CN102657861A - 单纯疱疹病毒ⅰ型基因重组减毒活疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗及其制备方法，在于联合敲除了其基因组中的US2、US3、US4和US5基因和其它复制或感染非必需基因片段；所述其它复制或感染非必需基因片段是指US9～US12基因。该方法是取水泡较为明显的口唇疱疹和生殖器疱疹患者的水泡液，分离鉴定出野生型HSV-1；扩大培养后提取病毒完整基因组；和含有荧光表达基因及拟定敲除的HSV基因左右两侧700bp至2000bp的同源侧翼序列的穿梭载体共同转染Vero细胞；在荧光显微镜下使用一种或者联合使用多种荧光蛋白基因作为标记挑选出重组病毒，经过空斑纯化后可获得所需要的重组减毒活疫苗。
Description
一、技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种能够防治单纯疱疹病毒I型感染所致疾病的基因重组减毒活疫苗及其制备方法。
二、背景技术
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是一种经皮肤和粘膜密切接触传播的病毒，包括单纯疱疹病毒I型(简称HSV-1)和单纯疱疹病毒II型(简称HSV-2)，两种病毒具有83％以上的共同基因特征，50％以上的基因同源性。其中I型在人群的感染率可高达80％以上，并长期潜伏于感觉神经节内，虽然大多数HSV-1感染者没有明显症状，但少数感染者可产生终生的反复发作的面口疱疹、致盲性很高的眼内眼炎以及致命性的疱疹性肺炎和疱疹脑炎。HSV-2是生殖器疱疹的主要病原体，占生殖器疱疹原发感染的90％以上。II单纯疱疹病毒感染人类后主要引起生殖系统原发性和复发性疱疹，可以终生潜伏在神经节内，在机体免疫力降低时复发。孕妇感染HSV-II型病毒后易发生流产，也可致胎儿先天畸形或智力低下。新生儿在分娩时感染可导致高热、呼吸困难或中枢神经系统病变，其中60％-70％的新生儿可能死亡。此外，有研究表明，生殖器疱疹可将艾滋病感染风险增加2-3倍，并促进艾滋病病毒的传播。研究表明安全套并不能有效预防疱疹病毒感染，世界范围内生殖器疱疹发病率在逐年上升，据美国最新统计数据显示，美国成人生殖器疱疹患病率已经上升到了16％以上，在纽约已经上升至25％以上，目前并无单纯疱疹病毒感染，尤其是复发性感染的特效治疗方法，抗病毒药物常规用药虽能缓解一些临床症状，但不能彻底清除体内潜伏的病毒，也不能减少复发次数，因此迫切需要开发能有效防治单纯疱疹病毒感染的疫苗。
近数十年来世界各国HSV疫苗的研究结果表明，传统的灭活疫苗和亚单位疫苗免疫原性弱，仅能诱导体液免疫应答，细胞免疫诱导效果较差；新型DNA疫苗虽能同时诱导体液和细胞免疫，但是其转染效率较低，经粘膜免疫诱导有效的粘膜免疫应答能力更低。而在单纯疱疹病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着更大的作用，但上述几类疫苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可以在临床上应用的疫苗上市，单纯疱疹病毒疫苗基本上都处于临床前或临床研究阶段。
病毒减毒活疫苗是最为经典的疫苗形式，这种类型的疫苗如天花疫苗、脊髓灰质炎疫苗等在人类抵抗感染性疾病的历史上发挥了不可替代的作用，为人类的健康做出了不可磨灭的贡献。减毒活疫苗基本上包含病毒的全部或大部分抗原，并且具有野生型病毒一样的感染和复制特性，但没有致病作用，此类疫苗可以有效地诱导机体产生全面的免疫应答，相对于其它种类的疫苗而言，免疫原性强，保护效果好。
传统的减毒活疫苗主要是通过连续培养筛选得到的，但这种方法耗时费力，用这种方法很难得到致病性降低的单纯疱疹病毒毒株。近年来，研究者开始采用现代分子生物学技术，将HSV基因组的特定基因进行敲除以获得重组株。本发明则是利用现代分子生物学技术，以Genebank中的HSV-1基因组参考序列(HSV-1登录号：NC_001806，为蓝本，通过联合敲除多个基因，筛选出了HSV-1型重组减毒株，它们的致病能力均发生了不同程度的降低，可用以有效地防治HSV-1感染所致疾病。
三、发明内容
本发明的目的是提供能够预防和治疗单纯疱疹病毒I型感染所致疾病的重组减毒活疫苗及所述疫苗的制备方法。
本发明涉及的单纯疱疹病毒I型重组株，均由野生型HSV-1经过重组、筛选和纯化得来的。
所采用的技术方案是取水泡较为明显的口唇疱疹和生殖器疱疹患者的水泡液，分离鉴定出野生型HSV-1；扩大培养后提取病毒完整基因组；和含有荧光表达基因及拟定敲除的HSV基因左右两侧700bp至2000bp的同源侧翼序列的穿梭载体共同转染Vero细胞；在荧光显微镜下使用一种或者联合使用多种荧光蛋白基因作为标记挑选出重组病毒，经过空斑纯化后可获得所需要的重组减毒活疫苗。
可以获得一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，特征是敲除了其基因组中的US2和US3和US4和US5基因的HSV-1重组株。
