JP2019524154A - アヒル腸炎ウイルス及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
a.有効量の上の組成物、及び
b.前記鳥類に前記組成物を投与するための手段
を含む、ワクチン接種キットを更に提供する。
用語「ウイルス」は、特に、カプシド又はカプセルに包まれた核酸分子(例えば、ゲノム)を含むウイルス粒子を表す。用語「ウイルス」はウイルスベクター又は単離されたウイルスゲノムも表す。
アヒル腸炎ウイルス(DEV)は、アヒルウイルス腸炎ウイルス(DVEV)としても知られるが、天然ではアヒル及びガチョウに感染する。DEVの完全ヌクレオチド配列は確定されており、オンラインで入手可能である(例えば、JQ673560参照)。ウイルスゲノムは約162Kbを含有し、ほぼ80の異なるタンパク質をコードしている。ジャンセン株、CSC株、CHv株、VAC株、及び2085株等の、DEVのいくつかのセロタイプ及び株が単離されている。VAC株: ID EU082088.2; カモ科分離株C-KCE: ID KF263690.1; カモ科株CHv: ID JQ647509.1; カモ科株2085: ID JF999965; カモ科株CV: ID KJ549663.1又はカモ科株CSC: ID JQ673560.1等のいくつかのDEV株の完全配列がジェンバンクで入手可能である。
ウイルスは、細胞培養において大規模に培養することが可能であり、その後組換えウイルスを収集することが可能である。
本発明のDEVはいかなる外来核酸でも、好ましくは、いかなる外来遺伝子でも含有することができる。外来遺伝子は、RNA又は生物学的に活性な及び/若しくは免疫原性(例えば、抗原性)タンパク質、ポリペプチド又はペプチド等の目的のいかなる産物でもコードすることができる。好ましい実施形態では、外来遺伝子は抗原、更により好ましくは、動物、特に鳥類に感染を引き起こすことができる病原性生物の抗原由来のペプチド又はポリペプチドをコードする。鳥類に感染を引き起こす病原体の例は、ウイルス、細菌、真菌、原虫、等を含む。免疫原性(ポリ)ペプチドは好ましくは、前記病原体の表面タンパク質、分泌タンパク質、若しくは構造タンパク質、又はその断片であって(に由来して)よい。ポリペプチドは、例えば、ウイルス、原核、真核又は合成のいかなる供給源にでも由来することが可能である。
本発明の好ましいDEVは全US4及びUS5遺伝子の欠失を含む。
・ US7遺伝子配列の少なくともnt100〜nt1000の欠失
・ UL4遺伝子配列の少なくともnt100〜nt1200の欠失、及び/又は
・ UL23遺伝子配列の少なくともnt100〜nt1000の欠失
から選択される少なくとも1つの更なる欠失を含む。
本発明は、不活性なUS4及びUS5遺伝子を有するDEVのゲノムを含む核酸分子にも関する。そのような核酸は一本鎖又は二本鎖、DNA又はRNAでもよい。特定の実施形態では、核酸は上で定義されるDEVのゲノムを含有するDNA分子である。
本発明の組換えウイルスは、いかなるコンピテント細胞培養物においても増殖させてよい。ウイルスの要求される成長が達成された後、細胞はスクレーパーを使用して又はトリプシンを用いてウェルから引き離してもよく、感染細胞は遠心分離により上澄みから分離してもよい。
本発明は、本発明の1つ又は複数のDEVを含む、ワクチン等の、組成物にも関する。
卵又は若い家禽における野生型DEVの毒性
異なるタイムスケジュールでの注射によるニワトリでのDEVの病原性又は毒性を調査するために臨床研究を実施した。更に詳細には、注射はin ovoで(孵化の3日前)、孵化後1日目、又は孵化後4日目に実施した。使用したDEVは野生型DEVジャンセン株であった。投与量は100又は1000pfu/用量であった。対照として、PBS溶液を投与した。病原性は孵化後日ごとに死亡率を測定することにより評価した。
不活性なUS4又はUS5遺伝子を有するDEVの毒性
2.1. 不活性なUS4遺伝子又はUS5遺伝子を含むDEVの構築
ニワトリ胚に対する毒性を低減しようと試みて、US4-又はUS5-不活性DEVを構築した。
rpsLneo-DsRed2カセットの2.8kb DNA断片をPCR反応によって構築した。手短に言えば、3つのPCR反応を行った。第1のPCR反応は、rpsLneo(配列番号3)の合成された断片の鋳型を用いて、配列番号1(5'-GGCCTGGTGATGATGGCGGGATCGTTGTAT-3')と配列番号2(5'-CCATGGTGCTGCGCTCAGAAGAACTCGTCA-3')のプライマー対を使用して行った。第2のPCR反応は、pSI哺乳動物発現ベクター(Promega社、カタログ番号E1721)の鋳型プラスミドを用いて、配列番号4(5'-ACGAGTTCTTCTGAGCGCAGCACCATGGCC-3')と配列番号5(5'-TCGGAGGAGGCCATCCTTAAGAGCTGTAAT-3')のプライマー対を使用して行った。第3のPCR反応は、pIRES2-DsRed2(Clontech社、カタログ番号632420)の鋳型プラスミドを用いて、配列番号6(5'-TACAGCTCTTAAGGATGGCCTCCTCCGAGA-3')及び配列番号7(5'-GCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAAT-3')のプライマー対を使用して行った。もう1つのPCR反応は、鋳型として第1と第2のPCR反応由来のPCR産物の混合物を、プライマーとして配列番号1及び配列番号5を使用して行った。このPCR産物と第3のPCR反応由来のPCR産物を混合し、配列番号1と配列番号7のプライマー対を用いて最終PCR反応のために使用し、rpsLneo-DsRed2カセットを得た。
