CN110013547B

CN110013547B - 一株重组小反刍兽疫病毒h基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法

Info

Publication number: CN110013547B
Application number: CN201910284617.3A
Authority: CN
Inventors: 丁家波; 蒋卉; 冯宇; 朱良全; 范学政; 秦玉明; 彭小薇; 许冠龙; 沈青春
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2019-04-10
Filing date: 2019-04-10
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2039-04-10
Also published as: CN110013547A

Abstract

本发明涉及一株重组小反刍兽疫病毒H基因的粗糙型布鲁氏菌的构建及其疫苗。本发明以粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株RA343株为亲本株，以蔗糖自杀质粒为载体，将含有特定启动子序列的小反刍兽疫病毒H基因经密码子优化后无痕插入到了布鲁氏菌基因组中，成功构建了能够高效表达型重组小反刍兽疫病毒H基因的重组布鲁氏菌RA343‑PPRV‑H株。该重组菌株不仅保留了原始亲本株RA343的粗糙型特性，对布鲁氏菌病(布病)良好的免疫保护性，而且该重组菌免疫动物后，能产生针对小反刍兽疫的特异性中和抗体，从而实现对小反刍兽疫的免疫保护。用该重组苗株制备的疫苗，免疫动物后能同时实现对布病和小反刍兽疫的双重免疫保护。

Description

一株重组小反刍兽疫病毒H基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法

所属技术领域

本发明涉及一株小反刍兽疫病毒H基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法，属于兽用生物制品领域。

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。

2007—2012年间，本实验室陆续从我国不同省份和地区牛、羊、犬和鹿等动物体内分离到牛种布鲁氏菌41株，羊种布鲁氏菌74株，犬种布鲁氏菌9株。研究过程中，我们初步发现了一株牛种布鲁氏菌分离株，其毒力介于强毒和疫苗毒之间，专利申请人已对其进行了全面的生化检定，并分别用小鼠和豚鼠测定了其毒力。结果发现其毒力介于强毒和弱毒之间，测定为中等毒力布鲁氏菌，命名为Abortus 343。本发明对此分离株进行了诱导和驯化，筛选获得了稳定的粗糙型布鲁氏菌疫苗株，命名为RA343，并已取得相关专利(ZL201410240895.6)。目前该疫苗株已经完成了全部的实验室研发和临床试验，进入新兽药注册环节。

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是一种由副黏病毒科麻疹病毒属PPRV(Peste des petits ruminants virus)引起的小反刍动物的A类传染性疾病，以引起山羊、绵羊及野生小反刍动物发生发热、口炎、腹泻、肺炎等症状，属于OIE列出的法定通报性疾病。今年来，PPRV全球疫情趋于复杂，老挝、孟加拉国、印度等我国周边多个国家呈地方性流行态势。2013年底，PPR由境外传入我国新疆地区，之后迅速蔓延至全国多个省份。目前小反刍兽疫的防控主要是以弱毒疫苗免疫为主。但是弱毒疫苗存在着病毒的重组、突变和毒力增强的风险，且难以区分疫苗毒与野毒的抗体。重组活载体疫苗具有安全性高等优点，PPRV具有免疫保护性的蛋白主要是H和F蛋白，由于H蛋白较F蛋白能产生更高水平的中和抗体，所以H蛋白是目前PPR亚单位疫苗和重组活载体疫苗的主要免疫性抗原。

发明内容

本发明的目的以粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株RA343株为亲本株，利用蔗糖自杀质粒为载体，将含有特定启动子序列的小反刍兽疫病毒H基因经密码子优化后无痕插入到了布鲁氏菌基因组中，成功构建了能够高效表达小反刍兽疫病毒H基因的重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株。该重组疫苗株不仅保留了原始亲本株RA343的粗糙型特性，对布鲁氏菌病(布病)良好的免疫保护性，而且该重组菌免疫动物后，同时能产生针对小反刍兽疫病毒的抗体，从而实现对小反刍兽疫的免疫保护。该重组菌制备的疫苗，免疫动物后能同时实现对布病和小反刍兽疫的双重免疫保护。

本发明技术方案

1.一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗免疫动物后能同时实现对布鲁氏菌病和小反刍兽疫的双重免疫保护；其生产菌株是含有能够高效表达小反刍兽疫病毒H基因的重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株(本发明简称重组菌RA343-PPRV-H株)；该菌株是通过将P₃启动子与小反刍兽疫病毒H基因序列进行密码子优化，人工合成基因片段，并构建含有P₃-PPRV-H序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自杀质粒载体pUC/P₃-PPRV-H⁺，将小反刍兽疫病毒H基因表达框部分无痕插入到布鲁氏菌基因组中，通过氨苄和蔗糖双重筛选，筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测序鉴定其稳定性，获得重组布鲁氏菌(Bovinebrucella)RA343-PPRV-H株，并已于2019年04月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.16860。

