CN102618508A - 一种重组猪伪狂犬病毒及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组猪伪狂犬病毒及其构建方法和应用，该病毒含有由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因。该方法包括：(1)构建包含PRV全基因组的细菌人工染色体pPRV；(2)将pPRV中的CMV启动子替换为EF1启动子；(3)将Pcmv-V2C-BGH-pA表达框替换pPRV-EF1的gE基因，获得pPRV-V2C-ΔgE；(4)pPRV-V2C-ΔgE与pCAGGS-NLS/Cre两种质粒共转染Vero细胞系，筛选获得删除pHA2质粒的rPRV-V2C-ΔgE。本发明重组病毒同时能免疫猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒等引起的三种疾病。

Description

一种重组猪伪狂犬病毒及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种重组病毒，尤其涉及一种重组猪伪狂犬病毒及其构建方法和应用。

背景技术

细菌人工染色体(bacteria artificial chromosome，Bac)是高通量低拷贝的质粒载体，最大可以容纳300kb的DNA，并能稳定传代。Bac技术为疱疹病毒反向和正向遗传研究提供了新方法(Shizuya H，Birren B，Kim U J，et al.Cloning and stable maintenance of 300-Kilobase-pair fragments ofhuman DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(18)：8794-8797.)。目前该技术在多种疱疹病毒相继成功应用，如1型单纯疱疹病毒(StavropouLos T A，Strathdee C A.An enhancedpackaging system for helper-dependent herpes simplex virus vectors[J].JVirol，1998，72：7137-7143.)、EBV(Delecluse H J，Hilsendegen T，Pich D，et al.Propagation and recovery of intact，infectious Epstein-Barr virus fromprokaryotic to human cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995：8245-8250.)、人巨细胞病毒(HCMV)(Wagner M，Ruzsics Z，Koszinowski U H.Herpesvirusgenetics has come of age[J].Trends Microbiol，2002，10(7)：318-324.)、BHV-1 ZJ株(张存，叶伟成，王一成，等.牛Ⅰ型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性[J].科学通报，2009，54(24)3823-3829.)等。TK基因缺失的猪伪狂犬病毒(PRV)ZJ株Bac也于2010年成功克隆(尹文玲，叶伟成，张存，等.猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建[J].病毒学报，2010，26(4)：331-335.)。

PRV属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科成员，大小约143kb，含有多个可缺失的非必需基因。PRV基因缺失疫苗的成功应用，使该病在世界范围内得到了有效控制。目前以PRV-Bac系统为载体表达其它病原主要保护性抗原基因已成为基因工程活载体疫苗研究的热点(Osterrieder N，Schumacher D，Trapp S.Establishment and use of infectious bacterial artificialchromosome(BAC)DNA clones of animal herpesviruses[J].Berl MunchTierarztl Wochenschr，2003，116(9-10)：373-380.)。迄今为止，以伪狂犬病毒为载体已成功表达了CSFV E2(潘兹书，张楚瑜，陈玉栋，等.表达猪瘟病毒E2基因和gfp报道基因的伪狂犬病病毒双基因转移载体的构建[J].武汉大学学报(理学版)，2002，48(4)：466-470.)、PPV VP2(吕建强，陈焕春，赵俊龙，等.表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究[J].病毒学报，2004，20(2)134-137.)、PCV2 Cap(琚春梅，陈焕春，郗鑫，等.表达猪2型圆环病毒ORF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定[J].中国农业科学，2006，39(8)：1716-1722.)和PRRSV GP5蛋白(方六荣，肖少波，江云波，等.表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的构建及其生物学特性初步探讨[J].病毒学报，2004，20(20)：250-254.)。

猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)和PRV是猪的三种重要的传染病，经常存在混合感染，因此研制出这三种病毒的重组疫苗对生产实践具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种重组猪伪狂犬病毒，该病毒可以共表达猪细小病毒VP2基因和猪圆环病毒Cap基因，可以对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)和PRV三种病毒产生免疫。

一种重组猪伪狂犬病毒，该病毒含有由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因。

Cap基因是PCV2的主要结构蛋白基因，编码病毒的衣壳蛋白，可自装配成病毒样粒子，是目前PCV2疫苗研究的主要候选基因。VP2蛋白是构成PPV病毒粒子的主要结构蛋白，在体外表达后，不仅具有良好的免疫原性，还可以自我装配成病毒样颗粒，形态大小、血凝性与全病毒的相似，将其接种动物后可以诱导产生强烈的免疫应答反应，可以抵抗PPV强毒的攻击，三个基因共表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，该病毒包含Pcmv-V2C-BGH-pA表达框；

