JP2022536120A - インフルエンザウイルスバックボーン - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｖｅｒｏ細胞中において増殖の亢進を示すインフルエンザウイルスを提供する。該インフルエンザウイルスには、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントが含まれる。場合により、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１は、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む。本発明はまた、該インフルエンザウイルスを含有する医薬製剤、及び該インフルエンザウイルスを哺乳動物に投与することにより哺乳動物において免疫応答を誘発する方法、並びにインフルエンザウイルスを作製するための方法を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１９年６月７日に出願された米国仮特許出願第６２／８５８，７３７号（参照によりその全体が本明細書に組込まれる）の利益を主張する。

電子的に提出された物件の参照による組込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に組込まれる：２０２０年６月２日作成の「７４９４８８ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前の７３，６００バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。

発明の背景
インフルエンザ、即ち「インフル（ｆｌｕ）」は、毎年世界中で数十万人の人間の命を奪う、伝染性が強いウイルス感染症である。インフルエンザウイルスには、コアタンパク質に基づいて分類された４の型（即ち、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）があるが、季節性の流行は、流行しているＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスによって引き起こされることがほとんどである。

ワクチンはインフルエンザを予防するための最良の方法であるが、インフルエンザウイルスは抗原連続変異及び抗原不連続変異にさらされるため、インフルエンザワクチンは頻繁に再処方されなければならない。更に、インフルエンザウイルス、特にＡ型インフルエンザは一般に高い変異率及び進化率を示すため、インフルエンザワクチン株が流行株と一致せず、ワクチンの有効性が僅かになる場合がある。しかし、流行しているインフルエンザウイルスがインフルエンザワクチンと十分に一致する場合、ワクチン接種により、インフルエンザ関連の病気のリスクを全人口の４０％～６０％低減できる。従って、研究者らは、種々のインフルエンザの亜型間で交差防御免疫を誘導できるワクチンを研究してきた。かかる例の１つは、機能的なＭ２タンパク質を発現しない弱毒化生インフルエンザウイルスを含むワクチン（例、Ｍ２ＳＲワクチン）である。

インフルエンザワクチンは、哺乳動物細胞培養が卵ベースの産生よりも有利であるため、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞及びアフリカミドリザル（Ｖｅｒｏ）細胞中において増殖させることが好ましい。これらの利点としては、コストの削減、生産時間の短縮、及びウイルスにおける抗原変異のリスクの低減等が挙げられる。例えば、Ｍ２ＳＲワクチンは、Ｍ２タンパク質を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞中において増殖させられる。しかし、細胞培養におけるワクチン生産は、多くの場合、望ましくない収量をもたらしている。更に、ＭＤＣＫ細胞は一般にＶｅｒｏ細胞よりも許容状態であるため、Ｖｅｒｏ細胞中におけるワクチン生産は比較的非効率的である。

ウイルスバックボーン、即ち、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、及びＮＳからなる６の内部遺伝子セグメントへの改変により、ワクチン産生が促進されることが示されている。例えば、Ｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，６：８１４８（２０１５）において開発及び記載された高収量ワクチンバックボーン「ＰＲ８－ＨＹ」は、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ１タンパク質中に特定のアミノ酸変異を含み、細胞培養システム及び卵培養システムの両方において、汎発性及び季節性インフルエンザワクチンの力価を改善することが期待された。しかし、当該技術分野で記載されているこれらの改変は、特に好ましい製造条件下で、Ｖｅｒｏ細胞中におけるウイルス増殖を増大させるのに効果的ではなかった。従って、Ｍ２ＳＲワクチンのようなワクチンがより効率的且つ効果的に生産され得るように、Ｖｅｒｏ細胞中におけるウイルス増殖を亢進させる必要がある。

発明の要旨
本発明は、Ｖｅｒｏ細胞中における増殖が亢進したインフルエンザウイルスを提供する。該インフルエンザウイルスは、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、タンパク質、例、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ１タンパク質、をコードする遺伝子セグメントを含む。例えば、ＰＢ１タンパク質は、４０位のロイシン及び１８０位のトリプトファンを含み、４６４位のアスパラギン又は６０７位のセリンのうちの少なくとも１を含む。ＰＢ２タンパク質は、５０４位のバリンを含み、場合により、４６７位のイソロイシン及び５２９位のバリンを含む。ＰＡタンパク質は、４０１位のリシンを含む。ＮＰタンパク質は、１１６位のロイシンを含み、２９４位のリシン又は３１１位のアルギニンのうちの少なくとも１を含む。ＮＳ１タンパク質は、３０位のプロリン及び１１８位のリシンを含む。更に、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１は、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む。