2.如本发明所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于其生产用重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株区别于其他细菌的特异性是采用一对分别针对布鲁氏菌基因组和小反刍兽疫病毒H基因的特异性PCR引物(序列21，序列22)，扩增出大小为679bp的特异性片段(序列23)；

小反刍兽疫病毒H基因的表达验证是通过实时荧光定量PCR(qPCR)的方式验证H基因转录组水平的表达；

通过蛋白印记法(Western Blot)验证H基因在蛋白水平的表达；

将重组菌免疫小鼠，监测小鼠体内小反刍兽疫病毒抗体的表达情况。

3.本发明所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗的生产方法是用胰蛋白胨大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCC No.16860株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.16860株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为布鲁氏菌RA343-PPRV-H株活疫苗。

4.本发明所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗免疫效果是通过将疫苗免疫动物后，分别采用布鲁氏菌及小反刍兽疫进行攻毒保护试验进行评价。

本发明有益效果

1.布鲁氏菌病和小反刍兽疫目前已成为对我国羊养殖业危害最大的两个人畜共患病。本发明用布鲁氏菌疫苗RA343为载体，构建了能成功表达了小反刍兽疫病毒H基因的新型疫苗株，巧妙解决了两种重要疾病(布鲁氏菌病和小反刍兽疫)的防控难题，实现了“一针防两病”的构想，减少了生产实践中的免疫成本和劳动力成本。2.目前就全球范围内，困扰布病免疫防控的关键技术难题是疫苗免疫产生的抗体(光滑型抗体)干扰了布病的临床诊断。而本发明巧妙采用粗糙型布鲁氏菌(RA343株)作为载体，疫苗免疫动物后产生的是粗糙型抗体，不干扰布病的临床诊断，从根本上改进了现有布病疫苗的弱点。3.本发明通过重组布鲁氏菌表达PPRV的H蛋白，诱导机体产生针对小反刍兽疫病毒的中和抗体，解决了当前小反刍兽疫弱毒疫苗可能会增加病毒重组、突变和毒力增强等问题，并且可以通过血清学检测免疫动物是否感染PPRV野毒等优点。4.为了确保小反刍兽疫病毒H基因稳定高效表达，本发明一方面采用无痕插入技术代替质粒介导，直接将H基因插入到布鲁氏菌疫苗株RA343的基因组中，并通过传代验证了其稳定性，从而确保了外源基因不会因为在生产传代过程中被丢失。另一方面，发明实施过程中我们以布鲁氏菌易于翻译的密码子代替H基因中稀有密码子，这种对密码子进行优化的方法促进了外源基因的高效表达。

常规动物活疫苗一般情况下都需要在-20℃保藏和运输，本发明设计了4组不同耐热保护剂配方，并优化出其中的一种最优配方作为实际采用的冻干保护剂，使本发明可以在4℃长期保存，减少了储藏和运输成本。

本发明涉及微生物资源信息

本发明中涉及的微生物资源为牛种布鲁氏菌RA343株，该株菌是2009年本实验室从山东某奶牛场流产牛体内分离到一株牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)分离株A343株的诱导和驯化而获得一株粗糙型弱毒菌株，该株均已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.8886；牛种布鲁氏菌2308株菌(即为CVCC 788株)，羊种布鲁氏菌BM28株菌(即为CVCC 920株)由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保藏和供应，见中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版，中国农业科技出版社，2002，p24、p29)。

附图说明

图1绿色荧光质粒GFP-pZL1790质粒图谱。

图2重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株PCR特异性结果图中1为marker，2为重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株，3为大肠杆菌，4为葡萄球菌和5为沙门氏菌。

图3qPCR验证H基因相对表达量(The relative expression of PPRV-H gene)图中纵坐标为相对表达值。1为布鲁氏菌RA343，2为重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株。

图4重组疫苗Western Blot鉴定图中纵坐标为450nm吸收值(absorbamce at450nm)；横坐标为感染后的时间(day post infenction)。1为重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株，2为布鲁氏菌RA343，3.为marker。

图5H基因诱导的特异性抗体反应结果。

图6冻干曲线示意图。

发明具体实施方法

1.重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株的构建

(1)布鲁氏菌RA343表达外源基因的启动子筛选(详见实施例1)