其中V2C表示由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因；Pcmv表示启动子CMV；BGH-pA表示人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾。

所述的外源基因替换了该病毒的gE基因。

优选的，该病毒的TK基因部分缺失，，缺失位置为第387～694个碱基，可以降低病毒毒性。

所述的猪细小病毒VP2基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的口蹄疫病毒2A基因碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的猪圆环病毒Cap基因碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种重组猪伪狂犬病毒的构建方法，包括：

(1)将pHA2质粒插入到原始猪伪狂犬病毒的TK基因内，获得rPRV；

(2)将rPRV基因组转化大肠杆菌DH10B菌株，获得pPRV；

其中pPRV为感染性细菌人工染色体，包含PRV的全基因组，记为质粒pPRV，一般情况下，r起始表示重组病毒，p起始表示质粒。

(3)将pPRV的标记基因GFP的CMV启动子更换为EF1启动子，获得pPRV-EF1；

(4)将Pcmv-V2C-BGH-pA表达框替换pPRV-EF1的gE基因，获得pPRV-V2C-ΔgE；

其中V2C表示由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因；Pcmv表示启动子CMV；BGH-pA人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾；

(5)pPRV-V2C-ΔgE与pCAGGS-NLS/Cre两种质粒共转染Vero细胞系，筛选获得删除pHA2质粒的rPRV-V2C-ΔgE。

本发明还提供了所述的重组猪伪狂犬病毒在制备动物疫苗中的应用。

本发明通过缺失gE基因及TK基因部分序列对伪狂犬病病毒起到了减毒的作用，能通过检测gE或者TK蛋白抗体区分免疫动物和自然感染动物(鉴别诊断)，能同时免疫保护猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒等引起的三种疾病。

附图说明

图1为pPRV-V2C-ΔgE、pPRV-V2C-Kan-ΔgE、pPRV-ΔgE、pPRV-EF1，pPRV质粒限制性核酸酶切电泳图Marker：DL15000；1Kb ladder；

A 1：pPRV-V2C-Kan-ΔgE；2：pPRV-ΔgE；3：pPRV-EF1；4，5：pPRV-V2C-ΔgE为BamH I单酶切结果；

B 1：pPRV-V2C-ΔgE；2：pPRV-ΔgE；3：pPRV-EF1；4：pPRV为BamH I单酶切结果；

C重组PRV-Bac PCR鉴定：Marker：250bp；1：以pPRV-V2C-ΔgE为模板PCR扩增获得4135bp的片段；2：以pPRV-ΔgE为模板PCR扩增获得617bp的片段；3：以pPRV-EF1为模板PCR扩增获得2351bp的片段(以上所用引物均为PRV-dgE-seq-s和PRV-dgE-seq-as)；

图2为PRV重组病毒噬斑图谱；

a.rPRV-Bac-EF1病毒噬斑；b.rPRV-Bac-EF1病毒荧光噬斑；c.rPRV-Bac病毒噬斑；d.rPRV-Bac病毒荧光噬斑；e.rPRV-ΔgE病毒噬斑；f.rPRV-ΔgE病毒荧光噬斑；g.rPRV-V2C-ΔgE病毒噬斑；h.rPRV-V2C-ΔgE病毒荧光噬斑；

图3为四种不同重组PRV病毒在BHK-21细胞上的噬斑面积柱状图；

图4为图4rPRV-V2C-ΔgE、rPRV-ΔgE、rPRV-Bac、rPRV-Bac-EF1在BHK-21细胞上的生长曲线，其中(a)细胞外；(b)细胞内；

图5为PRV-Bac-EF1浙江株表达PPV VP2蛋白(a)和PCV2 Cap蛋白(b)western blotting分析图；

M.Protein marker；

a 1，2.rPRV-V2C-ΔgE病毒感染的BHK-21细胞裂解液；3.rPRV-ΔgE病毒感染的BHK-21细胞裂解液；

b 1.rPRV-ΔgE病毒感染的BHK-21细胞裂解液；2.rPRV-V2C-ΔgE病毒感染的BHK-21细胞裂解液。

具体实施方式

1、引物设计与合成

PPV、PCV2和PRV引物分别参考序列GeneBank(NC_014665.1)、GenBank(HQ591381.1)和GenBank(NC_006151)设计，由生工公司合成，序列见上表。

