CN101792775A - 用干扰素诱导蛋白esat6修饰禽流感病毒的方法 - Google Patents

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罗琴芳
郭霄峰
黄韧
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COLLEGE OF VETERINARY MEDICINE SOUTH CHINA AGRICULTURAL UNIVERSITY
Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
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COLLEGE OF VETERINARY MEDICINE SOUTH CHINA AGRICULTURAL UNIVERSITY
Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute
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Abstract

本发明涉及一种用干扰素诱导蛋白ESAT6修饰禽流感病毒的方法。它是采用结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT6基因对禽流感病毒进行修饰，是在建立禽流感病毒反向遗传操作系统基础上，拼接入外源DNA的方法。所选用的ESAT6蛋白，是具有T细胞多功能表位的分泌蛋白，其主要功能是刺激机体产生IFN，这在研究病毒抗感染免疫机理路径中具有独特性。在DNA修饰禽流感病毒基因后，修饰病毒拯救时，既不影响禽流感病毒蛋白的转录、翻译和病毒包装，同时又可产生ESAT6蛋白。

Description

用干扰素诱导蛋白ESAT6修饰禽流感病毒的方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，尤其涉及一种利用反向遗传操作技术体外对禽流感病毒进行修饰、加工的方法，以获得新的修饰病毒，用于其在抗感染免疫机理研究及免疫预防方面的用途。
背景技术
禽流感病毒不仅给养禽业带来巨大损失，对人类公共卫生健康也有巨大威胁。摸清禽流感病毒与机体相互作用机制，对于预防禽流感有重要意义。禽流感病毒属于正粘病毒科，流感病毒属A型病毒，是有囊膜、多形态的单股负链RNA病毒，其病毒基因组由8个节段组成，编码11种蛋白。其中，血凝素蛋白HA、神经氨酸酶NA、非结构蛋白NS1是病毒的主要毒力基因，变异性也较大。机体抗禽流感病毒感染主要体现在抗HA/NA中和抗体及各类细胞因子，而细胞因子因不同禽流感病毒有很大差异。部分高致病力毒株感染机体后会产生大量促炎细胞因子，而导致机体产生细胞因子风暴，而使机体迅速衰竭死亡；部分低致病力禽流感病毒又会出现免疫抑制的现象，促使机体极易发生继发感染。而特异性免疫反应与机体产生的固有免疫反应类型有很大关系，其中，固有免疫反应产生的细胞因子IFNs有重要作用。目前，围绕禽流感病毒、甲型H1N1流感病毒与刺激机体产生IFNs机理研究成为一个热点和难点。我们试图利用干扰素诱导蛋白体外修饰禽流感病毒入手，用修饰病毒感染敏感动物，观察IFN及其他天然免疫路径的差异以及对特异性免疫应答的影响，从另一个视角来观察和探索禽流感病毒及流感病毒机体抗感染免疫机制，为开发更好的药物和疫苗奠定基础。
体外修饰禽流感病毒或流感病毒技术源于流感病毒反向遗传操作技术，起初，人们为了更好地鉴别和筛选从体外培养细胞中拯救获得的流感病毒，将标记基因CAT整合到流感病毒基因中，与辅助病毒共同感染获得。利用这一技术，人们也开始尝试用一些功能基因标记或以病毒为载体，表达外源蛋白。如HIV-1病毒gp120蛋白的gp41蛋白胞内域中高度保守的片段插入在流感病毒HA片段的抗原位点上，从而诱导出对于外源片段的免疫反应。有的是将目的基因和流感病毒的基因进行物理连接，在这种方法中外源基因的转录和翻译是作为流感病毒基因的一部分进行的。另一种方法是将外源基因作为一个独立的片段进行表达。近十年中，流感病毒反向遗传技术、标记技术和外源蛋白修饰技术都取得了很大进步，不再依赖辅助病毒，可以完全用质粒转染敏感细胞，即可获得病毒。但在这十年的尝试中，人们发现，利用现在的12质粒系统或8质粒系统进行体外修饰并不容易。因此，能够获得修饰病毒的依然是凤毛麟角。
发明内容
本发明主要目的是通过分子生物学技术，将已经构建的禽流感病毒反向遗传操作系统，用外源基因修饰禽流感病毒基因(对病毒部分基因进行缺失、修饰)的方法，获得新的修饰病毒，为进一步阐述禽流感病毒感染免疫机理、开发更好的药物或疫苗打好基础。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种用干扰素诱导蛋白ESAT6修饰禽流感病毒的方法，它是采用结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT6基因对禽流感病毒进行修饰。