根据布鲁氏菌RA343(CGMCC No.8886，ZL201410240895.6)全基因组及基因功能预测的分析，筛选出三个在布鲁氏菌中可持续高水平表达的分子伴侣的启动子P1、P2、P3，并分别在绿色荧光质粒GFP-pZL1790(本实验室构建)的绿色荧光基团上游插入布鲁氏菌启动子P₁、P₂、P₃及常见启动子tac、trc、T7，构建六种携带不同启动子的绿色荧光质粒P₁-GFP-pZL1790，P₂-GFP-pZL1790，P₃-GFP-pZL1790，tac-GFP-pZL1790，trc-GFP-pZL1790，以及T7-GFP-pZL1790。分别将其电转到布鲁氏菌RA343株中，通过绿色荧光蛋白相对表达量的高低筛选出适合的用于外源基因表达的强启动子P₃。

(2)通过将P₃启动子与PPRV的H基因序列进行密码子优化，人工合成基因片段，并构建含有P₃-PPRV-H序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自杀质粒载体pUC/P₃-PPRV-H⁺，将PPRV的H基因表达框部分无痕插入到布鲁氏菌基因组中，通过氨苄蔗糖双筛选筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测序鉴定其稳定性，获得重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株。

2.重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株的常规生物学特性

(1)形态和生化特性

RA343-PPRV-H株重组布鲁氏菌菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察微带蓝色乳光。染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。大小在0.3～0.6μm之间。革兰氏染色为阴性。该菌的生长不依赖于CO₂，能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长，H₂S试验强阳性。

(2)热凝集试验、吖啶黄实验和菌落结晶紫试验结果表明重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株菌保留了RA343粗糙型的特性。

(3)特异性

1)血清学特异性以重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清应不出现凝集，与粗糙型血清应出现凝集。

2)PCR特异性重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株区别于其他细菌的特异性是采用一对分别针对布鲁氏菌基因组和H基因的特异性PCR引物(序列21，序列22)，扩增出大小为679bp的特异性片段(序列23)；扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现1条特异性PCR条带(附图2)，大小为679bp。此法作为有别于其他细菌的鉴定方法。

(4)毒力

用生理盐水将在固体培养基上培养48～72h的重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株培养物洗下，稀释成每毫升含活菌10亿的悬液，腹股沟皮下注射体重350～400g的豚鼠(Hartley品系)5只，1ml/只。经14～15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种TSA平板，根据其生长的菌落数，计算吞噬脾脏的含菌量，每1g脾脏含菌量应不超过20万个。

(5)小鼠的安全性

体重20～20g的Balb/C小鼠分成5只/组，将重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株菌稀释成1×10¹²CFU/ml至1×10⁸CFU/ml的菌悬液，腹股沟皮下注射0.1ml/只，同时设立对照组。接种后1周内观察并记录小鼠的健康状况，结果接种10¹¹CFU/只及以下重组菌的免疫组的小鼠6日全部健活。结果表明重组布鲁氏菌以不同剂量免疫非靶动物具有良好的安全性。

3.重组布鲁氏菌(RA343-PPRV-H株)活疫苗的制备

该疫苗是用表达小反刍兽疫病毒H基因的重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株作为生产菌株，其生产方法是：以用胰蛋白胨大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCC No.16860株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.16860株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂，优选为耐热保护剂，经充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为重组布鲁氏菌(RA343-PPRV-H株)活疫苗，该疫苗免疫动物后能同时实现对布病和小反刍兽疫的双重免疫保护。

实施例

以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。

实施例1——重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株的构建

1.布鲁氏菌RA343感受态细胞的制备

挑取布鲁氏菌RA343株单个接菌落，接种与100ml TSB培养基中培养至细菌生长对数期，放冰水中冷却。12000r/min离心10min，弃去液体培养基，再分别用不同体积的无菌去离子水反复洗涤数次。最后将获得的菌体重悬于1ml 10％的甘油水溶液中，将制备完成的亲本株RA343株感染态细菌置于-80℃保存备用。

2.布鲁氏菌RA343表达外源基因的启动子筛选

(1)绿色荧光质粒GFP-pZL1790的构建

pZL1790质粒由本实验室保存，GFP绿色荧光基因由上海生工公司合成，设计引物(序列28和序列29)扩增绿色荧光基因并添加酶切位点，引物序列如下：

序列28 GFP-F：tgagtcgaca tggtctcgaa gggcgaagaa 30

序列29 GFP-R：ataccgcggt tacttataca gttca 25

上游引物加入Sal I酶切位点，下游引物加入Sac I酶切位点，使用上述引物以GFP绿色荧光基因为模板进行PCR，反应体系如下：

PCR反应体系(50μL)：

Max 2×buffer 25μL，上下游引物(10μM)各1μL，ddH₂O 22μL，模板DNA 1μL。

反应条件：95℃5min；95℃30s、56℃30s、72℃30s，31个循环；72℃10min。

将6×Loading Buffer100μL与PCR扩增产物20μL充分混匀后加入0.8％的琼脂糖凝胶孔中，150V电泳25min左右，用凝胶成像系统成像分析，切取含目的片段的琼脂糖凝胶块，按照Takara凝胶回收试剂盒(Code No:9762)说明书进行PCR产物的回收纯化。对绿色荧光基因回收产物与pZL1790质粒进行定量后，分别进行双酶切，反应体系如下：

