CN111481663B - 一种流感病毒活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种流感病毒活疫苗的制备方法，包括如下步骤：1)破坏流感病毒的神经氨酸酶基因片段编码区序列两端原有的包装信号序列，并对神经氨酸酶基因进行同义突变改造；2)将步骤1)改造后的神经氨酸酶基因连接至表达载体，得到重组表达载体；3)将步骤2)所得重组表达载体转染细胞，之后收集转染上清，即得。本发明的重编程流感病毒具备显著减毒表型、良好的免疫原性以及高度稳定的基因组遗传稳定性；本发明的重编程流感疫苗株是一种高度安全、免疫原性好、便于生产的新型流感减毒活疫苗，为人类有效预防、控制流感病毒的感染提供新的策略与手段。

Description

一种流感病毒活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及病毒疫苗技术领域，尤其是一种流感病毒活疫苗及其制备方法。

背景技术

流感病毒的多亚型性和高变异性给该病毒的防治带来极大困难。国内外流感防治实践表明，安全有效的接种流感疫苗是预防流感爆发和控制其流行的有效措施和关键环节。目前，临床上使用的流感疫苗主要有两种，一种是灭活病毒裂解疫苗，另一种是减毒活疫苗。流感灭活疫苗主要是含有甲型H1N1、H3N2和乙型流感病毒株裂解后有效成分的三价灭活疫苗。在我国，每年10月份之前，对于流感的高危人群，都要建议其进接种流感疫苗。虽然流感灭活裂解疫苗是现在最常使用的疫苗，具有较好的安全性和有效性，但灭活疫苗存在着以下缺点：1.流感灭活疫苗只能诱导机体产生较强的体液免疫，其诱导产生的细胞免疫以及局部免疫(呼吸道)的水平均较低；2.其接种途径为肌肉注射，会产生疼痛和潜在的感染风险；3.对不同血清型流感病毒的交叉保护比较弱。

基于病毒灭活疫苗存在的问题，流感减毒活疫苗(live attenuatedinfluenzavaccine,LAIV)的研制越来越为人们所重视。从上世纪60年代至今，俄罗斯联邦国家一直使用LAIV,当前俄罗斯的三价冻干流感减毒活疫苗来源于A型供体株经冷适应、减毒而获得活病毒株，而A型供体株是由推荐的A型季节性疫苗H1N1和H3N2疫苗株经重配得到。疫苗中另含季节性B型流感病毒的类似重组株。温度敏感的疫苗株在温度较低的鼻腔环境复制较好，但在下呼吸道的正常体温下复制较弱。2003年，由MedImmue公司研制生产的三价流感减毒活疫苗—FluMist^TM在美国批准上市，于2011年获欧盟批准上市(Fluenz)。FluMist^TM是采取“6+2”的方式，把亲代减毒株(冷适应病毒株)的六个编码病毒内部蛋白基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)和目前流行病毒株的两个表面抗原基因(编码血凝素HA和神经氨酸酶NA)进行重配，通过反向遗传技术得到的重组病毒即为流感减毒活疫苗的生产用毒株。FluMist TM的亲代供体株caA/AnnArbor/6/60病毒株是由患者体内分离出来的野毒株在逐步低温条件下传代获得的。通过基因定向诱变分析得知，其温度敏感性特征是由PB1、PB2、NP这三个基因片段上的5个突变氨基酸位点协同作用产生^[1]。FluMist经鼻内接种年龄在2～49岁健康个体，无防腐剂的单剂量包装的LAIV储存在2～8℃。有消息表明，我国首个冻干流感减毒活疫苗(长春百克生物科技股份公司)已于2015年9月获得国家食品药品监督管理总局颁发的《药物临床试验批件》，该产品将于不久后上市。与灭活疫苗相比，流感减毒活疫苗具有给药方便(鼻腔给药)、通过模拟病毒自然感染过程诱导机体产生全面免疫(体液免疫、细胞免疫及呼吸道粘膜免疫)应答反应、对异型流感病毒具有一定的交叉保护作用等有优点，这些优点有助于LAIV在将来得到广泛应用。

