CN103316357B - 携带rsv基因的重组流感病毒嵌合疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗及其制备方法与应用。其特征是所述的嵌合疫苗是由RSV抗原或抗原优势表位整合入流感病毒基因组组成的双价疫苗。为发展携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗实现“一苗两用”或“一苗多用”奠定了基础。

Description

携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗及其制备方法

发明领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

呼吸道传染病至今仍然是世界上导致死亡的主要原因之一，而呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus，RSV）、腺病毒、副流感、流感病毒则是重要的呼吸道病原体。临床结果显示，在呼吸道感染发生的肺炎、支气管炎和哮喘病人中RSV占首位，严重影响了人类健康和生命安全。尤其是，上世纪的三次流感大流行，近年来H5N1跨种传染人的事件以及2009年全球出现的甲型H1N1流感疫情，使得对流感的防控成为重中之重。

目前，疫苗接种是预防和控制人类呼吸道传染病的最有效措施。

病毒载体已广泛应用于基因治疗研究与疫苗开发，且作为有效的基因递送手段为生命过程的基础研究提供了有力的工具。当前开发的病毒载体主要以DNA病毒为主，比如腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体与腺相关病毒载体等。DNA病毒载体中DNA形式的外源基因存在着一种整合到宿主基因组的风险，极大的影响了在临床上的广泛应用。而RNA病毒因其基因组不存在插入宿主细胞基因组的可能性，开发为病毒载体具有较高的安全性，因此开发新型的RNA病毒载体成为病毒载体开发的一个重要方向。真正可用的RNA病毒载体较少，主要有正链RNA病毒，包括脊髓灰质炎病毒载体（Poliovirus），辛德比斯病毒载体，西门利克森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等，和非节段的负链RNA病毒主要包括水泡性口炎病毒和狂犬病毒。在应用方面，现有这些RNA病毒载体自身存在诸多局限（颜新民等，非节段负链RNA病毒作为疫苗载体研究进展，动物医学进展，2007，28（11）：71-74；胡伟等，RNA病毒作为疫苗载体研究与应用，生物技术通讯，2007,18（3）：483-485。

流感病毒属于正粘病毒科，分节段的负链RNA病毒。流感病毒能够在鸡胚中得到高的病毒滴度，成熟的规模化生产体系已经在现有流感疫苗的生产过程中广泛应用。

近年来，一是抗原免疫生物信息学技术迅速发展为针对RSV主要保护性抗原表位设计产生了重大影响，为提升全面免疫保护的RSV疫苗研制提供了理论和技术支持；二是反向遗传技术快速发展，为研制安全、有效、多价的减毒活疫苗提供了先进的技术，使得流感病毒作为递送系统显现了良好的发展前景，同时为嵌合病毒达到“一苗两用”或“一苗多用”的目的提供了理论依据；三是喷鼻免疫途径为嵌合病毒针对RSV设计出具有产生黏膜和系统免疫应答、实现免疫交叉保护，成为了呼吸道嵌合疫苗的重要发展方向。

目前，反向遗传学技术在流感病毒领域的广泛应用和迅速发展，从cDNA直接拯救流感病毒的反向遗传学技术的开发极大简化了重配病毒的拯救过程。流感病毒的8质粒病毒拯救系统在国内外已经成为成熟的技术，使得以流感病毒作为递送系统表达外源基因成为很有吸引力的研究方向，重组呼吸道传染病疫苗的研究热点集中在流感病毒身上。流感病毒作为开发其它传染病病原体疫苗的载体有许多优势：(1)能够刺激机体产生强烈的黏膜和系统免疫应答；(2)流感疫苗由于抗原变异需要每年生产；(3)HA和NA表面蛋白的结构和功能决定了能够对它们进行基因操作而不影响它们的功能；(4)流感病毒已经形成了高效的反向遗传学操作系统；(5)小鼠和雪貂为重组流感病毒疫苗候选株呼吸道黏膜免疫应答和免疫保护的研究提供了很好的动物模型。与其他载体如腺病毒，逆转录病毒相比，流感病毒在复制周期不会形成DNA中间产物，此外由于它不会整合进宿主的染色体，使得其具有更高的安全性。用于流感病毒基因组操作的策略有：外源蛋白嵌合入表面糖蛋白HA和NA，产生另外的基因片段，改造非结构蛋白NS1。