本発明は、該インフルエンザウイルスを含む医薬製剤、該インフルエンザウイルスを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法、及びインフルエンザウイルスを作製する方法も提供する。

図面の簡単な説明
図１Ａは、Ｖｅｒｏ適応ＨＡタンパク質を含み、ＵＷ－ＰＲ８（「ＨＧ」）及びＰＲ８－ＨＹ（「ＨＹ」）バックボーンを含むＡ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／１５／２０１３ Ｍ２ＳＲウイルス（即ち、Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖウイルス）についての、Ｖｅｒｏ細胞に中における増殖曲線を示す、ウイルス力価（ｌｏｇ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図１Ｂは、ＨＧ及びＨＹバックボーンを含むＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７ Ｍ２ＳＲウイルス（即ち、Ｂｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ）についての、Ｖｅｒｏ細胞中における増殖曲線を示す、ウイルス力価（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図１Ｃは、Ｂｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ－ＨＧ及びＢｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ－ＨＹウイルスについての、Ｖｅｒｏ細胞中におけるＨＡ力価（ＨＡ／５０μｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図２は、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７ウイルスの増殖曲線と比較した、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７ウイルスについての、Ｖｅｒｏ細胞中における増殖曲線を示す、ウイルス力価（ｌｏｇ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図３は、ＨＧ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖウイルス。の増殖曲線と比較した、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖウイルスについての、Ｖｅｒｏ細胞中における増殖曲線を示す、ウイルス力価（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図４Ａは、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０及びＨＧ－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０ウイルスについての増殖曲線と比較した、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０ウイルスについての、Ｖｅｒｏ細胞中における増殖曲線を示す、ウイルス力価（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図４Ｂは、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０及びＨＧ－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０ウイルスと比較した、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０ウイルスについての、Ｖｅｒｏ細胞中におけるＨＡ力価（ＨＡ／５０μｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図５Ａは、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＩ４５、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＩ４５、及びＨＧ－Ｍ２ＳＲ－ＭＩ４５ウイルスについての増殖曲線と比較した、ベロ適応ＨＡタンパク質及びＦＧＨＹ１バックボーンを含むＡ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５ Ｍ２ＳＲウイルス（即ち、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＩ４５Ｖウイルス）についての、Ｖｅｒｏ細胞中における増殖曲線を示す、ウイルス力価（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図５Ｂは、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＨＫ４８０１及びＨＧ－Ｍ２ＳＲ－ＨＫ４８０１ウイルスについての増殖曲線と比較した、ＦＧＨＹ１バックボーンを含むＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４ Ｍ２ＳＲウイルス（即ち、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＨＫ４８０１ウイルス）についての、Ｖｅｒｏ細胞中における増殖曲線を示す、ウイルス力価（ｌｏｇ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図５Ｃは、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ａｖＶＮ１２０３及びＨＧ－Ｍ２ＳＲ－ａｖＶＮ１２０３ウイルスについての増殖曲線と比較した、ＦＧＨＹ１バックボーンを含むＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ Ｍ２ＳＲウイルス（即ち、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ａｖＶＮ１２０３ウイルス）についての、Ｖｅｒｏ細胞中における増殖曲線を示す、ウイルス力価（ｌｏｇ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図６は、Ｍ２ＣＫ細胞及びＭ２ＶｅｒｏＡ細胞中におけるＨＧ（即ち、ＵＷ－ＰＲ８）、ＨＹ（即ち、ＰＲ８－ＨＹ）、及びＦＧＨＹ１バックボーンを含む季節性及び汎発性インフルエンザ亜型Ｍ２ＳＲウイルスのウイルス力価（ｌｏｇ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）を示すグラフである。 図７Ａは、Ｖｅｒｏ適応Ｈ１Ｎ１ウイルスにおけるＨＡ変異を示す表である。 図７Ｂは、Ｖｅｒｏ適応Ｈ３Ｎ２ウイルスにおけるＨＡ変異を示す表である。 図７Ｃは、種々のＶｅｒｏ適応ＨＡ変異を含むＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６ Ｍ２ＳＲウイルス（即ち、Ｍ２ＳＲ Ｓｉｎｇ２０１６ウイルス）についての増殖曲線を示す、ウイルス力価（ｌｏｇ_１０ Ｍ２ＣＫ ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）－時間（感染後日数）のグラフである。 図８Ａは、種々のバックボーン（即ち、ＦＧＨＹ１、ＵＷ－ＰＲ８（「ＨＧ」）、及びＩＶＲ－１４７）を有し、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（即ち、Ｂｒｉｓ１０ウイルス）由来のＨＡ及びＮＡを含むウイルスについての、感染後１日目及び２日目の、ヒト細胞株（即ち、Ａ５４９、ＭＲＣ－５及びＣＡＬＵ）中における、ＮＰ抗原産生（即ち、ＮＰ発現レベル）を示す。 図８Ｂは、種々のバックボーン（即ち、ＦＧＨＹ１、ＵＷ－ＰＲ８（「ＨＧ」））を有し、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（即ち、Ｓｉｎｇ２０１６ウイルス）由来のＨＡ及びＮＡを含むウイルスについての、感染後１日目及び２日目の、ヒト細胞株（即ち、Ａ５４９、ＭＲＣ－５及びＣＡＬＵ）中における、ＮＰ抗原産生（即ち、ＮＰ発現レベル）を示す。 