荧光减少(见图28)。

2.1.4重组病毒在IBRS-2细胞上的培养特性

猪肾细胞系IBRS-2来源于猪肾，为贴壁生长的上皮样细胞。IBRS-2细胞建系于1964年(CastroMde)，该细胞可用于很多猪病毒增殖，包括猪的嵌杯状病毒(Porcinecaliciviruses)、猪细小病毒(Porcineparvovirus)、水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus)、非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth-disease-virus)等。该细胞对胰酶很敏感，能在较短的时间内消化下来，但该细胞容易传代，很容易成活，即使有时消化有点过头仍然能活过来。该细胞另外一个特点就是生长相对PK-15较慢，一般按1：1传代后要2天才能长满。在传代的过程中发现加入林可霉素后有利于细胞的生长。

重组病毒接种IBRS-2单层细胞8h后，观察不到病变和绿色荧光；接种IBRS-2细胞12h后，未出现明显病变，细胞呈多形性，在荧光显微镜下并不能观察到绿色荧光(见图29)。重组病毒感染IBRS-2细胞24h后，细胞肿胀、变亮、变圆，细胞开始融合，能观察到大量绿色荧光(见图30)。重组病毒感染36h后，出现PRV特征空泡病变，有细胞脱落现象，倒置荧光显微镜下能观察到大量绿色荧光(见图31)。病毒感染48h后，荧光显微镜下能观察到少量可晃动的绿色荧光，细胞基本脱落完全(见图32)。

2.2重组病毒在不同细胞的生长曲线

将重组病毒接种不同细胞的第8h、12h、24h、36h、48h、60h分别取细胞上清，然后在各自细胞上测定病毒TCID₅₀绘制一步生长曲线(见图33)。结果表明，重组病毒在ST细胞和Vero细胞上的生长具有较短的潜伏期，而在PK-15细胞和IBRS-2细胞上具有较长的潜伏期。从平稳期来看，在IBRS-2细胞上具有较高的TCID₅₀具有较高的裂解量。

2.3遗传稳定性评价

将获得重组病毒PGVP218在ST细胞中盲传15代后，感染初长满单层的ST细胞12h即可观察到明亮的绿色荧光，并可持续约72h至细胞病变脱落(见图34)，说明EGFP在重组病毒中能够稳定表达。

提取病毒培养液上清DNA进行VP2基因的PCR扩增鉴定，结果在1.6kb处出现VP2目的基因片段，说明VP2基因在传代后的重组病毒中依然稳定表达(见图35)。用IL-18特异引物进行PCR，结果能够扩增出猪IL-18约570kb的特异条带(见图36)，纯化的重组病毒传代15次前后IL-18基因PCR扩增结果无明显差异。

将盲传至15代的重组病毒和PRV弱毒株分别感染ST细胞，在ST细胞上产生的增殖速度和在普通显微镜下观察到的细胞病变没有明显差别。

对PCR产物送至华大基因公司分别进行测序，测序结果与之前测序的VP2基因序列和猪IL-18基因序列完全一致，表明携带了VP2基因和IL-18基因的重组病毒PGVP218遗传稳定，外源基因的插入不影响PRV的增殖特性。

2.4重组病毒的理化特性研究

分别经氯仿、胰蛋白酶处理、5％石炭酸处理、紫外线照射、2％氢氧化钠处理重组病毒PGVP218，均能使病毒失去活性，具体所需处理时间见表2，与PRV弱毒株相比所需时间相同，失活后的重组病毒接种ST细胞后不再引起任何细胞病变，而未经处理的重组病毒接种ST细胞后，12h即能观察到绿色荧光并在24h左右出现PRV特征性空泡病变。

表2重组病毒处理方式与时间

2.5重组病毒在多种细胞上增殖滴度测定结果

经测定重组病毒在ST、PKl5、Vero及IBRS-2细胞上的增殖滴度见表3，结果表明重组病毒在IBRS-2细胞上的增殖滴度最高，在Vero细胞重组病毒PGVP218的增殖滴度较低，因此，ST细胞和IBRS-2细胞更适合重组病毒毒PGVP218的大量培养。

