CN104928261B

CN104928261B - 伪狂犬病病毒la‑a株、构建方法及其应用

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Publication number: CN104928261B
Application number: CN201510388390.9A
Authority: CN
Inventors: 王继春; 郭容利; 乔永峰; 顾奇; 顾一奇; 柳畅; 许梦微; 王志胜; 刘芳; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-07-03
Filing date: 2015-07-03
Publication date: 2017-10-31
Anticipated expiration: 2035-07-03
Also published as: CN104928261A

Abstract

本发明提供伪狂犬病病毒LA‑A株、构建方法及其应用，属于动物医学的疫苗领域。伪狂犬病病毒株LA‑A株，是敲除伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因后获得的，所述伪狂犬病病毒AH02LA株的保藏登记号为：CGMCC No.10891。本发明还要求保护LA‑A株的构建方法及以LA‑A株为活性成分的疫苗。本发明伪狂犬病病毒LA‑A株构建方法简单，能够很好的适应BHK‑21细胞，生长滴度高达10^9.5TCID₅₀/mL。采用伪狂犬病病毒LA‑A株的疫苗能达到对伪狂犬病病毒变异株100%保护效果，尤其是该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒。

Description

伪狂犬病病毒LA-A株、构建方法及其应用

技术领域

本发明属于动物医学的疫苗领域，具体涉及伪狂犬病病毒LA-A株、构建方法及其应用。

背景技术

伪狂犬病又被称为Aujesky病，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV，又称为猪疱疹病毒1型)引起的一种急性、烈性传染病，感染牛、羊等家畜和野生动物，常表现为发热、奇痒、脑脊髓炎等临床症状。发病猪只常出现体温升高，母猪常发生流产，新生仔猪有神经症状，育肥猪主要是呼吸道症状，成年猪感染伪狂犬病毒后生长停滞，对养猪业危害极大。上世纪80年代到2010年期间，由于PRV gE缺失株疫苗(如Bartha K61株等)的大规模推广使用，并配合检测gE和gB抗体进行免疫猪只与野毒感染猪只的鉴别诊断，通过持续淘汰阳性种猪的方法，我国许多猪场成功建立了PRV阴性的猪群，许多猪场基本实现了PRV的净化，猪伪狂犬病得到了较好控制。一些发达国家宣布在家养猪群中已全面实现PRV的净化，停止接种猪伪狂犬病疫苗。然而，自2011年以来，河南、河北等多地免疫过PRV BarthaK61株疫苗的猪场大规模出现猪伪狂犬病疫情，之后疫情逐步向全国大部分养猪场蔓延。初步研究结果表明从免疫过PRV Bartha K61疫苗猪场的死亡仔猪分离获得的PRV野毒株的致病性显著增强，因此研制出一种新的针对目前伪狂犬变异株的疫苗是极为迫切的。

发明内容

本发明的目的是提供伪狂犬病病毒LA-A株，能够很好的适应BHK-21细胞，生长滴度高达10^9.5TCID₅₀/mL。

本发明的另一目的是提供简单、高效的伪狂犬病病毒株LA-A株的构建方法。

本发明的再一目的是提供以伪狂犬病病毒LA-A株为活性成分的疫苗。采用伪狂犬病病毒LA-A株的疫苗能达到对伪狂犬病病毒变异株100％保护效果，尤其是该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒，取得了意想不到的技术效果。通过对抗体进行监测，可以区分免疫该疫苗的动物与感染动物，有利于对PRV变异株的净化。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

伪狂犬病病毒株LA-A株，是敲除伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因后获得的，所述伪狂犬病病毒AH02LA株的保藏登记号为：CGMCC No.10891。

在本发明中，所述伪狂犬病病毒LA-A株gB基因的序列如SEQ ID No:1所示、gC基因的序列如SEQ ID No:2所示、gD基因的序列如SEQ ID No:3所示。

优选的技术方案中所述伪狂犬病病毒株LA-A株，是敲除伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因第1～1418位核苷酸后获得的，所述gE基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

本发明还要求保护所述伪狂犬病病毒株LA-A株的构建方法，包括如下步骤：

(1)分别扩增伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因上游同源臂和下游同源臂；将表达绿色荧光蛋白的表达盒插入上游同源臂和下游同源臂之间，得到同源重组片段A；将上游同源臂和下游同源臂直接连接，得到同源重组片段B；

(2)伪狂犬病病毒AH02LA株的DNA与同源重组片段A进行同源重组，挑选在紫外光下发出绿色荧光的重组病毒，获得重组病毒C；

(3)重组病毒C的DNA与同源重组片段B的DNA进行同源重组，挑选在紫外光下不能发出绿色荧光的重组病毒，得到所述伪狂犬病病毒株LA-A株。

本发明还要求保护以所述伪狂犬病病毒LA-A株为活性成分的疫苗。

优选的技术方案中，所述伪狂犬病病毒LA-A株采用如下方法进行培养：将伪狂犬病病毒LA-A株接种BHK-21细胞，采用含有胎牛血清的DMEM培养基培养36～48小时，收获病毒培养物，冻融后离心取上清液作为伪狂犬病病毒LA-A株病毒液。

优选的技术方案中，所述疫苗为灭活疫苗或活疫苗。

优选的技术方案中，所述灭活疫苗为油乳剂或双相复乳，伪狂犬病病毒株LA-A株采用甲醛或β-丙内酯灭活。

本发伪狂犬病病毒株LA-A株可以作为载体构建载体活疫苗，外源基因的插入位点包括基因组的UL51与UL50之间、UL46与UL27之间、UL35与UL36之间、UL40与UL41之间、UL44与UL26.5之间、UL22与UL21之间和UL4与UL3.5之间的非编码区，启动子可以选择pHCMV IE、pMCMV IE和SV40等，插入的外源基因包括狂犬病病毒的G蛋白基因、猪瘟病毒的E蛋白基因、口蹄疫病毒的VP1基因、猪流感病毒的HA基因、猪圆环病毒的Cap蛋白基因和兔瘟病毒的VP60基因等。

本发明以伪狂犬病病毒LA-A株为载体的活疫苗，既可以预防伪狂犬病病毒变异株引起的疫病，又可以预防所载外源抗原的病原引起的疫病，而且可以区别PRV免疫动物与野毒感染动物。

本发明活疫苗，是以伪狂犬病病毒LA-A株作为种毒，疫苗内可以加入免疫佐剂与疫苗赋形剂等，本领域技术人员可以容易地进行生产。

发明人通过大量富有创造性的劳动，获得了一株伪狂犬病病毒野毒AH02LA株。AH02LA株对仔猪攻毒后，所有仔猪出现临床症状、体温升高、伴有排毒现象，最终致死率达到100％。AH02LA株gB、gC和gD基因均与现公开经典毒株有差异，显示了该毒株是新出现的变异毒株。本发明伪狂犬病病毒LA-A株是敲除伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因后获得的，构建方法简单、高效。伪狂犬病病毒LA-A株能够很好地适应BHK-21细胞，生长滴度高达10^9.5TCID₅₀/mL。采用伪狂犬病病毒LA-A株的活疫苗或灭活疫苗能达到对伪狂犬病病毒变异株100％保护效果，尤其是该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒，取得了意想不到的技术效果。通过对抗体进行监测，可以区分免疫该疫苗的动物与感染动物，有利于对PRV变异株的净化。