可以获得一种如上所述的单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，在于联合敲除了其基因组中的US2～US5基因和其它复制或感染非必需基因片段的HSV-1重组株；所述其它复制或感染非必需基因片段是指US9～US12基因。
用类似的方法在上述重组株的基础上可进一步敲除其它如基因获得致病性进一步减低的重组株。
作用在小鼠身上可证明，上述的重组株病毒致病能力均有不同程度的减弱，可以保护小鼠免受致死量单纯疱疹病毒I型的攻击；作用在豚鼠身上证明重组株可以预防和治疗豚鼠生殖器疱疹。上述重组株可以作为重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗以防治单纯疱疹病毒感染所致相关疾病。
本发明用以构建同源重组穿梭质粒的pShuttle-CMV质粒购自Stragene公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录。
本发明所用荧光标记基因是绿色荧光蛋白表达盒和红色荧光蛋白表达盒。
本发明的有益效果：相比传统疫苗而言，本发明制备的减毒活疫苗均是经过基因工程重组后的减毒活疫苗，不易发生毒力回复，其它生物学特性和野生型单纯疱疹病毒相似，但进入机体后仅能刺激机体产生免疫应答而无致病作用，具有良好的安全性；本疫苗保留了单纯疱疹病毒I型的大部分抗原，具有较高的免疫原性，能很好地模拟野生型HSV-1，有效地诱导机体粘膜和体液免疫应答，构建机体抵抗疱疹感染的第一道防线，降低人群发病率；激发细胞免疫应答，构建机体的第二道防线，有可能清除已感染病毒，控制疱疹的复发和传播。
四、附图说明
图1重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗的构建策略示意图
图2重组单纯疱疹病毒减毒I型活疫苗JSH01S结构示意图
图3重组单纯疱疹病毒减毒I型活疫苗JSH01SS结构示意图
五、具体实施方式
本发明技术方案中单纯疱疹病毒I型重组减毒活疫苗的总体构建策略参见附图1。提取野生型HSV-1完整基因组；构建含有绿色或红色荧光表达基因及拟定敲除的HSV基因左右两侧700bp至2000bp的侧翼序列的同源重组穿梭载体，二者共同转染Vero细胞，在荧光显微镜下挑选表现相应颜色荧光的重组病毒，经过空斑纯化后可获得敲除了HSV-1重组减毒活疫苗。其中：
敲除了HSV-1US2～US5基因的HSV-1重组株，命名为JSH01S；
敲除了HSV-1US2～US5和US9～US12基因的HSV-1重组株，命名为JSH01SS。
用类似的方法在上述重组株的基础上可进一步敲除其它如基因获得致病性进一步减低的重组株。
实施例1重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01S的构建
1.构建同源重组穿梭载体pShuttle-01S-GFP。
(1)参考NCBI上登录号为NC_001806的HSV-1基因组US区US2～US5的序列，分别设计US2基因的左侧侧翼序列和US5基因的右侧侧翼序列的扩增引物。
(2)US2侧翼序列的引物设计
在US2左侧翼序列上游引物的5’末端添加NotI位点和三个保护碱基，在US2左侧翼序列下游引物的5’末端添加PmeI、AseI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。
(3)US5侧翼序列的引物设计
US5右侧翼序列上游引物5’末端添加PmeI和MluI位点和三个保护碱基，US5右侧翼序列下游引物5’末端添加HindIII位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。
(4)PCR扩增GFP表达质粒pLKO-GFP(由本公司自己构建)上的GFP表达盒，上游引物5’末端添加AseI位点和三个保护碱基，下游引物的5’末端添加PmeI位点和三个保护碱基，PCR扩增30个循环后回收目的条带。
(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR产物，回收备用。
(6)用NotI和PmeI酶切US2侧翼序列PCR产物，PmeI和HindIII酶切US5侧翼序列PCR产物，回收酶切产物。
(7)分两步将1.5)和1.6)步骤中回收的产物克隆至pShuttle-CMV载体上即构建成功pShuttle-01S-GFP。
2.同源重组生产HSV-1敲除株JSH01S
(1)用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取pShuttle-01S-GFP质粒。
(2)用脂质体2000将HSV-1基因组和pShuttle-01S-GFP质粒共转染至vero细胞。
(3)在倒置荧光显微镜下将绿色CPE处的细胞吸出，转移至含有1ML培养基的EP管中。