引物a、b用于构建pPRV-V2C-ΔgE突变体，斜体序列与PRV gE上下游序列同源，下划线序列与pEP-CMV-in的Pcmv启动子上游和BGH-pA下游同源；

引物c、d用于缺失PRV gE基因(US8)，上游引物下划线部分与pEPKanS质粒模板结合的序列；粗体序列与PRV US8 CDS起始密码子上游同源，斜体序列与US8下游同源，下游引物粗体序列与PRV US8 CDS下游同源，斜体序列和US8起始密码子上游同源，下划线部分为与pEPKanS质粒模板结合的序列；

引物e、f用于pPRV-Bac ZJ株的Pcmv启动子更换，下划线部分与pEP-EF1质粒序列同源，斜体序列和PRV UL27序列上下游同源；引物g、h用于Bac突变体测序验证，引物分别与PRV US8上游-159bp和下游458bp序列同源，其PCR扩增产物可以根据大小、测序来验证US8的缺失、插入，产物大小如下：2351bp(pPRV-Bac-EF1)，617bp(pPRV-ΔgE)，4135bp(pPRV-V2C-ΔgE)。

表1

2、pEP-V2C-in质粒的构建

以VP2-2A-Cap基因(由口蹄疫病毒2A基因将猪细小病毒VP2基因和猪圆环病毒Cap基因串联，简称V2C)为模板，利用引物对V2C-for和V2C-re进行PCR扩增，共进行35个循环。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸3min，最后一个循环后72℃再延伸10min。

扩增出VP2-2A-Cap基因，用Kpn I酶切，经胶回收获2506bp的目的片段。提取pEP-CMV-in真核表达质粒(含Pcmv启动子和BGH-pA)，以Kpn I和EcoR V双酶切，回收载体。与回收的V2C基因连接，然后转化E.coli Top10，通过PCR和酶切鉴定筛选获得阳性克隆，测序鉴定。

3、重组Bac突变体的构建

3.1pPRV-Bac ZJ株的Pcmv启动子更换

通过Red E/T两步重组将pPRV-Bac ZJ株中的CMV启动子替换成EF1启动子，便于下一步VP2-2A-Cap基因表达框(含有CMV启动子)的精确插入，本发明所述的pPRV-Bac ZJ株是指文献(尹文玲，叶伟成，张存，等.猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建[J].病毒学报，2010，26(4)：331-335.)公开的感染性人工细菌染色体，该人工细菌染色体是在原始毒株(无特异性要求)的基础上将携带BAC载体的pHA2质粒通过同源重组插入该毒株基因组的TK基因内，获得携带BAC载体的重组PRV，进而将真核细胞内环化的重组病毒基因组转化到大肠杆菌内，筛选到包含该毒株全基因组的感染性PRV BAC克隆并稳定保持在大肠杆菌内，再用这种克隆转染PRV相容性真核细胞后获得了拯救的病毒。

电转化感受态细胞的制备：将pPRV/GS1783菌种按2～4％的接种量接种于氯霉素(CAM)抗性的100mlLB培养基中，32℃220r/min培养至OD₆₀₀为0.5-0.7，42℃水浴摇床摇15min以诱导Red重组酶表达，置冰浴20min后，4500g 4℃离心5min，弃上清加4℃预冷的10％甘油40～50ml重悬，12000g 4℃离心1min，弃上清，再加用4℃预冷的10％甘油40～50ml洗一次，弃上清，留1～2ml左右上清重悬(即为电转化感受态细胞)，每管50μl分装于预冷的EP管中，置-70℃保存。

第一步Red重组(用卡那霉素抗性(Kan)基因和EF1启动子基因替代pPRV-Bac的CMV启动子基因)：

以pEP-EF1-in质粒为模板，利用引物对EF1-ep1和EF1-ep2扩增，共35个循环。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸3min，最后一个循环后72℃再延伸10min。