鉴于流感病毒反向遗传技术取得的突破性进展，已有大量文献报道将流感病毒作为递送系统成功制备了能够达到有效免疫保护的、多价的嵌合疫苗候选株，为疫苗的研究拓宽了发展前景。2004年Horimoto等构建了嵌合体病毒(A/B)，该病毒含有嵌合体(A/B)的HA和B型病毒全长NA片段。该研究为从单一宿主菌株开发减毒活疫苗提供了一种新的思路。2005年MaedaY等通过反向遗传学技术产生一种重组的A型流感病毒，该病毒的编码区是副流感病毒的HA/NA外功能区，能够在鸡胚中有效繁殖但在小鼠体内却是减毒的。当用重组病毒鼻内给药小鼠后，全部都能产生抵抗流感病毒和副流感病毒的抗体。这种双价的活疫苗的免疫保护效果明显优于联合疫苗。同年ZhuNanLi等报道小肽能够插入流感病毒HA抗原的“loop”环区域，随后的研究显示，B.anthracis的保护性抗原(PA)大片段多肽能被插入流感病毒H3亚型HA的功能区，嵌合HA-PA基因的重组流感病毒经MDCK细胞和鸡胚传代后，遗传稳定性好，动物实验结果表明，重组病毒能够引起HA和PA蛋白诱导的抗体反应。2004年Kawaka等将GFP基因整合入NA基因的特定位置后，结果发现重组流感病毒粒子组装的效率可高达91%（YutakaFujii,YoshihiroKawaokaetal.SelectiveincorporationofinfluenzavirusRNAsegmentsintovirions.PNAS.2003.100(4):2002–2007；KyokoShinya,etal.CharacterizationofaNeuraminidase-DeficientInfluenzaAVirusasaPotentialGeneDeliveryVectorandaLiveVaccine,JOURNALOFVIROLOGY,2004,78(6):3083–3088）。2005年AndrejEgorov等先后将GFP和IL-2插入NS1的开放阅读框，结果成功得到了重组的流感病毒株（ChristianKittel,AndrejEgorovetal.RescueofinfluenzavirusexpressingGFPfromtheNS1readingframe,Virology324,2004,67–73;ChristianKittel,AndrejEgorovetal.GenerationofanInfluenzaAVirusVectorExpressingBiologicallyActiveHumanInterleukin-2fromtheNSGeneSegment,JOURNALOFVIROLOGY,2005,79(16):10672–10677）。2006年M.A.Stukova等报道将Mycobacteriumtuberculosis早期分泌蛋白(ESAT-6)插入到流感病毒NS1基因片段，获得的Flu/ESAT-6重配病毒有良好的治疗和预防效果。（M.A.Stukova，etal.VaccinepotentialofinfluenzavectorsexpressingMycobacteriumtuberculosisESAT-6proteinTuberculosis(2006)86,236–246）。2009年AnnaL.deGoede等HIV-1p17Gag(rFlu-p17)基因插入到流感病毒的NA基因，获得了复制缺陷型的流感病毒株，动物体内外实验证明有良好的免疫效果（AnnaL.deGoedeetal.CharacterizationofrecombinantinfluenzaAvirusasavectorforHIV-1p17Gag,Vaccine27(2009)5735–5739）。

以上所述是目前将流感病毒作为递送系统表达外源基因的研究现状，而国内外，将流感病毒基因组作为表达RSV抗原载体，用于研制嵌合抗原表位的重组流感减毒病毒株在国内外还未见报道。所以说，采用流感病毒的反向遗传技术制备流感双价、多价嵌合疫苗将是呼吸道传染性疾病预防和治疗的新里程碑。

喷鼻免疫是目前研究活跃的领域，近年也有许多企业开发鼻腔接种疫苗，特别是呼吸道传染性疾病疫苗，如流感减毒活疫苗通过鼻腔接种，不仅可以产生局部黏膜免疫，还可以产生系统免疫，并且产生具有交叉免疫保护。因此，开发鼻腔接种的嵌合RSV抗原表位的重组流感减毒疫苗替代注射具有很大的应用前景，这是由于鼻腔免疫具有简单、有效、非常适于广大人群的自我使用，同时使得机体能够抵抗RSV和流感两种或多种病原体感染，并且对疫苗免疫应答类型可以转变，由此达到更加安全的目的，为呼吸道病原体的免疫预防提供保证。

