CN108410784B

CN108410784B - 猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中应用

Info

Publication number: CN108410784B
Application number: CN201810076108.7A
Authority: CN
Inventors: 张安定; 徐磊; 林岚; 吕伟华; 韩丽
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2018-01-26
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2038-01-26
Also published as: CN108410784A

Abstract

本发明公开了一种猪链球菌△CPS/SsnA‑mSly(P353L)‑SC19工程菌及在疫苗中应用，该菌株以猪链球菌2型强毒分离株SC19为出发菌株，通过同源重组的方式，敲除了毒力基因cps和ssna，并将溶血素基因的353氨基酸由P突变成L，构建成功△CPS/SsnA‑mSly(P353L)‑SC19。菌株△CPS/SsnA‑mSly(P353L)‑SC19的致病力显著降低，作为灭活疫苗和弱毒疫苗菌株时，具有很好的安全性，免疫动物后可提供针对猪链球菌2型、7型等血清型菌株感染的保护效力。而且该疫苗免疫后不会产生针对SsnA的抗体，该菌株可作为区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的基因标记疫苗的菌株，从而有利于该病的根除和净化。

Description

猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体地指一种猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中应用。

背景技术

猪链球菌病是由多种致病性链球菌引起的一种人畜共患的急性热性传染病。主要病原为猪链球菌(Streptococcus suis)，包含众多血清型，已经定型的有33种，还有一些不能定型的菌株，各血清型之间缺少交叉免疫保护。导致现有市场上的灭活疫苗通常只针对特定的血清型，而无法预防多种血清型的感染。因此，开发具有广泛的能够预防多种血清型猪链球菌感染的疫苗，具有十分必要的价值和意义。

现有的研究结果表明血清型的不同主要取决于链球菌的荚膜成分。在猪链球菌的感染过程中，荚膜也能帮助链球菌逃避宿主免疫系统的攻击。因此，将荚膜成分缺失，暴露猪链球菌的菌体表面成分，既能避免由荚膜造成的免疫逃逸的问题，又可将多种血清型共有的抗原更好的暴露，从而增强针对共有的菌体成分的免疫应答。因此，缺失荚膜将可以显著降低致病力的同时达到预防多种血清型感染的目的。

猪链球菌感染过程中会分泌核酸酶SsnA，能分解粒细胞形成具有保护作用的胞外诱捕网(NET)，从而逃避宿主的天然杀伤作用。因此，缺失ssna基因可以显著降低细菌的致病力，提高其作为弱毒疫苗菌株的安全性。同时，分泌核酸酶的菌株感染会刺激动物机体产生SsnA的抗体，而缺失菌株免疫后不会产生该抗体。因此利用该菌株免疫的动物，就可通过检测SsnA的抗体来区分疫苗免疫和天然感染动物，从而有利于该病的控制和净化。

溶血素是猪链球菌重要的毒素，同时也具有很好的免疫保护效力。将溶血素基因缺失后，可使其致病力显著降低，但也会影响其介导的免疫应答反应。因此，研制一种既降低溶血素毒性又不影响其免疫原性的突变体将具有重要价值和意义。基于溶血素结构的分析，其353位点的氨基酸是溶血素溶血活性关键位点，构建猪链球菌溶血素353位点氨基酸突变的菌株理论上既可以保持其高的免疫效力，也可以降低其致病性。作为弱毒疫苗菌株时可保障更好的安全性；作为灭活疫苗菌株时也可避免毒素的副作用，一方面可提高免疫菌量增强免疫效力，另一方面可减少免疫的副反应提高安全性。

由于，猪链球菌是目前危害养猪业的第一大细菌性传染病，同时也是一种非常重要的人兽共患病。疫苗免疫是防控该病的重要策略，但是现有疫苗通常只针对特定血清型，而对其它血清型无效。因此，开发一种预防多种血清型猪链球菌感染的疫苗一直是该病防控技术研究的重大需求。正因如此，全球许多国家的兽医学实验室采用了多种策略来研制这种对多种血清型感染有效的疫苗。包括：基因工程亚单位疫苗、传代致弱的弱毒疫苗、以及分离的弱毒株开发的弱毒疫苗。虽然取得了一定的效果，但实际应用时却受到成本太高、免疫效力低等诸多限制以及毒力返强的风险。

发明内容

本发明针对现有疫苗存在的缺陷，提供了一种猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中应用，该菌株缺失了毒力基因cps和ssna，以及改变了毒力基因sly的溶细胞毒性作用，但仍可维持其免疫效力。因此，该菌株毒力非常显著地降低，可以作为灭活疫苗和弱毒疫苗的生产菌株。由于该菌株毒性丧失，可通过显著提高免疫剂量的方法来提高其血清型交叉蛋白的免疫效力，从而达到预防多种血清型猪链球菌感染的效果。而且由于该菌株缺少了ssna基因，因此，免疫后不会产生SsnA的抗体，因此可作为区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的基因标记疫苗的菌株，从而有利于该病的根除和净化。

为实现上述目的，本发明提供的一种猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌，其特征在于：所述菌株命名为streptococcus suis type 2△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，简称为：△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，该突变株于2016年10月20日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为：CCTCCNO：M 2016584。

本发明还提供了一种上述猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌在制备预防多种血清型猪链球菌引起疫病的弱毒疫苗或灭活疫苗中的应用。

通过应用灭活疫苗和弱毒疫苗对实验动物35-43日龄的昆明鼠上进行免疫，进行安全性评价和免疫效果的评价。证实该菌株作为疫苗用菌株具有很好的安全性及免疫效力，更为重要的是，对多个血清型猪链球菌感染均可提供保护效力。

作为优选方案，所述弱毒疫苗为液体制剂，每毫升的液体制剂中△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌的数量为2～8*10^8。

上述弱毒疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌放置于含有5％新生牛血清的TSB液体培养基中培养，

2)离心收集菌体，PBS清洗菌体，然后向菌体中加入PBS，得到液体制剂即为弱毒疫苗，其中，每毫升中突变株的数量为2～8*10^8。

作为优选方案，所述灭活疫苗为乳剂，所述灭活疫苗是由水相与油相按体积比1∶1～2混合，所述水相由灭活菌体与吐温-80按体积比为94∶4～8混合，所述油相由白油、司本-80按体积比为94∶4～8的比例制成，其中，灭活菌体中，菌体抗原浓度为3～6*10^10CFU/ml。

