CN105385663A - 鸭肠炎病毒gE、gI双基因缺失病毒株的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鸭肠炎病毒gE、gI双基因缺失病毒株的构建及其应用。其中涉及一种gE、gI双基因缺失、绿色荧光蛋白标记的重组鸭肠炎病毒，及其构建方法；本发明构建了缺失gI基因3’端的1068bp、gE基因5’端的510bp以及gI、gE基因间的223bp非编码区、带有GFP标记的重组病毒鸭肠炎病毒(Duck？enteritis？virus,DEV)rDEVΔgEgI-GFP株，制备成活疫苗，预防鸭瘟，可通过检测gE基因抗体，区分自然感染和免疫鸭；还可插入一种动物病原抗原基因，制备基因工程活载体疫苗。

Description

鸭肠炎病毒gE、gI双基因缺失病毒株的构建及其应用

技术领域

本发明涉及一种鸭肠炎病毒gE、gI双基因缺失病毒株的构建及其应用，属于生物技术和兽用生物制品领域。

背景技术

鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)，又名鸭瘟病毒，可感染鸭、鹅及其它雁形目禽类，引起血管损伤、组织出血、消化道粘膜损伤、淋巴器官受损和实质性器官退行性病变的一种急性、接触性、败血性传染病——鸭病毒性肠炎(Duckviralenteritis,DVE)，或称鸭瘟(Duckplague,DP)(SandhuandMetwally,2008)。自1923年被首次发现以来(Baudet,1923)，本病相继发生于法国、印度、比利时、英国、泰国和加拿大等国家(殷震和刘景华,1997)，流行范围、感染禽类的种类有逐步扩大的趋势，至少48种雁形目中的禽类对DEV易感(Kaletaetal.,2007)。鸭瘟是一种广泛嗜全身性感染的传染病，发病率和死亡率都很高，给水禽养殖业带来巨大损失。免疫接种是预防和控制该病暴发的重要措施，目前我国用于鸭瘟预防的疫苗主要是上世纪60年代研究成功的鸡胚弱化活疫苗。DEV具有良好的免疫原性，免疫力产生快速，免疫后3天便可抵抗鸭瘟强毒攻击；免疫期长，可达一年。

DEV属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、马立克病毒属、鸭疱疹病毒1型(http://www.ictvonline.org)。李玉峰应用Shot-gun方法首次完成了DEV——我国鸭瘟商品化疫苗(DEVVAC)的全基因组测序。DEVVAC基因组全长为158,089bp，G+C含量为44.91％，由长独特区(UniqueLong,UL)和短独特区(UniqueShort,US)组成，US区两端为一对反向重复序列，分别称为内部重复序列(InternalRepeat,IR)和末端重复序列(TerminalRepeat,TR)。基因组结构为UL-IR-US-TR，呈典型的D型疱疹病毒基因组结构(Lietal.,2009)。我们完成了我国鸭肠炎病毒强毒参考株全基因组序列测定，该毒株基因组全长为162,131bp，共78个ORF，编码76个蛋白(Yangetal.,2014)。

随着基因工程技术的发展，重组病毒活载体疫苗成为当前新型疫苗研究的热点。DEV作为活疫苗载体具有以下优点：(1)基因组容量大，可插入和表达多种外源基因；(2)产生免疫力，免疫后3天即可产生一定的保护；(3)免疫期长，可达1年；(5)宿主范围广，至少可感染48种雁形目中的禽类(Kaletaetal.,2007)。

发明内容

本发明的目的在于构建一株gE、gI双基因缺失的鸭肠炎病毒作为活病毒载体，同时将其作为生产种毒用于生产鸭瘟活疫苗，即本发明以中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)保存的鸭瘟病毒强毒株(目录编码为CVCCAV1221，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p138)为亲本毒，应用分子生物学方法，构建了缺失gE、gI双基因、携带绿色荧光蛋白(GFP)标记的重组DEV，该重组病毒可作为疫苗候选毒株，也可作为活病毒载体，用于基因工程疫苗的开发和应用。

本发明的技术方案

1.一株鸭肠炎病毒gE、gI双基因缺失病毒株，其特征在于该株为为鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)rDEVΔgEgI-GFP株，该毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11499。