但是，目前LAIV也存在一些弊端：1.2006年的一份比较研究表明，面对抗原漂移的流行株，灭活苗(IIV)与减毒活疫苗(LAIV)在各类人群中的有效率分别为86％和53％。这个现象让人出乎意料，为什么在免疫机制上更能诱导产生交叉保护力的LAIV在实际应用中的效果反倒不如传统的灭活苗呢？一个可能的推测是：LAIV的内部基因骨架毒株A/Ann/Arbor/6/60提供的交叉保护力不够^[2]。同时，不同年份的LAIV内部基因骨架不更换，也会导致个体免疫后产生的针对内部骨架蛋白的免疫应答反应会削减下一年度的新疫苗再次免疫效果^[3]；2.现有减毒活疫苗株减毒表型仅由5个突变氨基酸决定，在生产和使用过程中存在发生突变与重组而导致毒力反强的危险。3.LAIV的接种人群为2～49岁的健康个体，不适用于小于6个月的婴儿、哮喘患者、GB综合史并18岁以下长期使用阿司匹林者，以及严重的免疫抑制患者。因此，非常有必要寻找新的制备减毒活疫苗的策略，对疫苗株进行全面减毒，提高减毒活疫苗的安全性和有效性。

参考文献：

[1]Jin H,Lu B,Zhou H,Ma C,Zhao J,Yang CF,Kemble G,GreenbergH.Multiple amino acid residues confer temperature sensitivity tohumaninfluenza virus vaccine strains(FluMist)derived from cold-adapted A/AnnArbor/6/60.Virology,2003,306(1):18-24.

[2]Ohmit SE,Victor JC,Rotthoff JR et al.Prevention ofantigenicallydrifted influenza by inactivated and live attenuatedvaccines.2006,N.Engl.J.Med.355(24),2513–2522.

[3]Wang Z,Tobler S,Roayaei J,Eick A.Live attenuated or inactivatedinfluenza vaccines and medical encounters for respiratory illnesses among USmilitarypersonnel.JAMA.2009Mar4；301(9):945-53.

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种制备减毒活疫苗的方法，该方法制备的减毒活疫苗全面减毒，其安全性和有效性更高。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种流感病毒活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)破坏流感病毒的神经氨酸酶基因片段编码区序列两端原有的包装信号序列，并对神经氨酸酶基因进行同义突变改造；

2)将步骤1)改造后的神经氨酸酶基因连接至表达载体，得到重组表达载体；

3)将步骤2)所得重组表达载体转染细胞，之后收集转染上清，即得。

需要说明的是，所述步骤1)中通过破坏神经氨酸酶基因片段编码区序列两端原有的包装信号序列，是为了降低病毒的包装效率，从而达到致弱病毒的目的；而对神经氨酸酶基因进行同义突变改造，可以保证少量包装进入病毒基因组的NA基因的有效表达，使致弱的病毒能够有限自主复制，为减毒疫苗的细胞生产提供支持。

优选地，所述步骤1)中按照哺乳动物密码子使用偏好进行同义突变。

优选地，所述改造后的神经氨酸酶基因保留了野生型神经氨酸酶基因的部分包装信号区域序列；更优选地，所述部分包装信号区域序列为神经氨酸酶基因开放阅读框5’末端20个核苷酸以及3’末端13个核苷酸。

优选地，所述改造后的神经氨酸酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述表达载体为双向表达载体pM，所述步骤3)中采用质粒pM-rNA、pM-PB2、pM-PB1、pM-PA、pM-HA、pM-NP、pM-M和pM-NS进行共转染。更优选地，所述细胞为293H和/或MDCK细胞。