Sal I 1μL，Sac I 1μL，10×buffer 5μL，核酸1μg，ddH₂O补齐至50μL。

37℃酶切30min后，将酶切产物进行连接，反应体系如下：

T4连接酶1μL，10×buffer 2μL，酶切后pZL1790质粒2μL，酶切后绿色荧光基因15μL。将反应体系放入4℃冰箱连接过夜。将连接后重组的绿色荧光质粒GFP-pZL1790通过热激转化法转化到DH5α感受态细胞中进行分子克隆，使用含有氯霉素的培养基进行筛选，并测序获得阳性质粒(图1)。

(2)三种布鲁氏菌启动子及三种常用启动子

根据布鲁氏菌RA343全基因组及基因功能预测的分析，筛选出三个在布鲁氏菌中可持续高水平表达的分子伴侣启动子P1、P2、P3，将其密码子优化后在上海生工公司合成了含有启动子P₁，P₂，P₃以及常见启动子tac，trc和T7序列的质粒，使用不同启动子各自的引物(表1)分别扩增出启动子P₁，P₂，P₃，tac，trc和T7的PCR产物(添加KpnI和EcoRI酶切位点)，PCR反应体系与条件如下：

PCR反应体系(50μL)：

表1启动子PCR扩增引物表

(3)启动子PCR产物电泳与纯化

将6×Loading Buffer100μL与PCR扩增产物20μL充分混匀后加入0.8％的琼脂糖凝胶孔中，150V电泳25min左右，用凝胶成像系统成像分析，切取含目的片段的琼脂糖凝胶块，按照Takara凝胶回收试剂盒(Code No:9762)说明书进行PCR产物的回收纯化。

(4)载有启动子的绿色荧光蛋白质粒的构建

PCR产物纯化后用KpnI和EcoRI双酶切后分别克隆至相同限制酶双酶切的质粒GFP-pZL1790上，构建出6个理论上能够在布鲁氏菌中表达出绿色荧光蛋白质粒：P₁-GFP-pZL1790，P₂-GFP-pZL1790、P₃-GFP-pZL1790、tac-GFP-pZL1790，trc-GFP-pZL1790和T7-GFP-pZL1790。构建好的质粒经过测序验证后，电转化入布鲁氏菌RA343株菌中。

(5)电转化

取3μg的YGT-pZL1790(作为阴性对照)、P₁-YGT-pZL1790、P₂-YGT-pBBR1mcs2、P₃-YGT-pZL1790、tac-YGT-pZL1790、trc-YGT-pZL1790和T7-YGT-pBBR1mcs2质粒分别加入到50μL的RA343感受态细菌中，充分混匀后转移到电击杯中电击。电击电压和时间分别为：1.8kv，3ms。电击完成后，立即加入1mlTSB培养基在37℃摇振培养4h，然后将菌液涂布到2块含50μg/mL卡那霉素的TSA培养皿中，37℃培养48h以上，生长出的菌落即为电转化阳性菌。得到的基因工程重组菌命名为RA343-YGT-pZL1790(作为阴性对照)、RA343-P₁-YGT-pZL1790、RA343-P₂-YGT-pZL1790、RA343-P₃-YGT-pZL1790，RA343-tac-YGT-pZL1790、RA343-trc-YGT-pZL1790和RA343-T7-YGT-pZL1790。

(6)通过布鲁氏菌细胞感染实验筛选强启动子

小鼠巨噬细胞RAW264.7传代至六孔板，分别编为RA343组、RA343-P₁-YGT-pZL1790、RA343-P₂-YGT-pZL1790和RA343-P₃-YGT-pZL1790、RA343-tac-YGT-pZL1790、RA343-trc-YGT-pZL1790和RA343-T7-YGT-pZL1790组，培养至铺满6孔板底部。将对应菌接种到20ml的TSB培养基中，180r/min，37℃恒温摇床培养至对数期。收菌，PBS反复重悬菌体。按照布鲁氏菌与RAW364.7感染比(MOI)50:1、200:1、500:1三个感染强度分别进行感染，然后置于CO₂浓度为5％的37℃恒温培养箱。侵染1h后六孔板中每孔加入终浓度为50μg/ml的庆大霉素，作用45min。感染24h、48h、72h之后的小鼠巨噬细胞用PBS清洗3次以终止侵染。加入甲醛固定液进行固定，然后用荧光显微镜在激发光下进行荧光检测，并根据相同激发光强度下绿色荧光的强弱筛选出了强启动子P₃。