5'と3'末端の両方のDEV US4又はUS5領域相同配列(50bpそれぞれ)をその両末端に付加されたrpsLneo-DsRed2カセットのDNA断片はPCR反応により構築した。PCR反応は鋳型としてrpsLneo-DsRed2カセットを使用して行った。使用するプライマー対は、US4不活性DEVでは配列番号8(5'-ATGGCAACAATGATAGCTGTGGTGTTAGTTTTTTTGGGACGCGTTTTAGGGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3')及び配列番号9(5'-TTAAACTAATGGAACGCGTTGGAATTTCAAGTCTTGGCGCCCAAACATCGGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3')、US5不活性DEVでは配列番号10(5'-ATGTATACAGACGTTACGGTCATGTGGGTAGCCGTGATTTTATTTACTATGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3')及び配列番号11(5'- TCATACCATACAAAGGCATAGGTACAGCCCACAGGTTAAAAACAAAGAAAGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3')である。得られたPCR断片(US4-rpsLneo-DsRed2及びUS5-rpsLneo-DsRed2カセット)は電気泳動し精製した。
US4又はUS5領域にrpsLneo-DsRed2遺伝子を保有する組換えDEVの構築は、0.5μgのUS4-rpsLneoDsRed2又はUS5-rpsLneoDsRed2でトランスフェクトされた、DEVゲノムを保有する大腸菌株での相同組換えにより行った。トランスフェクションは、1.75kV、25μF、及び200ohmでGene Pulser XCell(Bio-Rad Laboratories社)を使用するエレクトロポレーションにより行った。トランスフェクション後、大腸菌はLuria-Bertani(LB)寒天プレート上に蒔き、30℃で一晩インキュベートした。US4又はUS5領域にrpsLneo-DsRed2遺伝子を含有する適切なインサートを保有する大腸菌クローンは、rpsLneo-DsRed2遺伝子とDEVゲノムの挿入部位領域の間の領域(ジャンクション1)を増幅するプライマー対を使用するPCRにより同定された。プライマーは、US4不活性DEVでは配列番号12(5'-AAGTGTATAAATTAGACAAGTAGCTATGCG-3')及び配列番号13(5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3')、US5不活性DEVでは配列番号13及び配列番号14(5'-GTTTATATTGACGCGGAATGTTGAC-3')である。DEV DNAは適切なインサートを保有する大腸菌クローンから抽出され、Nucleofector II(Lonza社、Basel、Switzerland)を使用してCEFにトランスフェクトさせた。トランスフェクトされた細胞は、Leibovitz's L-15(Life Technologies社、カタログ番号41300-39)、McCoy's 5A培地(Life Technologies社、カタログ番号21500-061)(1:1)及び4%の仔ウシ血清[LM(+)培地]に添加され、96ウェル組織培養プレートに蒔かれ、次にDEV細胞変性効果(CPE)が見えるようになるまで37℃、4〜5% CO2で、5〜7日間インキュベートした。US4又はUS5領域にrpsLneo-DsRed2遺伝子を保有するDEVは首尾よくレスキューされた(DEV/US4/rpsLneo-DsRed2又はDEV/US5/rpsLneo-DsRed2)。
組換えDEV/US4/rpsLneo-DsRed2又はDEV/US5/rpsLneo-DsRed2のゲノム構造は、挿入された遺伝子のそれぞれの末端でジャンクション領域(ジャンクション1、ジャンクション2、及びジャンクション3)を増幅する3つのPCR反応により検証した。ジャンクション1についてのPCR反応で使用したプライマー対は上に記載されている。DEV/US4/rpsLneo-DsRed2では、PCR反応で使用したプライマー対は、ジャンクション2では配列番号6及び配列番号15(5'-CATTTTAACCGTTTAAGTCAACATTCCGC-3')、ジャンクション3では配列番号12及び配列番号15である。DEV/US5/rpsLneo-DsRed2では、PCR反応で使用したプライマー対は、ジャンクション2では配列番号6及び配列番号16(5'-ACTGAGATGTTGGACCATCAAATCCTG-3')、ジャンクション3では配列番号14及び配列番号16である。PCR産物については予想されるサイズが観察され、DEV/US4/rpsLneo-DsRed2及びDEV/US5/rpsLneo-DsRed2が予想されるゲノム構造を有していたことが確かめられた。