在第二个方面，本发明提供了一种重编码的神经氨酸酶基因，其碱基序列如SEQID NO.1所示。

在第三个方面，本发明提供了一种重组表达载体，其中的野生型神经氨酸酶基因由上述的重编码的神经氨酸酶基因代替。优选地，所述表达载体为双向表达载体pM。

在第四个方面，本发明提供了含有上述重组表达载体的细胞。优选地，所述细胞为293H和/或MDCK细胞；更优选地，所述细胞中还含有质粒pM-PB2、pM-PB1、pM-PA、pM-HA、pM-NP、pM-M和pM-NS。

在第五个方面，本发明提供了一种重组的流感病毒株，其中的神经氨酸酶基因由上述的重编码的神经氨酸酶基因替换。优选地，所述流感病毒株为PR8病毒，其中的神经氨酸酶基因进行了重编码，重编后的神经氨酸酶基因如SEQ ID NO.1所示。

在第六个方面，本发明提供了上述的重编码的神经氨酸酶基因、重组表达载体、细胞或重组的流感病毒株在制备流感病毒活疫苗中的应用。

在第七个方面，本发明提供了一种流感病毒活疫苗，所述疫苗为重编码的流感病毒，重编码的流感病毒中的神经氨酸酶基因由上述重编码的神经氨酸酶基因代替。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明对流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)基因片段全长进行密码子同义突变设计，获得含有NA基因重编程改造的流感病毒；体内外实验证实，本发明制备的重编程流感病毒具备显著减毒表型、良好的免疫原性以及高度稳定的基因组遗传稳定性；本发明的重编程流感疫苗株是一种高度安全、免疫原性好、便于生产的新型流感减毒活疫苗，为人类有效预防、控制流感病毒的感染提供新的策略与手段。

附图说明

图1为rNA基因改造模式示意图；

图2为重编程rNA基因与野生型wtNA基因核苷酸序列比对图；

图3为病毒基因组RNAPAGE凝胶电泳图；

图4为病毒蛋白在感染细胞中的表达检测结果图；

图5为PR8-rNA病毒在MDCK细胞中噬斑形态的照片；

图6为PR8-rNA病毒在MDCK细胞中的复制曲线；

图7为PR8-rNA病毒感染小鼠体重变化曲线；

图8为PR8-rNA免疫小鼠血清中IgG抗体测定结果图；

图9为PR8-rNA免疫小鼠血清中HI抗体测定结果图；

图10为PR8-rNA免疫小鼠肺和鼻胛骨内sIgA抗体测定结果图；

图11为PR8-rNA免疫小鼠脾内IFNγ-secreting CD8+T细胞检测结果图；

图12为PR8-rNA免疫小鼠攻毒后体重变化曲线。

具体实施方式

本发明针对流感病毒NA基因进行了全基因密码子重编程改造，并利用反向遗传操作技术拯救了携带重编程改造NA基因的重组病毒。该病毒能够在MDCK细胞中自主生长复制，且具有明显减毒表型，在小鼠体内只能有限复制。该病毒免疫小鼠，可刺激机体产生全面的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答，能有效保护免疫小鼠免受致死剂量病毒的攻击。由此，本发明提供了一种NA基因重编程的策略，并将其运用到制备流感减毒活疫苗的研究中，提供了一种制备安全、有效流感减毒活疫苗的方法。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度。如无特别说明，本发明中的试剂、材料、试验动物、细胞、质粒和载体等均可从市场上或其它公开渠道获得。

实施例1流感病毒神经氨酸酶基因重编程设计改造

以实验室常规使用的流感病毒株A/Puerto Rico/8/1934(PR8)病毒为模型，对其神经氨酸酶(NA)基因进行全基因密码子同义突变改造。NA基因开放阅读框(ORF)共含有1365个碱基，编码455个氨基酸。本实施例对其中的280个氨基酸密码子同义突变，改变了其ORF编码框内1365个核苷酸中的319个，对NA基因的核苷酸序列进行重编程。保留了wtNA基因ORF 5’末端20nt核苷酸和3’末端13nt核苷酸的包装信号区域，以确保重编程后的rNA基因能够被包装进入病毒基因组(参见图1)。