3.小反刍兽疫病毒H基因的密码子优化及无痕插入

(1)穿梭质粒pUC/P₃-PPRV-H⁺的构建

在上海生物工程有限公司人工合成并密码子优化了的启动子P₃及小反刍兽疫病毒H基因序列，以克隆质粒作为模板，以PPRV-H-F(序列13)、PPRV-H-R(序列14)作为引物扩增PPRV-H基因；以布鲁氏菌RA343基因组DNA为模板，设计引物up-F(序列15)、up-R(序列16)、down-F(序列17)、down-R(序列18)分别扩增1号染色体814594位上游941bp碱基为上同源臂，下游781bp碱基为下同源臂(上下游同源臂分别添加XbaI和BamHI限制酶切位点)，将启动子P₃及小反刍兽疫病毒H基因无痕插入到布鲁氏菌基因组中，引物如表2所示：

表2 wboA基因上下游同源臂引物

PCR反应体系均为：50μL的反应体系中，含25μL 2×Buffer，混合引物储存液2μL，Taq酶1μL，模板DNA 1μL，ddH₂O 21μL。

PCR反应程序均为：95℃5min；95℃30s、56℃30s、72℃60s，31个循环；72℃10min。

将PCR扩增的布鲁氏菌上下游同源臂及小反刍兽疫病毒H基因片段的PCR产物进行纯化回收，测定浓度后按照公式计算融合PCR中各模板的用量：

并通过融合PCR将以上同源臂、H基因、下同源臂融合到一起。

PCR反应体系：50μL的反应体系中，含25μL 2×Buffer，混合引物储存液2μL，Taq酶1μL，模板DNA 2μL，ddH₂O 20μL。

PCR反应程序：95℃5min；95℃30s、56℃30s、72℃3min，31个循环；72℃10min。

通过XbaI和BamHI限制酶进行双酶切PCR胶回收产物及pUC19质粒，将融合片段连接到穿梭质粒pUC19的多克隆位点，获得重组穿梭质粒，命名为pUC/PPRV-H⁺。

(2)电转入

将以上制备的穿梭质粒pUC/P₃-PPRV-H⁺电转入至上述(1)所制备的布鲁氏菌RA343株感受态细菌中，具体方法为：

将1～10ng pUC/P₃-PPRV-H⁺质粒加入到50μL RA343株感受态细菌中，混匀。冰浴10min，吸取到2nm的电转化杯中进行点击。设定参数：2.5kV，5ms。电击完成后，电转化杯加入1ml TSB培养基，吸取菌悬液加入TSB培养基三角瓶中置37℃摇振培养至少4h。

(3)阳性重组菌RA343-PPRV-H株的筛选

氨苄青霉素筛选：将37℃振摇培养4h的菌液6000r/min离心3min，轻轻吸去部分上清，保留约200μL上清，并将沉淀菌体轻轻吹至均匀，然后全部菌落涂布到1块含50ug/ml氨苄青霉素的TSA培养基平板上，37℃培养至少72h。筛选含有氨苄青霉素的重组子。

蔗糖负筛选：在含氨苄青霉素的TSA平板上的挑取单个菌落，接种到不含氨苄青霉素的TSB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，培养24h后用生理盐水按1：10²、1:10³、1：10⁴倍稀释菌液，每稀释度各取菌液100μL涂布含5&蔗糖的TSA平板，37℃培养至少72h。

从5％蔗糖平板上随机挑取单个菌落，利用如下一对引物(序列19和20)进行菌落PCR筛选阳性重组菌，阳性菌的大小为2769bp；

序列19 F:ggagggacaa gcgtaaacca 20,

序列20 R:ccagtattcg gaagcgtgag c 21

同时进行测序验证启动子P₃与小反刍兽疫病毒H基因无痕插入到布鲁氏菌基因组中。将阳性重组菌为能够高效表达小反刍兽疫(H基因)的重组粗糙型布鲁氏菌(Brucella)RA343-PPRV-H株(简称布鲁氏菌RA343-PPRV-H株)，该菌株已于2019年04月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.16860；