最优选地，所述灭活疫苗是由水相与油相按体积比1∶1.5混合，所述水相由灭活菌体与吐温-80按体积比为94∶6混合，所述油相由白油、司本-80按体积比为94∶6的比例制成，其中，灭活菌体中，菌体抗原浓度为4*10^10CFU/ml。

上述灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

2)培养12小时，按照0.4％的比例加入甲醛对菌体进行灭活，置于37℃灭活48～72小时，期间每隔4小时搅拌1次，即为灭活的菌液，

3)将菌液离心收集菌体，并用生理盐水清洗，用PBS将菌体重悬，得到灭活菌体，灭活菌体中，菌体抗原浓度为4*10^10CFU/ml；

4)将上述收集的灭活菌体与吐温-80体积比为94∶4～8混合，制成水相；将白油、司本-80按体积比为94∶4～8的比例制成油相；将所述的水相与油相按体积比为1∶1～2的比例混合，将水相缓慢加入油相均质3～5分钟后，制成均匀乳剂，即为灭活疫苗，其中，灭活菌体中，菌体抗原浓度为3～6*10^10CFU/ml。

本发明还提供了一种构建上述猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌的方法，包括以下步骤：

1)根据已经在NCBI上公布的猪链球菌2型05ZYH33株的全基因组序列，设计敲除cpsEF基因和ssna基因的引物、以及构建sly基因点突变的引物对，

其中，敲除cpsEF基因引物包括cpsEF上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对；

敲除ssna基因的引物包括ssna上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对；

构建sly基因点突变的引物对包括ssna上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对，以及353位点点突变的引物；

2)从猪链球菌2型临床分离株SC19中提取细菌基因组；

3)以细菌基因组为模板，用上述cpsEF上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对进行PCR，纯化回收得到上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物，将上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物进行融合PCR，得到融合产物cpsEF-LR；

4)用EcoRI和BamHI将融合产物cpsEF-LR和载体pSET4s分别进行双酶切，并将产物cpsEF-LR和线性化的载体pSET4s连接，得到重组质粒pSET4s-cpsEF；

5)将猪链球菌2型菌株SC-19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-cpsEF加入到SC-19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布TSA平板上培养，得到单菌落；鉴定该菌落并命名为缺失突变体△cps-SC19，

6)以细菌基因组为模板，用上述ssna上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对进行PCR，纯化回收得到上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物，将上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物进行融合PCR，得到融合产物ssna-LR；

7)用EcoRI和BamHI将融合产物ssna-LR和载体pSET4s分别进行双酶切，并将产物ssna-LR和线性化的载体pSET4s连接，得到重组质粒pSET4s-ssna；

8)将cps基因敲除的突变菌株△cps-SC19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-ssna加入到△cps-SC19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布平板上培养，得到单菌落；鉴定该菌落并命名为缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19

9)以细菌基因组为模板，用sly上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对进行PCR，纯化回收得到上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物，将上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物进行融合PCR，得到融合产物sly-del353；应用sly上游同源臂的正向引物SLY-SacI-L1和下游同源臂的反向引物SLY-BamHI-R2扩增sly全长基因片段；

10)用SacI和BamHI将融合产物sly-del353、sly全长基因片段和载体pSET4s分别进行双酶切，得到线性化的融合产物sly-del353、线性化的基因组全长基因片段sly和线性化的载体pSET4s；将线性化的融合产物sly-del353和线性化的基因组全长基因片段sly分别与线性化的载体pSET4s连接，得到两个重组质粒，命名为pSET4s-sly-del353和pSET4s-sly-LR；再以pSET4s-sly-LR为模板，用353位点点突变的引物对进行PCR，得到质粒pSET4s-sly；

11)将猪链球菌缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-sly-del353加入到△cps/ssna-SC19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布得到平板上培养，得到单菌落；鉴定该菌落并命名为缺失突变体△sly/cps/ssna-SC19。

12)将缺失突变体△sly/cps/ssna-SC19制作电转感受态细胞，将pSET4s-sly质粒电转到感受态细胞中，利用温度和抗性诱导质粒和细菌基因组发生重组交换，利用SLY-SacI-L1、SLY-BamHI-R2引物进行PCR扩增，能扩增得到且仅有一条1200bp条带的菌株，为筛选得到正确的菌株，命名为猪链球菌cps和ssna基因敲除以及溶血素基因定点突变菌株streptococcus suis△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，即为猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌。

作为优选方案，所述步骤1)中，

a.构建敲除cpsEF基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

ECORI-E-1：AAAGAATTCGGCTCGTGCTATATTCTCTTGG，

RONGHE-EF-2：GAATCTTTTTCATAACAGCTCCTCCACTATTTC；

下游同源臂正反向引物：

RONGHE-EF-1：GAAATAGTGGAGGAGCTGTTATGAAAAAGATTC，

BAMHI-F-2：AAAGAATCCGGTTTGCCACAGCCTGTG；

b.构建敲除ssna基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

DSsnA-LF1:GGCGAATTCTGTTCGCATCAGTCGTAG，

DSsnA-LR1:GAACCAGGGCGTATCTCTTCATATAAAACTCCTTTTTGTTAT；

下游同源臂正反向引物：

Dssna-RL1:GAAAGATCGCCGTGTAATCATTTTTTGAGCTTGAAAGCATGAC，

Dssna-RR1:CGAGGATCCCAATTTCAACCTCGGTCGCTC；

c.构建SLY基因点突变的引物

上游同源臂正反向引物：

SLY-SacI-L1：ACCATTAGAGCTCAATTTTGATGCCGTG，

SLY(P353L)-R1：TCTCCACCACTCAAATAAATTG AGTTTT CCG；

下游同源臂正反向引物：

SLY(P353L)-L2：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-BamHI-R2：GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGT TTTC；

353位点点突变的引物：

SLY-P353L-L：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-P353L-R：GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTT TTC。

本发明的猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌构建的思路为：设计引物分别扩增cpsEF基因的上、下游同源臂，经过融合后得到大约为930bp，将其连接到自杀性质粒pSET4s上构建重组穿梭质粒(pSET4s-cpsEF)，再将重组质粒电转化到猪链球菌2型SC19中，利用温度和抗性筛选，使其发生双交换，获得缺失cpsEF的菌株△cps-SC19。