附图说明

图1、LA-A株gB基因序列对比分析。

图2、LA-A株gC基因序列对比分析。

图3、LA-A株gD基因序列对比分析。

图4、GFP转移载体pPRV-GFP(gE-)的结构图。

图5、伪狂犬病病毒LA-A株构建示意图。(A)所示为PRV的基因组，U_L指独特长区，U_s指独特短区，IR和TR分别指内部和未端重复区。(B)所示为通过上游同源臂H1和下游同源臂H2进行同源重组将GFP表达盒替换掉US8(gE)基因的部分序列。(C)所示为再次通过同源重组将GFP表达盒敲除，获得LA-A株。

图6、LA-A株和亲本病毒AH02LA株的体外生长特性比较。A：感染CEF后感染细胞上清液中病毒的滴度；B：感染细胞中细胞结合性病毒的病毒滴度。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明，但本发明的范围和精神并不限于所列实施例。

重组菌pHA2 corr，德国柏林自由大学惠赠，公开于文献：Reconstitution ofMarek's disease virus serotype 1(MDV-1)from DNA cloned as a bacterialartificial chromosome and characterization of a glycoprotein B-negative MDV-1mutant.Schumacher D,Tischer BK,Fuchs W,Osterrieder N.J Virol.2000Dec；74(23):11088-98。

实施例一、伪狂犬病病毒变异株AH02LA株的分离与鉴定

1、病料处理

病料来自安微六安某猪场的流产死胎猪，该场全群均免疫过PRV Bartha K61弱毒疫苗，经流行病学调查和剖检病理变化检测，初步判定疑似PRV感染所致。取死胎猪的脑组织和肺组织，按质量比为1:5加入PBS缓冲液，研磨成浆制成悬液，在37℃与-70℃冻融3次，12000rpm离心10min，取上清液经除菌过滤后置-70℃以下保存备用。

2、病毒分离及纯化

将上述组织上清液接种于长满单层的BHK-21细胞(来自中国兽医药品监察所，编号：CL6)，于37℃吸附1h后加入含2％FBS(胎牛血清)的DMEM细胞维持液(Gibco)，置37℃、5％CO₂培养箱内培养,36h后观察到细胞病变，开始病变细胞呈网格状，随着时间的推移，病变范围扩大，细胞开始出现融合，能观察到明显的合胞体，最后病变细胞变圆脱落。将病毒蚀斑经3次挑斑后纯化获得一株病毒，命名为AH02LA株。

3、病毒增殖滴度的测定

将病毒AH02LA株接种BHK-21细胞进行连续扩繁增殖至10代，并测定其2代，5代和10代的病毒滴度，结果表明其滴度分别为10^6.75TCID₅₀/0.1mL，10^7.875TCID₅₀/0.1mL和10^8.125TCID₅₀/0.Lml。将第10代病毒液作为AH02LA株种毒。下述对AH02LA株的操作均是指对AH02LA株种毒的操作。

4、病毒PCR鉴定与序列测定

根据GenBank登录的PRV基因序列(GenBank登录号：JF797218.0)设计一对引物gEF(SEQ ID No:5)和gE R(SEQ ID No:6)用于扩增gE全基因，引物经南京金斯瑞生物科技有限公司合成。gE F序列：5’-AAGATGACGTTGGCCGAGCT-3’；gE R序列：5’-TTGTCGCTCTCGCTGTAGTA-3’。

病毒DNA的提取：将病毒AH02LA株接种BHK-21细胞，待80％出现病变时，加入1ml细胞消化液和40μl蛋白酶K(20mg/ml)，置于37℃，每隔1小时轻轻摇晃细胞板重复3次，然后置于37℃恒温培养箱过夜消化；吸取混有细胞的消化液至加入相同体积的苯酚/氯仿溶液(苯酚与氯仿体积比1:1)的EP管中，4℃、10000rpm条件下离心5min；吸取上清至一个新的加入相同体积的氯仿的EP管中，4℃、10000rpm条件下离心5min；吸取上清至一个新的EP管中，加1/10体积的3M醋酸钠水溶液和2倍体积的无水乙醇，置于-20℃沉淀1h，4℃、10000rpm条件下离心20min，倒掉上清用吸水纸吸干残留液并晾干，最后加入100～300μl ddH₂O溶解，置于-20℃保存备用。

按照50μL体系对gE基因进行PCR扩增(试剂购自Takara公司：)2×GC Buffer Ⅰ25.0μL，dNTPs(2.5mM)8.0μL，LA Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 2.0μL，引物gE F1.0μL，引物gE R 1.0μL，H₂O 12.5μL，总计50μL。反应条件：95℃预变性5min；94℃30sec，48℃退火30sec，72℃延伸2min 30sec，38个循环；72℃延伸10min。PCR结束以后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收PCR产物.送上海英骏基因公司测序。结果表明病毒AH02LA株DNA的PCR扩增产物(包含完整的gE基因片段)在1％琼脂糖上电泳后在紫外灯下观察，可以见到清晰的特异性条带，大小约为2090bp，经测序gE基因序列如SEQ ID No:4所示。经同源性比对，证实病毒AH02LA株gE基因与参考序列(NC_006151.1)的同源性达到97.6％，因此病毒AH02LA株为伪狂犬病病毒野毒株。伪狂犬病病毒AH02LA株缩写为PRV AH02LA株，于2015年06月16日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为：CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，具体保藏信息如下：

参椐的生物材料：PRV AH02LA株；

分类命名：猪疱疹病毒1型；

保藏日期为2015年06月16日；

保藏编号：CGMCC No.10891。

实施例二、伪狂犬病病毒野毒株AH02LA株对仔猪致病性研究

1、试验分组与处理

取9周龄的PRV抗体阴性仔猪10头，随机分为对照组和攻毒组，每组5头。攻毒组每头猪滴鼻接种2ml 10倍稀释的PRV AH02LA株病毒液，病毒液稀释前的病毒含量为10^7.5TCID₅₀/0.1ml；对照组每头猪滴鼻接种2ml DMEM培养液。

2、临床观察

攻毒后每天观察记录临床症状，结果表明对照组猪只饮食、精神正常，无临床症状。攻毒组猪只在接种后2天开始出现食欲减退，精神不振，随后病程加重，呼吸道症状明显，主要表现为打喷嚏、气喘和呼吸困难，在接种后4～5天后出现神经症状，表现为后肢不稳和呆立，病重猪食欲废绝，卧地不起，最终死亡，攻毒组仔猪死亡率高达100％。

3、体温检测

每天测量直肠温度1次。结果表明对照组猪只体温正常，攻毒组猪只在攻毒后第2天体温开始升高，攻毒后第3～5天体温维持在42℃左右，直至濒死时体温下降至38℃以下。4、排毒情况检测