实施例2——重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株的常规生物学特性

1.形态和生化特性

重组菌菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察微带蓝色乳光。染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。大小在0.3～0.6μm之间。革兰氏染色为阴性。该菌的生长不依赖于CO₂，能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长，H₂S试验强阳性。

2.热凝集试验

将重组菌株接种于TSA培养基，置于37℃培养46h，然后勾取培养物放入装有生理盐水约100ml的试管中，摇匀，使其比浊到含活菌10亿/ml的菌悬液，取出后的菌悬液分成2管，每管4-5ml,置90℃水浴中加热1h，在30min和60min时观察结果，重组菌株和亲本株均呈凝集阳性为粗糙型，重组菌保留了RA343粗糙型的特性。

3.吖啶黄实验

用蒸馏水配制1:500中性吖啶黄溶液，取吖啶黄溶液一滴置于玻片上，用接种环钩取少许培养48h的重组疫苗，与亲本株混匀，立即观察结果。3min内出现凝集，重组疫苗为粗糙型菌落。

4.菌落结晶紫试验

将重组株做10倍系列稀释，接种与TSA平板培养物上，置37℃培养72～96h，用蒸馏水将结晶紫储存液做1:40倍稀释，吸取适量的稀释染液覆盖长满单个菌落的TSA平板染色15～20s，弃去结晶紫染液于消毒液中，用放大镜或低倍显微镜观察菌落边缘着色情况。重组菌落边缘着色，界限不清晰，为粗糙型。

5.特异性

(1)血清学特异性以培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清应不出现凝集，与粗糙型血清应出现凝集。

(2)PCR特异性通过一对特异性PCR引物(序列21和22)该重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株菌能扩增出大小为679bp(序列23)的RA343-PPRV-H特异性片段，此法作为本菌有别于其他细菌的鉴定方法。

合成如下一对引物，将其配成引物混合储存液，各引物浓度均为25μM。

(序列21)RA343-PPRV-H-F：ggacaagcgtaaaccatctcg 23

(序列22)RA343-PPRV-H-R：taccagcaggactccaagcaa 21

模板：以RA343培养菌落或试剂盒提取的RA343基因组DNA。

PCR反应体系：50μL的反应体系中，含5μL 10×Buffer，8μL 2.5mM dNTPs，混合引物储存液2μL，Taq酶2U，模板DNA 1μL(或挑取菌落少许)。

PCR反应程序：95℃5min后，按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min进行28个循环，最后72℃10min。

扩增产物，用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现1条特异性PCR条带，大小为679bp，而使用其他菌株(大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌)基因组为模板则无条带产生(图1)。

序列23：

6.毒力用生理盐水将在固体培养基上培养48～72h的培养物洗下，稀释成每毫升含活菌10亿的悬液，腹股沟皮下注射体重350～400g的豚鼠(Hartley品系)5只，1ml/只。经14～15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种TSA平板，根据其生长的菌落数，计算吞噬脾脏的含菌量，每1g脾脏含菌量应不超过20万个。

7.小鼠的安全性

体重20～20g的Balb/C小鼠分成5只/组，将重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株菌稀释成1×10¹²CFU/ml至1×10⁸CFU/ml的菌悬液，腹股沟皮下注射0.1ml/只，同时设立对照组。接种后1周内观察并记录小鼠的健康状况，结果表明，重组疫苗的10¹¹CFU/只及以下免疫组的小鼠6日全部健活。结果表明重组疫苗以不同剂量免疫非靶动物具有良好的安全性。

实施例3——重组菌RA343-PPRV-H株在靶动物体内的稳定性

利用重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株菌以1×10¹⁰CFU/头份免疫成年绵羊的实验组，免疫后第3d采血接种于TSA培养基进行细菌分离，对分离菌进行PCR鉴定，并继续传代未免疫的成年绵羊，按此方法连续传5代。连续传代后的重组疫苗株表型没有发生改变，且1号染色体中插入的小反刍兽疫病毒H基因稳定存在。

实施例4——重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株中H基因的表达验证

1.qPCR验证H基因在转录水平的表达

吸取适量重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株与RA343亲本株菌液，80℃恒温水浴锅灭活菌液2h以上，用TAKARA细菌基因组提取试剂盒提取细菌RNA，进行反转录后以16s基因作为内参，通过qPCR对H基因转录的mRNA进行相对定量；所用引物如表3所示：

表3 qPCR引物列表

反应体系如下：2×Premix Ex Taq 10μL，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，Rox0.4μL，模板2μL,去离子水6.6μL。

