CN104031874A - 一种双基因缺失粗糙型牛种布鲁氏菌及其疫苗的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双基因缺失粗糙型牛种布鲁氏菌及其疫苗的生产方法。该重组菌株通过非抗性基因筛选技术，缺失牛种布鲁氏菌2308株WboA基因以及vjbR基因。上述2个基因的缺失，一方面使其失去了光滑型布鲁氏菌细胞壁LPS结构中O链形成的条件(WboA基因缺失导致)，菌落形态由光滑型转变为粗糙型；另一方面由于vjbR基因的缺失，导致重组菌的毒力和在细胞内生存能力下降，降低布鲁氏菌对靶动物的感染能力，进一步提高了疫苗的安全性。以此菌株生产疫苗将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，并有效提高现有疫苗的安全性。

Description

一种双基因缺失粗糙型牛种布鲁氏菌及其疫苗的生产方法

技术领域本发明涉及一种双基因缺失粗糙型牛种布鲁氏菌及其疫苗的生产方法。该疫苗为牛、羊和猪对布鲁氏菌病的预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。

技术背景

布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。布鲁氏菌疫苗免疫带来的主要问题是无法区分疫苗免疫和自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌病疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。

根据布鲁氏菌表型的差异，可将布鲁氏菌分为光滑型(S)和粗糙型(R)两类，目前在我国使用的布病活疫苗均为光滑型菌株，其免疫带来的主要问题是使用后无法区分疫苗免疫与自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。

虽然布鲁氏菌存在两种不同的表型，在凝集类抗体水平上无交叉反应，但却具有良好的交叉保护性，并且不同种来源的布鲁氏菌相互之间同样存在交叉保护能力。如果用粗糙型布鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗生产用菌株和野毒株。基于上述原因，人们对粗糙型布鲁氏菌疫苗株的研发从未间断过。到目前为止，成功开发出具有良好免疫原性的粗糙型布鲁氏菌疫苗株却鲜有报道。

最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家以牛种布鲁氏菌参考强毒株(2308株)为原始菌种，通过人工诱变的方法筛选获得了粗糙型布鲁氏菌疫苗株(RB51)，动物试验表明该菌株具有良好的免疫力。1996年被美国批准为牛用布病疫苗，现已在美国、欧洲及拉美等多个国家生产和广泛使用。由于知识产权等方面的 原因，我国尚未能成功引进RB51疫苗株。随后基因组测序研究表明，相对于原始菌2308株，RB51在WboA基因中有一个大小为711bp的插入(IS711)，从而导致WboA基因的破坏。

功能基因组学研究证实布鲁氏菌细胞壁脂多糖(LPS)中的O链组成决定了其光滑型或粗糙型的表型，O链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC等。WboA基因编码了一种糖基转移酶，该酶参与了布鲁氏菌LPS中O链的形成。因此，WboA基因得缺失或破坏同样会导致布鲁氏菌无法形成含有O链完成结构的LPS，从而表现为粗糙型。

本实验室曾以猪种布鲁氏菌疫苗株(S2株)为研究对象，构建了wbkC和wboA基因缺失的重组布鲁氏菌疫苗株，并比较了它们之间的免疫效果。其后，又进一步构建了wboA基因不完全缺失株，系统地研究了wboA基因不同长度缺失株的存活率、免疫保护性以及粗糙型表型等方面的特性，并最终确定了wboA基因1-897之间的片段为缺失的最佳片段区域。

随着RB51粗糙型布鲁氏菌疫苗株的广泛应用，其安全性也遭到了更多质疑。有研究表明，静脉注射全剂量RB51疫苗可引起试验牛严重的胎盘炎和胎盘感染，并能从奶液中分离到RB51。RB51疫苗同样会引起早期怀孕牛的流产等等。

基于上述研究背景，申请人以2308株为研究对象，通过基因同源重组和蔗糖敏感基因的负筛选技术，首先构建了布鲁氏菌2308株wboA基因(1-897#)缺失的粗糙型布鲁氏菌2308-wboA缺失株(该疫苗株实质上等同于RB51株疫苗株)，在此基础上，又利用同样的原理和技术，敲除了与布鲁氏菌毒力相关的另一个基因vjbR(1-614#)，获得了具有更好安全性，并保留有良好免疫原性的粗糙型牛种布鲁氏菌疫苗株2308-ΔWboA-ΔvjbR。