每日采取鼻拭子置入1mL PBS溶液，在4℃、10000rpm条件下离心10分钟，取上清接种长满单层的BHK-21细胞分离病毒，并检测病毒的滴度。结果表明对照组猪均没有检出排毒，攻毒组猪只从攻毒后第2天开始到病死前的样品均能检出排毒，病毒滴度达10^0.25～10^3.875TCID₅₀/0.1mL，说明仔猪接种伪狂犬病病毒野毒株AH02LA株后会引起长时间大量排毒。

实施例三、伪狂犬病病毒AH02LA株gB、gC和gD基因序列的测定和分析

根据GenBank中的Kaplan(GenBank登录：JF797218)全基因组序列，应用VectorNTI软件，共设计8对PCR引物，这些引物的扩增片段覆盖了PRV的主要保护性抗原gB、gC和gD基因序列(如表1)。所有设计的引物由南京金斯瑞生物科技公司进行合成。

表1、扩增PRV gB、gC和gD糖蛋白的PCR引物

以提取的AH02LA株病毒DNA为模板，PCR反应体系如实施例一中标题4所示，PCR反应条件为：94℃1min；94℃30s，退火30s(根据引物Tm值确定退火温度)，72℃延伸(根据扩增片段大小确定延伸时间)，30个循环；72℃延伸5min。PCR完成后，用1％琼脂糖凝胶电泳跑胶鉴定，切下含有与预期大小一致的PCR目的条带凝胶块进行DNA的回收，方法按照E.Z.N.AGel Extraction Kit琼脂糖凝胶回收试剂盒操作说明进行。

将回收的3个糖蛋白基因的8段序列片段送华大公司进行测序，测序引物与PCR扩增引物一致。将测序后的基因序列应用Vector NTI软件进行拼接和分析。将测序完成的糖蛋白序列与GenBank收录的PRV经典株Bartha(JF797217)、Kaplan(JF797218)、Becker(JF797219)和PRV TJ变异株(KJ789182)(如表2)用Vector NTI软件作基因序列对比分析。

表2、PRV参考株列表

1、gB基因序列的测定与分析

AH02LA株gB基因全长2754bp(序列如SEQ ID No:2所示)，序列分析比较结果表明，AH02LA株与Bartha株(JF797217)的同源性为99.1％。与Bartha株gB基因相比，AH02LA株gB基因在第224～233位碱基之间缺失了9个碱基，在第350～361位碱基之间连续插入12个碱基(如图1)，此外两基因之间存在14个氨基酸的非同义突变。AH02LA株与Kaplan gB基因(JF797218)相比，同源性为99.2％，AH02LA株在Kaplan株gB基因第227～234位碱基之间缺失了9个碱基、在第350～361位碱基之间连续插入12个碱基，此外存在10个非同义突变。AH02LA株与Becker株gB基因(JF797219)的同源性为99.9％，AH02LA株在Becker株gB基因第227～234位碱基之间缺失了9个碱基，此外存在4个非同义突变。AH02LA株与TJ株gB基因(KJ789182)的同源性为99.9％，AH02LA株在TJ株gB基因第350～361位碱基之间连续插入12个碱基，此外存在3个非同义替代突变。

2、gC基因序列的测定与分析

AH02LA株gC基因全长1464bp(SEQ ID No:3)。与其他参考株之间同源性在95.8％～99.9％之间。相比较而言，AH02LA株的gC基因与TJ株(KJ789182)的同源性为99.9％，而与Bartha株(JF797217)gC基因相比同源性仅为96％左右，且AH02LA株与Bartha株相比在gC基因第174～194位碱基之间插入了连续的21个碱基(如图2)，差异非常明显。

3、gD基因序列的测定与分析

AH02LA株gD基因全长1199bp(SEQ ID No:4)，与其他参考毒株之间的同源性在98.9％-100％之间。gD基因的比对结果如下：AH02LA株与Bartha株(JF797217)的gD基因同源性为98.9％，AH02LA株在Bartha株gD基因第825～830位碱基之间插入了连续的6个碱基(图3)，还存在9个非同义突变。AH02LA株与Kaplan株(JF797218)株gD基因的同源性为99.1％，AH02LA株在Kaplan株gD基因第825～830位碱基之间插入了连续的6个碱基，还存在7个非同义突变。AH02LA株与Becker株(JF797219)gD基因的同源性为99.2％，存在5个非同义突变。AH02LA株与2014年分离的TJ株(KJ789182)gD基因同源性为100％。

作为主要的囊膜糖蛋白，gB、gC和gD与PRV的免疫原性密切相关，对AH02LA株的这3个基因序列的测定和分析表明，AH02LA株与在我国新近流行株的同源性高，而与Bartha株相比，发生序列缺失和插入以及较多的非同义替代，同源性较低，可能影响AH02LA株对流行株的免疫原性，从而导致Bartha株疫苗对流行株的保护力不足的原因，而AH02LA株与流行株同源性高，可以提供更好的保护。

实施例四、伪狂犬病病毒gE基因缺失株(LA-A株)的构建

1、GFP转移载体的构建

首先，PCR扩增获得GFP表达盒片段。GFP表达盒是绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein)的表达盒(SEQ ID No:15)。应用pHA2corr质粒DNA为模板，以pGFPcasse F(SEQ ID No:16)和pGFP casse R(SEQ ID No:17)为引物进行PCR(PCR试剂来自Takara公司)，PCR方法的反应体系如下表(表3)：

表3、GFP表达盒的PCR反应体系

梯度PCR方法的反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30sec，52℃退火40sec，72℃延伸1min55sec，循环10次；然后94℃变性30sec，60℃退火40sec，72℃延伸1min55sec，循环27次；最后72℃延伸10min。反应结束后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增得到长度约为1600～1700bp的片段，回收后备用。经测序发现该片段长度为1672bp，序列与预期完全一致。

其中，pGFP casse F序列:5’-cgcgcatgcgcatccgatgcaagtgtgtc-3’，

pGFP casse R序列:5’-cgcgcatgccgaagttatgcggccattta-3’。

其次，克隆制备含上、下游同源臂的pUC19载体。

选择伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因ORF上游大小为2508bp的片段作为上游同源臂H1，自gE基因ORF第1419位核苷酸起至下游大小为1602bp的片段作为下游同源臂H2。

以伪狂犬病病毒AH02LA株基因组DNA为模板，分别扩增gE基因上游同源臂H1和下游同源臂H2。扩增上游同源臂的引物为PRV gE-H1 F(SEQ ID No:18)和PRV gE-H1 R(SEQID No:19)，扩增下游同源臂的引物为PRV gE-H2 F(SEQ ID No:20)和PRV gE-H2 R(SEQ IDNo:21)。