扩增产物经纯化后，取100ng加入50μL pPRV/GS1783的感受态细胞中，混匀后，转入冰浴预冷的1mm电击杯，电击参数(1.8kv、25uF、200欧姆)。立即加入1ml soc，32℃振荡培养1h后，涂布含34μg/mL Cam和50μg/mL Kan的LB平板上，32℃培养30h。提取质粒，经BamHⅠ酶切筛选正确的克隆，命名为pPRV-Kan-EF1。

第二步Red重组(删除pPRV-Kan-EF1质粒中的Kan基因)：

挑取含pPRV-Kan-EF1的单菌落，培养过夜，取100μL接种于2mLCam抗性的LB培养基中，32℃220r/min至OD值为0.4-0.6时加入终浓度为1％的L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导限制性核酸内切酶Ⅰ-SceⅠ的表达，转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组，32℃培养1h。

将细菌悬液作10^-3～10^-5稀释后涂布于含有1％L-阿拉伯糖的Cam抗性平板，32℃培养30h。挑取单菌落时分别在Kan抗性的平板和Cam抗性的平板接种，用BamHⅠ酶切鉴定在Cam抗性平板上生长，而Kan抗性平板上不长的菌落，筛选正确的阳性克隆命名为pPRV-EF1。

以pPRV-EF1为模板，用引物对EF1-ep1和EF1-ep2扩增，得到2358bp的片段，纯化后连接pMD18-T Vector，选取阳性克隆测序，测序正确表明EF1启动子成功替换了pPRV ZJ株CMV启动子。

3.2pPRV-V2C-ΔgE突变体的构建

通过Red E/T重组将Pcmv-V2C-BGH-pA表达框替换pPRV-EF1的gE基因，获得的Bac质粒命名为pPRV-V2C-ΔgE。

以pEP-V2C-in质粒为模板，用引物对PRV-VP2-2A-Cap-in-dgE-s和PRV-VP2-2A-Cap-in-dgE-as进行PCR扩增，共35个循环。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

95℃变性45s，62℃退火45s，72℃延伸4.5min，最后一个循环后72℃再延伸10min。

扩增出长度约为4557bp的片段，经胶回纯化后，取100ng纯化产物加入50μLpPRV-EF1/GS1783的感受态细胞混匀后，转入冰浴预冷的1mm电击杯，电击参数(1.8kv、25uF、200欧姆)。立即加入1ml soc，32℃振荡培养1h后，涂布含34μg/mL CAM和50μg/mL Kan的LB平板，32℃培养30h。挑克隆提质粒，经BamHⅠ酶切筛选正确的克隆命名为pPRV-Kan-V2C-ΔgE。

第二步Red重组(删除pPRV-Kan-V2C-ΔgE质粒中的Kan基因)：

挑取含pPRV-Kan-V2C-ΔgE的单菌落，培养过夜，取100μL接种于2mL Cam抗性的LB培养基中，32℃220r/min至OD值为0.4-0.6时加入终浓度为1％的L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导限制性核酸内切酶Ⅰ-SceⅠ的表达，转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组，32℃培养1h。将细菌悬液作10^-3～10^-5稀释后涂布于含有1％L-阿拉伯糖的Cam抗性平板，32℃培养30h。挑取单菌落时分别在Kan抗性的平板和Cam抗性的平板接种，用BamHⅠ酶切鉴定在Cam抗性平板上长，Kan抗性平板上不长的菌，筛选正确的阳性克隆命名为pPRV-V2C-ΔgE。

以pPRV-V2C-ΔgE为模板，用引物对PRV-dgE-seq-s和PRV-dgE-seq-as进行PCR扩增，扩增出大小约4135bp的片段，胶回收后连接pMD18-T Vector，选取阳性克隆测序，测序正确即可获得正确的pPRV-V2C-ΔgE突变体。

3.3pPRV-ΔgE突变体的构建

通过两步Red E/T重组删除PRV gE基因，获得的Bac质粒命名为pPRV-ΔgE。

以pEPKanS质粒为模板，利用引物对PRV-dgE-rew和PRV-dgE-for进行PCR扩增，共35个循环。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，最后一个循环后72℃再延伸10min。