反应条件如下：95℃30s，95℃5s、60℃34s 40个循环。

结果表明重组菌RA343-PPRV-H株H基因的mRNA的相对表达量显著高于亲本株RA343，H基因在转录水平有较高的表达量(图3)。

2.Western blot鉴定重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株H基因的表达

将布鲁氏菌重组RA343-PPRV-H株和亲本株RA343接种TSB培养基振荡培养24～48h，经超声波裂解，加上样缓冲液，沸水浴10min后进行SDS-PAGE和Wsetern Blot分析，结果发现重组菌株RA343-PPRV-H相对于亲本株RA343在88kD左右有明显条带，用蛋白印记法验证了H蛋白的表达(图4)。

3.重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H刺激小鼠的小反刍兽疫中和抗体

小鼠随机分成3组，每组30只。第一组腹股沟皮下免疫重组疫苗RA343-PPRV-H株，10⁹CFU/只；第二组腹股沟皮下免疫亲本株RA343株，10⁹CFU/只；第三组是空白组，免疫生理盐水，1ml/只。

免疫组小鼠免疫后14d起进行采血分离血清，通过间接ELISA方法，测定小反刍兽疫病毒H基因抗体。结果显示重组疫苗RA343-PPRV-H组小反刍兽疫病毒H基因抗体水平OD₄₅₀保持在1.0以上，为阳性，亲本株RA343组及空白组OD₄₅₀保持在0.5以下，为阴性(图5)。

实施例5——重组布鲁氏菌RA343-PPRV-H株活疫苗耐热保护剂筛选和效果验证。

依据RA343-PPRV-H的特性和共融性能，设计成4组耐热保护剂(分别标记为配方1、2、3和4)，按常规冻干曲线(图6)分别进行冻干，通过冻干前后以及冻干后37℃保存7日耐老化试验结果(表4)，确定耐热保护剂配方1冻干RA343-PPRV-H效果最好，冻干后不结晶，冻干菌存率达85.1％；37℃保存7日不萎缩，活菌减少率为12.8％。明显优于明胶蔗糖对照。

表4不同保护剂配方冻干结果(活菌数：10⁸CFU/ml)

保护剂配方及配制方法见下表5：

表5耐热冻干保护剂配方

注：配制方法

(1)溶液1：在洁净烧杯中，加入注射用水(100℃)适量，按配方依次称取PVP、甘露醇、海藻糖、硫脲加入烧杯中，边加入边用玻璃棒搅拌，使其完全溶解，再用注射用水定容至500ml，经116℃灭菌30min。

(2)溶液2：按配方依次称取BSA、199培养基、抗坏血酸、维生素C、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾于烧杯中，加入注射用水使其充分溶解后，定容至500ml，0.22μm滤膜的除菌滤器过滤除菌。

实施例6——重组布鲁氏菌株RA343-PPRV-H株活疫苗免疫后对布鲁氏菌和小反刍兽疫的免疫保护效果测定

(1)重组疫苗对布鲁氏菌免疫保护效果将45只清洁级绵羊随机分为三组，每组15只。一组口服免疫50亿CFU的RA343疫苗株，一组口服免疫50亿CFU的RA343-PPRV-H重组疫苗株，一组对照口服免疫相同剂量的生理盐水。免疫后第0d，7d，14d，28d，42d，60d采集血液，分离血清，用微量试管凝集方法检测布鲁氏菌抗体IgG。3个组免疫后第8周用最小感染量为5×10⁶CFU/只剂量B.melitensis M28株眼结膜感染攻毒。观察并记录采食情况、体重和精神状态等。攻毒后30d剖杀，取脾脏和腹股沟淋巴结，捣碎研磨，接种TSA培养基，37℃培养至少3d，分离细菌并鉴定。结果表明，免疫RA343及RA343-PPRV-H重组株免疫羊后7d开始出现布鲁氏菌抗体，7～28d抗体水平持续增加，免疫后28d抗体效价达到高峰，随后开始逐渐下降。对照组无抗体产生。羊的脾脏和腹股沟淋巴结细菌分离结果表明，重组菌RA343-PPRV-H株亲本株RA343均对羊能提供87％的免疫保护率。

(2)重组疫苗对小反刍兽疫免疫保护效果将40只清洁级绵羊随机分为两组，每组20只，实验组按照50亿CFU小反刍兽疫病毒卵囊皮下注射重组疫苗免疫成年绵羊，对照组皮下注射等剂量的生理盐水。30日后分别感染小反刍兽疫病毒。14d后观察两组绵羊的小反刍兽疫感染率，测定免疫重组疫苗组的免疫保护效果。结果对照组20只绵羊均发病，小反刍兽疫感染率100％；实验组仅有5只绵羊发病，小反刍兽疫感染率75％。说明重组疫苗对小反刍兽疫的免疫保护率达到75％，现实了良好的免疫保护效果。