再设计引物分别扩增ssna基因的上、下游同源臂，经过融合后得到大约为2766bp，将其连接到自杀性质粒pSET4s上构建重组穿梭质粒(pSET4s-ssna)，再将重组质粒电转化到猪链球菌2型△cps-SC19中，利用温度和抗性筛选，使其发生双交换，获得缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19。

设计引物分别扩增sly基因的上、下游同源臂，经过融合后得到大约为800bp，将其连接到自杀性质粒pSET4s上构建重组穿梭质粒(pSET4s-sly-del353)，再将重组质粒电转化到菌株△cps/ssna-SC19中，利用温度和抗性筛选，使其发生双交换，获得溶血素基因碱基序列从1053bp到1393bp(包含1056bp至1059bp、即翻译353位氨基酸的密码子区域)的基因片段缺失突变体△sly/cps/ssna-SC19。

再以sly左臂上游引物和右臂下游引物扩增包含溶血素1053bp到1393bp包含353位氨基酸位点的基因片段，大约为1200bp并连接到pSET4s质粒上，获得重组质粒pSET4s-sly-LR，并以这个质粒为模板，将353位点的CCA基因序列突变为TTA，密码子编码的氨基酸从脯氨酸(P)变为亮氨酸(L)，获得重组质粒pSET4s-sly。将重组质粒转化到上一步所得的△sly/cps/ssna-SC19菌株中，利用温度和抗性筛选，使其发生双交换，获得溶血素353位氨基酸从P变为L并伴随溶血活性失活毒力降低的突变体△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19。

本发明的有益效果在于：

1)本发明针对猪链球菌毒力基因构建的cps和ssna基因敲除菌株，不仅将菌株的毒力大大降低而且菌株毒力不可能返强，从而保证了该菌株的安全性。针对sly是重要的毒力基因同时也是重要的保护性抗原基因，本发明对sly基因进行了改造，使其失去了溶细胞毒性，但仍然保留诱导免疫性应答的抗原性。从而既降低菌株的毒力和免疫时的副作用，又能保证免疫效力。因此，我们构建的荚膜(cps)和分泌核酸酶(ssna)基因缺失、溶血素基因353氨基酸位点改变的菌株△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，并将其作为灭活疫苗和弱毒疫苗的菌株。通过应用研究发现该菌株具有如下优势：

a.因毒力基因荚膜(cps)和分泌核酸酶(ssna)缺失以及SLY的溶细胞毒性失活，细菌毒力下降，大大提高疫苗生产的安全性；

b.该菌株作为灭活疫苗毒株时，由于溶血素毒性的丧失，其副作用明显降低，而且可进一步提高免疫剂量，诱导更高水平的免疫效力和降低副作用。

c.由于荚膜敲除，同时溶血素毒性的丧失，不仅安全性好，而且可以显著提高免疫剂量，作为灭活疫苗和弱毒疫苗菌株，显著提高针对多种血清型共有抗原的免疫应答，提供对多种血清型猪链球菌感染的保护作用；

d.因SsnA的缺失，该菌株作为疫苗菌株应用时，不会产生针对SsnA的抗体，因此可作为区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的基因标记疫苗的菌株，从而有利于该病的根除和净化。

2)本发明通过缺失株链球菌的毒力基因cps和ssna，以及改造猪链球菌2型的溶血素蛋白的溶血活性大大降低猪链球菌的毒力，大大提高疫苗生产的安全性；由于菌株毒力非常低，而且仍可保证SLY诱导抗体的能力，从而可作为安全的弱毒疫苗用菌株。

3)该菌株作为灭活疫苗毒株时，由于溶血素毒性的丧失，其副作用明显降低，而且可进一步提高免疫剂量。诱导更高的抗体水平和多血清型的交叉保护效力，从而可以提供对多种血清型猪链球菌感染的保护作用。

4)因SsnA的缺失，该菌株作为疫苗菌株应用时，不会产生针对SsnA的抗体，因此可作为区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的基因标记疫苗的菌株，从而有利于该病的根除和净化。

附图说明

图1：△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19构建的技术路线图；

图2：△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19荚膜基因鉴定结果，

图中，1为Marker，2为water，阴性对照，3为SC19，4为△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，5为质粒pSET4s-cpsEF；

图3：△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19核酸酶基因鉴定结果，

图中，1为Marker，2为water，为阴性对照，3为SC19，

4为△CPS-SC19，5为△CPS/SsnA-SC19，

6为△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19；

图4：△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19溶血素基因第353位氨基酸对应的DNA测序的结果；

图5：△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19和WT的培养上清溶血活性比较结果，

图中，1为SC19，2为△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，3为生理盐水，阴性对照；

图6：作为灭活疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19安全性试验结果；

图7：作为灭活疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后产生的针对△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19菌体的抗体水平的检测结果；

图8：作为灭活疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后产生的针对SLY抗体水平的检测结果；

图9：作为灭活疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后产生的针对猪链球菌7型菌体的抗体水平的检测结果；

图10：作为灭活疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后猪链球菌2型强毒株SC-19攻毒后小鼠存活情况；

图11：作为灭活疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后猪链球菌7型毒株(SS7)攻毒后小鼠存活情况；

图12：作为弱毒疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19安全性试验结果；

图13：作为弱毒疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后产生的针对△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19菌体的抗体水平的检测结果；

图14：作为弱毒疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后产生的针对SLY抗体水平的检测结果；

图15：作为弱毒疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后产生的针对猪链球菌7型菌体的抗体水平的检测结果；

图16：作为弱毒疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后猪链球菌2型强毒株SC-19攻毒后小鼠存活情况；

图17：作为弱毒疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后猪链球菌7型毒株(SS7)攻毒后小鼠存活情况；

图18：疫苗免疫小鼠血清及野毒感染小鼠血清SsnA抗体检测结果。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1：