図９Ａは、感染後１日目に種々のバックボーン（即ち、ＦＧＨＹ１、ＵＷ－ＰＲ８（「ＨＧ」）、及びＩＶＲ－１４７）を有するＢｒｉｓ１０ウイルスに感染させた後の、種々の細胞株中における、ＮＰ発現レベルが低い細胞に対する、ＮＰ発現レベルが高い細胞の比率を示す。 図９Ｂは、感染後１日目に種々のバックボーン（即ち、ＦＧＨＹ１、ＵＷ－ＰＲ８（「ＨＧ」））を有するＳｉｎｇ１０ウイルスに感染させた後の、種々の細胞株中における、ＮＰ発現レベルが低い細胞に対する、ＮＰ発現レベルが高い細胞の比率を示す。 図１０は、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ変異体の接種後のマウスの体重変化率－時間（接種後日数）を示すグラフである。群の平均の％体重と該平均の標準誤差を示す。 図１１は、試験１４、３０、及び４９日目において１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０ Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、１×１０^９ Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したフェレットの血清中における抗Ｈ３ ＨＡ ＥＬＩＳＡ ＩｇＧ力価を示すグラフである。 図１２は、研究１４、３０、及び４９日目において１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０ Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、１×１０^９ Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したフェレットの血清中における抗Ｈ３ ＨＡＩ力価を示すグラフである。 図１３は、研究１４、３０、及び４９日目において１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、１×１０^９ Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したフェレットの血清中における抗Ｈ３ ＰＲＮＴ_５０力価を示すグラフである。 図１４Ａは、一価Ｈ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、一価Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、二価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、三価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ＋ＢＭ２ＳＲ－Ｖｉｃ、三価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ＋ＢＭ２ＳＲ－Ｙａｍ、四価、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したマウス由来の血清中における抗Ｈ１ ＨＡ力価－時間（免疫後日数）を示すグラフである。 図１４Ｂは、一価Ｈ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、一価Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、二価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、三価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ＋ＢＭ２ＳＲ－Ｖｉｃ、三価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ＋ＢＭ２ＳＲ－Ｙａｍ、四価、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したマウス由来の血清中における抗Ｈ３ ＨＡ力価－時間（免疫後日数）を示すグラフである。 図１５は、一価Ｈ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、一価Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、又はＳＰＧ（コントロール）－時間（チャレンジ後の日数）で免疫したマウスの、インフルエンザ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス接種後のマウスの体重変化率－時間（接種後日数）を示すグラフである。 図１６は、一価Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、ＦｌｕＭｉｓｔ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫後の、マウスの体重変化率－時間（ワクチン接種後の日数）を示すグラフである。 図１７Ａは、一価Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、ＦｌｕＭｉｓｔ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したマウスの血清における抗インフルエンザ Ａ／Ｈ１ ＨＡ血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価－時間（ワクチン接種後の日数）を示すグラフである。 図１７Ｂは、一価Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、ＦｌｕＭｉｓｔ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したマウスの血清における抗インフルエンザ Ａ／Ｈ３ ＨＡ血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価－時間（ワクチン接種後の日数）を示すグラフである。 図１７Ｃは、一価Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、ＦｌｕＭｉｓｔ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したマウスの血清における抗インフルエンザ Ｂ／Ｙａｍ ＨＡ血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価－時間（ワクチン接種後の日数）を示すグラフである。 図１７Ｄは、一価Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、ＦｌｕＭｉｓｔ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したマウスの血清における抗インフルエンザ Ｂ／ＶｉｃＨＡ血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価－時間（ワクチン接種後の日数）を示すグラフである。 図１８Ａは、一価Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、ＦｌｕＭｉｓｔ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したマウスの気管－肺洗浄液中のＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価－ＨＡ１試験抗原（Ａ／Ｈ１、Ａ／Ｈ３、Ｂ／Ｙａｍ、又はＢ／Ｖｉｃ）を示すグラフである。 図１８Ｂは、一価Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、ＦｌｕＭｉｓｔ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したマウスの気管－肺洗浄液中の抗インフルエンザＨＡ１ ＩｇＡ ＥＬＩＳＡ力価－ＨＡ１試験抗原（ＭＩ４５、ＳｉｎｇＥｇｇ、Ｐｈｕｋｅｔ又はＣＯ／０６）を示すグラフである。 図１９は、Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、ＦｌｕＭｉｓｔ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ、又はＳＰＧ（コントロール）で免疫したマウスの、インフルエンザ Ａ／Ｈ１Ｎ１接種後のマウスの体重変化率－時間（接種後日数）を示すグラフである。