发明内容

本发明的目的是提供一种不干扰布病临床诊断的安全、高效的布病疫苗株及其疫苗生产方法。

本发明是采用蔗糖敏感基因的负筛选技术，缺失牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)2308株(本发明又简称为牛种布鲁氏菌2308株)wboA基因(1～897bp之间的序列)及vjbR基因(1-614bp之间的序列)，构建重组布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株，该重组菌使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型，其安全性满足疫苗生产要求。用该菌制备的疫苗免疫动物后，其血清用常规凝集试验即可与自然感染相区分。

本发明的技术方案

1基因缺失粗糙型布鲁氏菌，其特征在于采用非抗性筛选技术，缺失牛种布鲁氏菌2308菌株wboA基因1～897bp之间的序列，使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型；同时缺失了vjbR基因，使重组菌的安全性进一步提高。牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)2308-ΔWboA-ΔvjbR菌株制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，本菌株已于2014年5月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCC No.8884。

2一种基因缺失粗糙型布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗该疫苗含有活的布鲁氏菌CGMCC No.8884株和兽用生物制品常用的冻干保护剂。

3.一种基因缺失粗糙型布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用胰大豆肉汤作为重组菌疫苗制造用培养基，培养基灭菌后按培养基量的按1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.8884株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为2308-ΔWboA-ΔvjbR株基因缺失粗糙型布鲁氏菌活疫苗。

4.一种基因缺失粗糙型布鲁氏菌活疫苗的鉴别诊断，其特征在于使用如序列7、8和序列13、14所述序列的2对引物，通过PCR方法可对其进行特异性鉴别。

本发明是通过以下步骤实现的：

1.重组穿梭质粒的构建及转化

(1)蔗糖敏感基因(SucB^r)克隆以含有蔗糖敏感基因(SucB^r)的商品化质粒pKNG101(购自英国NCCB。)为模板，PCR扩增SucB^R基因，然后通过限制性内切酶NdeⅠ，将SucB^r基因克隆进pUC18载体中，构建重组质粒pUC-SacB。

(2)穿梭质粒pLR_(WboA)-SacB的构建将WboA基因(1～897位)的上、下游同源臂(L _(WboA)和R_(WboA))的PCR产物分别克隆进pUC18载体中，构建重组质粒pUC_(WboA)-L-R。通过一对引物，以pUC_(WboA)-L-R为模板，将包含L_(WboA)和R_(WboA)的片段扩增后通过SalⅠ和SmaⅠ克隆进pUC-SacB质粒中，获得重组穿梭质粒pLR_(WboA)-SacB。

(3)穿梭质粒pLR_(vjbR)-SacB的构建将vjbR基因的上、下游同源臂(L_(vjbR)和R_(vjbR))的PCR产物分别克隆进pUC18载体中，构建重组质粒pUC_(vjbR)-L-R。通过一对引物，以pUC _(vjbR)-L-R为模板，将包含L_(vjbR)和R_(vjbR)的片段扩增后通过EcoRⅠ和SphⅠ克隆进pUC-SacB质粒中，获得重组穿梭质粒pLR_(vjbR)-SacB。

(4)按常规方法制备布鲁氏菌2308株的感受态细胞，取50μl制备好的感受态细胞，加入5μl的pLR_(WboA)-SacB(浓度约为400μg/μl)，进行电转化。设定点转化参数为：Tc＝5ms,V＝2500v。

2.重组菌2308-ΔWboA的筛选与鉴定将电转化的2308涂布到含5μg/ml氨苄青霉素(Amp)的TSA平板上，利用pUC18载体中的氨苄抗性(Amp^R)以及克隆进的蔗糖抗性(SucB^R)基因进行筛选。首先用筛选出能在50μg/ml氨苄上生长的重组菌(第一次同源重组)，挑选出的重组菌经不含氨苄的TSB培养后，再通过5％蔗糖TSA平板筛选出丢失氨苄抗性基因和蔗糖敏感基因全的重组菌(第二次同源重组)。通过一对PCR引物，鉴定wboA基因缺失的重组菌2308-ΔWboA。