1、△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌

具体的构建策略如图1所示，构建方法包括以下步骤：

1)根据已经在NCBI上公布的猪链球菌2型05ZYH33株(GenBank:CP000407.1)的全基因组序列中cpsEF基因的ORF序列如SEQ ID No.1，ssna基因的ORF序列如SEQ ID No.2和sly基因的ORF序列如SEQ ID No.3设计敲除cpsEF基因和ssna基因的引物，以及构建sly基因点突变的引物对，分别为：

a.构建敲除cpsEF基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

ECORI-E-1：AAAGAATTCGGCTCGTGCTATATTCTCTTGG，

RONGHE-EF-2：GAATCTTTTTCATAACAGCTCCTCCACTATTTC；

下游同源臂正反向引物：

RONGHE-EF-1：

GAAATAGTGGAGGAGCTGTTATGAAAAAGATTC，

BAMHI-F-2：AAAGAATCCGGTTTGCCACAGCCTGTG；

鉴定引物：

CpsEF-jd：CGACTACTGCTCCAAGTATATCT

b.构建敲除ssna基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

DSsnA-LF1:GGCGAATTCTGTTCGCATCAGTCGTAG，

DSsnA-LR1:GAACCAGGGCGTATCTCTTCATATAAAACTCCTTTTTGTTAT；

下游同源臂正反向引物：

Dssna-RL1:GAAAGATCGCCGTGTAATCATTTTTTGAGCTTGAAAGCATGAC，

Dssna-RR1:CGAGGATCCCAATTTCAACCTCGGTCGCTC；

c.构建SLY基因点突变的引物

上游同源臂正反向引物：

SLY-SacI-L1：ACCATTAGAGCTCAATTTTGATGCCGTG，

SLY(P353L)-R1：TCTCCACCACTCAAATAAATTG AGTTTT CCG；

下游同源臂正反向引物：

SLY(P353L)-L2：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-BamHI-R2：GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGT TTTC；

353位点点突变的引物：

SLY-P353L-L：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-P353L-R：GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTT TTC；

2)从猪链球菌2型野生菌株SC19(2005年四川临床分离得到并由农业微生物学国家重点实验室保存)中提取细菌基因组；

上游同源臂PCR反应体系：

PCR反应条件：

下游同源臂PCR反应体系：

PCR反应条件：

融合PCR的条件，

PCR反应体系：

PCR反应条件：

酶切条件：

酶切体系：

在温度为37℃条件下保温3h；

5)将猪链球菌2型菌株SC-19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-cpsEF加入到SC-19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布TSA平板上培养，得到单菌落；

6)将单菌落利用ECORI-E-1、BAMHI-F-2引物进行PCR扩增鉴定，能扩增得到一条930bp条带的菌落即为电转成功的菌落，利用温度和抗性诱导质粒和基因组发生重组交换，利用ECORI-E-1、CpsEF-jd引物进行PCR扩增鉴定，若检测到一条1294bp条带的菌落即为野生菌，缺失突变体△cps-SC19由于缺失cpsEF基因，将扩增不到该条带(图2)

cpsEF缺失突变体的鉴定PCR反应体系：

PCR反应条件：

7)以细菌基因组为模板，用上述ssna上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对进行PCR，纯化回收得到上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物，将上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物进行融合PCR，得到融合产物ssna-LR；

上游同源臂PCR反应体系：

PCR反应条件：

下游同源臂PCR反应体系：

PCR反应条件：

融合PCR的条件，

PCR反应体系：

PCR反应条件：

8)用EcoRI和BamHI将融合产物ssna-LR和载体pSET4s分别进行双酶切，并将产物ssna-LR和线性化的载体pSET4s连接，得到重组质粒pSET4s-ssna；

酶切条件：

酶切体系

在温度为37℃条件下保温3h；

9)将cps基因敲除的突变菌株△cps-SC19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-ssna加入到△cps-SC19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布平板上培养，得到单菌落；

10)将单菌落利用DSsnA-LF1、Dssna-RR1引物进行PCR扩增鉴定，能扩增得到一条2766bp条带的菌落即为电转成功的菌落，利用温度和抗性诱导质粒和基因组发生重组交换，利用DSsnA-LF1、Dssna-RR1引物进行PCR扩增鉴定，检测得到一条且仅有一条2766bp条带的菌落即为缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19(图3)。

ssnA缺失突变体的鉴定PCR反应体系：

PCR反应条件：

11)以细菌基因组为模板，用sly上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对进行PCR，纯化回收得到上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物，将上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物进行融合PCR，得到融合产物sly-del353；应用sly上游同源臂的正向引物SLY-SacI-L1和下游同源臂的反向引物SLY-BamHI-R2扩增sly全长基因片段；

12)用SacI和BamHI将融合产物sly-del353、sly全长基因片段和载体pSET4s分别进行双酶切，得到线性化的融合产物sly-del353、线性化的基因组全长基因片段sly和线性化的载体pSET4s；将线性化的融合产物sly-del353和线性化的基因组全长基因片段sly分别与线性化的载体pSET4s连接，得到两个重组质粒，命名为pSET4s-sly-del353和pSET4s-sly-LR；再以pSET4s-sly-LR为模板，用353位点点突变的引物对进行PCR，得到质粒pSET4s-sly；

上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物的PCR条件：

上游同源臂PCR反应体系：

PCR反应条件：

下游同源臂PCR反应体系：

PCR反应条件：

融合PCR的条件，

PCR反应体系：

PCR反应条件：

扩增sly全长PCR的条件

PCR反应体系：

PCR反应条件：

酶切条件：

酶切体系

在温度为37℃条件下保温3h；

PCR的条件：

PCR反应体系：

PCR反应条件：

13)将猪链球菌缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-sly-del353加入到△cps/ssna-SC19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布得到平板上培养，得到单菌落；

14)将单菌落利用SLY-SacI-L1、SLY-BamHI-R2引物进行PCR扩增鉴定，能扩增得到一条800bp条带的菌落即为电转成功的菌落，利用温度和抗性诱导质粒和基因组发生重组交换，利用SLY-SacI-L1、SLY-BamHI-R2引物进行PCR扩增鉴定，检测得到一条且仅有一条800bp条带的菌落即为缺失突变体△sly/cps/ssna-SC19；

15)将缺失突变体△sly/cps/ssna-SC19制作电转感受态细胞，将pSET4s-sly质粒电转到感受态细胞中，利用温度和抗性诱导质粒和细菌基因组发生重组交换，利用SLY-SacI-L1、SLY-BamHI-R2引物进行PCR扩增，能扩增得到且仅有一条1200bp条带的菌株，为筛选得到正确的菌株，命名为streptococcus suis△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19。

2、对构建的菌株streptococcus suis△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19进行鉴定：