其中，PRV gE-H1 F(带有Sac I酶切位点):5’-atcgagctcccacgcccagcggtccataaaattgggt-3’，

PRV gE-H1 R(带有Sph I酶切位点):5’-cgcgcatgcaaagggccgcatggtctcaacc-3’，

PRV gE-H2 F(带有Sph I酶切位点):5’-cgcgcatgctctctccggtgtacaccagc-3’，

PRV gE-H2 R(带有Hind III酶切位点):5’-gcgaagcttagggcctccgtccactcgcc-3’。

上游同源臂H1和下游同源臂H2的PCR反应体系(试剂来自Takara公司)和条件基本相同。反应体系如下表(表4)：

表4、扩增PRV同源臂的PCR反应体系

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30sec，48℃退火40sec，72℃延伸(H1延伸2min30sec/H2延伸1min40sec)，循环10次；然后94℃变性30sec，56℃退火40sec，72℃延伸(H1延伸2min30sec/H2延伸1min40sec)，循环27次；最后72℃延伸10min。

PCR反应结束后，取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到长度约2500～2550bp的H1扩增片段，得到长度约1600～1650bp的H2扩增片段，分别回收上、下游同源臂PCR扩增片段。

将上游同源臂H1的PCR扩增片段与pUC19质粒，分别应用Sac I与Sph I限制性内切酶进行双酶切(酶切试剂来自TaKaRa公司)。酶切体系为：Sac I 1μL,Sph I 1μL,5×TBuffer 1μL,DNA1μg,加水补足体积至20μL。酶切反应在37℃作用1小时，反应结束后进行电泳回收。应用T4连接酶(TaKaRa公司)连接两酶切片段。连接体系为：10×Buffer 1μL，T4连接酶1μL，pUC19质粒酶切产物2μL(约150ng),上游同源臂H1酶切产物5μL(约400ng),加水补足体积至10μL。连接体系在4℃过夜，获得含上游同源臂的重组质粒pUC19-H1(PRV gE-)，再转化感受态细胞DH5α。

将下游同源臂H2的PCR扩增片段和重组质粒pUC19-H1(PRV gE-)，分别应用SphI与HindIII限制性内切酶进行双酶切，酶切试剂来自TaKaRa公司。酶切体系为：SphI 1μL,HindIII 1μL,10×K Buffer 2μL,DNA 1μg,加水补足体积至20μL。酶切体系在37℃作用1小时，反应结束后进行电泳回收。再应用T4连接酶连接两酶切片段，连接试剂来自TaKaRa公司。连接体系为：10×Buffer1μL，T4连接酶1μL，pUC19-H1(PRV gE-)酶切产物2μL(约250ng),下游同源臂H2酶切产物5μL(约600ng),加水补足体积至10μL。连接体系在4℃过夜，获得含上、下游同源臂的质粒pUC19-H1-H2(PRV gE-)，再转化感受态细胞DH5α。

最后，将GFP表达盒插入质粒pUC19-H1-H2(PRV gE-)的上、下游同源臂之间获得GFP转移载体(结构如图4)。

将GFP表达盒与pUC19-H1-H2(PRV gE-)质粒分别应用Sph I限制性内切酶进行酶切，酶切试剂来自TaKaRa公司。酶切体系为：10×H Buffer 2μL,Sph I 1μL,DNA 1μg,加水补足体积至20μL。酶切体系于37℃作用1小时，反应结束后进行电泳回收。再应用T4连接酶进行连接。连接体系为：10×Buffer 1μL，T4连接酶1μL，pUC19-H1-H2(PRV gE-)酶切产物2μL(约200ng),GFP表达盒酶切产物5μL(约500ng),加水补足体积至10μL。连接体系在4℃过夜，连接产物为GFP转移载体pPRV-GFP(gE-)(图4)。将GFP转移载体pPRV-GFP(gE-)转化感受态细胞DH5α，筛选阳性重组菌。最后通过基因测序验证所获得的GFP转移载体pPRV-GFP(gE-)是正确的克隆。

2、GFP重组伪狂犬病病毒的获得

按照常规方法制备和培养原代及次代鸡胚成纤维细胞(Chicken embryofibroblasts，CEF),细胞长成单层后，进行转染，将约5μg GFP转移载体pPRV-GFP(gE-)与约2μg伪狂犬病病毒AH02LA株的DNA共转染原代CEF进行同源重组(图5)，24小时后吸除培养液，加入含10％胎牛血清的低融点琼脂培养基覆盖，继续培养12～24h，在波长为488nm紫外光激发下寻找发出绿色荧光的重组病毒蚀斑，挑取绿色荧光的蚀斑接种新鲜的CEF，如此重复2～3循环，获得纯化后的重组病毒PRV AH02LA-GFP(gE-)。重组病毒PRV AH02LA-GFP(gE-)是将伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因第1～1418位替换插入了GFP表达盒(图5)后获得的。

3、伪狂犬病病毒gE单基因缺失株(LA-A株)的获得与鉴定

取重组病毒PRV AH02LA-GFP(gE-)DNA约1μg与约700ng的pUC19-H1-H2(PRV gE-)DNA，按照常规磷酸钙转染法转染原代CEF进行第二次同源重组，以敲除GFP表达盒(图5)。24小时后吸除培养液，加入含10％胎牛血清的低融点琼脂培养基覆盖，继续培养12～24h，在波长为488nm紫外光激发下挑取不发出绿色荧光的病毒蚀斑接种新鲜CEF，如此重复2～3循环，直至病毒纯化成功，提取其DNA作为模板，应用引物PRV gE-H1 F和PRV gE-H2 R进行PCR扩增获得4100～4200bp的片段，测序验证结果表明其序列与预期一致，AH02LA株gE基因的第1～1418位核苷酸被敲除，仅残留gE基因的第1419～1740位(SEQ ID No：1)，获得的gE基因缺失株，命名为伪狂犬病病毒LA-A株(缩写为PRV LA-A株),作为本研究试验用毒种。

4、伪狂犬病病毒LA-A株毒种的gB、gC和gD基因序列的测定

取伪狂犬病病毒LA-A株的DNA，按实施例三相同的方法通过PCR扩增其gB、gC和gD基因片段，并进行序列测定，结果表明LA-A株的gB、gC和gD基因序列与AH02LA株完全一致，具有PRV变异株的典型特征。

实施例四、伪狂犬病病毒LA-A株的生长特性鉴定

将亲本病毒PRV AH02LA株和PRV LA-A株分别以MOI为0.004接种长满单层原代BHK-21细胞的6孔细胞板，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中孵育1h后，吸去细胞病毒液，换成细胞维持液(添加有终浓度为3％(质量百分浓度)FBS(胎牛血清)的DMEM培养基(Gibco))进行培养，并分别于接种前和接种后6h、12h、24h、36h、48h和72h测定感染细胞上清液和感染细胞中细胞结合性病毒的病毒滴度。感染细胞上清液的病毒滴度是按照以下方法进行操作：在指定时间点分别收集病毒的上清液1ml，376×g离心5min，取100μl细胞上清液加入900μl DMEM中混匀，再吸去以上的混合液至900μl DMEM培养基中，重复以上步骤，作10～10⁹倍比稀释。感染细胞的细胞结合性病毒滴度按照以下方法进行操作：吸去细胞上清液，用PBS清洗2次，刮取细胞后用2ml DMEM重悬，反复冻融3次后500×g离心5min，取100μl上清液作10～10⁹倍比稀释。将病毒稀释液接种于预先铺满的单层CEF的96孔细胞板中，每个稀释度作8个重复，37℃孵育2h，弃掉病毒液，每孔加入100μl的细胞维持液(成分同上)。12h后开始观察细胞病变情况，连续观察3天，按照Reed-Muench法计算病毒TCID₅₀，统计所有时间点病毒液的TCID₅₀，绘制生长曲线(图6)。从病毒的体外生长曲线可以看出，gE基因缺失病毒PRV LA-A株和亲本病毒AH02LA株具有相似的生长动力学，在36h～48h都达到峰值，滴度可达10^9.5TCID₅₀/mL以上，差异微小，这说明gE基因的缺失对病毒的复制几乎没有影响。