表3重组病毒的增殖滴度

细胞	PK-15	ST	Vero	IBRS-2
					病毒增值滴度	10^6.75/0.1mL	10^6.75/0.1mL	10^6.5/0.1mL	10⁷/0.1mL

2.6血凝试验结果

血凝试验结果表明，重组病毒PGVP218无血凝现象。原因可能是由于VP2基因N端的缺失造成的。

3结论与讨论

本发明对重组病毒PGVP218在不同传代细胞体外扩增培养时的增殖滴度及培养特性、理化特性、遗传稳定性、血凝性等生物学特性进行了研究，为选择合适的宿主细胞增殖重组病毒提供了试验依据。

3.1病毒增殖滴度的测定

测定病毒滴度的方法有空斑法、TCID₅₀(半数组织培养物感染剂量)法、斑点杂交法、PCR法等。PCR的灵敏性远高于斑点杂交法，但是斑点杂交法的特异性要优于PCR。目前测定病毒滴度的最准确方法是采用实时荧光定量PCR技术(QuantitativeReal-timePCR)，可直接测定病毒核酸的含量，具有对模板进行准确定量等特点，敏感性通常达100拷贝/mL，且线性范围宽；重复性好，结果相当稳定。空斑检测的是具有感染力的病毒粒子数量，是病毒滴度检测的金标准，但只限于用在有产生空斑能力的病毒，但是由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果。本发明采用的是TCID₅₀方法计算病毒滴度，其滴度值理论上为半个具有感染力的病毒粒子数量的稀释值，理论上即可换算为logTCID50＝logplaque+0.67。

从重组病毒在不同细胞的增殖滴度来看，PGVP218在IBRS-2细胞上的增殖滴度最高(10⁷/0.1mL)，在Vero细胞上的增殖滴度最低(10^6.5/0.1mL)，其次为ST细胞和PK-15细胞，增殖滴度均为10^6.75/0.1mL。从重组病毒感染不同细胞出现细胞病变和观测到绿色荧光的情况来看，在ST细胞和Vero细胞上较早(12h)能观测到细胞病变和绿色荧光。综合两方面的因素，ST细胞最适合重组病毒的培养和增殖，不但具有较高的增殖滴度而且出现病变和荧光的时间最快，适合大量培养。

经测定，重组病毒在ST细胞上的TCID₅₀为10^6.75/0.1mL与PRV弱毒株的TCID₅₀(10^6.3/0.1mL)相差不大，说明外源基因的插入对亲本株的毒力影响不大。

3.2重组病毒理化特性的测定

猪伪狂犬病毒(PRV)抵抗力较强，在环境中存活主要受其附着的介质、酸碱度和温度的影响，对热较为不敏感性，在55℃-60℃经30-50min可灭活病毒，在80℃3min即可灭活，如果是短期保存4℃可存活300d以上，-20℃和-15℃一般百日以内可丧失感染力，所以在建议在4℃冷藏保存比保存在冰箱的冷冻室效果更好。附着于干草、树枝、饲料上的病毒在常温下可存活10d到1个月；在肌肉组织中可存活11-36d。PRV在PH6-8最合适，在5-9还能保持稳定的感染力，但过酸或过碱环境病毒很快失活，高渗透压对病毒活力没有影响。由于PRV有囊膜，所以对乙醚、氯仿、丙酮、酒精等脂溶剂有高度敏感性。本发明研究表明重组病毒的理化特性与亲本株PRV弱毒疫苗株的理化特性类似,重组病毒遗传性稳定，说明外源基因的插入未改变PRV的理化特性及遗传特性。

四、重组PRVPGVP218的免疫原性研究

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物、疫苗及病毒

体重17～20g的6周龄雌性昆明小鼠100只，购自河南省试验动物中心。猪细小病毒病灭活疫苗(WH-1株)、猪伪狂犬病活疫苗(HB98株)购自武汉科前动物生物制品有限责任公司；重组病毒PGVP218由试验二获得；伪狂犬闽A强毒株、重组病毒rPRV-VP2购自河南省动物性食品安全重点实验室。PPVHP/104株(CCTCCV201313)