2.一株鸭肠炎病毒株，其特征在于该株为缺失gI、gE基因带有绿色荧光蛋白(GFP)标记的重组鸭肠炎病毒，

3.权利要求1所述的一株鸭肠炎病毒株，其特征在于该毒株的构建包括下述步骤：

(1)亲本病毒的培育：将鸭瘟病毒CVCCAV1221强毒株经鸡胚成纤维细胞和鸡胚连续传代获得的克隆纯化弱毒株作为亲本毒株；

(2)转移载体的构建：以pMD-18T克隆载体为骨架载体，分别PCR扩增gI基因的上游序列、gE基因的下游序列，作为同源重组的左右同源臂，然后在左右同源臂间插入GFP基因，获得转移载体pT-gEgI-GFP；

(3)绿色荧光蛋白标记重组鸭肠炎病毒的构建将pT-gEgI-GFP转移载体与重组鸭肠炎病毒亲本株共转染CEF细胞，通过克隆筛选，获得含GFP标记蛋白的缺失重组病毒鸭肠炎病毒rDEV-ΔgEgI-GFP株。

4.一种鸭瘟活疫苗，其特征在于该疫苗主要含有鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株，该疫苗预防鸭瘟，可通过检测gE基因抗体，区分自然感染和免疫鸭。

5.如权利要求3所述的一种鸭瘟活疫苗的制备方法，其特征在于该疫苗是将重组鸭肠炎病毒(rDEVΔgEgI-GFP)接种长满单层的无特异性病原鸡的鸡胚成纤维细胞，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。

6.权利要求1所述的一株鸭肠炎病毒株的应用，其特征在于该重组病毒鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株作为载体还可插入一种动物病原抗原基因，制备基因工程活载体疫苗。

具体实施方式

1.毒株的构建

(1)病毒和载体

1)亲本毒鸭瘟病毒CVCCAV1221株为亲本毒，该毒株来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心；参见：中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p138)。

2)pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有GFP基因的载体pT-GFP-gpt，均由本实验室保存。

(2)引物设计

根据GenBank上发表的DEV序列设计合成以下引物：

表1本发明构建所涉及的相关引物信息

3.DEV基因组DNA提取

取鸭肠炎病毒CVCCAV1221病毒液437.5μL，加入蛋白酶K(20mg/mL)12.5μL、10％SDS50μL；56℃水浴1h；分别用酚、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿各抽提1次；取上清，加入1/10体积3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；12000×g离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤1次，沉淀溶于30μL去离子水中，-20℃保存备用。

4.转移载体pT-gEgI-GFP-gpt的构建

以鸭肠炎病毒CVCCAV1221基因组DNA为PCR扩增模板，以引物US7F、US7R扩增gI基因的上游1368bp片段。以引物US8F、US8R扩增gE基因的右端1323bp片段。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒pT-gI和pT-gE。用SalI和HindIII双酶切上述重组质粒，分别回收3900bp和1300bp片段，获得重组质粒pT-gEgI。将重组质粒pT-gEgI用SalI酶切，电泳回收后去磷酸化；pT-GFP-gpt用SalI酶切，电泳回收2.1kb片段，将GFP-gpt表达盒插入到pT-gEgI中，获得转移载体pT-gEgI-GFP-gpt。

5.同源重组

按照Lipofectamine^TM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-gEgI-GFP-gpt与DEV进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：

六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的DEV，吸附1～4小时；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50μL，室温孵育5min；取2μLLipofectamine2000与48μL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min；将50μLLipofectamine2000稀释液分别滴加到50μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将100μLLipofectamine2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养3～5d，每天观察，直至出现重组病毒荧光斑。

6.重组病毒的蚀斑纯化

将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于0.5mlM199营养液中，冻融1次后接种6孔板CEF细胞，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)rDEVΔgEgI-GFP株，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11499。

7.重组鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株的鉴定

采用引物D5F(序列5)、D6R(序列6)进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证实，重组病毒缺失了gE、gI基因，并成功插入了有绿色荧光蛋白标记基因(GFP)。

8.重组鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株遗传稳定性试验

重组鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株在CEF细胞上传代20代，所有蚀斑均有绿色荧光，表明所获得的重组鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株在CEF中稳定遗传。

9.动物试验

(1)安全性试验

将15只4周龄SPF鸭，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射rDEVΔgEgI-GFP，每只1000TCID₅₀，第2组肌肉注射DEV亲本毒，每只1000TCID₅₀，第3组不接种，作对照。每组单独隔离饲养。观察14d，每天记录发病死亡情况(表2)。