使用cpsEF的鉴定引物进行PCR扩增，对于野生菌株，能扩增到一段长为1294bp的片段；菌株缺失cpsEF后，PCR不能扩增得到此片段(图2)。

cpsEF缺失突变体的鉴定PCR反应体系：

PCR反应条件：

使用ssna的鉴定引物进行PCR扩增，对于野生菌株，能扩增得到4380bp的条带；如果缺失ssna，则PCR扩增的片段只有2766bp的条带(图3)。

ssnA缺失突变体的鉴定PCR反应体系：

PCR反应条件：

使用溶血素基因两端的引物扩增菌株的溶血素基因后，将产物回收并送测序。测序的结果显示，353氨基酸位点密码子由CCA突变为TTA，氨基酸翻译由此从P变为L(图4)。同时，将培养过夜的上清取出测定溶血，发现此突变株不具有溶血活性(图5)。

实施例2：以△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19制备的灭活疫苗的安全性和对多血清型猪链球菌感染的免疫保护效力

1.以△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19菌株作为抗原的灭活疫苗的制备

(1)菌液制备

将△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19从平板上挑取至TSB(含5％的血清)培养过夜，再分别将培养至稳定期的细菌按照1：100转接至300ml TSB(含5％的血清)中，培养12个小时。

(2)菌体抗原灭活

将培养至稳定期的菌液：取出1ml用于细菌纯度检测及计数，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应纯粹，利用连续梯度稀释的方法，最后取出100ul涂布平皿，菌落计数的结果显示每ml菌液中的细菌数目为；剩余细菌按照0.4％的比例加入甲醛对菌体进行灭活。置于37℃灭活48～72小时，期间每隔4小时搅拌1次，即为灭活的菌液。PBS同样处理作为对照。

(3)菌体抗原浓缩

将菌液使用10000g离心5分钟收集菌体，并用生理盐水清洗3次，用适量的PBS将菌体重悬，按照活菌计数的结果，将菌体抗原浓度调整为4*10^10CFU/ml。灭活后取样,按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。

(4)疫苗的配制

将上述收集的灭活菌体与吐温-80体积比为94∶6混合，制成水相；将白油、司本-80按体积比为94∶6的比例制成油相；将所述的水相与油相按体积比为1∶1.5的比例混合，将水相缓慢加入油相均质3～5分钟后，制成均匀乳剂，即为灭活疫苗。

(5)无菌检验

取上述疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌生长。

(6)疫苗检测：

疫苗外观眼观为乳白色乳液，疫苗剂型为油包水(O/W)型，吸取疫苗10mL置一次性离心管中，以3000r/min离心15min，底部析出的水相不超过0.5mL，黏度测定，按现行《中国兽药典》附录进行，不超过200mPa.s。

2.作为灭活疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19安全性试验

将制备的疫苗按照每只小鼠0.5ml超剂量腹腔注射免疫小鼠，1周后，按照同样的方法再次免疫小鼠，观察28日，小鼠无局部和全身不良反应，且小鼠全部健活，证实疫苗对小鼠安全。

3.作为灭活疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19对多种血清型猪链球菌感染提供免疫效力的试验

为了评价该灭活疫苗对于多个血清型的菌株感染的抵抗力，实验设计免疫组和对照组，分别用于猪链球菌2型和7型菌株进行感染来评价其免疫保护效力。疫苗免疫组按照0.2ml的剂量免疫小鼠，对照组采用对照疫苗免疫。两周后采血检测溶血素抗体和2型菌、7型菌的抗体。一周后按照相同的方法再次免疫小鼠。在二次免疫两周后，同样采血检测抗体。随后，分别用于猪链球菌2型和7型菌株进行感染，观察小鼠的致死率及体重变化和发病情况，以评价免疫效果。

(1)疫苗免疫的安全性

统计小鼠免疫后的体重增殖发现，疫苗免疫组在当日会造成小鼠的体重轻微下降外，疫苗免疫组和对照组均不会影响小鼠的增重，证明此疫苗安全性好(图6)。

(2)抗体检测

在第二周和第三周的两次抗体水平检测中，发现二免后小鼠的菌体(图7)和SLY抗体(图8)阳性率均可达到100％。另外，第二次的抗体和7型的菌体抗原之间存在反应(图9)，证实使用灭活疫苗免疫后，能产生针对7型菌体的抗体。

(3)疫苗保护效果评估

在攻毒之前，检测SC19(血清2型)和SS-7(血清7型)对小鼠的致死剂量。研究发现，SC19的菌量达到2*10^9时，能使未免疫的小鼠全部死亡。而SS-7的攻毒剂量需达到3*10^9时才能使未免疫的小鼠全部死亡。

使用两株菌的攻毒剂量分别对免疫组和未免疫组小鼠攻毒，攻毒完成后记录小鼠的体重变化及致死率情况。从致死率的结果来看，该剂量下SC-19对小鼠的致死率可达100％，疫苗免疫组小鼠无死亡的情况，疫苗免疫后对SC-19感染小鼠的保护率可达100％(图10)。

SS-7菌株在该剂量下，对空白小鼠的致死率达到75％，而免疫组小鼠未出现死亡，且未出现结膜炎，而导致结膜炎是SS-7感染所致小鼠的十分典型的病变。因此，本研究说明该疫苗免疫后对SS-7感染小鼠的保护率同样可达100％(图11)。

由此，可说明以△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19作为抗原制备的灭活疫苗，具有很好的安全性，以及对多血清型猪链球菌感染均可提供很好的保护效力。

实施例3：以△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19制备的弱毒疫苗的安全性和对多血清型猪链球菌感染的免疫保护效力

1.作为弱毒疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19安全性试验

分别从过夜培养的新鲜平板上挑取野生菌SC19和突变菌株△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19的单菌落于5ml TSB(含5％的血清)后放置在37度160转摇晃培养12小时，且设置空白对照。在培养过程中，每隔一个小时从各组中取出100μl测定在OD600的光吸收值，绘制生长曲线。实验重复三次，可观察到野生株和突变体生长速度没有显著的差别，表明突变后没有影响猪链球菌在培养基中的生长特性。取对数期和稳定期的细菌计数，计数结果显示两者菌量没有显著性的差异。

将△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19和野生菌SC19从平板上挑取至TSB(含5％的血清)培养过夜，再分别将培养至稳定期的细菌按照1：100转接至50ml TSB(含5％的血清)中，培养6个小时至对数期后集菌，用PBS清洗细菌一次，然后再用原体积的五分之一重悬菌体，分别取0.2ml(4×10⁸CFU)对随机分组的小鼠进行腹腔注射攻毒，连续观察7天，比较两株细菌对小鼠的毒力差异，发现野生菌SC19可使10只小鼠中死亡8只，△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19感染小鼠精神正常，且连续8天中未出现明显发病和死亡的情况。为了进一步评估其安全性，继续采用，20×10⁸CFU的菌量进行人工感染，野生菌感染的小鼠迅速死亡，而△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19感染小鼠有少量在感染第一天有被毛粗乱的情况，但随后快速恢复。