DEV/US4/rpsLneo-DsRed2又はDEV/US5/rpsLneo-DsRed2によるDsRed2タンパク質の発現はDsRed2についての励起により確かめられた。DsRed2についての励起は、DEV/US4/rpsLneo-DsRed2又はDEV/US5/rpsLneo-DsRed2を感染させたCEFを使用して行った。手短に言えば、6ウェルプレートのCEF細胞に、DEV/US4/rpsLneo-DsRed2、DEV/US5/rpsLneo-DsRed2、又は親DEV株をおおよそ0.01の感染多重度で感染させた。接種の3日後、細胞は563nmで励起すると組換えDEV/US4/rpsLneo-DsRed2又はDEV/US5/rpsLneo-DsRed2のプラークで赤色蛍光が観察され、したがって、組換えDEVによる実際のタンパク質発現が確かめられた。
DEV/US4/rpsLneo-DsRed2又はDEV/US5/rpsLneo-DsRed2はCEFにおいて15回継代され、rpsLneo-DsRed2の挿入された遺伝子の安定性が確かめられた。継代は3日〜4日ごとに行われた。5継代ごとに、DEV/US4/rpsLneo-DsRed2又はDEV/US5/rpsLneo-DsRed2のプラークは蛍光顕微鏡により赤色蛍光をチェックし、そのゲノム構造は、実施例2に示されるプライマーを用いてジャンクション領域(ジャンクション1、ジャンクション2、及びジャンクション3)を増幅するPCR分析により確かめた。観察したウイルスすべてでPCR産物の赤色蛍光及び予想されるサイズが観察され、DEV/US4/rpsLneo-DsRed2及びDEV/US5/rpsLneo-DsRed2が少なくとも15継代の間rpsLneo-DsRed2遺伝子を保持したことが確かめられた。
DEV/US4/rpsLneo-DsRed2又はDEV/US5/rpsLneo-DsRed2をSPFニワトリの18日目の胚に接種して、ニワトリ胚に対するその病原性又は毒性を調べた。ニワトリ胚に、おおよそ1000pfu/0.1mlのDEV/US4/rpsLneo-DsRed2、DEV/US5/rpsLneo-DsRed2、親DEV、又は0.1mlのPBSを20ゲージ及び1.5インチ針を介してin ovoに投与した。ニワトリは11日間、衰弱及び死亡等のDEVに関連する臨床徴候について毎日観察された。結果は以下の表に示されている。
不活性なUS4及びUS5遺伝子を含むDEVの構築
US4及びUS5不活性DEVの構築では、相同ベクターを先ず構築し、次にこれを使用して大腸菌において相同組換えによりウイルスを作成した。プラスミド構築及びDNA操作は本質的に標準的分子生物学技法(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第4版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、USA、2012年)に従って実施した。
US3及びUS6遺伝子に隣接するDEVゲノムの1.1kbのDNA断片を、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローングした。手短に言えば、鋳型としてDEVから抽出したDNAを使用して、2つのPCR反応を行った。使用したプライマー対は配列番号17(5'-GCGCATGCTAGCTGATCTAACTTTAC-3')と配列番号18(5'-GGTGGCCAATAAGGCCTGACGGCAATATGT-3')及び配列番号19(5'-TCAggccttattggccACCAGCTACACAAG-3')と配列番号20(5'-GCGAATTCGATTAATTCTCCCGAACTGTTG-3')である。別のPCR反応は、鋳型として2つの以前のPCR反応由来のPCR産物の混合物並びにプライマーとして配列番号17及び配列番号20を使用して行った。得られたPCR断片は、EcoRI及びSphIを用いた消化後pUC18ベクター(ジェンバンク受託番号L09136)にクローニングし、pUC18-KAPEVAC-US4US5del-SfiIを得たが、これはDEVゲノムのUS3及びUS6領域の一部を含む。次に、標準負荷株(VP2-STC)由来のプロモーター及びIBDV VP2遺伝子を含有する相同ベクターは、プラスミドpUC18-KAPEVAC-US4US5del-SfiIを利用することにより構築した。第1に、pUC18-KAPEVAC-US4US5del-SfiIをSfiIを用いて切断し、アルカリホスファターゼシュワネラ種S1B1リコンビナント(PAP)(Funakoshi社、番号DE110)を用いて脱リン酸化した。次に、ニワトリベータアクチン(Bac)プロモーター(配列番号21)及びVP2-STC遺伝子はp45/46bacVP2-STC#11(米国特許第6,764,684号)のBg1I消化により得た。最後に、このBacプロモーターVP2-STCカセットをSfiI消化pUC18-KAPEVAC-US4US5del-SfiIに挿入し、pUC18-KAPEVAC-US4US5del-BacVP2stcを得た(図2)。このプラスミドpUC18-KAPEVAC-US4US5del-BacVP2stcを使用してDEV/US4US5del/BacVP2stcを構築した(図2)。
US4-US5領域にBacVP2遺伝子を保有するDEVの構築は、0.5μgのpUC18-KAPEVAC-US4US5del-BacVP2stcをトランスフェクトされた、DEVゲノムを保有する大腸菌株での相同組換えにより行った。トランスフェクション条件は実施例2に記載していた。BacVP2遺伝子を含有する適切なインサートを保有する大腸菌クローンは、BacVP2遺伝子とDEVゲノムの挿入部位領域の間の領域(ジャンクション1、図2)を増幅するプライマー対を使用するPCRにより同定した。プライマーは配列番号22(5'-GTCCACTATGCCATGACATAGGTG-3')及び配列番号23(5'-GAGCAACTTCGAGCTGATCC-3')である。DEV DNAは適切なインサートを保有する大腸菌クローンから抽出し、これをCEFにトランスフェクトした。トランスフェクト細胞は、DEV CPEが見えるようになるまでインキュベートした。DEV/US4US5del/BacVP2は、そのUS4及びUS5遺伝子をノックアウトされBacVP2遺伝子を有するが、構築に成功した。