本发明的效果在于开发了一种利用流感病毒携带RSV基因作为病毒载体的方法。利用流感病毒株的NS1，M和NA基因片段携带RSV基因，通过反向遗传学获得的重配流感病毒在鸡胚中可以稳定传代，表明利用廉价的鸡胚介质可得到大量病毒，为以后构建携带RSV基因的流感病毒载体奠定了基础。重组流感病毒载体可以应用于疫苗开发，肿瘤治疗，药物开发以及在鸡胚生物反应器中生产重组细胞因子药物。

发明内容

本发明目的在于提供一种携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗及其制备方法与应用，本发明的目的还在于公开该疫苗的制备方法和应用。

本发明目的是通过如下技术方案实现的。

本发明疫苗为一种携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗。

本发明的携带RSV基因的重组流感病毒载体能通过病毒拯救方法在细胞内进行拯救，并能在鸡胚中大量扩增。

本发明携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗，其特征是流感病毒为表达外源基因的载体，其中流感病毒可以是A型流感病毒中的任一亚型（H1-H16），也可以是B型流感病毒。

本发明流感病毒载体可以是A/PR/8/34,也可以是冷适应流感病毒株骨架A/AA/6/60或B/AA/6/66,也可以是其他亚型流感病毒株骨架。

本发明流感病毒株骨架可以是流感病毒基因组8个基因片段中的任意一个，均可以作为插入外源基因片段的靶点，包括PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS。优选NS、M和NA。

在流感病毒NS基因组片段中引入外源基因，实现了外源基因与NS基因的同步表达，充分利用了NS片段的选择性包装信号区域，最大限度的提高了插入基因的长度，并且可以使用鸡胚扩大培养该流感病毒载体。

在流感病毒M基因组片段中引入外源基因，实现了外源基因与M基因的同步表达，充分利用了M片段的选择性包装信号区域，最大限度的提高了插入基因的长度，并且可以使用鸡胚扩大培养该流感病毒载体。

在流感病毒NA基因组片段中引入外源基因，实现了外源基因与NA基因的同步表达，充分利用了NA片段的选择性包装信号区域，最大限度的提高了插入基因的长度，并且可以使用鸡胚扩大培养该流感病毒载体。

上述携带RSV基因的重组流感病毒载体的制备方法包括以下步骤：

（1）构建用于流感病毒拯救的在流感病毒基因组片段上引入了外源基因的质粒；

（2）将步骤1得到的重组流感病毒载体在宿主细胞上进行拯救。

本发明所述外源基因片段可以是呼吸道传染病病原体的保护性抗原或其优势表位，呼吸道合胞病毒（RSV）、副流感、呼吸道腺病毒（HAdV）等。

所述外源基因也可以是HIV,手足口病、痢疾、结核等病原体的保护性抗原或其优势表位。

所述外源基因可以是呼吸道、消化道和泌尿生殖道病原体的保护性抗原或其优势表位。

本发明所述外源基因片段可以是呼吸道合胞病毒（RSV）A型的F、G的全基因或F+G、或F、G优势表位、或F优势表位+G优势表位。也可以是B型的F、G的全基因或F+G、或F、G优势表位、或F优势表位+G优势表位。也可以是A、B型混合优势表位。

所述的外源基因包括EGFP报告基因。

所述的外源基因序列根据宿主细胞类型不同，经过密码子优化。

本发明所述外源基因片段可以整合入流感病毒PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M和NS任一基因片段开放阅读框（ORF）的任意位置，如果有必要，可以同时替换部分流感病毒基因序列，通过基因工程手段构建重组质粒。