3.重组菌2308-ΔWboA-ΔvjbR的筛选与鉴定按1.4中的方法制备2308-ΔWboA感受态细胞，取50μl制备好的感受态细胞，加入5μl的pLR_(vjbR)-SacB(浓度约为400μg/μl)，进行电转化。设定点转化参数为：Tc＝5ms,V＝2500v。

4.对获得的重组布鲁氏菌进行形态学、血清学及基因水平检测，并对重组菌安全性、免疫保护性进行鉴定。

5疫苗制备对安全性和免疫保护性良好的重组菌，按布鲁氏菌活疫苗(A19株)的生产方法(参照(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○年版.化学工业出版社，2001，本发明简称《规程》)，将2308-ΔWboA-ΔvjbR接种于适宜培养基，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成活疫苗。用于预防布鲁氏菌病。

发明的详细描述

本发明所涉及基因为与光滑型表型相关的布鲁氏菌wboA基因，以及与布鲁氏菌毒力相关基因vjbR。本发明所涉及基因重组技术包括：利用含蔗糖敏感基因的穿梭质粒介导，筛选wboA基因缺失的重组布鲁氏菌2308-ΔWboA，并在此基础上，利用同样的原理和技术再筛选vjbR基因缺失的重组菌，即为2308-ΔWboA-ΔvjbR。

本发明通过2次同源重组，无痕缺失了光滑型牛种布鲁氏菌2308株的wboA基因第1-897bp之间的序列，以及vjbR全基因(1-614bp之间的序列)，最终筛选获得了粗糙型重组布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株。

1.重组布鲁氏菌的构建及筛选

本发明首先利用同源重组及蔗糖敏感基因的负筛选技术，成功构建了wboA基因第1-897bp之间的序列缺失的重组牛种布鲁氏菌2308-ΔWboA株，该重组菌株由光滑型转变为了粗糙型。进一步通过同源重组和蔗糖负筛选技术，敲除了2308-ΔWboA株中的一个毒力相关基因vjbR(1-614#)，使其毒力进一步下降，从而满足疫苗安全性要求，并保留了良好的免疫原性。重组菌在培养基上传20代后，遗传性状仍很稳定。动物试验表明重组菌比牛种布鲁氏菌A19的安全性更高，免疫保护性与A19相似，其突出的优点还在于该重组菌免疫动物后 产生的抗体不干扰布病的临床诊断。

具体操作方法如下：

(1)PCR扩增wboA基因上、下游同源臂

引物设计：

上游同源臂引物(序列1和序列2)：

F_WboaL5’-CGCAGAGCTCGCATCCAGATACATTGAAC-3’(含SacI位点)；

R_WboaL5’-CCGTTCTAGAACTGATTTCCCGTGTCAAC-3’(含XbaI位点)。

下游同源臂引物(序列3和序列4)：

F_WboaR5’-ATGCTCTAGAGACAAGGAGTATGCGCAGC-3’(含XbaI位点)；

R_WboaR5’-CACGGCATGCTGACCTGATAACACGACTA-3’(含SphI位点)。

用Promega公司的细菌基因组提取试剂盒(Lot：187282)，参照说明书(附件1)提取布鲁氏菌2308基因组DNA，并以提取的基因组DNA为模板扩增wboA上、下游的基因片断。PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃50s—54℃50s—72℃1min，进行30个循环，72℃延伸10min。获得的上游同源臂标注为L_(WboA)，下游同源臂标注为R_(WboA)。

(2)构建用于同源重组的穿梭质粒。

1)pUC-L-R质粒的构建

将以上(1)项中PCR获得的左侧同源臂L，用SacI和XbaI酶双酶切后，克隆进同酶处理的pUC18质粒中，按常规方法筛选重组质粒pUC-L；将其与(1)项中PCR获得右侧同源臂R均用XbaI和SphI双酶切后，连接、转化，筛选重组质粒pUC-L-R。

2)穿梭质粒pLR(WboA)-SacB的构建

设计引物(序列5和序列6)如下：

F:5’-CGCAGTCGACGCATCCAGATACATTCAAC-3’(含SalⅠ位点)；

R:5’-CAAACCCGGGTGACCTGATAACACGTCTA-3’(含SmaI位点)，

以pUC-L-R质粒为模板，扩增出包含上、下游同源臂(LR)的大小为1800bp的序列。将该PCR产物用SalⅠ和SmaⅠ酶切后，克隆进同酶处理的pUC-SacB质粒(本实验室构建保存)中，获得重组质粒pLR(WboA)-SacB。