DEV/US4US5del/BacVP2のゲノム構造は、挿入された遺伝子のそれぞれの末端でジャンクション領域(ジャンクション1、ジャンクション2、及びジャンクション3;図2)を増幅させる3つのPCR反応により検証した。ジャンクション1についてのPCR反応で使用したプライマー対は上に記載されている。ジャンクション2についてのPCR反応で使用したプライマー対は、配列番号24(5'-GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3')及び配列番号12である。ジャンクション3では、配列番号22及び配列番号12を使用した。PCR産物については予想されるサイズが観察され、DEV/US4US5del/BacVP2が予想されるゲノム構造を有していたことが確かめられた。
DEV/US4US5del/BacVP2によるVP2遺伝子の発現
組換えDEV/US4US5del/BacVP2によるVP2タンパク質の発現はブラックプラークアッセイにより確かめた。手短に言えば、DEV/US4US5del/BacVP2を感染させたCEFは、メタノール:アセトン混合物(1:2)で固定させ、抗IBDV VP2モノクローナル抗体R63(ATCC#; HB-9490)と一緒にインキュベートした。次に、ビオチン化抗マウスIgG抗体(Vector Laboratories社、カタログ番号BA-9200)と一緒に、その後VECTASTAIN ABC-APキット(Vector Laboratories社、カタログ番号AK-5000)と一緒にインキュベートし、VP2タンパク質を発現しているプラークはNBT/BCIP溶液(Roche Applied Science社、カタログ番号1681451)の添加により染色した。図3に示されるように、VP2タンパク質の発現はDEV/US4US5del/BacVP2を感染させた細胞で観察された。
DEV/US4US5del/BacVP2のin ovo投与
DEV/US4US5del/BacVP2はSPFニワトリの18日目の胚に接種した。胚のすべての群には、おおよそ1000pfu/0.1mlの組換DEV/US4US5del/BacVP2、親DEV、又は0.1mlのPBSを20ゲージ及び1.5インチ針を介してin ovoでワクチン接種した。ニワトリは35日間、衰弱及び死亡等のDEVに関連する臨床徴候について毎日観察された。孵化5週間後、ニワトリは体重増加を調べ、死体解剖し、肉眼的に観察可能な病変について観察した。結果は下の表に示されている。
不活性なUS4及びUS5遺伝子を含むDEV/Coa5VP2の構築
本セクションでは、US4とUS5遺伝子の両方に欠失がありBacプロモーター(Coa5プロモーター;配列番号25)のコア領域により駆動されるVP2遺伝子を保有するDEVを構築した。これらのDEVの構築では、先ず相同ベクターを構築し、次にこれを使用して大腸菌において相同組換えによりウイルスを作成した。
US3及びUS6遺伝子に隣接するDEVゲノムの1.1kbのDNA断片を、PCR反応によりクローングした(図4)。手短に言えば、鋳型としてDEVから抽出したDNAを使用して、2つのPCR反応を行った。使用したプライマー対は配列番号17と配列番号26(5'-GCTTGTGTAGCTGGTTGACGGCAATATG-3')及び配列番号27(5'-CATATTGCCGTCAACCAGCTACACAAGC-3')と配列番号20(5'-gcGAATTCGATTAATTCTCCCGAACTGTTG-3')である。別のPCR反応は、鋳型として2つの以前のPCR反応由来のPCR産物の混合物並びにプライマーとして配列番号17及び配列番号20を使用して行った。得られたPCR断片は、EcoRI及びSphIを用いた消化後pUC18ベクターにクローニングし、pUC18-KAPEVAC-US4US5del(図4)を得た。
US4とUS5遺伝子の両方に欠失がある組換えDEV/US4US5delの構築は、0.5μgのpUC18-KAPEVAC-US4US5delをトランスフェクトされた、DEVゲノムを保有する大腸菌において相同組換えにより行った。適切な欠失(DH10B/ DEV/US4US5del)を保有する大腸菌クローンは、US3とUS6の間の領域(ジャンクション1;図4)を増幅するプライマー対を使用してPCRにより同定した。使用したプライマーは配列番号22及び配列番号20である。DEV DNAは大腸菌クローンから抽出し、CEFにトランスフェクトしてDEV/US4US5delをレスキューした。