本发明所述构建的流感和其他病原体抗原或表位的重组质粒，利用反向遗传学技术，转染细胞，筛选获得重配的流感双价、多价疫苗候选株。

将拯救组合物感染或转染到至少一个宿主细胞中，其中，拯救组合物包含上述的NA、M或NS重组质粒与流感病毒的其余7个表达质粒。

所述宿主细胞可以是MDCK、Vero、293T、COS细胞或MDCK/293T、MDCK/COS共培养细胞系。

重配的流感双价、多价疫苗候选株通过电镜、RT-PCR、免疫荧光、WB等方法进行鉴定。

重组病毒的稳定性鉴定可以在9-11日龄SPF鸡胚或MDCK细胞中连续传代。

本发明双价、多价嵌合疫苗，可用公知技术加工成供临床用的各种制剂，所述的制剂选自液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型、片剂、丸剂中的一种，优选剂型是液体剂型、冻干剂型、胶囊剂型，更优选液体剂型和冻干剂型，最优选液体剂型。

本发明双价、多价嵌合疫苗接种途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射、口服，还包括鼻腔、口腔、肛门、阴道黏膜途径。

本发明的流感双价、多价嵌合疫苗可以覆盖更多的呼吸道传染病病原体，保护更多人群免受流感和其他呼吸道病原体之害。而且，本发明的流感多价嵌合疫苗是一种全新的组合，至今还未见类似疫苗。本发明的独到之处还在于发现不同不同的呼吸道病原体的抗原或表位整合入流感病毒基因组后，并不影响各自的免疫原性，为疫苗实现“一苗两用”或“一苗多用”目的奠定了基础。

另外，上述重组流感病毒载体可应用于：1）应用于增强流感病毒疫苗的免疫效果与开发针对其他疾病的疫苗；2）用于肿瘤治疗；3）利用鸡胚作为生物反应器生产外源蛋白；4）应用于抗流感药物的筛选。

附图说明

图1是构建本发明实施例所述嵌合RSV抗原表位的流感嵌合疫苗的具体策略示意图。A图为FLU-RSV-F/NS1重组策略示意图；B图为FLU-RSV-FG/NS1重组策略示意图；C图为FLU-RSV-FG/M重组策略示意图；D图为FLU-RSV-FG/NA重组策略示意图。

图2为嵌合RSV抗原表位的流感嵌合疫苗FLU-RSV-F/NS1的鉴定结果。A图为电镜观察得到的重配病毒株形态；B图为重配病毒株粒子大小统计结果；C图为病毒株浓缩、纯化后WB鉴定嵌合抗原。

图3为所述嵌合RSV抗原表位的流感嵌合疫苗FLU-RSV-F/NS1免疫动物后，于初次、二次免疫后2周，抗体效价测定结果。A图为HI方法测定针对流感病毒的抗体效价；B图为NT方法测定针对RSV的抗体效价。

具体实施方式

本发明可通过如下实验例进一步了解，所述实施例选择了几个优选实施方案，仅为了更好展示本发明，而非对发明内容进行限制。

实验例1：嵌合RSV-F抗原表位的流感嵌合疫苗制备

1.获得的RSV的F优势抗原表位序列如序列表SEQIDNO:1所示，经免疫动物实验验证，符合下一步实验要求。

2.构建重组质粒：以流感病毒株PR8的NS1基因片段为插入该表位基因的靶点，利用分子生物学方法构建重组质粒，具体策略如附图1A所示。

具体来说，重组质粒的5′端非编码区之后为PR8病毒株NS1基因的前125氨基酸，中间加入linker（UAAUG），既有终止子作用，又有启动子作用。连接上述获得的RSV-F抗原表位，最后是NEP蛋白和3′端非编码区。

3.设计好的基因序列进行全基因合成，具体全长基因序列如序列表SEQIDNO:2所示。合成序列与pUC57连接。

4.利用分子生物学方法，目的基因序列与双向转录表达载体pHW2000连接，挑选阳性克隆。构建好的重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变。

5.经鉴定正确的重组质粒，与PR8病毒株的其他7个基因片段PB2、PB1、PA、NP、HA、NA和M分别构建的重组质粒，共转染MDCK细胞，37℃，5%CO2，培养48-60h,细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚，35℃培养72h,收获鸡胚尿囊液测定HA血凝效价，获得嵌合RSV-F抗原表位的流感病毒疫苗株。