实施例五、伪狂犬病病毒LA-A株对仔猪的安全性

取PRV阴性的4周龄仔猪15头，随机分成3组，每组5头，分别为滴鼻试验组、肌注试验组和对照组，隔离饲养。滴鼻试验组和肌注试验组分别滴鼻或肌肉注射接种伪狂犬病病毒LA-A株10^7.5TCID₅₀/头，每头2mL；对照组肌肉注射PBS缓冲液2mL/头。注射后每日观察采食、饮水、精神状况和临床症状(包括是否出现精神不振，厌食，打喷嚏，呼吸困难，流鼻涕和运动失调等)，每日测量体温，每日采集鼻拭子，按实施例二标题4的方法检测排毒情况。接种后第14天，采集所有猪只血清，应用CIVTESTSUIS ADVgB HIPRA公司试剂盒检测gB和gE抗体情况。研究结果表明，对照组和两试验组猪只未见任何临床症状，无发热反应，鼻拭子均未检测到排毒，接种后第14天对照组猪只血清中gB和gE抗体均为阴性，而试验组猪只的gE抗体均为阴性，gB抗体均为阳性。结果表明伪狂犬病病毒LA-A株对4周龄仔猪安全，可以通过常规鉴别诊断方法区别伪狂犬病病毒LA-A株免疫猪只与自然感染猪只，因此用伪狂犬病病毒LA-A株研制的疫苗是一种DIVA疫苗。

实施例六、伪狂犬病病毒LA-A株活疫苗和灭活疫苗对仔猪的免疫效力

1、试验材料

1.1 病毒与伪狂犬病活疫苗

PRV AH02LA株种毒传两代后的湿毒(病毒液)，批次120816，用于攻毒试验，对9～10周龄PRV阴性猪的LD₅₀为10^-2.5/mL。

伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)，缩写为Bartha K61株活疫苗：PRV Bartha K61株(南京天邦生物科技有限公司)湿毒，批次120912，病毒滴度TCID₅₀＝10^7.0/mL。

伪狂犬病活疫苗(LA-A株)，缩写为LA-A株活疫苗：是PRV LA-A株的湿毒，批次120724，病毒滴度TCID₅₀＝10^9.6/mL。

1.2 灭活疫苗制备

伪狂犬病灭活疫苗(LA-A株)，缩写为LA-A株灭活疫苗，具体制备方法为：取PRVLA-A株种毒，按MOI(感染复数)为0.004接种BHK-21细胞，培养36～48h，待细胞75％以上出现病变时收毒，-70℃与37℃冻融3次后，在4℃、5000rpm条件下离心30min，将上清液倒入新的盐水瓶中，在病毒液中加入终浓度为0.2％(质量百分含量)的甲醛，在37℃、220rpm条件下摇晃48h。将灭活好的病毒液检验合格后4℃保存备用。按规程中相应方法将灭活好的病毒液与白油按照体积比1：3混合后乳化，制备油包水型猪伪狂犬病灭活疫苗(LA-A株)一批，批次20130209-1，每头份2mL，抗原含量每头份≥10^9.0TCID₅₀。

1.3 诊断试剂盒

PRV gE抗体诊断试剂盒，CIVTESTSUIS ADVgB HIPRA公司产品，批次CAE.68YC，有效期至DIC.2015。

PRV gB抗体诊断试剂盒，CIVTESTSUIS ADVgB HIPRA公司产品，批次CAB.73VS，有效期至ABR.2016。

2、试验动物

28日龄健康仔猪，其PRV gE和gB抗体均为阴性。适应期3天以上。接种前核实猪只的饮食、精神状况和临床情况等，凡不健康的猪只排除出试验。通过耳标号码和笼号与圈号进行标识。在隔离环境中分笼饲养。饲料为全价配合饲料(市售产品)，饮水为自来水，每日上午和下午各饲喂一次。专人负责饲养，每天进行2次清洁卫生。

3、分组

试验动物一次引入，随机分为A-F组，每组5头。

表5、动物免疫攻毒试验分组

4、试验方法和研究的指标

(1)试验方法

各组免疫和攻毒方法见表5。

免疫：A组在4周龄接种伪狂犬病灭活疫苗(LA-A株)一次，2周后加强接种一次；B组在4周龄接种Bartha K61株活疫苗一次。A、B组接种方法均为每头猪颈部肌肉注射2mL。C组和D组猪只8周龄免疫。C组每头猪接种伪狂犬病活疫苗(LA-A株)，每头份疫苗中病毒含量为10³TCID₅₀。D组每头猪接种伪狂犬病活疫苗(Bartha K61株)，每头份疫苗中病毒含量为10⁵TCID₅₀。C组和D组猪只的接种方法均为每头颈部肌肉注射2mL。E、F组每头肌注2mL PBS缓冲液。

攻毒：除空白对照组外的所有猪只于9周龄攻毒。应用PRV AH02LA株，以100LD₅₀/头/2mL，滴鼻攻毒，攻毒后观察14天。血清gB和gE抗体检测：免疫前、攻毒前和攻毒结束时三个时间点采取所有猪只血清样品应用试剂盒检测PRV gE和gB抗体。临床症状观察：所有试验猪只每天观察精神、饮食状况和各种呼吸系统、神经系统和全身性临床表现。体温测量：从接种前开始，至试验结束(攻毒后14天)，所有猪只每天测量体温一次(直肠温度)。排毒情况检测：攻毒前和攻毒后至试验结束(攻毒后14天)，每天采取猪只鼻拭子样品，样品置-70℃保存，检测时倍比稀释后接种BHK-21细胞观察病变以确定是否排出病毒。