(3)制备布鲁氏菌2308的电转化感受态细菌

将单个CFU的2308菌接种于100ml TSB培养基中培养至对数期的中期，放冰水中冷却。12000r/min离心10min，弃去培养基，再分别用100ml、50ml、10m、5m、2ml灭菌水各离心洗涤一次。最后将获得的菌体重悬于1ml10％的甘油水溶液中，此即为待用的感受态细菌。

(4)电转化和2308-ΔWboA重组菌的筛选

1)电转化将3μg pLR-SacB质粒加入到50μl2308感受态细菌中。混匀后转移到电极杯中。电击电压：2.5KV；电击时间：5毫秒。电击完成后，加入1ml SOC培养基，置37℃摇振培养4h后，将全部菌落涂布到含50μg/ml氨苄青霉素的TSA平板上，37℃培养72h。

2)用于鉴定第二次同源重组成功的PCR引物

设计如下引物(序列7和序列8)：

F389：5’-AATGAGCTATTCCCGC-3’(位于WboA阅读框上游-44到-28位。)

R389：5’-TAGCCGATAAACACGC-3’(位于WboA阅读框下游1243到1258反向互补位。)

阳性重组菌的预期大小为389bp，非重组菌的PCR产物大小为1302bp。

3)筛选挑取平板上单个菌落(第一次重组菌)，接种到不含氨苄的TSB培养液中，37℃摇振培养6-8h，将菌液用生理盐水进行1:10、1:100和1:1000稀释，每稀释度各取菌液100μl涂布含5％蔗糖的TSA平板，37℃培养72h。挑取蔗糖平板上生长的菌落，用鉴定引物进行菌落PCR，筛选阳性重组菌。对PCR筛选获得的阳性菌，进一步用凝集试验验证其粗糙型特性。提取重组菌的基因组DNA，以F389和R389为引物进行PCR，并将PCR产物进行克隆和序列测定，结果证实WboA基因1-897bp之间的序列已经缺失，获得的重组菌命名为2308-ΔWboA。

(5)穿梭质粒pLR(vjbR)-SacB质粒的构建

设计用于扩增VjbR基因上、下游同源臂的引物(序列9、序列10、序列11和序列12)如下：

F(L-vjb):5’-ACCCGAATTCCGACGACAAGAAAG-3’(含EcoRⅠ位点)；

R(L-vjb):5’-GGGGTCTAGATGGAAATATCCTTGGTG-3’(含XbaⅠ位点)；

F(R-vjb):5’-ACACTCTAGACTGATGGCGAAATCG(含XbaⅠ位点)；

R(R-vjb):5’-CACAGCATGCAGGAGGTGAAGGATGAA-3’(含SphⅠ酶切位点)。

以2308基因组DNA为模板，扩增出包含上、下游同源臂(LR)的大小分别978bp、1169bp。将上、下游PCR产物经相应的限制性内切酶处理后，克隆进同酶处理的pUC-SacB质粒(本实验室构建保存)中，获得重组质粒pLR(vjb)-SacB。

(6)2308-ΔWboA感受态细菌的制备、电转化及2308-ΔWboA-ΔvjbR的筛选

1)参照步骤(3)制备2308-ΔWboA感受态细菌；

2)参照步骤(4)-①进行电转化；

3)重组菌筛选参照步骤(4)-3)，鉴定引物(序列13和序列14)设计如下：

FΔvjbR:5’-GACCTGTTATTGTGTGC-3’

RΔvjbR:5’-GCTTTTCTTTTCGCCTG-3’

重组菌预期PCR条带大小为399bp.