1.1.2主要试剂

猪细小病毒ELISA诊断试剂盒购自深圳市绿诗源生物技术有限公司、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG抗体购于北京博奥森生物技术发展公司；SPRD、FITC、PE标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体购自SouthernBiotech公司；PremixExTaqHs，SYBRPremixExTaqTM购于大连宝生物公司；FACSAria流式细胞仪为BD公司；微量核酸蛋白分析仪(Nano)。

1.2方法

1.2.1病毒TCID₅₀的测定

分别将重组病毒PPGVP218、伪狂犬闽A强毒株和PPVHP/104株病毒液按10倍系列稀释，每个病毒稀释液按100μL/孔接种到已培养至ST单层细胞的96孔板中，每个滴度重复10孔，同时设正常细胞对照，放入5％CO₂细胞培养箱中在37℃下培养。每天记录观察细胞病变孔数，按Reed-Muench氏法计算病毒TCID₅₀。计算公式为：

距离比例＝(大于50％的病变率-50％)/(大于50％的病变率-小于50％的病变率)

TCID₅₀＝大于50％病变的病毒最高稀释度的对数+距离比例

1.2.2动物分组免疫

将100只6周龄雌性昆明小鼠，体重17～20g，随机分为5组，每组20只。具体分组情况如下：第1、2组分别为重组病毒rPRV-VP2、PGVP218免疫组；第3组为PRVHB98疫苗组；第4组为PPV疫苗组；第5组为DMEM培养液对照组。免疫途径均采用两后肢胫骨前肌多点注射300μL/只。免疫2周后，相同剂量加强免疫一次，免疫分组与方案见表4。并于一免后第1周开始每周尾静脉采血，分离血清，检测PRV、PPV血清抗体水平。首次免疫第56d分别用PPVHP/104株与伪狂犬病毒强毒株进行攻毒保护试验，以10⁵TCID₅₀的剂量采用后肢肌肉注射接种各试验组及对照组小鼠，接种病毒后连续观察2周。

表4免疫分组与免疫方案

1.2.3血清中和试验检测PRV抗体

第一次免疫后每周从PRV疫苗组、重组病毒组和对照组随机抽取5只小鼠断尾采血分离血清，进行PRV抗体中和试验，具体操作如下：

将血清灭活，用DMEM倍系列稀释血清为1:4，1:8，1:16，1:32，1:64稀释液，每孔50μL分别加入到96孔细胞培养板中，每个稀释度4个重复。然后每孔加入50μL200TCID₅₀的PRV闽A株病毒液。同时设血清毒性对照孔，病毒对照孔和细胞对照孔，37℃下作用1h，然后每孔中滴加ST细胞悬液50μL，于含5％CO₂的培养箱中37℃继续培养4-6d，每天观察CPE，按Reed-Muench氏法计算被检血清中的半数保护量PD₅₀。首先计算出各稀释度血清液保护50％细胞不引起细胞病变和不保护细胞引起细胞病变的累积孔数，按下述公式计算出距离比：

距离比＝(高于保护50％细胞的百分数-50％)/(高于保护50％细胞的百分数-低于保护50％细胞的百分数)

血清的PD₅₀＝高于50％保护率血清稀释度的对数+距离比×稀释系数的对数

1.2.4PPV间接ELISA抗体水平检测

一免后第1周至第7周，每周从重组病毒免疫组、PPV疫苗免疫组和DMEM对照组随机抽取5只小鼠断尾采血，分离血清，用猪细小病毒ELISA诊断试剂盒在450nm波长下测定吸光度(OD值)，检测小鼠的PPV抗体水平。具体操作过程如下：

(1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需的板条；(2)设置阴、阳性对照孔每孔分别加阴、阳性对照各50μL；(3)待测样本孔内先加样本血清10μL，再加样本稀释液40μL；(4)各孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗原100μL，用封板膜封闭，37℃温育60min；(5)洗板5次，每次200μL洗涤液，静置1min后甩去洗涤液，在吸水纸上拍干；(6)各孔加入底物A、B各50μL，37℃闭光温育15min后每孔加入50μL终止液，15min内在450nm波长下测定各孔的OD值。