NA重编程的目标是：1.破坏NA片段编码区序列两端原有的包装信号，降低NA基因的包装效率，从而达到致弱病毒的目的。2.密码子按照哺乳动物密码子使用偏好进行同义突变，保证少量包装进入病毒基因组的NA基因的有效表达，使致弱的病毒能够有限自主复制，为减毒疫苗的细胞生产提供支持。

重编程NA基因(rNA)序列如SEQ ID NO.1所示。rNA基因与wtNA基因核苷酸同源性为76.4％，氨基酸同源性为100％。rNA基因序列与野生型NA基因(wtNA)核苷酸序列比对如图2所示。

重编程rNA基因序列如下所示：

agcgaaagcaggggtttaaaatgaatccaaatcagaaaatcaccaccattggctccatctgcctggtggtgggcctgatctccctgatcctgcaaattggcaacatcatctccatctggatctcccactccatccagaccggctcccagaaccacacaggcatctgcaaccagaacatcatcacctacaagaactccacctgggtgaaggacaccacctctgtgatcctgaccggcaactcctccctgtgccccatccggggctgggccatctactccaaggacaactccatcaggattggctccaagggcgatgtctttgtgatccgggagccattcatctcctgctcccatctggagtgcaggaccttcttcctgacccaaggcgccctgctgaatgacaagcactccaatggcacagtgaaggacaggtccccatacagggccctgatgtcctgccctgtgggcgaggccccatccccatacaactcccgctttgagtctgtggcctggtctgcctctgcctgccatgatggcatgggctggctgaccattggcatctctggccctgacaatggcgctgtggctgtgctgaagtacaatggcatcatcacagagaccatcaagtcctggaggaagaagatcctgaggacccaggagtctgagtgtgcctgtgtgaatggctcctgcttcaccatcatgacagatggcccatctgatggcctggcctcctacaagatcttcaagattgagaagggcaaggtgaccaagtccattgagctgaatgcccccaactcccactatgaggagtgctcctgctaccctgacacaggcaaggtgatgtgtgtctgcagggacaactggcatggctccaacaggccatgggtctcctttgaccagaacctggactaccagattggctacatctgctctggcgtctttggcgacaacccccggcctgaggatggcacaggctcctgtggccctgtctatgtggatggcgccaatggcgtgaagggcttctcctaccgctatggcaatggcgtctggattggcaggaccaagtcccactcctcccggcatggctttgagatgatctgggaccccaatggctggacagagacagactccaagttctctgtgaggcaggatgtggtggccatgacagactggtctggctactctggctcctttgtgcagcatcctgagctgacaggcctggactgcatgaggccatgcttctgggtggagctgatcaggggcaggcccaaggagaagaccatctggacctctgcctcctccatctccttctgtggcgtgaactctgacacagtggactggtcctggcctgatggcgctgagctgccattctccattgacaagtagtctgttcaaaaaactccttgtttctact(SEQ ID NO.1)

实施例2携带rNA基因的重组流感拯救

将实施例1设计好的rNA基因序列提交生物技术公司，通过人工合成获得rNA基因双链DNA。以合成基因为模板，设计引物，通过聚合酶链式反应得到两端含有SapI酶切位点的rNA扩增产物。扩增产物经SapI酶切后，连接双向表达载体pM，得到pM-rNA重组质粒。