研究表明△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19即使使用超高的剂量感染后，也不会引起严重临床表现，说明该菌株具有很好的安全性(图12)。

2.作为弱毒疫苗菌株的△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19对多种血清型猪链球菌感染提供免疫效力的试验

将△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19按照0.5ml(8×10⁸CFU/ml)通过腹腔人工接种，并设置接种的PBS作为对照。免疫7天后进行第二次人工接种，接种小鼠均未表现明显的临床表现。第二次免疫后第14天，采血检测针对△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19菌体的抗体、针对SLY的抗体、以及针对猪链球菌7型菌体的抗体，结果发现该弱毒疫苗免疫后，可产生针对△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19菌体的抗体(图13)、针对SLY的抗体(图14)、和针对猪链球菌7型菌体的抗体(图15)。说明该疫苗免疫后可诱导针对不同血清型菌株的抗体。

进一步使用猪链球菌2型(8×10⁸CFU/ml)进行人工感染。对照小鼠全部发病，死亡率达到80％。而免疫小鼠10只中有一只死亡(图16)。使用猪链球菌7型(10×10⁷CFU/ml)进行人工感染。对照小鼠全部发病，死亡率达90％以上。而免疫小鼠全部存活(图17)。

因此，△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19免疫后可对多个血清型感染提供免疫保护。由于该菌株具有很好的安全性和对多血清型提供免疫保护，因此，该菌株可以作为弱毒疫苗的菌株。

实施例4：△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19可作为基因标记疫苗的菌株

1.△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19作为区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的基因标记疫苗菌株

由于制备的菌株缺失了SsnA基因，不管是制备的灭活疫苗还是弱毒疫苗免疫后，均不能诱导相应的抗体产生。而该基因在感染动物的野生菌中高表达，且能诱导高水平的抗体。因此以SsnA作为检测抗原的ELISA技术应该可以区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的抗体。通过ssnA-ELISA方法进行疫苗免疫小鼠和野毒感染小鼠抗体的检测，发现疫苗免疫动物不能诱导ssnA抗体，而野毒感染动物会产生高水平的抗体(图18)。

因此，△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19可作为区分疫苗免疫动物和野毒感染动物的基因标记疫苗菌株。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2550

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 1

atgaatattg aaataggata tcgccaaacg aaattggcat tgtttgatat gatagcagtt 60

acgatttctg caatcttaac aagtcatata ccaaatgctg atttaaatcg ttctggaatt 120

tttatcataa tgatggttca ttattttgca ttttttatat ctcgtatgcc ggttgaattt 180

gagtatagag gtaatctgat agagtttgaa aaaacattta actatagtat aatatttgta 240

atttttctta tggcagtttc atttatgtta gagaataatt tcgcactttc aagacgtggt 300

gccgtgtatt tcacattaat aaacttcgtt ttggtatacc tatttaacgt aattattaag 360

cagtttaagg atagctttct attttcgaca acctatcaaa aaaagacgat tctaattaca 420

acggctgaac tatgggaaaa tatgcaagtt ttatttgaat cagatatact atttcaaaaa 480

aatcttgttg cattggtaat tttaggtaca gaaatagata aaattaattt accattaccg 540

ctctattatt ctgttgaaga agctatagag ttttcaacaa gggaagtggt cgactacgtc 600

tttataaatt taccaagtga atattttgac ttaaagcaat tagtttcaga ctttgagttg 660

ttaggtattg atgtaggcgt tgatattaat tcattcggtt ttactgtgtt gaagaataaa 720

aaaatccaaa tgctaggtga ccatagcatc gtcacttttt ccacaaattt ttataagcct 780

agtcacatct tgatgaaacg acttttagat atacttggag cagtagtcgg gttaattatt 840

tgtggtatag tttctatttt gttaattcca attattcgta gagatggtgg accagccatt 900

tttgctcaga aacgagttgg acagaatgga cgcatattta cattctacaa gtttcgttcg 960

atgtttgttg atgccgaggt acgtaagaaa gaattaatgg ctcaaaacca gatgcaaggt 1020

gggatgttca aaatggacaa cgatcctaga attactccaa ttggacactt catacgaaaa 1080

acaagtttag atgagttacc acaattttat aatgttctaa ttggagatat gagtctagtc 1140

ggtacccgtc cgcctacagt tgatgaattt gaaaaatata ctcctagtca aaagagaaga 1200

ttgagtttta aaccagggat tacaggtctt tggcaagtga gcggaagaag tgatatcaca 1260

gattttaatg aagtcgttag gctggaccta acatacattg ataattggac catctggtca 1320

gacattaaga ttttattgaa gacagtgaaa gttgtattgt tgagagaggg aagtaagtaa 1380

atgagaacag tttatattat tggttcaaaa ggaataccag caaagtatgg tggtttcgag 1440

actttcgtag aaaaattaac tgagtatcag aaagataaat caattaatta ttttgttgca 1500

tgtacaagag aaaattcagc aaaatcagat attacaggag aagtttttga acataatgga 1560

gcaacatgtt ttaatattga tgtgccaaat attggttcag caaaagccat tctttatgat 1620

attatggctc tcaagaaatc tattgaaatt gccaaagata gaaatgatac ctctccaatt 1680

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ttggttgttg gacgatttgt gcctgaaaat aactatgaag taatgattcg agagtttatg 2100

aaatcatatt caagaaaaga ttttgttttg ataacgaatg tagagcataa ttccttttat 2160

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gtctataatc aggagctgtt aaaatatatt cgtgaaaatg catttgctta ttttcatggt 2280

cacgaggttg gaggaacgaa cccatcttta cttgaagcac tttcttctac taaactaaat 2340

cttcttctag atgtgggctt taatagagaa gtaggggaag aaggagcgaa atactggaat 2400

aaagataatc ttcacagagt tattgacagt tgtgagcaat tatcacaaga acaaattaat 2460

gatatggata gtttatcaac aaaacaagtc aaagaaagat tttcttggga ttttattgtt 2520

gatgagtatg agaagttgtt taaaggataa 2550

<210> 2

<211> 3180

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 2

atgtatataa caactgcaga cgtttttatg acgtccatat ataacaaaaa ggagttttat 60

atgaagatta gaaaccgttc tctcttctat accgtaggtt ctgtagcggt aacagccgga 120

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ggaactagcg atacatacat gaagcgagct gggatcaaac cagctacagc gattgaaatc 480