1.2.5小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定

从每组中随意取5只小鼠，利用流式细胞仪检测首免疫后35d时小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化。将各组试验小鼠抗凝血各100μL加入流式细胞仪专用上样管，加入荧光标记的抗CD3、CD4、CD8抗原的单克隆抗体各1μL，轻轻混匀，室温孵育20min；2mL/管溶血素混匀，室温下作用15min后200×g离心5min；按2mL/管加入2％FBS-PBS，200×g5min离心3次；最后用400μLPBS定容，用流式细胞仪进行检测。用Excel和IBMSPSSStatistics19统计软件处理数据。

1.2.6攻毒保护试验

在第一次免疫接种后49d，各组试验小鼠取10只，再将每组中的10只一分为二。重组病毒组、PPV疫苗组和DMEM对照组的各一半小鼠分别用10⁷TCID₅₀PPVHP/104株通过腹腔注射进行攻毒；重组病毒组、PRV疫苗组和DMEM对照组的各一半小鼠分别用PRV闽A强毒通过腹腔注射途径进行攻击(500μL/只)。对攻毒的小鼠观察2周，每隔12h观察小鼠的发病、死亡情况。于第3周全部处死，取肺脏、脾脏组织提取DNA。利用PPVNS1基因特异性引物(上游引物序列：5'-CCAAAAATGCAAACCCCAATA-3'；下游引物序列：5'-ATCTGGCGGTGTTGGAGTTAAG-3')，并进行PPV病毒的检测。

2结果与分析

2.1病毒TCID₅₀的测定

按Reed-Muench氏法计算每种病毒的TCID₅₀，在ST细胞上进行了两次判定，得到的平均结果见表5：

表5病毒TCID₅₀测定结果

病毒	PPV HP/104株	rPRV-VP2	PGVP218	PRV HB98疫苗株	PRV闽A强毒株
						TCID₅₀	1×10⁸	1×10^6.5	1×10^6.75	1×10^6.3	1×10⁸

2.2血清中和试验检测PRV抗体结果

重组病毒组、PRV疫苗组和DMEM对照组小鼠血清抗PRV的测定结果见表6。由表6分析表明，从首免后第2周，重组病毒PGVP218和rPRV-VP2免疫组及PRV疫苗组有可检测到PRV中和抗体；加强免疫后，除DMEM对照组外，三组小鼠体内PRV抗体水平都得到显著的提高，首免后3、4、5、6和7周与首免后第2周相比，差异极显著(P<0.01)。对照组小鼠体内始终未检测到PRV中和抗体。在首免后第3-7周，重组病毒PGVP218免疫组诱导小鼠产生PRV中和抗体水平明显高于与重组病毒rPRV-VP2免疫组，差异显著(P<0.05)。该结果表明重组病毒PGVP218、rPRV-VP2和PRV弱毒苗都能在小鼠体内得到有效的增殖，并能诱导小鼠产生中和抗体，二次免疫后中和抗体水平显著升高，抗体水平达到高峰出现在首免后第5周左右，并且重组病毒PGVP218诱导产生的PRV中和抗体比重组病毒rPRV-VP2同期诱导产生的PRV中和抗体水平高。

表6PRV中和抗体效价水平

2.3PPV抗体ELISA检测结果

按照ELISA试剂盒说明书进行不同时期采集的小鼠血清中PPV特异抗体检测，其中羊抗猪二抗被羊抗鼠二抗代替。结果如表7、图37所示，首免后第一周重组病毒PGVP218和PPV疫苗组小鼠体内有可检测的抗PPV特异抗体，到首免后第二周时，重组病毒PGVP218和rPRV-VP2和PPV疫苗组小鼠体内均产生了明显的抗PPV特异抗体，与对照组相比差异极显著(p＜0.01)。第4周除对照组外各组小鼠体内PPV体内抗体达到最高值。DMEM组小鼠体内始终未检测到PPV特异抗体。PGVP218组明显高于不含猪IL-18的重组病毒(rPRV-VP2)同期的抗体水平(p＜0.05)。