将构建好的pM-rNA质粒同PR8病毒其余7个质粒PM-PB2，PM-PB1，PM-PA，PM-HA，PM-NP，PM-M，PM-NS共同转染293H和MDCK共培养的细胞。具体实验步骤参照Lipofectamine2000(Invitrogen)转染试剂说明书。转染后48h，收取转染上清，接种9日龄的鸡胚。接种后，鸡胚于37℃孵箱培养48h后，放置于4℃冰箱过夜，收取鸡胚尿囊液，血凝实验测定血凝活性。收获血凝测定阳性的鸡胚尿囊液，提取总RNA，RT-PCR扩增病毒基因组，测序验证拯救的病毒。鉴定正确的重组流感病毒命名为PR8-rNA。

实施例3PR8-rNA病毒生物学特点分析

1)PR8-rNA病毒基因组内NAvRNA含量鉴定

1.1病毒基因组RNA电泳检测：为了检测NA片段包装效率，进行病毒基因组RNA电泳。使用MagMAX Viral RNAIsolation Kit(Ambion)提取纯化病毒的基因组RNA(vRNA)。基因组RNA提取后，使用浓度为3.5％的聚丙烯酰胺(PAGE)胶进行RNA电泳，80V，5小时。电泳完成后，SYBR Green II RNA Gel Stain(Invitrogen)染色，拍照。相比野生型PR8病毒(wtPR8)，重组病毒PR8-rNA基因组内NAvRNA条带浓度明显减弱(参见图3)。

1.2荧光定量PRC(Q-PCR)测定NA片段的包装效率：

以NP基因为内参，对病毒基因组内NA基因含量进行相对定量分析。病毒基因组作为模板，使用SYBR green reactionmixture(Takara)进行PCR。

PCR引物对为：

NP[5’-TGTATGGACCTGCCGTAGC-3’(SEQ ID NO.2)和

5’-CCCTCTTGGGAGCACCTT-3’(SEQ ID NO.3)]；

rNA[5’-CCCAGGAGTCTGAGTGTGC-3’(SEQ ID NO.4)和

5’-ACCTTGCCCTTCTCAATCTTG-3’(SEQ ID NO.5)]；

wtNA[5’-CAAATGGGACTGTTAAGGACAG-3’(SEQ ID NO.6)和5’-TGACCAAGCAACCGATTCAA-3’(SEQ ID NO.7)]；

HA[5’-GCATCATCACCTCAAACGCATCA-3’(SEQ ID NO.8)和5’-TCAATTTGGCACTCCTGACGTAT-3’(SEQ ID NO.9)]。

PCR所使用的条件为95℃for 1min，45cycles of95℃for 5s，60℃for30s，and 70℃for 10s。用2^-△△CT方法对病毒基因组内NA和HA基因的相对含量进行分析，结果表明携带重编程NA基因的重组病毒PR8-rNA病毒基因组中，NA基因的含量仅为0.2％，HA基因的包装量未受影响(表1)。

表1 PR8-rNA病毒NA、HA片段的包装效率

2)PR8-rNA病毒感染细胞后NA蛋白表达含量测定

Western-blot检测PR8-rNA病毒中NA蛋白表达量：将wtPR8和PR8-rNA病毒分别感染MDCK细胞(moi＝2)，感染后12小时收取细胞，RIPA裂解，细胞裂解物用作western-blot检测。Western检测中使用到的一抗有：小鼠抗NA，鼠抗HA，鼠抗NP，鼠抗M以及兔抗actin的抗体。Western-blot检测结果(参见图4)表明，PR8-rNA病毒中NA蛋白在感染细胞中的表达量显著低于wtPR8病毒，但HA、NP和M蛋白的表达量与wtPR8相近。