6.对获得的嵌合RSV-F抗原表位的流感病毒疫苗株进行鉴定：电镜观察病毒形态，符合流感病毒典型形态特征，病毒颗粒大小在80-120nm之间（见附图2A,2B）。

7.鸡胚尿囊液提取病毒RNA,RT-PCR，扩增8个基因片段，与转染用质粒序列完全一致。

8.病毒株经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后，跑SDS-PAGE电泳，抗原的主要成分存在。进而经WB鉴定，有外源目的基因表达（见附图2C）。

9.嵌合疫苗小鼠免疫效果实验：

选用6-8周龄BALB/c小鼠，滴鼻免疫流感多价嵌合疫苗2剂，间隔2周，剂量分别为10⁴TCID₅₀和10⁵TCID₅₀，体积为20μl，以PBS为对照。每组20只动物，分别于初次免疫后、二次免疫后2周，经眼底采血，离心收集血清测定。HI方法测定针对流感病毒的抗体效价，NT方法测定针对RSV的抗体效价，结果见附图3A和3B。可以看出，重组病毒可以产生针对RSV和流感双重抗体效价。

实验例2：嵌合RSV-F/G抗原表位的流感嵌合疫苗制备

1.获得的RSV的F/G优势抗原表位序列见如序列表SEQIDNO:3所示，经免疫动物实验验证，符合下一步实验要求。

2.构建重组质粒：以流感病毒株PR8的NS1基因片段为插入该表位基因的靶点，利用分子生物学方法构建重组质粒，具体策略如图1B所示。

具体来说，重组质粒的3′端非编码区之后为PR8病毒株NS1基因的前125氨基酸，中间加入linker（UAAUG），既有终止子作用，又有启动子作用。连接上述获得的RSV-F/G抗原表位，最后是NEP蛋白和5′端非编码区。

3.设计好的基因序列进行全基因合成，具体全长基因序列如序列表SEQIDNO:4所示。合成序列与pUC57连接。

4.利用分子生物学方法，目的基因序列与双向转录表达载体pHW2000连接，挑选阳性克隆。构建好的重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变。

5.经鉴定正确的重组质粒，与PR8病毒株的其他基因片段PB2、PB1、PA、NP、HA、NA和M分别构建的重组质粒，共转染MDCK细胞，37℃，5%CO2，培养48-60h,细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚，35℃培养72h,收获鸡胚尿囊液获得嵌合RSV-F抗原表位的流感病毒疫苗株。

6.对获得的嵌合RSV-F/G抗原表位的流感病毒疫苗株进行鉴定：电镜观察病毒形态，符合流感病毒典型形态特征。

7.鸡胚尿囊液提取病毒RNA,RT-PCR，扩增8个基因片段，与转染用质粒序列完全一致。

8.病毒株经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后，跑SDS-PAGE电泳，抗原的主要成分存在。进而经WB鉴定，有外源目的蛋白表达。

9.嵌合疫苗小鼠免疫力实验：

选用6-8周龄BALB/c小鼠，滴鼻免疫流感多价嵌合疫苗2剂，间隔2周，剂量20μl，以PBS为对照。每组20只动物，分别于第一剂和第二剂免疫后2周，经眼底采血，离心收集血清测定。

HI方法测定针对流感病毒的抗体效价，NT方法测定针对RSV的抗体效价。

表1流感多价嵌合疫苗免疫原性研究

实验例3：嵌合RSV-F/G抗原表位的流感嵌合疫苗制备

1.获得的RSV的F/G优势抗原表位序列如序列表SEQIDNO:3所示，经免疫动物验证，符合下一步实验要求。

2.构建重组质粒：以流感病毒株PR8的M基因片段为插入该表位基因的靶点，利用分子生物学方法构建重组质粒，具体策略如下：

具体来说，重组质粒的5′端非编码区之后为PR8病毒株M基因的前222核苷酸，中间连接上述获得的RSV-F/G抗原表位，最后是M基因的后222核苷酸和3′端非编码区。

3.设计好的基因序列进行全基因合成，具体全长基因序列如序列表SEQIDNO:5所示。合成序列与pUC57连接。

4.利用分子生物学方法，目的基因序列与双向转录表达载体pHW2000连接，挑选阳性克隆。构建好的重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变。