扩增长度约为1.2kb的片段，经纯化后，取100ng纯化产物加入50μLpPRV/GS1783的感受态细胞混匀后，转入冰浴预冷的1mm电击杯，电击参数(1.8kv、25uF、200欧姆)。立即加入1ml soc，32℃振荡培养1h后，涂布含34μg/mL CAM和50μg/mL Kan的LB平板，32℃培养30h。挑克隆提质粒，经BamHⅠ酶切筛选正确的克隆命名为pPRV-Kan-ΔgE。

第二步Red重组删除(pPRV-Kan-ΔgE质粒中的Kan基因)：

挑取含pPRV-Kan-EF1的单菌落，培养过夜，取100μL接种于2mLCam抗性的LB培养基中，32℃220r/min至OD值为0.4-0.6时加入终浓度为1％的L-阿拉伯糖，继续培养1h诱导限制性核酸内切酶Ⅰ-SceⅠ的表达，转入42℃水浴摇床培养30min进行Red重组，32℃培养1h。将细菌悬液作10^-3-10^-5稀释后涂布于含有1％L-阿拉伯糖的Cam抗性平板，32℃培养30h。挑取单菌落时分别在Kan抗性的平板和Cam抗性的平板接种，用BamHⅠ酶切鉴定在Cam抗性平板上长，Kan抗性平板上不长的菌，筛选正确的阳性克隆命名为pPRV-ΔgE。

以pPRV-ΔgE为模板用引物PRV-dgE-seq-s和PRV-dgE-seq-as(序列见表1)扩增，获得大小约617bp的片段，胶回收后连接pMD-18T Vector，选取阳性克隆测序，酶切和测序正确即可获得正确的pPRV-ΔgE突变体。

4、重组病毒在BHK-21细胞中的拯救

用碱裂解法分别提取pPRV-V2C-ΔgE、pPRV-Bac、pPRV-ΔgE和pPRV-Bac-EF1的Bac质粒，参照Morgan R W的磷酸钙转染方法拯救重组病毒：

取提取的Bac-DNA 5μL加4℃预冷的10mM pH7.5 Tris-HCL 45μL混匀，再加388μL水混匀后室温作用3-4h后，将62μL 2MCaCL₂边加边混，，加好后置4℃冰箱过夜。次日加500μL 2×HEPES(将1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2HPO4.2H2O、0.2g葡聚糖(glucan or dextran)和1g HEPES溶解在90ml的蒸馏水，用0.5M NaOH调节至pH值7.0，再用蒸馏水定容至100ml即可。)混匀，室温作用15min后，加入经10％FBS无抗生素的DMEM洗过的6孔板培养的BHK-21细胞中，每孔加500μL10％FBS无抗生素的DMEM及500μL转染液，混匀后37℃作用3-4h后，弃细胞中的液体，用2ml PBS洗转染细胞后，每孔加1.5ml 15％甘油的1×HEPES室温作用2～2.5min后去掉，并用2ml PBS洗一次，加2ml 10％FBS无抗生素的DMEM培养过夜后，换成4％FBS 200单位双抗的DMEM继续培养，每天观察细胞，待出现70～80％病变后收取病毒，拯救的病毒分别命名为rPRV-V2C-ΔgE、rPRV-ΔgE、rPRV-Bac、rPRV-Bac-EF1。

5、突变体鉴定

分别提取pPRV-V2C-ΔgE、pPRV-V2C-Kan-ΔgE、pPRV-ΔgE和pPRV-Bac-EF1 Bac DNA，经BamHⅠ酶切图谱显示pPRV-Bac比pPRV-Bac-EF1多一条8500bp左右的条带，与预期的结果一致，表明EF1启动子替换Bac中CMV启动子成功。pPRV-Bac-EF1比pPRV-V2C-ΔgE、pPRV-ΔgE和pPRV-V2C-Kan-ΔgE多出一条7500bp左右的条带；pPRV-V2C-Kan-ΔgE比pPRV-ΔgE和pPRV-V2C-ΔgE多一条7000bp的条带；pPRV-V2C-ΔgE比pPRV-ΔgE多一条5000bp的条带，表明所有基因按照预期得到了替换、缺失或插入。同时RLFP分析结果显示，pPRV-BacZJ株经两步Red重组和细菌转化后得到的Bac突变体，除了外源序列插入外，未出现BamHⅠ酶切位点的变化和酶切片段大小的改变(图1A，B)。用引物对PRV-dgE-seq-s和PRV-dgE-seq-as分别以pPRV-V2C-ΔgE、pPRV-ΔgE、pPRV-Bac-EF1为模板进行PCR扩增，分别获得了4135bp、617bp和2351bp的片段(图1C)。测序结果表明目的片段已插入PRV基因组正确位置。结合酶切图谱和PCR产物大小及测序结果说明四种Bac突变体构建成功。