(2)研究的指标

发病率、死亡率、体温升高情况、排毒情况、血清抗体阳转情况。

(3)试验结果

如表6所示，空白对照组猪只无发病死亡，无体温升高，未检出排毒。攻毒对照组5头猪从攻毒第2天开始全部出现减食，精神沉郁，打喷嚏，流鼻涕和呼吸困难等症状；在攻毒后第5～8天陆续死亡3头；在测量的46个体温数据中有32个在42℃以上，另11个在40～42℃，只有3个不超过40℃；在检测的46份鼻拭子样品中有32份检出排毒。因此，空白对照和攻毒对照成立。A组中伪狂犬病灭活疫苗(LA-A株)两次免疫猪只产生坚强保护力，所有猪只无发病死亡，无体温升高，未检出排毒。B组中Bartha K61株活疫苗免疫猪只，在4周龄接种后间隔5周攻毒，无死亡，但有两头发病，70个体温数据中有10个在42℃以上，32个在40～42℃，而且70个鼻拭子样品有32个检出排毒，表明Bartha株免疫后4周能提供一定保护，但不能阻止发病和排毒，免疫效力不佳。C组伪狂犬病活疫苗(LA-A株)免疫猪只在8周龄接种后间隔1周攻毒，所有猪只无发病死亡，无体温升高，未检出排毒，获得完全保护。D组BarthaK61株活疫苗免疫猪只在8周龄接种后间隔1周攻毒，所有猪只无发病死亡，但有明显体温升高，70份鼻拭子样品中检出12份排毒，仅获得部分保护。接种前所有试验猪只PRV gB和gE抗体为阴性，与Bartha K61株活疫苗免疫前后一样，LA-A株灭活苗、活疫苗免疫前猪只的gB、gE抗体均为阴性，免疫后猪只的gB抗体都呈阳性，而gE抗体都为阴性，表明LA-A株或BarthaK61株疫苗免疫后猪只均能与感染动物相区别。攻毒后14天，攻毒对照组的所有猪只gB和gE抗体都呈阳性，B组和D组接种Bartha K61株疫苗的猪只中分别有3头和2头gE抗体为阳性，A组和C组接种LA-A株疫苗的所有猪只gE抗体均没有出现阳转，表明LA-A株疫苗免疫后在猪只体内产生了坚强的保护力，显著优于Bartha K61株(表7)。

表6、免疫攻毒试验临床情况统计表

表7、免疫攻毒试验血清抗体阳转情况统计表

综上所述，PRV LA-A株活疫苗和灭活疫苗免疫猪只均能产生对PRV野毒株AH02LA株的完全保护，而Bartha K61株只能产生部分保护，LA-A株作为疫苗株显著优于BarthaK61株。PRV LA-A株制备的活疫苗和灭活疫苗接种猪只后能检出gB抗体，不能检出gE抗体，是一种能鉴别疫苗免疫动物与野毒感染动物的DIVA疫苗。PRV LA-A株制备的活疫苗和灭活疫苗的推广应用将非常有利于在猪场中进行PRV变异株的净化，前景广阔。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 伪狂犬病病毒LA-A株、构建方法及其应用