2.布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR菌株的特性检查

(1)形态和生化特性检查革兰氏染色为阴性。菌体为球杆菌，单个散在，无鞭毛，不形成芽孢和荚膜，大小约0.6～2.5μm。生化试验为硫化氢试验阳性。

(2)培养特性检查重组布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株，在pH6.4～6.8的胰大豆琼脂(TAB)或其他适宜培养基(如马丁汤、胰眎肉汤、肉肝汤等)上生长良好；静止培养易出现沉淀，振摇后液体浑浊、不透明。

(3)粗糙型特性检查热凝集试验、吖啶黄凝集试验、菌落结晶紫染色试验结果符合粗糙型布鲁氏菌的特点，即热凝集试验阳性，吖啶黄凝集试验阳性，能被结晶紫染色。

(4)血清学特性检查将牛种布鲁氏菌2308株和重组布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株菌培养物制成抗原注射小鼠2次，间隔1个月，第二次接种1个月后采血分离血清。牛种布鲁氏菌2308株的抗血清与布鲁氏菌M5株、M28株、A387株和A19株等光滑型布鲁氏菌凝集反应为阳性；与布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株和M111株等粗糙型布鲁氏菌凝集反应为阴性；而布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株抗血清与S2株、M5株、M28株、A387株和A19株等光滑型布鲁氏菌凝集反应为阴性，与粗糙型布鲁氏菌M111株凝集反应为阳性(表1)。表明2308-ΔWboA-ΔvjbR菌株免疫小鼠后，其血清不含有对光滑型布鲁氏菌的凝集类抗体。

表1布鲁氏菌r2308-ΔWboA-ΔvjbR株血清学检查结果

注：+：阳性反应；-：阴性反应。以上试验说明重组布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株菌免疫动物后，所产生的血清抗体通过凝集试验能够与光滑型布鲁氏菌感染或免疫后所产生的血清抗体相区别，即重组布鲁氏菌rS2-ΔWboA株菌免疫动物后不会对布鲁氏菌病血清学检疫产生干扰。

(5)基因特性检查

设计用于检测WboA基因缺失的引物

F389：5’-AATGAGCTATTCCCGC-3’(位于WboA阅读框上游-44到-28位)；

R389：5’-TAGCCGATAAACACGC-3’(位于WboA阅读框下游1243到1258反向互补位)。

以重组菌落或其基因组DNA为模板，按如下PCR反应程序进行：95℃5min——95℃45sec,56℃45sec,72℃1min(30cycles)——72℃10min——4℃10min。反应结束后，取5μLPCR产物进行电泳。重组菌PCR产物大小为389bp；原始菌2308为1302bp。

设计用于检测vjbR基因缺失的引物

FΔvjbR(F399):5’-GACCTGTTATTGTGTGC-3’(位于VjbR阅读框上游-177到-161位)

RΔvjbR(R399):5’-GCTTTTCTTTTCGCCTG-3’(位于VjbR阅读框下游821到837反向互补位)，以重组菌落或其基因组DNA为模板，按如下PCR反应程序进行：95℃5min——95℃45sec,56℃45sec,72℃1min(30cycles)——72℃10min——4℃10min。反应结束后，取5μLPCR产物进行电泳。重组菌PCR产物大小为399bp；原始菌2308为1013bp。

结果见图1，图中1-4.2308-ΔWboA-ΔvjbR不同代次扩增结果(F399和R399，鉴定vjbR基因)；5.2308扩增结果(F399和R399，鉴定vjbR基因)；6.Mareker2000；7-10.2308-ΔWboA-ΔvjbR不同代次扩增结果(F389和R389，鉴定WboA基因)；11.2308扩增结果(F389和R389，鉴定WboA基因)。

(6)毒力检查用生理盐水将固体培养基上培养48h的培养物洗下，稀释成每毫升含10亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠5只，每只1ml。经14～15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种胰眎琼脂或其他适宜的培养基平板，根据其生长的菌落数计算豚鼠脾脏的含菌量，结果脾脏含菌为2.4×10³CFU，不超过20万CFU(强毒株的判断标)。

(7)安全检验将重组布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株活菌用生理盐水稀释成1ml含活菌100亿，皮下注射体重18～20g的小白鼠5只，每只0.1ml，观察6日，均全部健活。

(8)免疫原性用生理盐水将重组布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠10只，每只0.1ml。30日后，用3个最小感染量的强毒布鲁氏菌S1330菌株(约60个CFU)接种攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，结果7只豚鼠未分离到细菌，保护率为70％。

(9)遗传稳定性重组布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株在TSA培养基上传30代，其形态和生化特性、培养特性、血清学特性、粗糙型特性、基因特性、毒力、免疫原性进行检测，结果30代内遗传稳定(见表2)。