(4)将EP管在-80℃-37℃反复冻融三次。
(5)将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微镜下挑出绿色空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-1敲除株JSH01S，参见附图2。
实施例2重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01S的复制感染能力减低
1.实验材料：野生型HSV-1，JSH01S，Vero细胞，六孔板。
2.实验方法：六孔板内每孔传入5×105个Vero细胞，培养24小时，按感染复数(MOI)0.1和1分别用野生型HSV-1和JSH01S感染六孔板其中四孔，剩余两个孔做为对照，观察病毒感染孔细胞病变效应产生情况。
3.结果：预期野生型HSV-148小时至72小时左右完全产生CPE，而JSH01S在6到7天左右方可产生完全CPE，说明重组株JSH01S相对于野生型HSV-1而言复制和感染能力明显降低。
实施例3重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01S的致病能力减低
1.实验方法和实施例2所用方法相同，经鼻腔滴注途径给予对照组野生型单纯疱疹病毒I型20微升，正常剂量组给予20微升JSH01S，高剂量组给予100微升JSH01S，观察小鼠情况。
2.结果：预期对照组小鼠在滴鼻后第5天开始出现死亡情况，第13天后全部死亡，死亡率为100％；正常剂量组和高剂量组小鼠全部存活，死亡率是0，说明和野生型相比，JSH01S几乎没有致病能力。
实施例4活疫苗JSH01S对小鼠的免疫保护实验
1.实验方法和实施例3中所用方法相同，免疫5周后攻毒，预期阴性组攻毒后第5天开始出现死亡情况，第13后全部死亡，死亡率为100％；阳性组全部存活，死亡率是0。预期阳性组和阴性组差别显著，疫苗可抵抗致死量病毒攻击。
实施例5联合应用红色和绿色荧光标记构建重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01SS
1.用Axygen质粒小提试剂盒按其说明书提取实施例1中构建的pShuttle-01-RED质粒。
2.扩增实施例1所构建的表达绿色荧光的重组型病毒JSH01S。
3.用实施例1中基因组提取方法提表达绿色荧光的重组型病毒JSH01S的基因组。
4.用脂质体2000将JSH01S基因组和pShuttle-01-RED质粒共转染至vero细胞。
5.在倒置荧光显微镜下将同时表现红色荧光和绿色荧光的CPE处的细胞吸出，转移至含有1ML培养基的EP管中。
6.将EP管在-80℃-37℃反复冻融三次。
7.将病毒稀释至合适的滴度，用低熔点琼脂糖覆盖法进行空斑纯化，在荧光显微镜下挑出同时表现红色荧光和绿色荧光的空斑，进行5轮空斑纯化后获得HSV-1敲除株JSH01SS。参见附图3。
实施例6重组单纯疱疹病毒减毒活疫苗JSH01SS的致病能力减低
实验方法和实施例2所用方法相同，经鼻腔滴注途径给予对照组野生型单纯疱疹病毒I型20微升，正常剂量组给予20微升JSH01SS，高剂量组给予100微升JSH01S，观察小鼠情况。
结果：预期对组组小鼠在滴鼻后第5天开始出现死亡情况，第13天后全部死亡，死亡率为100％；正常剂量组和高剂量组小鼠全部存活，死亡率是0，这说明和野生型相比，JSH01SS几乎没有致病能力。
实施例7活疫苗JSH01SS对小鼠的免疫保护实验
实验方法和实施例3中所用方法相同，免疫5周后攻毒，预期阴性组攻毒后第5天开始出现死亡情况，第13后全部死亡，死亡率为100％；阳性组全部存活，死亡率是0。预期阳性组和阴性组差别显著，疫苗可抵抗致死量病毒攻击。
Claims (3)
1.一种单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，其特征在于敲除了其基因组中的US2～US5基因。
2.一种如权利要求1所述的单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗，其特征在于联合敲除了其基因组中的US2、US3、US4和US5基因和其它复制或感染非必需基因片段；所述其它复制或感染非必需基因片段是指US9～US12基因。
3.一种如权利要求1或2所述的单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗的制备方法，其特征在于：
步骤一：取疱疹患者的水泡液，分离鉴定出野生型单纯疱疹病毒I型；
步骤二：扩大培养后提取病毒完整基因组，设计引物扩增出单纯疱疹病毒I型病毒基因组的US2基因左侧700bp至2000bp的同源侧翼序列和单纯疱疹病毒I型病毒基因组的US5基因右侧700bp至2000bp的同源侧翼序列；