<130> 20150701

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2754

<212> DNA

<213> PRV LA-A株

<400> 1

atgcccgctg gtggcggtct ttggcgcggg ccccgggggc atcggcccgg gcaccacggc 60

ggtgctggcc tcggacgtct ttggcctgct ccacaccacg ctgcagctgc gcggggcgcc 120

gtcgcgctag cgctgctgct gctggcgctc gccgcggccc cgccgtgcgg cgcggcggcc 180

gtgacgcggg ccacctcggc ctcgccgacg cccgggacgg gcgccacccc caacgacgtc 240

tccgcggagg cgtccctcgg ggagatcgag gcgttctccc ccggcccctc ggaggccccc 300

gacggcgagt acggcgacct ggacgcgcgg acggccgtgc gcgcggccgt gcgcgcggcc 360

gcgaccgagc gggaccgctt ctacgtctgc ccgccgccgt ccggctccac ggtggtgcgg 420

ctggagcccg agcaggcctg ccccgagtac tcgcaggggc gcaacttcac ggaggggatc 480

gccgtgctct tcaaggagaa catcgccccg cacaagttca aggcccacat ctactacaag 540

aacgtcatcg tcacgaccgt gtggtccggg agcacgtacg cggccatcac gaaccgcttc 600

acagaccgcg tgcccgtccc cgtgcaggag atcacggacg tgatcgaccg ccgcggcaag 660

tgcgtctcca aggccgagta cgtgcgcaac aaccacaagg tgaccgcctt cgaccgcgac 720

gagaaccccg tcgaggtgga cctgcgcccc tcgcgcctga acgcgctcgg cacccgcggc 780

tggcacacca ccaacgacac ctacaccaag atcggcgccg cgggcttcta ccacacgggc 840

acctccgtca actgcatcgt cgaggaggtg gaggcgcgct ccgtgtaccc ctacgactcc 900

ttcgccctgt ccacggggga cattgtgtac atgtccccct tctacggcct gcgcgagggg 960

gcccacgggg agcacatcgg ctacgcgccc gggcgcttcc agcaggtgga gcactactac 1020

cccatcgacc tggactcgcg cctccgcgcc tccgagagcg tgacgcgcaa ctttctacgc 1080

acgccgcact tcacggtggc ctgggactgg gcccccaaga cgcggcgcgt gtgcagcctg 1140

gccaagtggc gcgaggccga ggagatgatc cgcgacgaga cgcgcgacgg ctccttccgc 1200

ttcacgtcgc gggccctggg cgcctccttc gtcagcgacg tcacgcagct ggacctgcag 1260

cgcgtgcacc tgggcgactg cgtcctccgc gaggcctcgg aggccatcga cgccatctac 1320

cggcggcgct acaacagcac gcacgtgctg gccggcgaca ggcccgaggt gtacctcgcc 1380

cgcgggggct tcgtggtggc cttccgcccg ctgatctcga acgagctggc gcagctgtac 1440

gcgcgcgagc tcgagcgcct cggcctcgcc ggcgtcgtgg gccccgcggc ccccgcggcc 1500

gcccgtcggg cccggcgctc ccccggcccg gcggggacgc ccgagccgcc ggccgtcaac 1560

ggcacggggc acctgcgcat caccacgggc tcggcggagt ttgcgcgcct gcagttcacc 1620

tacgaccaca tccaggcgca cgtgaacgac atgctgggcc gcatcgcggc cgcctggtgc 1680

gagctgcaga acaaggaccg caccctgtgg agcgagatgt cgcgcctgaa ccccagcgcc 1740

gtggccacgg ccgcgctcgg ccagcgcgtc tcggcgcgca tgctcggcga cgtgatggcc 1800

atctcgcggt gcgtggaggt gcgcggcggc gtgtacgtgc agaactccat gcgcgtgccc 1860

ggcgagcgcg gcacgtgcta cagccgcccg ctggtcacct tcgagcacaa cggcacgggc 1920

gtgatcgagg gccagctcgg cgacgacaac gagctcctca tctcgcgcga cctcatcgag 1980

ccctgcaccg gcaaccaccg gcgctacttt aagctgggga gcgggtacgt gtactacgag 2040

gactacaact acgtgcgcat ggtggaggtg cccgagacga tcagcacgcg ggtgaccctg 2100

aacctgacgc tgctggagga ccgcgagttc ctgcccctcg aggtgtacac gcgcgaggag 2160

ctcgccgaca cgggcctcct ggactacagc gagatccagc gccgcaacca gctgcacgcg 2220

ctcaagttct acgacatcga ccgcgtggtc aaggtggacc acaacgtggt gctgctgcgc 2280

ggcatcgcca acttcttcca gggcctcggc gacgtgggcg ccgccgtcgg caaggtggtc 2340

ctgggcgcca cgggggccgt gatctcggcc gtcggcggca tggtgtcctt cctgtccaac 2400

cccttcgggg cgctcgccat cgggctgctg gtgctggccg gcctggtcgc ggccttcctg 2460

gcctaccggc acatctcgcg cctgcgccgc aaccccatga aggccctgta ccccgtcacg 2520

acgaagacgc tcaaggagga cggcgtcgac gagggcgacg tggacgaggc caagctggac 2580

caggcccggg acatgatccg gtacatgtcc atcgtgtcgg ccctcgagca gcaggagcac 2640

aaggcgcgca agaagaacag cgggcccgcg ctgctggcca gccgcgtcgg ggcgatggcc 2700

acgcgccgcc ggcactacca gcgcctcgag agcgaggacc ccgacgccct gtag 2754

<210> 2

<211> 1464

<212> DNA

<213> PRV LA-A株

<400> 2

atggcctcgc tcgcgcgtgc gatgctcgcg ctgctggcgc tctacacggc ggccatcgcc 60

gcggcgccgt cgtccacgac ggcgctcggc acgacgccca acgggggcgg gggcggcaac 120

agcagcgcgg gcgagctctc gccctcgccg ccctcgacgc ccgagcccgt ctcggggacg 180

acgggggccg cggcctccac gcccgccgcc gtctcgacgc cccgggtccc gccgccctcg 240

gtctcgcgcc ggaagcccca gcggaacggc aacaggacgc gcgtccacgg cgacaaggcc 300

acctcgcacg ggcgcaagcg catcgtgtgc cgcgagcggc tgttctcggc gagggtgggg 360

gacgcggtca gcttcgggtg cgccgtcgtc ccgcgcgccg gggagacctt cgaggtccgc 420

ttctgccgcc gcgggcgctt ccgctcgccc gacgccgacc ccgagtactt tgacgagccc 480

ccgcgcccgg agctcccgcg ggagcggctc ctcttcagct ccgccaacgc ctccctcgcc 540

cacgcggacg cgctcgcctc cgccgtcgtc gtcgagggcg agcgcgcgac cgtcgccaac 600

gtctcgggcg aggtgtccgt gcgcgtggcc gcggcggacg ccgagaccga gggcgtctac 660

acgtggcgcg tgctgtccgc caacggcacc gaggtccgca gcgccaacgt ctcgctcgtc 720

ctgtaccacc agcccgagtt cggcctgagc gcgccgcccg tcctcttcgg cgagcccttc 780

cgggcggtgt gcgtcgtccg cgactactac ccgcggcgca gcgtgcgcct gcgctggttc 840

gcggacgagc acccggtgga cgccgccttc gtgaccaaca gcaccgtggc cgacgagctc 900

gggcgccgca cgcgcgtctc cgtggtgaac gtgacgcgcg cggacgtccc gggcctcgcg 960

gccgcggacg acgcggacgc gctcgcgccg agcctgcgct gcgaggccgt gtggtaccgc 1020

gacagcgtgg cctcgcagcg cttctccgag gccctgcgcc cccacgtcta ccacccggcg 1080

gcggtctcgg tgcgcttcgt cgagggcttc gccgtctgcg acggcctctg cgtgcccccg 1140

gaggcgcgcc tcgcctggtc cgaccacgcc gccgacaccg tctaccacct cggcgcctgc 1200

gccgagcacc ccggcctgct caacgtgcgg agcgcccgcc cgctgtcgga cctcgacggg 1260

cccgtcgact acacctgccg cctcgagggc atgccctcgc agctgcccat cttcgaggac 1320

acgcagcgct acgacgcctc ccccacgtcc gtgagctggc ccgtcgtgac cagcatgatc 1380

accgtcatcg ccggcatcgc catcmtagcc atcgtgctgg tcatcatggc gacgtgcgtc 1440

tactaccgcc ggtccgcgct gtga 1464

<210> 3

<211> 1209

<212> DNA

<213> PRV LA-A株

<400> 3

atgctgctcg cagcgctatt ggcggcgctg gtcgcccgga cgacgctcgg cgcggacgtg 60

gacgccgtgc ccgcgccgac cttccccccg cccgcgtacc cgtacaccga gtcgtggcag 120

ctgacgctga cgacggtccc ctcgcccttc gtcggccccg cggacgtcta ccacacgcgc 180

ccgctggagg acccgtgcgg ggtggtggcg ctgatctccg acccgcaggt ggaccggctg 240

ctgaacgagg cggtggccca ccggcggccc acgtaccgcg cccacgtggc ctggtaccgc 300

atcgcggacg ggtgcgcgca cctgctgtac tttatcgagt acgccgactg cgaccccagg 360

cagatctttg ggcgctgccg gcgccgcacc acgccgatgt ggtggacccc gtccgcggac 420

tacatgttcc ccacggagga cgagctgggg ctgctcatgg tggccccggg gcggttcaac 480

gagggccagt accggcgcct ggtgtccgtc gacggcgtga acatcctcac cgacttcatg 540

gtggcgctcc ccgaggggca agagtgcccg ttcgcccgcg tggaccagca ccgcacgtac 600

aagttcggcg cgtgctggag cgacgacagc ttcaagcggg gcgtggacgt gatgcgattc 660

ctgacgccgt tctaccagca gcccccgcac cgggaggtgg tgaactactg gtaccgcaag 720

aacggccgga cgctcccgcg ggcctacgcc gccgccacgc cgtacgccat cgaccccgcg 780

cggccctcgg cgggctcgcc gaggcccagg ccccggcccc ggcccaggcc ccggccgaag 840

cccgagcccg ccccggcgac gcccgcgccc cccggccgcc tgcccgagcc ggcgacgcgg 900

gaccacgccg ccggggggcg ccccacgccg cgacccccga ggcccgagac gccgcaccgc 960

cccttcgccc cgccggccgt cgtgcccagc gggtggccgc agcccgcgga gccgttcccg 1020

ccccggacca ccgccgcgcc gggcgtctcg cgccaccgct cggtgatcgt cggcacgggc 1080

accgcgatgg gcgcgctcct ggtgggcgtg tgcgtctaca tcttcttccg cctgaggggg 1140