6、重组病毒的细胞增殖特性

6.1重组病毒滴度测定及噬斑大小的测定

分别接种1 MOI rPRV-V2C-ΔgE、rPRV-ΔgE、rPRV-Bac、rPRV-Bac-EF1重组病毒于铺满12孔板的BHK-21细胞中，按照文献(尹文玲，叶伟成，张存，等.猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建[J].病毒学报，2010，26(4)：331-335.)公开的方法在荧光显微镜下每种病毒各拍100张噬斑照片，用Image J软件来测量不同病毒的噬斑面积，计算各病毒的平均值，将rPRV-Bac噬斑面积设成100％，其他病毒噬斑面积以之为标准换算成百分比，如图3显示，rPRV-Bac-EF1噬斑面积最大。。

6.2重组PRV病毒的一步生长曲线

每孔分别接种1 TCID50 rPRV-V2C-ΔgE、rPRV-ΔgE、rPRV-Bac、rPRV-Bac-EF1重组病毒于铺满12孔板的BHK-21细胞中，按文献(张存，叶伟成，王一成，等.牛Ⅰ型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性[J].科学通报，2009，54(24)3823-3829.)的方法，于接种后2、4、8、12、24、36、48和60h分别收集细胞培养上清和细胞沉淀，-70℃冷冻保存。细胞沉淀冻融3次，5000r/min离心5min，取上清和细胞培养上清，同时测定TCID50，绘制得到一步生长曲线。

如图4所示，无论是细胞外还是细胞内的病毒滴度，表明EF1启动子替换PRV ZJ株CMV启动子未见差异，PRV ZJ株gE基因缺失和用V2C基因替换PRV ZJ株gE基因的毒株无差异，和亲本株相比增殖滴度有较明显的下降。

7、PPV VP2和PCV-2 Cap蛋白的表达分析

7.1Western blot

接种rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE于BHK-21细胞，待出现80％病变时，弃上清收取细胞，用PBS洗三次，进行Western blot。SDS-PAGE胶浓度为10％，硝酸纤维素膜电转印后，用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜，加入病毒抗体后，37℃孵育1h，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，按1∶5000稀释，37℃孵育1h，DAB显色。PPV抗体为单抗，1∶100稀释；PCV2抗体为病毒的阳性血清(内含伪狂犬病毒抗体)。

如图8a所示，rPRV-V2C-ΔgE感染的细胞样品与rPRV-ΔgE感染的细胞样品相比在64kDa处有一条特异性条带与预期蛋白大小一致，为PPVVP2蛋白；如图8b所示，在28kDa处有一特异性条带与预期蛋白大小一致为PCV2 Cap蛋白，说明两外源蛋白获得表达，且在FMDV 2A蛋白位点裂解。

7.2重组病毒血凝试验

无菌采1月龄鸡血2mL，制备1％的红细胞，在96孔微量反应板中每孔加50μL生理盐水，将rPRV-V2C-ΔgE、rPRV-ΔgE、rPRV-Bac、rPRV-Bac-EF1四种病毒在96孔微量反应板上倍比稀释至11孔，第12孔作对照，然后每孔加50μL 1％的新鲜制备的鸡红细胞悬液。每种毒做三个重复，并设红细胞阴性对照。