步骤三：将步骤二所述同源侧翼序列和荧光蛋白基因克隆至pShuttle-CMV载体，使荧光蛋白基因位于同源侧翼序列之间，再和单纯疱疹病毒I型基因组共转染至Vero细胞中，进行同源重组；
步骤四：在荧光显微镜下使用荧光蛋白基因作为标记挑选出重组病毒；经过空斑纯化后可获得单纯疱疹病毒I型基因重组减毒活疫苗。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104827426A (zh) * | 2015-06-03 | 2015-08-12 | 安徽雷风动力科技有限公司 | 一种便于安装法兰的冷凝器风扇组装夹具 |
| EP3263129A1 (en) * | 2016-06-29 | 2018-01-03 | Ceva Sante Animale | Duck enteritis virus and the uses thereof |
| CN107893056A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-04-10 | 江苏省农业科学院 | 山羊疱疹病毒ⅰ型疫苗株及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001009361A1 (en) * | 1999-08-03 | 2001-02-08 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Recombinant hsv-1 and live viral vaccines |
| US20020028925A1 (en) * | 1994-07-29 | 2002-03-07 | Christopher Preston | Hsv viral vector |
| WO2002092826A2 (en) * | 2001-05-09 | 2002-11-21 | M's Science Corporation | Composition and method for treating cancer using herpes virus |
-
2010
- 2010-08-16 CN CN2012101593382A patent/CN102657861A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020028925A1 (en) * | 1994-07-29 | 2002-03-07 | Christopher Preston | Hsv viral vector |
| WO2001009361A1 (en) * | 1999-08-03 | 2001-02-08 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Recombinant hsv-1 and live viral vaccines |
| WO2002092826A2 (en) * | 2001-05-09 | 2002-11-21 | M's Science Corporation | Composition and method for treating cancer using herpes virus |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104827426A (zh) * | 2015-06-03 | 2015-08-12 | 安徽雷风动力科技有限公司 | 一种便于安装法兰的冷凝器风扇组装夹具 |
| EP3263129A1 (en) * | 2016-06-29 | 2018-01-03 | Ceva Sante Animale | Duck enteritis virus and the uses thereof |
| WO2018002133A1 (en) * | 2016-06-29 | 2018-01-04 | Ceva Sante Animale | Duck enteritis virus and the uses thereof |
| CN109789199A (zh) * | 2016-06-29 | 2019-05-21 | 法国诗华大药厂 | 鸭肠炎病毒及其用途 |
| US10821170B2 (en) | 2016-06-29 | 2020-11-03 | Ceva Sante Animale | Duck Enteritis Virus and the uses thereof |
| CN107893056A (zh) * | 2017-12-13 | 2018-04-10 | 江苏省农业科学院 | 山羊疱疹病毒ⅰ型疫苗株及其应用 |
| CN107893056B (zh) * | 2017-12-13 | 2019-08-27 | 江苏省农业科学院 | 山羊疱疹病毒ⅰ型疫苗株及其应用 |
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