3)PR8-rNA病毒在MDCK细胞的生长复制特性

3.1PR8-rNA病毒在MDCK细胞中的噬斑形态：将PR8-rNA和wtPR8病毒分别感染6孔板中的单层MDCK细胞。病毒吸附细胞后，吸弃病毒感染液，PBS洗细胞2次后，细胞上层铺琼脂糖凝胶(0.8％琼脂糖，0.3％BSA，1ug/ml TPCK-trypsin)，37度培养72小时。除去细胞培养板中的上层凝胶，用4％多聚甲醛固定细胞后，加入小鼠抗流感NP蛋白抗体(anti-NP)孵育。一抗孵育后，加入山羊抗小鼠二抗。最后用AEC显色试剂盒显色，观察病毒噬斑形态。PR8-rNA病毒在细胞中能够自主复制，形成噬斑。相比wtPR8病毒的噬斑，PR8-rNA病毒在MDCK细胞中生成的噬斑形态明显减小(参见图5)，该结果提示PR8-rNA病毒在MDCK细胞中的复制能力降低。

3.2PR8-rNA病毒在MDCK细胞中生长曲线的测定：

将PR8-rNA和wtPR8病毒分别感染MDCK细胞(moi＝0.001),于感染后0～72h每隔12h收取培养上清。待全部样品收集后，统一用空斑实验测定病毒含量，绘制生长曲线。如图6所示，PR8-rNA病毒在MDCK细胞中能够自主复制，在感染后60h可达到复制最高点，此时病毒滴度约为10000pfu/ml。PR8-rNA病毒在MDCK细胞中复制水平低于wtPR8病毒。

综上，本实施例成功拯救了携带重编程NA基因的重组流感病毒PR8-rNA。PR8-rNA病毒基因组内NA基因含量仅为野生型PR8病毒(wtPR8)NA含量的0.2％，而HA基因在基因组内的含量没有降低。PR8-rNA感染MDCK细胞后，NA蛋白表达量显著低于wtPR8病毒NA蛋白表达量，但HA、NP和M蛋白表达量与wtPR8病毒蛋白表达量相近。PR8-rNA病毒能够在没有外源辅助条件帮助下，自主在MDCK细胞中生长复制，病毒滴度可达10000pfu/ml。相比wtPR8病毒，PR8-rNA病毒在MDCK细胞上具有减毒表型。

实施例4PR8-rNA病毒体内毒力检测

为了进一步检测PR8-rNA病毒在体内的减毒表型，我们利用小鼠感染模型，评估了PR8-rNA流感病毒在小鼠体内的复制能力和致病力。6～8周龄雌性BALB/c小鼠(每组9只)鼻腔接种不同剂量的PR8-rNA和wtPR8病毒，对照组滴加PBS。在感染后第3天和第6天，每组各处死3只小鼠，测定鼻胛骨和肺脏中的病毒滴度。连续14天观察小鼠体重变化以及生存率的情况，绘制小鼠体重变化及生存曲线。

10³pfu的wtPR8病毒感染小鼠后第2～3天，小鼠呈现典型的发病状态(精神沉郁、被毛蓬乱、蜷缩、发抖)，体重迅速降低，全部小鼠在感染后第5天死亡。而感染10³pfu和10⁴pfu的PR8-rNA病毒的小鼠没有明显的临床症状，观察期内小鼠体重持续增长；感染10⁵pfu的PR8-rNA病毒的小鼠，体重仅有轻微的降低(参见图7)。

小鼠肺脏病毒滴定结果(参见表2)显示，感染后第3天，10³pfu的wtPR8感染组小鼠肺脏病毒滴度高达7.65log₁₀pfu/g,而感染103pfu剂量的PR8-rNA病毒，小鼠肺脏内检测不到病毒滴度；感染10⁴pfu和10⁵pfu的PR8-rNA病毒的小鼠肺脏滴度比感染10³pfu wtPR8病毒组第1000～10000倍。在感染后第6天，wtPR8病毒感染小鼠全部死亡，而PR8-rNA感染小鼠肺内检测不到病毒。小鼠鼻胛骨病毒滴定结果显示，感染后第3天，10³pfu的wtPR8感染组小鼠肺脏病毒滴度达4.64log₁₀ pfu/g,而感染PR8-rNA病毒的所有小鼠在鼻胛骨内未检测到病毒。