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ggtgatacag tccaattaac aggaacattg ggtgagtata aaggcgaact ccaactaacc 780

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ggagatattc aaagcgatag ctatcaaaat tctaccttta ccgtaactga ctccgaagga 960

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gcaggactag gaaagaccga agctgtaaca gtcggtcgca ttcaaggtgc aagtcaccag 1200

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gccaataact tctacgtgca agatgtcaca ccagatggag acaccaaaac atctgacggc 1320

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gactatttca tcggtcgtat cgctggacca gtcacctact cttacaccaa ttataaagtc 1860

tatgtagatg atagcaccct tccaacattg cacgaaggag ctacaaaacc agaaacaaca 1920

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caagagggag gcaatattcg cgtcggcttc ctctacaact caaaacgtgt cagcctatct 2280

gacaaaccaa tcggtaccgc aacacaggca gttgcatggg aaaacggcga actcaatctc 2340

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aatgctaata tcgttatgct aggcgacttc aatgactatg aatttactaa aaccatagaa 2640

attttagaag caggaggaat ggctaacctc gttagtcgtc acgatgcatc cgatcgcttc 2700

tcttacttct ataacggaaa taatcagtct cttgacaata tgctagtatc aactaacttg 2760

ttggagcgct atgcctttga tatggtccat gtcaattcag cctttatgga agaacatggc 2820

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actcaaccag aaccaagcga caagcagaca gatgactcag gaacagtcaa taatagtgat 2940

gacaatggta cgaccaacaa taacaagcca acaaatcttt caacttctaa tcaaacagct 3000

gtaaatgctg atgaccgttc tggcgctaca gacaagagac aaacaaccgt gacccctact 3060

gccaacaaca gtcaaaagaa aatccttcca aagacaggag gagaaacaag ctttgtactt 3120

atcacaatcg gtctcgtatt cttgagcgcc tgtcttgtca aaaaacaaaa agaatcctaa 3180

<210> 3

<211> 1497

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 3

atgagaaaaa gttcgcactt gattttaagc tcaatagtca gtttggcact cgtaggggtc 60

acaccattga gtgttcttgc agattccaaa caagatatta atcagtattt tcaaagcttg 120

acttacgagc cacaagagat tcttacaaat gagggagaat acattgataa tccgccagca 180

acaactggta tgttagaaaa cggacgtttt gtagtacttc gcagagaaaa gaagaatatt 240

acgaacaata gtgcagatat tgctgttatt gatgctaagg ctgcaaatat ttatccaggt 300

gctttattgc gtgctgacca aaatcttctg gataataatc caacgcttat cagtattgcg 360

cggggagatc tgacgcttag tttgaattta cctggtttgg ccaatgggga tagccacact 420

gttgtaaatt ctccaacaag aagtactgtt cgaacagggg tgaataacct tctgtctaaa 480

tggaataata cgtatgctgg agagtatggc aatacccaag cagagcttca atatgatgaa 540

acaatggcat acagtatgtc acaattgaaa acgaagttcg gaacctcttt tgaaaaaatt 600

gctgtaccat tagatatcaa ttttgatgcc gtgaattcgg gtgaaaaaca ggttcagatt 660

gttaacttta aacaaattta ttatacagtt agtgttgatg aaccagaatc tccaagcaag 720

ctttttgcag aagggacaac tgtagaagat ttgaaacgaa atgggataac agatgaggta 780

cctcctgttt atgtttccag cgtttcttat ggacgctcta tgttcatcaa gttagaaact 840

agcagtagga gtacccaagt tcaagccgca tttaaagcag ccatcaaagg cgttgatatt 900

agtggcaatg ctgagtatca agacattctg aaaaatactt cattctctgc ttatattttt 960

ggtggggatg caggtagcgc ggctactgtt gtgagcggaa atattgaaac actgaagaag 1020

attattgaag aaggtgcaag atacggaaaa ctcaatccat taggtgttcc gatttcgtat 1080

tcaaccaact ttgtcaaaga caatagacct gctcagattt tgagcaattc agagtacata 1140

gaaacaactt caacagtcca taatagcagt gcattgacat tggatcattc aggtgcttat 1200

gttgcgaaat acaacattac ttgggaagaa gtatcttaca atgaagctgg agaagaagtt 1260

tgggaaccaa aagcttggga taagaatggt gtaaatctga cctcacactg gagtgaaacc 1320

attcaaattc caggaaatgc tcgcaatctt catgtcaata ttcaagaatg tacaggatta 1380

gcatgggagt ggtggagaac agtttatgac aaagatttac cacttgttgg tcaacgtaaa 1440

ataaccatct ggggaacaac gttataccca cagtatgcgg atgaggtgat agagtaa 1497

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 4

aaagaattcg gctcgtgcta tattctcttg g 31

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 5

gaatcttttt cataacagct cctccactat ttc 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 6

gaaatagtgg aggagctgtt atgaaaaaga ttc 33

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 7

aaagaatccg gtttgccaca gcctgtg 27

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 8

cgactactgc tccaagtata tct 23

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 9

ggcgaattct gttcgcatca gtcgtag 27

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 10

gaaccagggc gtatctcttc atataaaact cctttttgtt at 42

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 11

gaaagatcgc cgtgtaatca ttttttgagc ttgaaagcat gac 43

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 12

cgaggatccc aatttcaacc tcggtcgctc 30

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 13

accattagag ctcaattttg atgccgtg 28

<210> 14

<211> 31

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 14

tctccaccac tcaaataaat tgagttttcc g 31

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 15

gatacggaaa actcaattta ggtgttc 27

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 16

gaatacgaaa tcggaacacc taaattgagt tttc 34

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 17

gatacggaaa actcaattta ggtgttc 27

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型05ZYH33(Streptococcus suis Serotype 2 05ZYH33)

<400> 18

gaatacgaaa tcggaacacc taaattgagt tttc 34

Claims

1.一种猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌，其特征在于：所述菌株命名为streptococcus suis type 2△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，简称为：△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，其保藏编号为：CCTCC NO：M2016584；所述猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌由以下方法制备而成：