(2)免疫原性试验

将10只4周龄SPF鸭，随机分成2组，每组5只。第1组肌肉注射rDEVΔgEgI-GFP，每只1000TCID₅₀，第3组不免疫，作对照。每组单独隔离饲养。在免疫后14天，腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCCAV1221)，每只1000MLD。观察14d，每天记录发病死亡情况，攻毒对照组100％死亡，免疫100％保护，说明rDEVΔgEgI-GFP株具有良好的免疫原性(表3)。

二、疫苗制备

1.本发明所提供的制备疫苗的方法，是将重组鸭肠炎病毒(rDEVΔgEgI-GFP)接种长满单层的无特异性病原鸡的鸡胚成纤维细胞(SPFCEF)，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。

(1)细胞制备选择发育良好的9～11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成CEF，培养24小时左右长成单层备用。

(2)病毒液的制备按体积比0.01％～0.5％的接毒量接种CEF细胞单层，37～38℃培养36～72小时，当病变率达75％以上收获病毒液，-20℃结冻保存。

(3)半成品的检验

1)无菌检验每组分别取样，按《中国兽药典》二〇一〇年版三部进行，应无菌生长。

2)病毒含量测定每0.1ml病毒含量≥10^5.0TCID₅₀。

3)配苗及分装将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5％蔗糖脱脂奶稳定剂和抗生素，充分混匀，定量分装。

4)冻干分装后，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程2000年版，化学工业出版社，2001，437页以下称《规程》)附录中的方法迅速进行冷冻真空干燥。

2.疫苗成品检验

本发明涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版(三部).中国农业出版社，2011，本发明称《中国兽药典》)的方法进行。

(1)性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

(2)无菌检验按《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。

(3)支原体检验按《中国兽药典》进行检验，应无支原体生长。

(4)外源病毒检验按《中国兽药典》进行检验，应无外源病毒污染。

(5)鉴别检验将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID50/0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特异性血清混合，置室温作用60分钟后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔(48孔细胞板)，每孔0.2ml,同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组应全部出现病变，中和组应不出现细胞病变。

(6)安全检验用5～7日龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10羽份，观察14日，应全部健活。

(7)效力检验下列方法任择其一。

①病毒含量测定按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔(96孔细胞培养板)，每孔0.1ml，置37～38℃条件下，培养观察120小时。根据CPE产生情况，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。每羽份病毒含量应≥10^3.5TCID₅₀。

②用鸭检验用1～3周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗1羽份，另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。14日后，每只鸭肌肉注射1000MLD鸭瘟病毒强毒(CVCCAV1221)，观察14日。对照鸭应至少4只死亡，免疫鸭应至少8只保护。

(8)剩余水分测定按《中国兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。

(9)真空度测定按《中国兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及的微生物为：鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)CVCCAV1221株，又名鸭瘟病毒(中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p138)保存于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心；gE、gI双基因缺失、绿色荧光蛋白标记的重组鸭肠炎病毒鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)rDEVΔgEgI-H9，该株病毒已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11499。

本发明的积极意义

本发明涉及鸭肠炎病毒gE、gI双基因缺失病毒株的构建及其应用。其中涉及一种gE、gI双基因缺失、绿色荧光蛋白标记的重组鸭肠炎病毒，其构建方法；本发明构建了缺失gI基因3’端的1068bp、gE基因5’端的510bp以及gI、gE基因间的223bp非编码区、带有GFP标记的重组病毒鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)rDEVΔgEgI-GFP株，制备成活疫苗，预防鸭瘟，可通过检测gE基因抗体，区分自然感染和免疫鸭；还可插入一种动物病原抗原基因，制备基因工程活载体疫苗。

实施例

以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。

实施例1

——鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株的构建

1.病毒和载体

(1)亲本毒鸭瘟病毒CVCCAV1221株为亲本毒，该毒株来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心；参见：中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版，中国农业科学技术出版社，2002，p138)。

(2)pMD-18T载体，用于克隆测序及转移载体的构建，购自宝生物工程(大连)有限公司。含有GFP基因的载体pT-GFP-gpt，均由本实验室保存。

2.引物设计

根据GenBank上发表的DEV序列设计合成引物(见表1)：

3.DEV基因组DNA提取

取鸭肠炎病毒CVCCAV1221病毒液437.5μL，加入蛋白酶K(20mg/mL)12.5μL、10％SDS50μL；56℃水浴1h；分别用酚、酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿各抽提1次；取上清，加入1/10体积3M醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；12000×g离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤1次，沉淀溶于30μL去离子水中，-20℃保存备用。