表2重组布鲁氏菌r2308-ΔwboA-ΔvjbR株遗传稳定性测定结果

测毒代次

形态和生化特性

培养特性

粗糙型特性

特异性片段

脾脏含菌量

保护率

原代

G-，球杆菌，H2S+

TAB生长良好

粗糙型

398bp，399bp

2.4×103CFU

70％

5

G-，球杆菌，H2S+

TAB生长良好

粗糙型

398bp，399bp

1.3×103CFU

70％

10

G-，球杆菌，H2S+

TAB生长良好

粗糙型

398bp，399bp

1.9×103CFU

80％

15

G-，球杆菌，H2S+

TAB生长良好

粗糙型

398bp，399bp

2.7×103CFU

70％

20

G-，球杆菌，H2S+

TAB生长良好

粗糙型

398bp，399bp

4.1×103CFU

70％

25

G-，球杆菌，H2S+

TAB生长良好

粗糙型

398bp，399bp

3.3×103CFU

80％

30

G-，球杆菌，H2S+

TAB生长良好

粗糙型

398bp，399bp

2.6×103CFU

80％

注：特异性片段扩增采用了两对引物，F399、R399和F389和R389，其中F399、R399用于鉴定vjbR基因的缺失；F399、R399用于鉴定WboA基因的缺失)。

3.疫苗制备与质量标准

(1)疫苗制备用重组布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株作为粗糙型布鲁氏菌疫苗生产菌株，按牛种布鲁氏菌A19株作为生产菌株生产布鲁氏菌活疫苗的常规方法，接种于适宜培养基，收获培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成活疫苗(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇○○年版.化学工业出版社，2001，本发明简称《规程》)。用于预防布鲁氏菌病。用胰大豆肉汤(TSB，美国BD公司)或按布鲁氏菌S2菌株疫苗生产用培养基(如马丁汤、胰眎肉汤、肝汤等)均可作为本发明的疫苗生产用培养基。培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入重组布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株种子菌液，37℃培养48～72h，加入兽用生物制品常用的蔗糖明胶稳定剂，充分混匀、分装于疫苗瓶中后立即进行冷冻真空干燥，即成为2308-ΔWboA-ΔvjbR活疫苗，命名为基因缺失粗糙型2308-ΔWboA-ΔvjbR活疫苗。冷冻真空干燥后的疫苗应按质量标准立即进行成品检验。

(2)质量标准本标准涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版(三部).中国农业出版社，2006，本发明按《中国兽药典》)的方法进行。

1)疫苗应为疏松团快，加入稀释液后能迅速(1min内)溶解。

2)疫苗应纯粹无其他细菌。

3)将疫苗稀释成每1ml含1×10⁹CFU活菌，腹股沟皮下接种18～20g的昆明系小白鼠5只，各0.25ml/只，观察6日，应全部健活。

4)对疫苗进行活菌计数，每瓶活菌含量应不低于核定的头份数。

附图说明

图1重组菌2308-ΔWbo A-ΔvjbR不同代次PCR鉴定结果图中1-4.为2308-ΔWboA-ΔvjbR不同代次扩增结果(F399和R399)；5.2308扩增结果(F399和R399)；6.Mareker2000；7-10.2308-ΔWboA-ΔvjbR不同代次扩增结果(F389和R389)；11.2308扩增结果(F389和R389)。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明中涉及的微生物资源为牛种布鲁氏菌2308株菌(即为CVCC788株，由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保藏和供应，见中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版，中国农业科技出版社，2002，p24.)；本发明通过2次同源重组，无痕缺失了光滑型牛种布鲁氏菌2308株的wboA基因第1-897bp之间的序列，以及vjbR全基因(1-614bp之间的序列)，最终筛选获得了牛种布鲁氏菌2308-ΔWboA-ΔvjbR株(本菌株已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏编号：GMCC No.8884)。

本发明的积极意义

本发明涉及一种双基因缺失粗糙型牛种布鲁氏菌及其疫苗的生产方法。该菌株是通过构建缺失wboA(1-897bp)基因缺失的重组布鲁氏菌2308-ΔwboA株，破坏了光滑型布鲁氏菌细胞壁LPS结构中O链形成条件，使重组菌由光滑型转变为粗糙型。通过进一步缺失布鲁氏菌2308-ΔWboA株毒力基因vjbR基因，获得重组双基因缺失的2308-ΔWboA-ΔvjbR株，提高重组菌作为疫苗使用的其安全性。以此菌株制备布鲁氏菌疫苗将改变布鲁氏菌病疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，并确保疫苗的安全性。