5.经鉴定正确的重组质粒，与PR8病毒株的其他基因片段PB2、PB1、PA、NP、HA、NA和NS分别构建的重组质粒，共转染MDCK细胞，37℃，5%CO2，培养48-60h,细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚，35℃培养72h,收获鸡胚尿囊液获得嵌合RSV-F/G抗原表位的流感病毒疫苗株。

6.对获得的嵌合RSV-F/G抗原表位的流感病毒疫苗株进行鉴定：电镜观察病毒形态，符合流感病毒典型形态特征。

7.鸡胚尿囊液提取病毒RNA,RT-PCR，扩增8个基因片段，与转染用质粒序列完全一致。

8.病毒株经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后，跑SDS-PAGE电泳，抗原的主要成分存在。进而经WB鉴定，有外源目的蛋白表达。

9.嵌合疫苗小鼠免疫力实验：

选用6-8周龄BALB/c小鼠，滴鼻免疫流感多价嵌合疫苗2剂，间隔2周，剂量20μl，以PBS为对照。每组20只动物，分别于第一剂和第二剂免疫后2周，经眼底采血，离心收集血清测定。

HI方法测定针对流感病毒的抗体效价，NT方法测定针对RSV的抗体效价。

表1流感多价嵌合疫苗免疫原性研究

实验例4：嵌合RSV-F/G抗原表位的流感嵌合疫苗制备

1.获得的RSV的F/G优势抗原表位序列如序列表SEQIDNO:3所示，经免疫动物实验验证，符合下一步实验要求。

2.构建重组质粒：以流感病毒株PR8的NA基因片段为插入该表位基因的靶点，利用分子生物学方法构建重组质粒，具体策略如下：

具体来说，重组质粒的3′端非编码区为19nt，之后为PR8病毒株NA基因的前183核苷酸，中间连接上述获得的RSV-F/G抗原表位，最后是NA基因的后157核苷酸，和5′端非编码区。

3.设计好的基因序列进行全基因合成，具体全长基因序列如序列表SEQIDNO:6所示。合成序列与pUC57连接。

4.利用分子生物学方法，目的基因序列与双向转录表达载体pHW2000连接，挑选阳性克隆。构建好的重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变。

5.经鉴定正确的重组质粒，与PR8病毒株的其他基因片段PB2、PB1、PA、NP、HA、M和NS分别构建的重组质粒，共转染MDCK细胞，37℃，5%CO2，培养48-60h,细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚，35℃培养72h,收获鸡胚尿囊液获得嵌合RSV-F/G抗原表位的流感病毒疫苗株。

6.对获得的嵌合RSV-F/G抗原表位的流感病毒疫苗株进行鉴定：电镜观察病毒形态，符合流感病毒典型形态特征。

7.鸡胚尿囊液提取病毒RNA,RT-PCR，扩增8个基因片段，与转染用质粒序列完全一致。

8.病毒株经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后，跑SDSPAGE电泳，抗原的主要成分存在。进而经WB对外源目的基因进行鉴定。

9.嵌合疫苗小鼠免疫力实验：

选用6-8周龄BALB/c小鼠，滴鼻免疫流感多价嵌合疫苗2剂，间隔2周，剂量20μl，以PBS为对照。每组20只动物，分别于第一剂和第二剂免疫后2周，经眼底采血，离心收集血清测定。

HI方法测定针对流感病毒的抗体效价，NT方法测定针对RSV的抗体效价。

表1流感多价嵌合疫苗免疫原性研究

实验例5：嵌合RSV-F/G抗原表位的流感嵌合疫苗制备

1.获得的RSV的F/G优势抗原表位序列如序列表SEQIDNO:3所示，经免疫动物实验验证，符合下一步实验要求。

2.构建重组质粒：以流感病毒当年流行株H1N1亚型的NA基因片段为插入该表位基因的靶点，利用分子生物学方法构建重组质粒，具体策略如下：

具体来说，重组质粒的3′端非编码区为19nt，之后为流感病毒当年流行株H1N1亚型的NA基因的前183核苷酸，中间连接上述获得的RSV-F/G抗原表位，最后是NA基因的后157核苷酸，和5′端非编码区。