UL24及びUL22遺伝子に隣接するDEVゲノムの1.0kbのDNA断片を、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローングした(図5)。手短に言えば、鋳型としてDEVから抽出したDNAを使用して、2つのPCR反応を行った。使用したプライマー対は配列番号28(5'-GCGCATGCCAATTGTCTAATTCCAG-3')と配列番号29(5'-CCCGGCCAATAAGGCCACAGAAAAAGCGCG-3')及び配列番号30(5'-CTGTGGCCTTATTGGCCGGGATCTGGAAC-3')と配列番号31(5'-GCGAATTCATGTGCTACGCCCAG-3')である。別のPCR反応は、鋳型として2つの以前のPCR反応由来のPCR産物の混合物並びにプライマーとして配列番号28及び配列番号31を使用して行った。得られたPCR断片は、EcoRI及びSphIを用いた消化後pUC18ベクターにクローニングし、pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIを得た。次に、プロモーター及びVP2-STCを含有する相同ベクターは、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIを利用することにより構築した。第1に、pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIをSfiIを用いて切断し、PAPを用いて脱リン酸化した。次に、Coa5プロモーターはBglI及びXbaI消化によりプラスミドpGICOA(米国特許第6,866,852号)から入手し、p45/46bacVP2-STC#11(米国特許第6,764,684号)のXbaI-EcoRI断片(6.3kb)及びEcoRI-Bg1I断片(0.1kb)を用いてライゲートし、p45/46COA5VP2-STC#11を得た。次に、Coa5プロモーター-VP2-STCカセットをBglI消化によりp45/46COA5VP2-STC#11から切り取り、SfiI消化pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIを用いてライゲートし、pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2を得た。このプラスミドを使用してDEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2を構築した。
UL26及びUL27遺伝子に隣接するDEVゲノムの1.0kbのDNA断片を、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローングした(図6)。手短に言えば、鋳型としてDEVから抽出したDNAを使用して、2つのPCR反応を行った。使用したプライマー対は配列番号32(5'-CGGTCGACACTCCCAGGGGTGAAGC-3')と配列番号33(5'-CGGCCAATAAGGCCAAGAATGCATTCGGCC-3')及び配列番号34(5'-TGGCCTTATTGGCCGCCGTATGAATTGCGC-3')と配列番号35(5'-GCGAGCTCCTGCAACCACAGACCGC-3')である。別のPCR反応は、鋳型として2つの以前のPCR反応由来のPCR産物の混合物並びにプライマーとして配列番号32及び配列番号35を使用して行った。得られたPCR断片は、SalI及びSacIを用いた消化後pUC18ベクターにクローニングし、pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIを得た。次に、標準負荷株由来のプロモーター及びIBDV VP2遺伝子を含有する相同ベクターは、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIを利用することにより構築した。第1に、pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIをSfiIを用いて切断し、PAPを用いて脱リン酸化した。Coa5プロモーター-VP2-STCカセットはSfiI消化によりpUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2から切り取り、SfiI消化pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIを用いてライゲートし、pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2を得た。このプラスミドを使用してDEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2を構築した。
UL45及びUL46遺伝子に隣接するDEVゲノムの1.0kbのDNA断片を、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローングした(図7)。手短に言えば、鋳型としてDEVから抽出したDNAを使用して、2つのPCR反応を行った。使用したプライマー対は配列番号36(5'-CGGTCGACATAGAACGCGCTTCATCTAA-3')と配列番号37(5'-TGGCCAATAAGGCCGTTTATTGTTTATTAT-3')及び配列番号38(5'-CGGCCTTATTGGCCAATCTGATTCATCCAA-3')と配列番号39(5'-GCGAGCTCCGCCTAATCACAATCGGTATTG-3')である。別のPCR反応は、鋳型として2つの以前のPCR反応由来のPCR産物の混合物並びにプライマーとして配列番号36及び配列番号39を使用して行った。得られたPCR断片は、SalI及びSacIを用いた消化後pUC18ベクターにクローニングし、pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIを得た。次に、標準負荷株由来のプロモーター及びIBDV VP2遺伝子を含有する相同ベクターは、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIを利用することにより構築した。