4.转移载体pT-gEgI-GFP-gpt的构建

以鸭肠炎病毒CVCCAV1221基因组DNA为PCR扩增模板，以引物US7F、US7R扩增gI基因的上游1368bp片段。以引物US8F、US8R扩增gE基因的右端1323bp片段。扩增目的片段分别连接pMD-18T载体，构建相应的重组质粒pT-gI和pT-gE。用SalI和HindIII双酶切上述重组质粒，分别回收3900bp和1300bp片段，获得重组质粒pT-gEgI。将重组质粒pT-gEgI用SalI酶切，电泳回收后去磷酸化；pT-GFP-gpt用SalI酶切，电泳回收2.1kb片段，将GFP-gpt表达盒插入到pT-gEgI中，获得转移载体pT-gEgI-GFP-gpt。

5.同源重组

按照Lipofectamine^TM2000转染试剂盒说明书，将转移载体pT-gEgI-GFP-gpt与DEV进行转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体步骤如下：

六孔板中的CEF培养至长成70％～90％细胞单层时，接种适量的DEV，吸附1～4小时；将1μg转移载体稀释于不含血清和抗生素的opti-DMEM中，使混合液的终体积均为50μL，室温孵育5min；取2μLLipofectamine2000与48μL不含血清和抗生素的opti-DMEM轻轻混匀，室温孵育5min；将50μLLipofectamine2000稀释液分别滴加到50μL质粒稀释液中，边加边混匀；室温孵育20min。在此期间，将六孔板中的细胞用无血清OPTI-MEM轻轻洗两遍后，每孔加入0.5mL无血清OPTI-MEM，将100μLLipofectamine2000/DNA复合物逐滴加入到6孔板中，轻轻摇动使其均匀混合，置37℃培养4h，弃去上清，加入10％胎牛血清的M199培养基，置37℃培养24h后，用1％胎牛血清的M199培养基换液，置37℃培养3～5d，每天观察，直至出现重组病毒荧光斑。

6.重组病毒的蚀斑纯化

将初步获得的重组病毒接种已长成良好细胞单层的6孔板CEF细胞，吸附1小时后，弃去吸附液，铺上1％的低熔点琼脂糖，继续培养。接种48小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光，挑选单个荧光蚀斑于0.5mlM199营养液中，冻融1次后接种6孔板CEF细胞，如此进行蚀斑纯化3～4次，将获得的重组病毒命名为鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株。

实施例2

——鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株的鉴定

1.采用引物D5F(序列5)、D6R(序列6)进行PCR扩增鉴定，PCR产物测序证实，重组病毒缺失了gE、gI基因，并成功插入了有绿色荧光蛋白标记基因(GFP)。

2.重组鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株遗传稳定性试验

重组鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株在CEF细胞上传代20代，所有蚀斑均有绿色荧光，表明所获得的重组鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株在CEF中稳定遗传。

3.动物试验

(1)安全性试验

将15只4周龄SPF鸭，随机分成3组，每组5只。第1组肌肉注射rDEVΔgEgI-GFP，每只1000TCID₅₀，第2组肌肉注射DEV亲本毒，每只1000TCID₅₀，第3组不接种，作对照。每组单独隔离饲养。观察14d，每天记录发病死亡情况(表2)。

表2鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株安全性试验

(2)免疫原性试验

将10只4周龄SPF鸭，随机分成2组，每组5只。第1组肌肉注射rDEVΔgEgI-GFP，每只1000TCID₅₀，第3组不免疫，作对照。每组单独隔离饲养。在免疫后14天，腿部肌肉注射接种DEV强毒(CVCCAV1221)，每只1000MLD。观察14d，每天记录发病死亡情况，攻毒对照组100％死亡，免疫100％保护，说明rDEVΔgEgI-GFP株具有良好的免疫原性(表3)。

表3鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株免疫原性

实施例3

——疫苗的制备

本发明所提供的制备疫苗的方法，是将重组鸭肠炎病毒(rDEVΔgEgI-GFP)接种长满单层的无特异性病原鸡的鸡胚成纤维细胞(SPFCEF)，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。