表7PPV抗体ELISA抗体检测

2.4小鼠外周血淋巴细胞亚群的测定

利用流式细胞仪检测小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化，从结果分析可以看出(见表8，图38)，各组小鼠体内T淋巴细胞亚类CD3⁺、CD8⁺的T淋巴细胞数量与DMEM对照组相比均无明显差异(p＞0.05)；CD4⁺的T淋巴细胞除DMEM对照组外各试验组之间无明显差异，PPV疫苗组与DMEM对照组之间差异不显著，两种重组病毒组和PRV疫苗组与DMEM对照组间差异显著(p＜0.05)。表明，各试验组在刺激CD4⁺的T淋巴细胞增殖方面优于对CD8⁺淋巴细胞的刺激作用，对CD3+淋巴细胞数量无太大影响。

表8小鼠外周血中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞数量的测定

Group	CD3+	CD4⁺	CD8⁺	CD4⁺:CD8⁺
					rPRV-VP2	62.30	34.00±	19.84±	1.68±0.24
PGVP218	65.22	34.44±	21.12±	1.72±0.57
					Parental PRV	64.16	32.84±	21.86±	1.58±0.40
PPV vaccine	61.00	32.76±	17.48±	1.92±0.57
					DMEM medium	63.30	22.22±	17.94±	1.37±0.50

CD4/CD8比值是判断机体免疫功能紊乱的临床诊断敏感指标。从试验结果T淋巴细胞CD4+：CD8+数量的比值来看(表8，图39)，各试验组的CD4+：CD8+比值升高，各试验组与DMEM对照组相比均有明显差异(p＜0.05)。表明重组病毒小鼠机体CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群数增多，细胞免疫水平增高。两种重组病毒的比较来看，由于PGVP218中IL-18的表达，引起γ干扰素的提高，使CD4+：CD8+比值更高，但从统计学上分析差异不显著。

2.5攻毒保护试验

在首免后第49d，将PRV疫苗组、DMEM对照组和两个重组病毒实验组的一半小鼠用10^6.0TCID₅₀的PRV闽A株强毒进行攻毒，每隔12h观察小鼠的发病、死亡情况，以及平均死亡时间，共观察2周。结果DMEM对照组小鼠在攻毒后72h出现典型的伪狂犬病发病症状，表现为神经兴奋性增高，啃咬病毒注射部位，发病动物相继在12h内死亡，而两个重组病毒组及PRV疫苗组内小鼠未见发病和死亡，在观察的2周内表现正常。

将PPVHP/104株攻毒的小鼠2周后全部处死，提取肺或肝组织DNA后用PPVNS1基因特异性引物进行PCR扩增。结果显示，DMEM营养液对照组中5只小鼠NS1基因的PCR扩增，均为阳性，表明小鼠体内存在PPV病毒感染。重组病毒rPRV-VP2免疫组5只小鼠中有2只小鼠扩出NS1基因，其余3只结果为阴性；重组病毒PGVP218免疫组5只小鼠中有1只小鼠扩出NS1基因，其余4只结果为阴性。结果表明重组病毒能部分抵抗PPV强毒的攻击。

3结论与讨论

本发明将试验一构建的重组伪狂犬病毒PGVP218和实验室构建的不含IL-18的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2分别免疫小鼠，同时以DMEM培养液作为阴性对照，PRVHB98疫苗、PPV灭活苗作为阳性对照组免疫小鼠，通过进行PPV特异抗体检测、PRV抗体中和试验、外周血T淋巴细胞亚群的测定及攻毒保护试验，来考察重组病毒的免疫原性。结果表明重组病毒PGVP218对小鼠安全有效，重组病毒PGVP218和rPRV-VP2均可诱导小鼠产生针对PRV和PPV的特异性抗体，CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群数增多。用PPVHP/104株攻毒后，重组病毒rPRV-VP2免疫组中有2只小鼠扩出NS1基因，而PGVP218免疫组中仅有1只小鼠扩出NS1基因，表明PGVP218优于rPRV-VP2，IL-18在重组病毒中起到了免疫增强作用。