発明の詳細な説明
本発明のインフルエンザウイルスは、任意の種類のインフルエンザウイルスであり得る。例えば、インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザの任意の亜型であり得る。いくつかの実施形態においては、インフルエンザウイルスは、汎発性Ａ型インフルエンザウイルス（例、Ｈ５Ｎ１）であり得る。他の実施形態においては、インフルエンザウイルスは、季節性Ａ型インフルエンザウイルス（例、Ｈ１Ｎ１又はＨ３Ｎ２）であり得る。いくつかの実施形態においては、インフルエンザウイルスは、組換えインフルエンザウイルスであり得る。本明細書で用いられる場合、組換えインフルエンザウイルス（例、再集合体インフルエンザウイルス）は、遺伝的に異なるインフルエンザウイルス（例、異種遺伝子セグメント）に由来する遺伝物質（例、遺伝子セグメント）を含むインフルエンザウイルスである。インフルエンザウイルスは、単離されたインフルエンザウイルスである場合もある。

本明細書で用いられる場合、用語「遺伝子セグメント」は、ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。遺伝子セグメントは、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）をコードするｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）配列、即ち、ウイルスタンパク質をコードする配列番号１～５、１１、１４、１６、１８によって表され得る。

本明細書で用いられる場合、用語「バックボーン」は、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ１及び／又はＮＳ２、並びにＭタンパク質をコードするインフルエンザ遺伝子セグメントを指す。本発明の遺伝子セグメントは、選択されたアミノ酸を有するタンパク質をコードする。

本明細書で用いられる場合、用語「選択されたアミノ酸」は、アミノ酸配列の特定の位置における特定のアミノ酸を指す。いくつかの実施形態においては、選択されたアミノ酸は、親アミノ酸配列への遺伝子変異の結果である。親アミノ酸配列は、選択されたアミノ酸に対応する位置を除いて、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列と同一であり得る。
インフルエンザウイルス
（Ａ）バックボーンタンパク質

本発明のＰＢ１（ポリメラーゼ塩基性タンパク質１）遺伝子セグメントは、少なくとも１の選択されたアミノ酸を含むタンパク質（即ち、ＰＢ１タンパク質）をコードし得る。好ましい実施形態においては、選択されたアミノ酸は、４０位のロイシン及び１８０位のトリプトファンを含む。ＰＢ１タンパク質の選択されたアミノ酸は、４６４位のアスパラギン又は６０７位のセリンのうちの少なくとも１を更に含む。ＰＢ１遺伝子セグメントは、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含み得る。