3.设计好的基因序列进行全基因合成，具体全长基因序列如序列表SEQIDNO:7所示。合成序列与pUC57连接。

4.利用分子生物学方法，目的基因序列与双向转录表达载体pAD3000连接，挑选阳性克隆。构建好的重组质粒经测序鉴定，片段大小与预期完全一致，并且无基因突变。

5.经鉴定正确的重组FG/NA质粒，与冷适应、减毒流感病毒株A/AA/6/60的6个内部病毒基因骨架PB2、PB1、PA、NP、M和NS分别构建的重组质粒，及流感病毒当年流行株H1N1亚型的HA基因构建的重组质粒，8个质粒经鉴定正确后，共转染MDCK细胞，37℃，5%CO2，培养48-60h,细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚，33℃培养72h,收获鸡胚尿囊液获得嵌合RSV-F/G抗原表位的流感病毒疫苗株。

6.对获得的嵌合RSV-F/G抗原表位的流感病毒疫苗株进行鉴定：电镜观察病毒形态，符合流感病毒典型形态特征。

7.鸡胚尿囊液提取病毒RNA,RT-PCR，扩增8个基因片段，与转染用质粒序列完全一致。

8.病毒株经鸡胚大量培养，超滤浓缩、蔗糖梯度离心纯化后，跑SDS-PAGE电泳，抗原的主要成分存在。进而经WB对外源目的基因进行鉴定。

9.嵌合RSV抗原表位的重组流感疫苗温度敏感（Temperaturesensitive,ts）、冷适应（Coldadapted,ca）和减毒（Attenuated,att）表型

嵌合RSV抗原表位的重组流感疫苗接种MDCK细胞或9-11日龄鸡胚，分别于25、33、37和39℃条件下培养3天，收集细胞上清或鸡胚尿囊液测定病毒滴度。结果表明：嵌合疫苗具有ts、ca表型。同时，重组流感疫苗株在BALB/c小鼠和雪貂动物上表现减毒表型。

10.嵌合疫苗小鼠免疫力实验：

选用6-8周龄BALB/c小鼠，滴鼻免疫流感多价嵌合疫苗2剂，间隔2周，剂量20μl，以PBS为对照。每组20只动物，分别于第一剂和第二剂免疫后2周，经眼底采血，离心收集血清测定。

HI方法测定针对流感病毒的抗体效价，NT方法测定针对RSV的抗体效价。

表1流感多价嵌合疫苗免疫原性研究

Claims (5)

1.携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗，其中所述RSV基因为F优势抗原表位，所述流感病毒载体是A/PR/8/34，其中所述F优势抗原表位的编码基因序列如SEQIDNO:1所示，其整合至流感病毒NS1基因的前125氨基酸之后，产生如SEQIDNO:2所示编码氨基酸的全长核苷酸序列。

2.携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗，其中所述RSV基因为F/G优势抗原表位，所述流感病毒载体是A/PR/8/34，其中所述F/G优势抗原表位的编码基因序列如SEQIDNO:3所示，其整合至流感病毒NS1基因的前125氨基酸之后，产生如SEQIDNO:4所示编码氨基酸的全长核苷酸序列。

3.携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗，其中所述RSV基因为F/G优势抗原表位，所述流感病毒载体是A/PR/8/34，其中所述F/G优势抗原表位的编码基因序列如SEQIDNO:3所示，其整合至流感病毒M基因的前222核苷酸和后222核苷酸序列之间，产生如SEQIDNO:5所示编码氨基酸的全长核苷酸序列。

4.携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗，其中所述RSV基因为F/G优势抗原表位，所述流感病毒载体是A/PR/8/34，其中所述F/G优势抗原表位的编码基因序列如SEQIDNO:3所示，其整合至流感病毒NA基因的前183个核苷酸之后，产生如SEQIDNO:6所示编码氨基酸的全长核苷酸序列。

5.携带RSV基因的重组流感病毒嵌合疫苗，其中所述RSV基因为F/G优势抗原表位，所述流感病毒载体是冷适应流感病毒株骨架A/AA/6/60，其中所述F/G优势抗原表位的编码基因序列如SEQIDNO:3所示，其整合至流感病毒NA基因的前183个核苷酸之后，产生如SEQIDNO:7所示编码氨基酸的全长核苷酸序列。