序列表

<110> 中国兽医药品监察所

<120> 一株重组小反刍兽疫病毒H基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成(P1-F)

<400> 1

cggggtaccc cgtgtcagcc cgccatccac a 31

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成(P1-R)

<400> 2

ccggaattcg gtcacgccct cgaacttgc 29

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成(P2-F)

<400> 3

cggggtaccc cgatgcggtg gtaagctcct tca 33

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成(P2-R)

<400> 4

ccggaattcc ggcggcagcg cctcatacat t 31

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成(P3-F)

<400> 5

cggggtaccc cgaaatgtgc cgctcttctc gc 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成(P3-R)

<400> 6

ccggaattcc caggagttgg tcgttcccag a 31

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成(tac-F)

<400> 7

cggggtgcct cgaatagctg acgtgcca 28

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成(tac-R)

<400> 8

ccggaaaaag gacacacttt aacaataggc 30

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(trc-F)

<400> 9

cggggtttga caattaatca tccgg 25

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(trc-R)

<400> 10

ccggaacatt atacgagccg gatgatt 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(T7-F)

<400> 11

cggggttaat acgactcact ataggga 27

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成(T7-R)

<400> 12

ccggaatctc cctatagtga gtcg 24

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(PPRV-H-F)

<400> 13

tcccgcgcat taagagtaga cacggga 27

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成(PPRV-H-R)

<400> 14

acaagctgaa gcaagaagct ccgcatactc cttg 34

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成(up-F)

<400> 15

ggctctagaa tacgcttatt gagaatgttc g 31

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成(up-R)

<400> 16

tcccgtgtct actcttaatg cgcggga 27

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成(down-F)

<400> 17

caaggagtat gcggagcttc ttgcttcagc ttgt 34

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成(down-R)

<400> 18

ccggatccta agccgacgag caaatagaag g 31

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(F)

<400> 19

atcagttcta gagacaagga 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(R)

<400> 20

attgttacac cgctaccctg g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(RA343-PPRV-H-F)

<400> 21

ggacaagcgt aaaccatctc g 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(RA343-PRV-H-R)

<400> 22

taccagcagg actccaagca a 21

<210> 23

<211> 679

<212> DNA

<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 23

ggacaagcgt aaaccatctc gcgaacctcc aacttcataa ctctagcacc ggggggaaaa 60

cttttgtggc caatgtcacc acaaatgggt ctgcataacg gtccttgcca ttttaactat 120

aaatgagcta ttcccgcgca ttaagagtag acacgggaaa tcagtcgcgg atccgcgaaa 180

tgtgccgctc ttctcgctgg aaaattccag ggcgaaccag aaattcatcg atgcgattta 240

ttccgcgggc agaagcgggg tgagcgagac tgtgtgacgc ctgtaaagag tgcggggcaa 300

ggaatctgtt tttgtctggc tcttgtgact tgcagtgaaa aactgccttt cttatatacg 360

cctcgcacag ggctttgatg acaggccgga aaccggtccg ctttctggaa cccaaccttg 420

aagcaggcat tgtgaaaacc gataggaact gcccatggaa cgctcggtcg aggtcttggc 480

agtttgctga atggagagaa atatggctaa ggttattggt atcgatcttg gtacgaccaa 540

ctcctggatg tccgcacaaa gggagaggat caatgccttc tacaaagaca atcctcacaa 600

taagaaccat agggtgatcc tggatagaga acgcttggtc attgaaagac cctacatctt 660

gcttggagtc ctgctggta 679

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成(16S-F)

<400> 24

cacaagcggt ggagcat 17

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成(16S-R)

<400> 25

gcaactaagg gcgaggg 17

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(PPRV-H-F1)

<400> 26

tggattccct aacagagcag a 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(PPRV-H-R1)

<400> 27

cctggaaaca tcataagtgg c 21

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成(GFP-F)

<400> 28

tgagtcgaca tggtctcgaa gggcgaagaa 30

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(GFP-R)

<400> 29

ataccgcggt tacttataca gttca 25

Claims

1.一种重组小反刍兽疫病毒H基因的粗糙型布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗含有表达小反刍兽疫病毒H基因的重组布鲁氏菌RA343-PPVR-H株；该株于2019年04月02日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.16860。

2.根据权利要求1所述的重组小反刍兽疫病毒H基因的粗糙型布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗的生产方法是用胰蛋白胨大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCC No.16860株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.16860株种子菌液，37℃，发酵培养28～38h，加入冻干保护剂，经冷冻真空干燥，即成为重组小反刍兽疫病毒H基因的粗糙型布鲁氏菌活疫苗。