第1に、pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIをSfiIを用いて切断し、PAPを用いて脱リン酸化した。Coa5プロモーター-VP2-STCカセットはSfiI消化によりpUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2から切り取り、SfiI消化pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIを用いてライゲートし、pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2を得た。このプラスミドを使用してDEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2を構築した。
UL50及びUL51遺伝子に隣接するDEVゲノムの1.0kbのDNA断片を、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローングした(図8)。手短に言えば、鋳型としてDEVから抽出したDNAを使用して、2つのPCR反応を行った。使用したプライマー対は配列番号40(5'-CCGCATGCGCAACTATATATGTCGGTC-3')と配列番号41(5'-GGGCCAATAAGGCCCAAAAGTACATTTTGT-3')及び配列番号42(5'-GGGCCTTATTGGCCCAATTTATTTACTATT-3')と配列番号43(5'-GCGAATTCTGGATATGATATACCGTTGC-3')である。別のPCR反応は、鋳型として2つの以前のPCR反応由来のPCR産物の混合物並びにプライマーとして配列番号40及び配列番号43を使用して行った。得られたPCR断片は、EcoRI及びSphIを用いた消化後pUC18ベクターにクローニングし、pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIを得た。次に、標準負荷株由来のプロモーター及びIBDV VP2遺伝子を含有する相同ベクターは、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIを利用することにより構築した。第1に、pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIをSfiIを用いて切断し、PAPを用いて脱リン酸化した。Coa5プロモーター-VP2-STCカセットはSfiI消化によりpUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2から切り取り、SfiI消化pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIを用いてライゲートし、pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2を得た。このプラスミドを使用してDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2を構築した。
US4及びUS5遺伝子に欠失がありUL23、UL26/UL27、UL45/UL46、又はUL50/UL51領域にCoa5VP2遺伝子を保有する組換えDEVの構築は、DEV/US4US5delを及びpUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2、pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2、pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2、又はpUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2のうちの1つの0.5μgをトランスフェクトした大腸菌株において相同組換えにより行った。トランスフェクション条件は実施例2に記載した。トランスフェクション後、Coa5VP2遺伝子を含有する適切なインサートを保有する大腸菌クローンは、Coa5VP2遺伝子とDEVゲノムの挿入部位領域の間の領域(ジャンクション1、図5〜図8)を増幅するプライマー対を使用してPCRにより同定した。プライマーは、挿入部位UL23では配列番号23と配列番号28、挿入部位UL26/UL27では配列番号32、挿入部位UL45/UL46では配列番号36、又は挿入部位UL50/UL51では配列番号40である。改変DEV DNAは適切なインサートを保有する大腸菌クローンから抽出され、NucleofectorIIを使用してCEFにトランスフェクトした。トランスフェクト細胞はLM(+)培地に添加し、96ウェル組織培養プレートに蒔き、次にDEV CPEが見えるようになるまで5〜7日間、37℃、4〜5%CO2でインキュベートした。トランスフェクション後、不活性なUS4及びUS5遺伝子を有しCoa5VP2遺伝子を保有するDEVはレスキューに成功した(DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2、及びDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2)。
DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2、及びDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2のゲノム構造は、挿入された遺伝子のそれぞれの末端でジャンクション領域(ジャンクション1、ジャンクション2、及びジャンクション3;図5〜図8)を増幅させる3つのPCR反応により検証した。ジャンクション1についてのPCR反応で使用したプライマー対は上に記載されている。ジャンクション2についてのPCR反応で使用したプライマー対は、配列番号24と配列番号31(挿入部位UL23)、配列番号35(挿入部位UL26/UL27)、配列番号39(挿入部位UL45/UL46)、又は配列番号43(挿入部位UL50/UL51)である。ジャンクション3では、プライマー対配列番号28/配列番号31(挿入部位UL23)、配列番号32/配列番号35(挿入部位UL26/UL27)、配列番号36/配列番号39(挿入部位UL45/UL46)、又は配列番号40/配列番号43(挿入部位UL50/UL51)を使用した。PCR産物については予想されるサイズが観察され、DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2、及びDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2が予想されるゲノム構造を有していたことが確かめられた。
不活性なUS4及びUS5遺伝子を含むDEV/Coa5VP2によるVP2遺伝子の発現
DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2、及びDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2によるVP2タンパク質の発現は、ブラックプラークアッセイ及びウェスタンブロット分析により確かめた。ブラックプラークアッセイの方法は実施例4に記載した。図9に示されるように、VP2タンパク質の発現は、DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2、又はDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2を感染させた細胞で観察された。ウェスタンブロットは、DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2、又はDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2を感染させたCEF及び抗IBDV VP2モノクローナル抗体R63を使用して行った。手短に言えば、12ウェルプレート中のCEFに組換えウイルス又は親DEVのうちの1つを感染させた。接種4日後、細胞はトリプシンで収穫し、913×gで5分間遠心分離した。ペレットはPBSで洗浄して25μlのPBSで再懸濁した。同体積の2×SDSサンプルバッファー(130mMのトリス-Cl(pH6.8)、6%のSDS、20%のグリセロール、10%の2-メルカプトエタノール及び0.01%のブロモフェノールブルー)を添加後、細胞懸濁液は5分間煮沸した。試料は12.5%ポリアクリルアミドゲルを使用してSDS-PAGEにより分離し、PVDF膜(Immobilon-P、Millipore社)に移した。膜は完全に乾燥させ、次にR63モノクローナル抗体と一緒にインキュベートした。R63抗体を洗い流した後、ビオチン化抗マウスIgG抗体及び次にVECTASTAIN ABC-APキットを用いて。R63モノクローナル抗体と結合しているタンパク質は、NBT/BCIP溶液の添加により可視化した。40キロダルトンのタンパク質バンドは、予想されるサイズのVP2タンパク質であるが、組換え細胞と共にすべてのレーンで観察され(図10)、組換えウイルスが感染した細胞がVP2タンパク質を発現することが確かめられた。
不活性なUS4及びUS5遺伝子を含むDEV/Coa5VP2の安定性
DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2、及びDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2はCEFにおいて15回継代され、BacVP2の挿入された遺伝子の安定性は正しく確かめられた。継代は3から4日ごとに行った。5継代ごとに、DEV/US4US5del/UL23/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL26/Coa5VP2、DEV/US4US5del/UL45/Coa5VP2、又はDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2を感染させた細胞はVP2遺伝子の発現についてブラックプラークアッセイにより調べ、そのゲノム構造はジャンクション領域(ジャンクション1、ジャンクション2、及びジャンクション3;図5〜図8)を増幅させるPCR分析により確かめ、プライマーは実施例7に示されている。その結果、US4及びUS5遺伝子の復帰変異もCoa5VP2遺伝子上の欠失も観察されず、これらのウイルスがCEFにおいて安定であることが示されている。
不活性なUS4及びUS5遺伝子を含むDEV/Coa5VP2のin ovo投与
本研究では、毒性のあるIBDVに対するin ovo安全性及び防御効率を調べる。
Claims (26)
- 不活性なUS4及びUS5遺伝子を有する、アヒル腸炎ウイルス(DEV)。
- 前記US4及びUS5遺伝子が、互いに独立して、変異している、欠失している、又は中断されている、請求項1に記載のDEV。