1.细胞制备选择发育良好的9～11日龄SPF鸡胚，按照常规胰酶消化法制成CEF，培养24小时左右长成单层备用。

2.病毒液的制备按体积比0.01％～0.5％的接毒量接种CEF细胞单层，37～38℃培养36～72小时，当病变率达75％以上收获病毒液，-20℃结冻保存。

3.半成品的检验

(1)无菌检验每组分别取样，按《中国兽药典》二〇一〇年版三部进行，应无菌生长。

(2)病毒含量测定每0.1ml病毒含量≥10^5.0TCID₅₀。

(3)配苗及分装将检验合格的病毒液过滤混合，加入适量的5％蔗糖脱脂奶稳定剂和抗生素，充分混匀，定量分装。

(4)冻干分装后，按《规程》附录中的方法迅速进行冷冻真空干燥。

实施例4

——疫苗成品检验

本发明涉及到的相关检验方法按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版(三部).中国农业出版社，2011，本发明称《中国兽药典》)的方法进行。

(1)性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

(2)无菌检验按《中国兽药典》进行检验，均无菌生长。

(3)支原体检验按《中国兽药典》进行检验，均无支原体生长。

(4)外源病毒检验按《中国兽药典》进行检验，无外源病毒污染。

(5)鉴别检验将疫苗用灭菌生理盐水稀释至100TCID₅₀/0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特异性血清混合，置室温作用60min后，接种5个已长成CEF单层的细胞孔(48孔细胞板)，每孔0.2ml,同时设病毒对照组，置37～38℃条件下，培养观察120小时。病毒对照组全部出现病变，中和组均不出现细胞病变。

(6)安全检验用5～7日龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉接种疫苗10羽份，观察14日，均全部健活。

(7)效力检验

①病毒含量测定按瓶签注明羽份，将疫苗稀释至每0.1ml含1羽份，再继续作10倍系列稀释，取3个适宜稀释度，分别接种5个已长成CEF单层的细胞孔(96孔细胞培养板)，每孔0.1ml，置37～38℃条件下，培养观察120小时。根据CPE产生情况，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。每羽份病毒含量10^4.5TCID₅₀。

②用鸭检验用1～3周龄易感鸭10只，按瓶签注明羽份，每只肌肉注射接种疫苗1羽份，另设5只不免疫作对照，在同样条件下隔离饲养。14日后，每只鸭肌肉注射1000MLD鸭瘟病毒强毒(CVCCAV1221)，观察14日。对照鸭5/5死亡，免疫鸭10/10只保护。

(8)剩余水分测定按《兽药典》规定方法进行测定，均小于4.0％。

(9)真空度测定按《兽药典》规定方法进行测定，均为紫色辉光。

Claims (6)

1.一株鸭肠炎病毒株，其特征在于该株为鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)rDEVΔgEgI-GFP株，该毒株已于2015年11月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.11499。

2.如权利要求1所述一株鸭肠炎病毒株，其特征在于该鸭肠炎病毒株病毒缺失gI、gE基因带有绿色荧光蛋白(GFP)标记的重组鸭肠炎病毒。

3.权利要求1所述的一株鸭肠炎病毒株，其特征在于该毒株的构建包括下述步骤：

(1)亲本病毒的培育：将鸭瘟病毒CVCCAV1221强毒株经鸡胚成纤维细胞和鸡胚连续传代获得的克隆纯化弱毒株作为亲本毒株；

(2)转移载体的构建：以pMD-18T克隆载体为骨架载体，分别PCR扩增gI基因的上游序列、gE基因的下游序列，作为同源重组的左右同源臂，然后在左右同源臂间插入GFP基因，获得转移载体pT-gEgI-GFP；

(3)绿色荧光蛋白标记重组鸭肠炎病毒的构建将pT-gEgI-GFP转移载体与重组鸭肠炎病毒亲本株共转染CEF细胞，通过克隆筛选，获得含GFP标记蛋白的缺失重组病毒鸭肠炎病毒rDEV-ΔgEgI-GFP株。

4.一种鸭瘟活疫苗，其特征在于该疫苗主要含有鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株，该疫苗预防鸭瘟，可通过检测gE基因抗体，区分自然感染和免疫鸭。

5.如权利要求3所述的一种鸭瘟活疫苗的制备方法，其特征在于该疫苗是将重组鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株接种长满单层的无特异性病原鸡的鸡胚成纤维细胞，收获病毒培养物，加适宜稳定剂，经冷冻真空干燥制成疫苗。

6.权利要求1所述的一株鸭肠炎病毒株的应用，其特征在于该重组鸭肠炎病毒rDEVΔgEgI-GFP株作为载体还可插入一种动物病原抗原基因，制备基因工程活载体疫苗。