进一步的技术措施是：上述用干扰素诱导蛋白ESAT6修饰禽流感病毒的方法，是在建立禽流感病毒反向遗传操作系统基础上，拼接入外源DNA。
与现有技术相比，本发明具有以下显著的进步和突出的特点：
1、选用ESAT6蛋白，该蛋白基因仅为288bp，分子量小，容易实施操作。
2、所选用的ESAT6蛋白，是具有T细胞多功能表位的分泌蛋白，其主要功能是刺激机体产生IFN，这在研究病毒抗感染免疫机理路径中具有独特性。
3、采用的DNA修饰禽流感病毒技术，是在建立禽流感病毒反向遗传八质粒操作系统基础上进行的，选择的剪切、拼接位点具有独特性。
4、在DNA修饰禽流感病毒基因后，修饰病毒拯救时，既不影响禽流感病毒蛋白的转录、翻译和病毒包装，又能同时产生ESAT6蛋白。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作更加详尽的描述。
图1是本发明修饰方案的第一种实施例；
图2是本发明修饰方案的第二种实施例；
图3是本发明修饰方案的第三种实施例。
具体实施方式
1.ESAT6基因的克隆
①结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组的提取：在P3实验室生物安全柜中操作，取500ul结核分枝杆菌标准株H37Rv培养物于1.5ml管中，加入1ml无水乙醇，密封。取出，放于-20℃过夜，4℃，12000rpm离心，去上清，空干，将沉淀用100ul灭菌水溶解，煮沸10min，再按常规操作提取细菌基因组DNA。
②取细菌基因组DNA进行PCR
在25uL体系中，
10×buffer 2.5uL
Mg2+       1.5uL(25mM)，
dNTP 1uL(25mM)
修饰DNA1   1uL(10pmol/mL)
修饰DNA2   1uL(10pmol/mL)
TaqDNA聚合酶1u(5u/uL)
加入制备的DNA模板25ng
最后用无菌去离子水补至25uL。
95℃3min，50℃30s，72℃30s，30循环后，72℃8min。获得产物在2％凝胶上进行电泳，有预期带，测序，序列进行blast验证。
修饰方案一：
图1示出了修饰方案的第一种实施例：先将ESAT6基因获得后，用PCR引物直接扩增的方法，在ESAT6基因5’末端加入禽流感病毒NA基因组5’NCR序列，在ESAT6基因3’端用具有蛋白切割活性的口蹄疫病毒2A酶基因修饰；同时用PCR方法将禽流感病毒NA基因cDNA5’NCR部分去除，裸露5’ORF起始序列；再用融合PCR方法将ESAT6-2A与NA基因两段序列进行拼接。
1.ESAT6基因的修饰
获得的ESAT6基因，通过PCR方法，在ESAT6基因5’末端加入禽流感病毒NA基因组5’端NCR序列，在ESAT6基因3’端连接具有蛋白切割活性的口蹄疫病毒2A酶基因。
在25uL体系中，
10×buffer 2.5uL
Mg2+       1.5uL(25mM)，
dNTP 1uL(25mM)
修饰DNA3  1uL(10pmol/mL)
修饰DNA4  1uL(10pmol/mL)
TaqDNA聚合酶1u(5u/uL)
加入制备的DNA模板25ng
最后用无菌去离子水补至25uL。
95℃3min，58℃30s，72℃30s，30循环后，72℃8min。获得产物在2％凝胶上进行电泳，有预期带，测序，序列进行blast验证。
ccAGCAAAAGCAGGAGTGAAAATGTCAGATCAAATCACGTATAACCCGGGAGCCGTATCCGACTTCGCTTCCGACGTGGG
CTCGCGCGCCGGCCAGCTCCACATGATTTACGAAGACACCGCCAGCAAAACAAATGCGCTGCAAGAGTTTTTCGCGGGCC
ACGGCGCGCAAGGGTTTTTCG
ACGCCCAGGCGCAGATGCTGTCGGGGCTGCAGGGGCTCATTGAGACGGTGGGTCAGCATGGGACTACCACCGGCCACGTG
CTGGACAACGCGATCGGAACCGACCAGGCCATCGCGGGCTTGTTCaacttcgacctcctcaagttggcgggagacgttga
gtccaaccccggg
2.改造修饰序列的拼接：
将ESAT6-2A基因及NA基因分别用T4聚合酶作用和T4连接酶作用，再将连接产物用修饰DNA1和修饰DNA4作为引物，进行PCR扩增，获得图1所示人工修饰拼接的基因ESAT6-2A-NA。
T4聚合酶作用体系及程序为：
10×buffer 5uL
1‰BSA     5uL
dATP       1uL(10mM)
加入制备的DNA模板3ug
最后用无菌去离子水补至45uL