選択されたアミノ酸は、親ＰＢ１配列、例、選択されたアミノ酸に対応する位置を除いて、本発明のＰＢ１アミノ酸配列と同一の配列、への遺伝子変異によって獲得され得る。ＰＢ１タンパク質４６４位のアミノ酸は、インフルエンザＰＢ１タンパク質のパーム領域（ｐａｌｍ ｒｅｇｉｏｎ）に位置し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性ドメインを接続する。一般に、４６４位のアスパラギン酸は、卵及びＭＤＣＫ細胞において単離されたインフルエンザウイルス間で高度に保存されている。このアミノ酸の役割は特定されていないが、この位置で観察されたアスパラギン（Ｎ）へのアミノ酸の変化は、ＰＢ１タンパク質のコンフォメーションに影響を及ぼし得、宿主細胞因子との相互作用、従ってＶｅｒｏ細胞中におけるポリメラーゼ活性に影響を及ぼし得る。更に、ＰＢ１タンパク質の４６５位のヒスチジンは、ＰＡタンパク質の２４３位のグルタミン酸と相互作用するので、ＰＢ１の４６４位のアミノ酸変化は、ＰＢ１とＰＡとの間の相互作用を変質させ得る。ＰＢ１タンパク質の６０７位のアミノ酸の機能も不明である。しかし、このアミノ酸はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ領域とＰＢ２結合領域の間に位置しており、このことにより、ＰＢ１とＰＢ２の間の相互作用が変質し、従ってＶｅｒｏ細胞中におけるポリメラーゼ活性に影響を与え得ることが示唆される。

本発明のＰＢ２（ポリメラーゼ塩基性タンパク質２）遺伝子セグメントは、少なくとも１の選択されたアミノ酸を含むタンパク質（即ち、ＰＢ２タンパク質）をコードする場合もある。好ましい実施形態においては、選択されたアミノ酸は、５０４位のバリン、場合により４６７位のイソロイシン、及び５２９位のバリンを含む。ＰＢ２遺伝子セグメントは、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含み得る。ＰＢ２タンパク質の４６７位と５２９位のアミノ酸はＰＢ２－Ｃ部分にある。具体的には、４６７位（ｐｏｔｉｏｎ）のアミノ酸はＰＢ２タンパク質のキャップ結合領域に位置し、５２９位のアミノ酸はキャップ－６２７リンカードメインに位置する。一部のインフルエンザウイルスにおいては、ＰＢ２タンパク質が宿主のキャップされたＲＮＡのキャップ構造に結合し、インフルエンザのｍＲＮＡを作成するために宿主のＲＮＡからのキャップを利用する。この過程は「キャップスナッチング」として知られている。更に、ＰＢ２の６２７位のアミノ酸は、宿主範囲及びウイルスの病原性における重要な決定因子であることが知られている。従って、キャップ結合領域に近接するアミノ酸の変化は、ウイルスのｍＲＮＡ合成の効率に影響を与える可能性がある。

本発明のＰＡ（ポリメラーゼ酸性タンパク質）遺伝子セグメントは、少なくとも１の選択されたアミノ酸を含むタンパク質（即ち、ＰＡタンパク質）をコードする場合もある。好ましい実施形態においては、選択されたアミノ酸は、４０１位のリシンを含む。ＰＡ遺伝子セグメントは、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含み得る。

本発明のＮＰ（核タンパク質）遺伝子セグメントは、少なくとも１の選択されたアミノ酸を含むタンパク質（即ち、ＮＰタンパク質）をコードする場合もある。好ましい実施形態においては、選択されたアミノ酸は、１１６位のロイシン及び２９４位のリシン又は３１１位のアルギニンのうちの少なくとも１を含む。ＮＰタンパク質のアミノ酸位置２９４及び３１１は、ＮＰタンパク質の本体に位置し、それらは核局在化シグナルとしても核外搬出シグナルとしても機能しない。

本発明のＮＳ（非構造）遺伝子セグメントは、少なくとも１の選択されたアミノ酸を含むタンパク質（即ち、ＮＳ１及び／又はＮＳ２タンパク質）をコードする場合もある。好ましい実施形態においては、選択されたアミノ酸は、３０位（ＮＳ１タンパク質）のプロリン及び１１８位（ＮＳ１タンパク質）のリシンを含む。