T淋巴细胞亚群，主管细胞免疫具有抗病毒和调节免疫系统功能的作用。正常情况下，亚群间互相拮抗达到平衡。CD3+淋巴细胞代表全T淋巴细胞，它包括辅助/诱导T淋巴细胞(CD3+CD4+)、抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+)、CD4+T细胞纯真亚群(CD4+CD45RA+/CD4+CD45RA+62L+)和记忆亚群(CD4+CD45RA-/CD4+CD45RO+)、功能亚群(CD28+)、激活亚群(CD38+、HLA-DR+)、凋亡亚群(CD95+)等。CD8即抑制性T细胞(TS)/细胞毒性T细胞(TC)，免疫中直接杀伤性细胞。CD4淋巴细胞也即诱导性T细胞(TI)/辅助性T细胞(TH)，为调控免疫反应最重要枢纽细胞。试验结果来看，试验组及疫苗组判断机体免疫功能是否紊乱的敏感指标CD4/CD8比值明显升高，说明产生了较强的细胞免疫反应。

PPVVP2基因全长1740bp，编码579个氨基酸，其N端73-108nt处的36bp有连续9个Gly富集的编码区(25-33aa)是VP3蛋白的切割位点，PCR时易缺失该段序列，陈弟诗等研究结果表明Gly富集区的缺失不影响VP2病毒样颗粒(VPLs)的装配和免疫原性，具有完整病毒类似的血凝性，可诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和良好的细胞免疫应答。利用大肠杆菌的Pr-bambda和lac启动子，ZaberezhnyA.D.等表达了PPV1.5kb的DNA片段也具有PPV抗原特异性。将PCV2的Cap蛋白的抗原表位108bp嵌合到N端缺失108bp的PPVVP2基因，Pan等通过重组腺病毒得到了能自行装配的PCV2Cap-PPVVP2嵌合病毒样粒子。与PPV全病毒粒子相比，该嵌合VPLs形态大小和血凝活性与之相似。试验结果表明比单独的PCV2腺病毒重组体能诱导更强的抗体反应，VP2N端108bp的缺失并不影响VLPS的装配。本发明构建的重组病毒PGVP218，其N端缺失105bp，而C端是完整的，结果表明其具有PPV抗原特异性，能够诱导机体产生特异的体液免疫和细胞免疫应答，且该缺失阻断了病毒重组的回复突变，因此可能更具有生物安全性。

近年来，学者们利用PPVVP2能够自我装配的特性对其作为疫苗递呈系统，携带外源基因构建重组病毒进行了研究，发现VP2N端，N端1/3处，VP2蛋白三级结构的loop2处均可作为外源基因的插入位点。将犬细小病毒VP2基因N端缺失突变体与EGFP蛋白C末端融合，重组杆状病毒后在昆虫细胞进行表达，Gilbert等发现缺失23个或40个氨基酸的EGFP-VP2能装配成表达EGFP的VPLs，而且缺失40个氨基酸(120bp)的猪细小病毒VP2基因更适宜于融合多肽进一步展示在衣壳样结构的表面，抗原性更强，VP2N端一定部位的缺失未影响病毒样颗粒的形成，同时还有利于嵌合多肽的抗原递呈。本试验使用的VP2基因片段也为N端的部分缺失，结果仍具有免疫原性。

综上所述，重组病毒PGVP218具备良好的免疫原性，且PGVP218优于rPRV-VP2，表明IL-18作为新型的免疫佐剂，在重组病毒中起到了加强免疫效果的作用，为预防猪细小病毒病和猪伪狂犬病新型二联活苗的开发奠定了基础。

Claims

1.一种表达PPVVP2基因和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒株，其特征在于：重组猪伪狂犬病毒（Herpesviridae）毒株，CCTCCNO：V201347。