表2 PR8-rNA病毒在小鼠肺脏以及鼻胛骨中的复制滴度

ND表示未检出。

上述结果表明，携带重编程NA基因的PR8-rNA病毒在小鼠体内具有显著的减毒表型，只能在小鼠体内有限复制，易被机体清除。

实施例5 PR8-rNA诱导机体产生免疫反应检测

为了检测PR8-rNA病毒诱导机体产生免疫反应的能力，本实施例用不同剂量(10,100,1000pfu)的PR8-rNA病毒经滴鼻免疫Balb/c小鼠。分别在免疫后1,2,3个月采取免疫小鼠血液，分离血清。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定病毒特异性IgG抗体滴度，血凝抑制试验(HI)测定血清中HI抗体效价。

检测结果显示，在免疫后1个月，10pfu的PR8-rNA即可诱导机体产生有效的病毒特异性IgG抗体，随剂量增加，100和1000pfu免疫组小鼠IgG滴度呈剂量依赖性增加。在持续观察的3个月内，免疫组小鼠体内病毒特异性IgG滴度水平可稳定保持，没有下降(参见图8)。HI检测显示，不同剂量免疫组可诱导小鼠产生HI抗体，不同组别的HI效价有剂量依赖效应，且HI抗体水平也可稳定维持3个月(参见图9)。

为测定PR8-rNA病毒诱导的粘膜免疫效果，在免疫后1个月，采取小鼠肺脏和鼻腔灌洗液，ELISA测定分泌型IgA(sIgA)抗体滴度。实验结果显示，100pfu的PR8-rNA可在肺内诱导产生低水平的sIgA,1000pfu的PR8-rNA在小鼠肺内和鼻腔均可诱导产生高水平的sIgA(参见图10)。

为检测PR8-rNA诱导机体产生的细胞免疫应答，在滴鼻免疫后10天，用酶联免疫斑点实验(ELISpot)测定免疫小鼠肺内IFNr-secreting T细胞水平。实验结果表明，所有免疫小鼠均可诱导机体产生有效的CD8⁺T-cell免疫反应，且与免疫剂量呈正相关(参见图11)。

综上所述，PR8-rNA病毒免疫不仅能够诱导机体产生高水平的体液免疫应答，而且还能产生有效的粘膜免疫和细胞免疫应答，是一个能够诱导机体产生全面免疫应答反应的免疫原。

实施例6PR8-rNA免疫保护效果评估

为了评估PR8-rNA病毒免疫的抗病毒保护效果，于免疫后3个月，对免疫小鼠进行致死剂量(10MLD₅₀)wtPR8攻毒保护实验。通过观察攻毒后小鼠疾病指正、体重变化、肺内病毒滴度来检测PR8-rNA免疫的保护效果。低剂量(10pfu)PR8-rNA免疫组小鼠在感染后第3～4天出现的精神沉郁、被毛蓬乱、体重下降的疾病表现，体重在感染后第5天降低约17％。随之疾病症状消失，体重也逐渐恢复。中剂量(100pfu)和高剂量(1000pfu)PR8-rNA免疫组小鼠则没有任何发病表现，体重基本没有降低。攻毒后所有免疫小鼠均存活，而对照组小鼠则在感染后第6天全部死亡(参见图12)

表3免疫小鼠攻毒后组织内病毒滴度

ND表示未检出(检出限,10PFU/ml/肺)。

感染后第3天，取免疫组和对照组小鼠肺脏和鼻胛骨，研磨，滴定病毒滴度。中剂量(100pfu)和高剂量(1000pfu)PR8-rNA免疫组小鼠均为检测到病毒复制，低剂量(10pfu)PR8-rNA免疫组小鼠肺内病毒滴度比对照组低1000倍，鼻胛骨内病毒滴度比对照组低10000倍(参见表3)。