- 前記US4及びUS5遺伝子のそれぞれのコード配列の少なくとも20%、更に好ましくは少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%が欠失している、請求項1又は2に記載のDEV。
- US4とUS5遺伝子の間の遺伝子間領域が欠失している、請求項1から3のいずれか一項に記載のDEV。
- US4遺伝子の少なくとも50%、US4遺伝子とUS5遺伝子の間の遺伝子間領域のすべて、及びUS5遺伝子の少なくとも50%を含むヌクレオチド領域の欠失を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のDEV。
- 不活性なUL23、US7及び/又はUL4遺伝子を更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載のDEV。
- (i)US4遺伝子の少なくとも50%、US4遺伝子とUS5遺伝子の間の遺伝子間領域のすべて、及びUS5遺伝子の少なくとも50%を含むヌクレオチド領域の欠失並びに(ii)UL23遺伝子配列の少なくとも50%の欠失を含む、請求項6に記載のDEV。
- (i)US4遺伝子の少なくとも50%、US4遺伝子とUS5遺伝子の間の遺伝子間領域のすべて、及びUS5遺伝子の少なくとも50%を含むヌクレオチド領域の欠失並びに(ii)US7遺伝子配列の少なくとも50%の欠失を含む、請求項6に記載のDEV。
- (i)US4遺伝子の少なくとも50%、US4遺伝子とUS5遺伝子の間の遺伝子間領域のすべて、及びUS5遺伝子の少なくとも50%を含むヌクレオチド領域の欠失並びに(ii)UL4遺伝子配列の少なくとも50%の欠失を含む、請求項6に記載のDEV。
- 外来核酸を更に含む、請求項1から9のいずれか一項に記載のDEV。
- 外来核酸が不活性なUS4又はUS5遺伝子に位置している、請求項10に記載のDEV。
- 前記ウイルスが、US4遺伝子の少なくとも50%、US4遺伝子とUS5遺伝子の間の遺伝子間領域のすべて、及びUS5遺伝子の少なくとも50%を含むヌクレオチド領域の欠失を含み、外来核酸が前記欠失した領域に代わって位置している、請求項11に記載のDEV。
- 外来核酸が、UL4遺伝子、UL44遺伝子、UL27-UL26遺伝子間領域、UL23遺伝子、UL45-UL46遺伝子間領域、UL50-UL51遺伝子間領域、US7遺伝子、US7-US8遺伝子間領域、又はUS10遺伝子から選択される挿入部位に位置している、請求項10に記載のDEV。
- 外来核酸が抗原又は免疫刺激分子、好ましくは、鳥類病原体由来の抗原をコードする、請求項10から13のいずれか一項に記載のDEV。
- 抗原が、鳥類パラミクソウイルス1型の抗原タンパク質又はペプチド、好ましくは、ニューキャッスル病ウイルス(NDV)のFタンパク質又はその断片、ガンボロ病ウイルスの抗原ペプチド、好ましくは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のVP2タンパク質又はその断片、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)の抗原ペプチド、好ましくは、gBタンパク質又はその断片、マイコプラズマ・ガリセプチカムの抗原ペプチド、好ましくは、40Kタンパク質又はその断片、及び鳥インフルエンザウイルスの抗原ペプチド、優先的に、表面タンパク質ヘマグルチニン(HA)又はその断片である、請求項14に記載のDEV。
- 抗原ペプチドが、IBDVのVP2タンパク質若しくはその免疫原性断片、又はインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)タンパク質若しくはその免疫原性断片である、請求項15に記載のDEV。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載のDEVのゲノムを含む核酸分子。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載のDEV又は請求項17に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載のDEVを生成する又は複製する方法であって、コンピテント細胞に請求項17に記載の核酸分子を又は請求項1に記載のDEVを感染させ、DEVを収集することを含む方法。
- 家禽、好ましくは、ニワトリにワクチン接種する又は免疫化するのに使用するための、請求項1から16のいずれか一項に記載のDEV、又は請求項17に記載の核酸。
- 家禽において、好ましくは、ニワトリにおいて防御免役を誘導するのに使用するための、請求項1から16のいずれか一項に記載のDEV、又は請求項17に記載の核酸。
- 注射により投与される、請求項20又は21に記載の使用のためのDEV。
- in ovoで又は孵化後1日目若しくは2日目に投与される、請求項20から22のいずれか一項に記載の使用のためのDEV。
- 請求項1から16のいずれか一項に記載のDEV、請求項17に記載の核酸、又は請求項18に記載の宿主細胞、及び薬学的に若しくは獣医学的に許容される賦形剤若しくは担体を含む組成物。
- アジュバンドを更に更に含む、請求項24に記載の組成物。
- 鳥類を免疫化するためのワクチン接種キットであって、以下の成分:
a.有効量の請求項24又は25に記載の組成物、及び
b.前記組成物を前記鳥類に投与するための手段
を含むキット。
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