70℃10min后冰浴
加入T4DNA聚合酶5u(5u/uL)
12℃20min，95℃3min灭活。获得产物经纯化回收后，在以下体系中进行连接：
10×buffer 1uL
ESAT6-2A基因 100ng
NA基因       100ng
T4聚合酶     0.5uL
用无菌去离子水补至10uL
置于16℃连接2h，取1uL连接产物进行PCR
在25uL体系中，
10×buffer 2.5uL
Mg2+       1.5uL(25mM)，
dNTP 1uL(25mM)
修饰DNA1  1uL(10pmol/mL)
修饰DNA4  1uL(10pmol/mL)
TaqDNA聚合酶1u(5u/uL)
加入制备的DNA模板1uL
最后用无菌去离子水补至25uL。
95℃3min，58℃30s，72℃30s，30循环后，72℃8min。获得产物在1％凝胶上进行电泳，有预期带，测序，序列进行blast验证。获得图1所示人工修饰拼接的基因ESAT6-2A-NA。
ccAGCAAAAGCAGGAGTGAAAATGTCAGATCAAATCACGTATAACCCGGGAGCCGTATCCGACTTCGCTTCCGACGTGGG
CTCGCGCGCCGGCCAGCTCCACATGATTTACGAAGACACCGCCAGCAAAACAAATGCGCTGCAAGAGTTTTTCGCGGGCC
ACGGCGCGCAAGGGTTTTTCGACGCCCAGGCGCAGATGCTGTCGGGGCTGCAGGGGCTCATTGAGACGGTGGGTCAGCAT
GGGACTACCACCGGCCACGTGCTGGACAACGCGATCGGAACCGACCAGGCCATCGCGGGCTTGTTCaacttcgacctcct
caagttggcgggagacgttgagtccaaccccgggATGAATCCA。。。。。。AAAAAAACTCCTTGTTTCTACT
修饰方案二：
图2示出了修饰方案的第二种实施例：先将ESAT6基因获得后，用PCR引物直接扩增的方法，在ESAT6基因5’端用具有蛋白切割活性的口蹄疫病毒2A酶基因修饰，用PCR方法将禽流感病毒NS基因组中NS1末端部分序列去除，形成两段序列，利用T4聚合酶外切酶活性将3个片段两两拼接，最终形成NS-ESAT6-NS片段。
1.ESAT6基因的修饰
获得的ESAT6基因，通过PCR方法，在ESAT6基因5’末端加入口蹄疫病毒2A基因。
在25uL体系中，
10×buffer 2.5uL
Mg2+       1.5uL(25mM)，
dNTP 1uL(25mM)
修饰DNA7   1uL(10pmol/mL)
修饰DNA8   1uL(10pmol/mL)
TaqDNA聚合酶1u(5u/uL)
加入制备的DNA模板25ng
最后用无菌去离子水补至25uL。
95℃3min，58℃30s，72℃30s，30循环后，72℃8min。获得产物在2％凝胶上进行电泳，有预期带，测序，序列进行blast验证。
修饰后的ESAT6为：
aacttcgacctcctcaagttggcgggagacgttgagtccaaccccgggATGTCAGATCAAATCACGTATAACCCGGGAGC
CGTATCCGACTTCGCTTCCGACGTGGGCTCGCGCGCCGGCCAGCTCCACATGATTTACGAAGACACCGCCAGCAAAACAA
ATGCGCTGCAAGAGTTTTTCGCGGGCCACGGCGCGCAAGGGTTTTTCGACGCCCAGGCGCAGATGCTGTCGGGGCTGCAG
GGGCTCATTGAGACGGTGGGTCAGCATGGGACTACCACCGGCCACGTGCTGGACAACGCGATCGGAACCGACCAGGCCAT
CGCGGGCTTGTTC
2.NS基因的切割
NS基因序列反向扩增，获得中间部分缺失的序列(1-408，528-890)
P1：AGCAAAAGCAGGGTG
P2：CGTCTTTATCCATTATTG
P3：GACATACTGAAGAGGATGTC
P4：TTAGTAGAAACAAGGGTG
扩增体系及程序与方案一中相同，Tm值50℃
获得两段序列，分别为：
①
AGCAAAAGCAGGGTGACAAAAACATAATGGATTCCAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGACTGCTTTCTTTGGCATGTC
CGCAAACGATTTGCAGACCAAGAAATGGGTGATGCCCCATTCCTTGACCGGCTTCGCCGAGATCAGAAGTCCCTAAGAGG
AAGAGGCAGCACTCTTGGTCTGGACATCAGAACTGCCACTCGTGAAGGAAAGCATATAGTGGAGCGGATTCTGGAAGAAG