实施例1

胰大豆肉汤(TSB，美国BD公司)或其它适宜培养基作为重组菌的培养基，按培养基量加入适量的常用消泡剂，灭菌后按培养基量的1％～2％接入重组布鲁氏菌rS2株种子菌液，在36～37℃逐渐加大通气量，按常规方法发酵培养36h，，培养过程中可根据需要加入50％的葡萄糖溶液，每次加入量为培养基总量的1％～2％。

培养完成，取样用胰大豆琼脂按《中国兽药典》规定的方法作纯粹检验，为纯粹。

同时取样用TSA进行活菌计数，供浓缩时参考。

将纯粹检验合格的菌液，按总量0.2％～0.4％加入羧甲基纤维素钠，使菌体沉淀，吸去上 清液，置2～8℃保存备用。

取浓缩的菌液按《中国兽药典》规定的方法进行纯粹检验，为纯粹。

取浓缩的菌液按《中国兽药典》规定的方法用TSA进行活菌计数，作为配苗时的参考。

经检验合格的菌液，按其菌数加入兽用生物制品常用的pH7.0蔗糖明胶稳定剂(《规程》)，使其最终含量为5％～10％蔗糖和1％～1.5％明胶；加入最终含量为1％～3％的硫脲。充分混匀后、按800亿～1000亿/ml的剂量定量分装。分装后疫苗瓶迅速冷冻真空干燥后即成为双基因缺失粗糙型布鲁氏菌病活疫苗(2308-ΔWboA-ΔvjbR株)。

实施例2

成品检验

本发明涉及到的相关检验方法按《中国兽药典》的方法进行

(1)物理性状疫苗应为疏松团快，加入稀释液后均在1min内能迅速)溶解。

(2)纯粹检验疫苗均纯粹无其他细菌。

(3)安全检验将疫苗稀释成每1ml含1×10⁹CFU活菌，腹股沟皮下接种18～20g的昆明系小白鼠5只，各0.25ml/只，观察6日，均全部健活(表3)。

表3粗糙型布鲁氏菌病活疫苗(2308-ΔWboA-ΔvjbR株)安全检验结果

-：健康存活，注射部位无异常；+：死亡或发病。

(4)活菌计数用TSA进行活菌计数对疫苗进行活菌计数，每瓶活菌含量均不低于核定的头份数。

(5)效力检验用生理盐水将2308-ΔWboA-ΔvjbR株活疫苗稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350～400g的豚鼠10只，每只0.1ml。30日后，用3个最小感染量的强毒牛种布鲁氏菌2308株(约30个CFU)接种攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，结果80％以上的豚鼠未分离到强毒(结果见表4)。

表4粗糙型布鲁氏菌病活疫苗(2308-ΔWboA-ΔvjbR)效力检验结果

注：+：分离到菌，判为不保护；-：未分离到菌，判为保护。*：小鼠编号

Claims (4)

1.基因缺失粗糙型布鲁氏菌，其特征在于采用非抗性筛选技术，缺失牛种布鲁氏菌2308菌株wboA基因1～897bp之间的序列，使原始菌株由光滑型转变为了粗糙型；同时缺失了vjbR基因，使重组菌的安全性进一步提高。用该菌(2308-ΔWboA-ΔvjbR)制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)2308-ΔWboA-ΔvjbR菌株已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为：CGMCCNo.8884。

2.一种基因缺失粗糙型布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗该疫苗含有活的布鲁氏菌CGMCC No.8884株和兽用生物制品常用的冻干保护剂。

3.一种基因缺失粗糙型布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用胰大豆肉汤作为重组菌疫苗制造用培养基，培养基灭菌后按培养基量的按1％～2％接入布鲁氏菌CGMCC No.8884株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为2308-ΔWboA-ΔvjbR株基因缺失粗糙型布鲁氏菌活疫苗。

4.一种基因缺失粗糙型布鲁氏菌活疫苗的鉴别诊断，其特征在于使用如序列7、8和序列13、14所述序列的2对引物，通过PCR方法可对其进行特异性鉴别。