1)以猪链球菌2型05ZYH33株全基因组为模板，设计敲除cpsEF基因和ssna基因的引物、以及构建sly基因点突变的引物对，

构建sly基因点突变的引物对包括ssna上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对，以及353位点点突变的引物；其中，

a.构建敲除cpsEF基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

ECORI-E-1：AAAGAATTCGGCTCGTGCTATATTCTCTTGG，

RONGHE-EF-2：GAATCTTTTTCATAACAGCTCCTCCACTATTTC；

下游同源臂正反向引物：

RONGHE-EF-1：GAAATAGTGGAGGAGCTGTTATGAAAAAGATTC，

BAMHI-F-2：AAAGAATCCGGTTTGCCACAGCCTGTG；

b.构建敲除ssna基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

DSsnA-LF1:GGCGAATTCTGTTCGCATCAGTCGTAG，

DSsnA-LR1:GAACCAGGGCGTATCTCTTCATATAAAACTCCTTTTTGTTAT；

下游同源臂正反向引物：

Dssna-RL1:GAAAGATCGCCGTGTAATCATTTTTTGAGCTTGAAAGCATGAC，

Dssna-RR1:CGAGGATCCCAATTTCAACCTCGGTCGCTC；

c.构建SLY基因点突变的引物

上游同源臂正反向引物：

SLY-SacI-L1：ACCATTAGAGCTCAATTTTGATGCCGTG，

SLY(P353L)-R1：

TCTCCACCACTCAAATAAATTGAGTTTTCCG；

下游同源臂正反向引物：

SLY(P353L)-L2：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-BamHI-R2：

GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；

353位点点突变的引物：

SLY-P353L-L：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-P353L-R：

GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；

2)从猪链球菌2型野生菌株SC19中提取细菌基因组；

5)将猪链球菌2型菌株SC-19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-cpsEF加入到SC-19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布TSA平板上培养，得到单菌落；鉴定该菌落并命名为缺失突变体△cps-SC19；

8)将cps基因敲除的突变菌株△cps-SC19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-ssna加入到△cps-SC19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布平板上培养，得到单菌落；鉴定该菌落并命名为缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19；

11)将猪链球菌缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-sly-del353加入到△cps/ssna-SC19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布得到平板上培养，得到单菌落；鉴定该菌落并命名为缺失突变体△sly/cps/ssna-SC19；

12)将缺失突变体△sly/cps/ssna-SC19制作电转感受态细胞，将pSET4s-sly质粒电转到感受态细胞中，利用温度和抗性诱导质粒和细菌基因组发生重组交换，利用SLY-SacI-L1、SLY-BamHI-R2引物进行PCR扩增，能扩增得到且仅有一条1200bp条带的菌株，为筛选得到正确的菌株，命名为猪链球菌cps和ssna基因敲除以及溶血素基因定点突变菌株streptococcus suis△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，即猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌。

2.一种权利要求1所述猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌在制备预防多种血清型猪链球菌引起疫病的弱毒疫苗或灭活疫苗中的应用；所述弱毒疫苗为液体制剂，每毫升的液体制剂中△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19基因工程菌株的数量为2～8*10^8；

或者，所述灭活疫苗为乳剂，所述灭活疫苗是由水相与油相按体积比1∶1～2混合，所述水相由灭活菌体与吐温-80按体积比为94∶4～8混合，所述油相由白油、司本-80按体积比为94∶4～8的比例制成，其中，灭活菌体中，菌体抗原浓度为3～6*10^10CFU/ml。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述灭活疫苗是由水相与油相按体积比1∶1.5混合，所述水相由灭活菌体与吐温-80按体积比为94∶6混合，所述油相由白油、司本-80按体积比为94∶6的比例制成，其中，灭活菌体中，菌体抗原浓度为4*10^10CFU/ml。

4.一种制备权利要求2所述弱毒疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

5.一种制备权利要求2所述灭活疫苗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

6.一种构建权利要求1所述猪链球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

a.构建敲除cpsEF基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

ECORI-E-1：AAAGAATTCGGCTCGTGCTATATTCTCTTGG，

RONGHE-EF-2：GAATCTTTTTCATAACAGCTCCTCCACTATTTC；

下游同源臂正反向引物：

RONGHE-EF-1：GAAATAGTGGAGGAGCTGTTATGAAAAAGATTC，

BAMHI-F-2：AAAGAATCCGGTTTGCCACAGCCTGTG；

b.构建敲除ssna基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

DSsnA-LF1:GGCGAATTCTGTTCGCATCAGTCGTAG，

DSsnA-LR1:GAACCAGGGCGTATCTCTTCATATAAAACTCCTTTTTGTTAT；

下游同源臂正反向引物：

Dssna-RL1:GAAAGATCGCCGTGTAATCATTTTTTGAGCTTGAAAGCATGAC，

Dssna-RR1:CGAGGATCCCAATTTCAACCTCGGTCGCTC；

c.构建SLY基因点突变的引物

上游同源臂正反向引物：

SLY-SacI-L1：ACCATTAGAGCTCAATTTTGATGCCGTG，

SLY(P353L)-R1：

TCTCCACCACTCAAATAAATTGAGTTTTCCG；

下游同源臂正反向引物：

SLY(P353L)-L2：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-BamHI-R2：

GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；

353位点点突变的引物：

SLY-P353L-L：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-P353L-R：

GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；

2)从猪链球菌2型野生菌株SC19中提取细菌基因组；

3)以细菌基因组为模板，用上述cpsEF上游同源臂正反向引物对和下游同源臂正反向引物对进行PCR，纯化回收得到上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物，将上游同源臂PCR产物和下游同源臂PCR产物进行融合PCR，得到融合产物cpsEF-LR；4)用EcoRI和BamHI将融合产物cpsEF-LR和载体pSET4s分别进行双酶切，并将产物cpsEF-LR和线性化的载体pSET4s连接，得到重组质粒pSET4s-cpsEF；

8)将cps基因敲除的突变菌株△cps-SC19制作电转感受态细胞，将重组质粒pSET4s-ssna加入到△cps-SC19感受态细胞中进行电转，复苏后涂布平板上培养，得到单菌落；鉴定该菌落并命名为缺失ssna 和cps的菌株△cps/ssna-SC19；