血凝试验表明，rPRV-V2C-ΔgE样品出现血凝现象，其血凝效价为2⁴，rPRV-ΔgE、rPRV-Bac、rPRV-Bac-EF1无血凝现象。

8、获得删除pHA2序列的rPRV-V2C-ΔgE

取pPRV-V2C-ΔgE 5μg和pCAGGS-NLS/Cre1μg加4℃预冷的10mMpH7.5 Tris-HCL至50μL混匀，再加388μL水混匀后室温作用3-4h后，将62μL 2M CaCL₂边加边摇，加好后置4℃冰箱过夜。次日加500μL 2×HEPES(将1.6g NaCl、0.074g KCl、0.027g Na2HPO4.2H2O、0.2g葡聚糖(glucanor dextran)和1g HEPES溶解在90ml的蒸馏水，用0.5M NaOH调节至pH值7.0，再用蒸馏水定容至100ml即可)。混匀，室温作用15min后，加入经10％FBS无抗生素的DMEM洗过的6孔板培养的Vero细胞中，每孔加500μL 10％FBS无抗生素的DMEM及500μL转染液，混匀后37℃作用3-4h后，弃细胞中的液体，用2ml PBS洗转染细胞后，每孔加1.5ml 15％甘油的1×HEPES室温作用2～2.5min后去掉，并用2ml PBS洗一次，加2ml10％FBS无抗生素的DMEM培养过夜后，换成含4％FBS和200单位双抗的DMEM继续培养，每天观察细胞，挑取无荧光的病毒蚀斑作毒种，在Vero细胞筛选至看不到有荧光的病毒蚀斑出现(3-4代)，即获得纯化的删除pHA2序列的rPRV-V2C-ΔgE。将该病毒在Vero细胞大量复制，置-70℃保存，并测定其TCID₅₀。

9、重组伪狂犬病毒的应用

将重组病毒稀释至10⁵TCID₅₀/ml，肌肉注射两月龄非免疫猪8头，其中4头注射1ml/头，另外4头每头注射2ml，定期采血分离血清，用ELISA方法进行PRV(gE、gB)、PPV抗体检测，用IPMA方法检测PCV2抗体。结果显示免疫当天的血清PRV gE-ELISA全是阴性，说明试验猪未被野生型PRV感染。而6天之后PRV gB抗体转阳，说明重组病毒感染诱发机体产生了PRV抗体，且该抗体产生可以持续较长时间(见表2A)；重组病毒免疫后一周时2只(共8只)试验猪体内诱发产生了PPV抗体，二周时所有试验猪体内PPV抗体全部转阳(见表2B)；IPMA检测PCV2抗体结果是：重组病毒免疫后一周时3只(共8只)试验猪体内诱发产生了PCV2抗体，三周时所有试验猪体内PCV2抗体全部转阳(见表2C)。

表2A免疫猪体PRV gE、gB蛋白抗体水平ELISA检测

表2B重组病毒免疫猪体诱发特异性针对PPV的抗体水平ELISA检测

表2C重组病毒免疫猪体诱发特异性针对PCV2的抗体IPMA检测

将rPRV-V2C-ΔgE免疫PRV、PPV、PCV2抗体阴性猪，抗体检测结果表明猪体在免疫后第6天PRV gB抗体转阳，2到3周内所有免疫猪体内出现PPV、PCV2抗体，说明以PRV作为载体表达的外源抗原都能诱发机体生成相应的抗体，这些研究结果表明重组病毒rPRV-V2C-ΔgE可以作为PRV、PPV和PCV2三联基因重组疫苗的候选毒株。

Claims (9)

1.一种重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，该病毒含有由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因。

2.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，该病毒包含Pcmv-V2C-BGH-pA表达框；

其中V2C表示由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因；Pcmv表示启动子CMV；BGH-pA表示人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾。

3.根据权利要求1或2所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，该病毒的gE基因被所述外源基因替换。

4.根据权利要求1或2所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，该病毒的TK基因部分缺失。

5.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述的猪细小病毒VP2基因碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述的口蹄疫病毒2A基因碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求1所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述的猪圆环病毒Cap基因碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

8.一种重组猪伪狂犬病毒的构建方法，包括：

(1)将pHA2质粒插入到原始猪伪狂犬病毒的TK基因内，获得rPRV；

(2)将rPRV基因组转化大肠杆菌(E.coli)DH10B菌株，获得pPRV；

(3)将pPRV的标记基因GFP的CMV启动子更换为EF1启动子，获得pPRV-EF1；

(4)将Pcmv-V2C-BGH-pA表达框替换pPRV-EF1的gE基因，获得pPRV-V2C-ΔgE；

其中V2C表示由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因；Pcmv表示启动子CMV；BGH-pA人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾；

(5)pPRV-V2C-ΔgE与pCAGGS-NLS/Cre两种质粒共转染Vero细胞系，筛选获得删除pHA2质粒的rPRV-V2C-ΔgE。

9.根据权利要求1～7任一所述的重组猪伪狂犬病毒在制备动物疫苗中的应用。

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