gcgaaggggt atcgcctcct gggcggtccc gcggacgccg acgagctaaa agcgcagccc 1200

ggtccgtag 1209

<210> 4

<211> 1740

<212> DNA

<213> PRV AH02LA株

<400> 4

atgcggccct ttctgctgcg cgccgcgcag ctcctggcgc tgctggccct ggcgctctcc 60

accgaggccc cgagcctctc cgccgagacg accccgggcc ccgtcaccga ggtcccgagt 120

ccctcggccg aggtctggga cgacctctcc accgaggccg acgacgatga cctcaacggc 180

gacctcgacg gcgacgaccg ccgcgcgggc ttcggctcgg ccctcgcatc cctgagggag 240

gcgcccccgg cccatctggt gaacgtgtcc gagggcgcca acttcaccct cgacgcgcgc 300

ggcgacggcg ccgtgctggc cgggatctgg acgttcctgc ccgtccgcgg ctgcgacgcc 360

gtgtcggtga ccacggtgtg cttcgagacc gcgtgccacc cggacctggt gctgggccgc 420

gcctgcgtcc ccgaggcccc ggagatgggc atcggcgact acctgccgcc cgaggtgccg 480

cggctccggc gcgagccgcc catcgtcacc ccggagcggt ggtcgccgca cctgagcgtc 540

ctgcgggcca cgcccaacga cacgggcctc tacacgctgc acgacgcctc ggggccgcgg 600

gccgtgttct ttgtggcggt gggcgaccgg ccgcccgcgc cggcggaccc ggtgggcccc 660

gcgcgccacg agccccgctt ccacgcgctc ggcttccact cgcagctctt ctcgcccggg 720

gacacgttcg acctgatgcc gcgcgtggtc tcggacatgg gcgactcgcg cgagaacttt 780

accgccacgc tggactggta ctacgcgcgc gcgcccccgc ggtgcctgct gtactacgtg 840

tacgagccct gcatctacca cccgcgcgcg cccgagtgcc tgcgcccggt ggacccggcg 900

tgcagcttca cctcgccggc gcgcgcgcgg ctggtggcgc gccgcgcgta cgcctcgtgc 960

agcccgctgc tcggggaccg gtggctgacc gcctgcccct tcgacgcctt cggcgaggag 1020

gtgcacacga acgccaccgc ggacgagtcg gggctgtacg tgctcgtgat gacccacaac 1080

ggccacgtcg ccacctggga ctacacgctc gtcgccaccg cggccgagta cgtcacggtc 1140

atcaaggagc tgacggcccc ggcccgggcc ccgggcaccc cgtggggccc cggcggcggc 1200

gacgacgcga tctacgtgga cggcgtcacg acgccggcgc cgcccgcgcg cccgtggaac 1260

ccgtacggcc ggacgacgcc cgggcggctg tttgtgctgg cgctgggctc cttcgtgatg 1320

acgtgcgtcg tcgggggggc catctggctc tgcgtgctgt gctcccggcg ccgggcggcc 1380

tcgcggccgt tccgggtgcc gacgcgggcg cggacgcaca tgctctctcc ggtgtacacc 1440

agcctgccca cgcacgagga ctactacgac ggcgacgacg acgacgacga ggaggcgggc 1500

gtcatccgcc ggcggcccgc ctcccccagc ggagacagcg gctacgaggg gccgtacgcg 1560

agcctggacc ccgaggacga gttcagcagc gacgaggacg acgggctgta cgtgcgcccc 1620

gaggaggcgc cccgctccgg cttcgacgtc tggttccgcg atccggagaa accggaagtg 1680

acgaatggac ccaactatgg cgtgaccgcc aaccgcctgt tgatgtcccg ccccgcttaa 1740

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> gE F

<400> 5

aagatgacgt tggccgagct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> gE R

<400> 6

ttgtcgctct cgctgtagta 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> gB F

<400> 7

cgtgttgcca aacaagcgca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> gB R

<400> 8

cggcttctac cgcttccaga 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> gC F1

<400> 9

gtgcgccact agcattaaat cc 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> gC R1

<400> 10

gtgctgttgg tcacgaaggc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> gC F2

<400> 11

gaccccgagt actttgacga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> gC R2

<400> 12

tcggactcgc tgtcgtttat 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> gD F

<400> 13

aacacctaat ttgcgtacgg c 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> gD R

<400> 14

tcatcatcga cgccggtact 20

<210> 15

<211> 1648

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> GFP表达盒

<400> 15

gcatccgatg caagtgtgtc gctgtcgagt ttaaacatgc atagttatta atagtaatca 60

attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta 120

aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat 180

gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg 240

taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac 300

gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt 360

cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg 420

cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc 480

attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt 540

aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 600

agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagcgct accggtcgcc accatggtga 660

gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg 720

taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc 780

tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga 840

ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg 900

acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg 960

acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc 1020

gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg 1080

agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca 1140

aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact 1200

accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga 1260

gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg 1320

agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag tccggactca 1380

gatccaccgg atctagataa ctgatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac 1440

ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 1500

ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 1560

atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 1620

atgtatctta aatggccgca taacttcg 1648

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> pGFP casse F

<400> 16

cgcgcatgcg catccgatgc aagtgtgtc 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> pGFP casse R

<400> 17

cgcgcatgcc gaagttatgc ggccattta 29

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> PRV gE- H1 F

<400> 18

atcgagctcc cacgcccagc ggtccataaa attgggt 37

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> PRV gE- H1 R

<400> 19

cgcgcatgca aagggccgca tggtctcaac c 31

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> PRV gE- H2 F

<400> 20

cgcgcatgct ctctccggtg tacaccagc 29

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> PRV gE- H2 R

<400> 21

gcgaagctta gggcctccgt ccactcgcc 29

Claims

1.伪狂犬病病毒株LA-A株，是敲除伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因后获得的，所述伪狂犬病病毒AH02LA株的保藏登记号为：CGMCC No.10891。

2.根据权利要求1所述伪狂犬病病毒株LA-A株，其特征在于是敲除伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因第1～1418位核苷酸后获得的，所述gE基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

3.权利要求1～2之一所述伪狂犬病病毒株LA-A株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）分别扩增伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因上游同源臂和下游同源臂；将表达绿色荧光蛋白的表达盒插入上游同源臂和下游同源臂之间，得到同源重组片段A；将上游同源臂和下游同源臂直接连接，得到同源重组片段B；

（2）伪狂犬病病毒AH02LA株的DNA与同源重组片段A进行同源重组，挑选在紫外光下发出绿色荧光的重组病毒，获得重组病毒C；

（3）重组病毒C的DNA与同源重组片段B的DNA进行同源重组，挑选在紫外光下不能发出绿色荧光的重组病毒，得到所述伪狂犬病病毒株LA-A株。

4.以权利要求之1～2之一所述伪狂犬病病毒LA-A株为活性成分的疫苗。

5.根据权利要求4所述疫苗，其特征在于所述伪狂犬病病毒LA-A株采用如下方法进行培养：将伪狂犬病病毒LA-A株接种BHK-21细胞，采用含有胎牛血清的DMEM培养基培养36～48小时，收获病毒培养物，冻融后离心取上清液作为伪狂犬病病毒LA-A株病毒液。

6.根据权利要求5所述疫苗，其特征在于所述疫苗为灭活疫苗或活疫苗。

7.根据权利要求6所述疫苗，其特征在于所述灭活疫苗为油乳剂或双相复乳，伪狂犬病病毒株LA-A株采用甲醛或β-丙内酯灭活。