AATCTGATGAGGCACTTAAAATGACTATCGCTTCAGTGCCTGCTCCACGCTACCTAACTGAAATGACTCTTGAGGAAATG
TCAAGGGACTGGTTAATGCTCATTCCCAAGCAGAAAGTGACAGGGTCCCTTTGCATTAGAATGGACCAGGCAATAATGGA
TAAAGACG
②
GACATACTGAAGAGGATGTCAAAAATGCAATTGGGGTCCTCATCGGAGGACTTGAATGG
AATGATAACACAGTCCGAGTCTCTGAAGCTCTACAGAGATTCACTTGGAGAGGCAGTGA
TGAGAATGGGAGATCTCCACTCCCTCCAAAACAGAAACGGAAAATGGAGAGAACAACT
GAGCCAGAAGTTTGAAGAGATAAGATGGTTAATTGAAGAAGTGCGACATAGGTTAAGAA
TTACAGAGAATAGCTTTGAGCAAATAACCTTTATGCAAGCCTTACAACTATTGCTTGAAG
TGGAGCAAGAGATAAGAACTTTCTCGTTTCAGCTTATTTAATGATAAAAAACACCCTTGT
TTCTACT
3.T4聚合酶的外切酶和T4连接酶，拼接三段序列，获得如下修饰序列：
T4聚合酶作用体系及程序同方案一。
T4连接酶体系同方案一。
将连接产物进行PCR扩增，获得产物在2％凝胶上进行电泳，有预期带，测序，序列进行blast验证。
最终获得拼接修饰基因
修饰方案三：
图3示出了修饰方案的第三种实施例：将获得的ESAT6基因两端直接用禽流感病毒NS基因组NCR部分进行拼接、修饰，获得能够组装入禽流感病毒基因组的ESAT6基因。
在100uL体系中，
10×buffer 10uL
Mg2+       6uL(25mM)，
dNTP   1uL(25mM)
修饰DNA5   4uL(10pmol/mL)
修饰DNA6   4uL(10pmol/mL)
TaqDNA聚合酶1u(5u/uL)
加入制备的DNA模板100ng
最后用无菌去离子水补至100uL。
95℃3min，52℃30s，72℃30s，30循环后，72℃8min。获得产物在2％凝胶上进行电泳，有预期带，测序，序列进行blast验证。
CCAGCAAAAGCAGGGTGACAAAAACATAATGTCAGATCAAATCACGTATAACCCGGGAGCCGTATCCGA
CTTCGCTTCCGACGTGGGCTCGCGCGCCGGCCAGCTCCACATGATTTACGAAGACACCGCCAGCAAAACAAATGCGCTGC
AAGAGTTTTTCGCGGGCCACGGCGCGCAAGGGTTTTTCGACGCCCAGGCGCAGATGCTGTCGGGGCTGCAGGGGCTCATT
GAGACGGTGGGTCAGCATGGGACTACCACCGGCCACGTGCTGGACAACGCGATCGGAACCGACCAGGCCATCGCGGGCTT
GTTCAAAAAACACCCTTGTTTCTACT

Claims (2)

1.一种用干扰素诱导蛋白ESAT6修饰禽流感病毒的方法，其特征在于，采用结核分枝杆菌早期分泌性抗原靶ESAT6基因对禽流感病毒进行修饰。
2.根据权利要求1所述的用干扰素诱导蛋白ESAT6修饰禽流感病毒的方法，其特征在于，在建立禽流感病毒反向遗传操作系统基础上，拼接入外源DNA。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102618508A (zh) * 2012-04-09 2012-08-01 浙江省农业科学院 一种重组猪伪狂犬病毒及其构建方法和应用
CN107586759A (zh) * 2017-11-03 2018-01-16 广西医科大学 一种重组新城疫病毒的构建方法及应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102618508A (zh) * 2012-04-09 2012-08-01 浙江省农业科学院 一种重组猪伪狂犬病毒及其构建方法和应用
CN107586759A (zh) * 2017-11-03 2018-01-16 广西医科大学 一种重组新城疫病毒的构建方法及应用
CN107586759B (zh) * 2017-11-03 2021-03-30 广西医科大学 一种重组新城疫病毒的构建方法及应用

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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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