综上所述，本发明的PR8-rNA病毒免疫对致死剂量病毒感染提供有效的保护效果。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<120> 一种流感病毒活疫苗及其制备方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcgaaagca ggggtttaaa atgaatccaa atcagaaaat caccaccatt ggctccatct 60

gcctggtggt gggcctgatc tccctgatcc tgcaaattgg caacatcatc tccatctgga 120

tctcccactc catccagacc ggctcccaga accacacagg catctgcaac cagaacatca 180

tcacctacaa gaactccacc tgggtgaagg acaccacctc tgtgatcctg accggcaact 240

cctccctgtg ccccatccgg ggctgggcca tctactccaa ggacaactcc atcaggattg 300

gctccaaggg cgatgtcttt gtgatccggg agccattcat ctcctgctcc catctggagt 360

gcaggacctt cttcctgacc caaggcgccc tgctgaatga caagcactcc aatggcacag 420

tgaaggacag gtccccatac agggccctga tgtcctgccc tgtgggcgag gccccatccc 480

catacaactc ccgctttgag tctgtggcct ggtctgcctc tgcctgccat gatggcatgg 540

gctggctgac cattggcatc tctggccctg acaatggcgc tgtggctgtg ctgaagtaca 600

atggcatcat cacagagacc atcaagtcct ggaggaagaa gatcctgagg acccaggagt 660

ctgagtgtgc ctgtgtgaat ggctcctgct tcaccatcat gacagatggc ccatctgatg 720

gcctggcctc ctacaagatc ttcaagattg agaagggcaa ggtgaccaag tccattgagc 780

tgaatgcccc caactcccac tatgaggagt gctcctgcta ccctgacaca ggcaaggtga 840

tgtgtgtctg cagggacaac tggcatggct ccaacaggcc atgggtctcc tttgaccaga 900

acctggacta ccagattggc tacatctgct ctggcgtctt tggcgacaac ccccggcctg 960

aggatggcac aggctcctgt ggccctgtct atgtggatgg cgccaatggc gtgaagggct 1020

tctcctaccg ctatggcaat ggcgtctgga ttggcaggac caagtcccac tcctcccggc 1080

atggctttga gatgatctgg gaccccaatg gctggacaga gacagactcc aagttctctg 1140

tgaggcagga tgtggtggcc atgacagact ggtctggcta ctctggctcc tttgtgcagc 1200

atcctgagct gacaggcctg gactgcatga ggccatgctt ctgggtggag ctgatcaggg 1260

gcaggcccaa ggagaagacc atctggacct ctgcctcctc catctccttc tgtggcgtga 1320

actctgacac agtggactgg tcctggcctg atggcgctga gctgccattc tccattgaca 1380

agtagtctgt tcaaaaaact ccttgtttct act 1413

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtatggacc tgccgtagc 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccctcttggg agcacctt 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaggagtc tgagtgtgc 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

accttgccct tctcaatctt g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaatgggac tgttaaggac ag 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaccaagca accgattcaa 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcatcatcac ctcaaacgca tca 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaatttggc actcctgacg tat 23

Claims (1)

1.一种流感病毒活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)破坏流感病毒的神经氨酸酶基因片段编码区序列两端原有的包装信号序列，并根据哺乳动物密码子使用偏好，对神经氨酸酶基因进行同义突变改造；

2)将步骤1)改造后的神经氨酸酶基因连接至表达载体，得到重组表达载体；

3)将步骤2)所得重组表达载体转染细胞，之后收集转染上清，即得；

所述改造后的神经氨酸酶基因保留了野生型神经氨酸酶基因的部分包装信号区域序列，所述部分包装信号区域序列为神经氨酸酶基因开放阅读框5’末端20个核苷酸以及3’末端13个核苷酸；

所述表达载体为双向表达载体pM，所述步骤3)中采用质粒pM-rNA、pM-PB2、pM-PB1、pM-PA、pM-HA、pM-NP、pM-M和pM-NS共转染；所述改造后的神经氨酸酶基因的碱基序列如SEQ IDNO.1所示。

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