本発明の一実施形態においては、インフルエンザウイルスは、４０位、１８０位、及び４６４位に選択されたアミノ酸、即ち、４０位のロイシン、１８０位のトリプトファン、及び４６４位のアスパラギンを有するタンパク質（即ち、ＰＢ１タンパク質）をコードするＰＢ１遺伝子セグメントを含む。ＰＢ１遺伝子セグメントは、配列番号２によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＢ１遺伝子セグメントは、配列番号７のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＰＢ１タンパク質）をコードし得る。該実施形態の別の態様においては、インフルエンザウイルスは、５０４位に選択されたアミノ酸、即ち、５０４位のバリンを有するタンパク質（即ち、ＰＢ２タンパク質）をコードするＰＢ２遺伝子セグメントを含み得る。ＰＢ２遺伝子セグメントは、配列番号１４によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＢ２遺伝子セグメントは、配列番号１５のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＰＢ２タンパク質）をコードし得る。該実施形態のＮＰ遺伝子セグメントは、１１６位置及び２９４位に選択されたアミノ酸、即ち、１１６位のロイシン及び２９４位のリシンを有するタンパク質（即ち、ＮＰタンパク質）をコードし得る。ＮＰ遺伝子セグメントは、配列番号１によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＰ遺伝子セグメントは、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＮＰタンパク質）をコードし得る。該実施形態のＰＡ及びＮＳ遺伝子セグメントは、４０１位（ＰＡタンパク質）、３０位（ＮＳ１タンパク質）、及び１１８位（ＮＳ１タンパク質）に、選択されたアミノ酸、即ち、４０１位のリシン（ＰＡタンパク質）、３０位のプロリン（ＮＳ１タンパク質）、及び１１８位のリシン（ＮＳ１タンパク質）を含むタンパク質（即ち、ＰＡタンパク質並びにＮＳ１及び／又はＮＳ２タンパク質）をコードする場合もある。ＰＡ遺伝子セグメントは、配列番号１６によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＡ遺伝子セグメントは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＰＡタンパク質）をコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号１８によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号１９のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＮＳ１タンパク質）をコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＮＳ２タンパク質）をコードし得る。該実施形態のＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ遺伝子セグメントは、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む場合もある。

本発明の別の実施形態においては、インフルエンザウイルスは、４０位、１８０位、及び６０７位に選択されたアミノ酸、即ち、４０位のロイシン、１８０位のトリプトファン、及び６０７位のセリンを有するタンパク質（即ち、ＰＢ１タンパク質）をコードするＰＢ１遺伝子セグメントを含む。ＰＢ１遺伝子セグメントは、配列番号４によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＢ１遺伝子セグメントは、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＰＢ１タンパク質）をコードし得る。該実施形態の別の態様においては、インフルエンザウイルスは、５０４位、４６７位、及び５２９位に選択されたアミノ酸、即ち、５０４位のバリン、４６７位のイソロイシン、及び５２９位のバリンを有するタンパク質（即ち、ＰＢ２タンパク質）をコードするＰＢ２遺伝子セグメントを含み得る。ＰＢ２遺伝子セグメントは、配列番号５によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＢ２遺伝子セグメントは、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＰＢ２タンパク質）をコードし得る。該実施形態のＮＰ遺伝子セグメントは、１１６位及び３１１位に選択されたアミノ酸、即ち、１１６位のロイシン及び３１１位のアルギニンを有するタンパク質（即ち、ＮＰタンパク質）をコードし得る。ＮＰ遺伝子セグメントは、配列番号３によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＰ遺伝子セグメントは、配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＮＰタンパク質）をコードし得る。ＰＡ及びＮＳ遺伝子セグメントは、４０１位（ＰＡタンパク質）、３０位（ＮＳ１タンパク質）、及び１１８位（ＮＳ１タンパク質）に選択されたアミノ酸、即ち、４０１位（ＰＡタンパク質）にリシン、３０位（ＮＳ１タンパク質）にプロリン、及び１１８位（ＮＳ１タンパク質）にリシンを含むタンパク質（即ち、ＰＡタンパク質並びにＮＳ１及び／又はＮＳ２タンパク質）をコードする場合もある。ＰＡ遺伝子セグメントは、配列番号１６によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＡ遺伝子セグメントは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＰＡタンパク質）をコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号１８によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号１９のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＮＳ１タンパク質）をコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するタンパク質（即ち、ＮＳ２タンパク質）をコードし得る。該実施形態のＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ遺伝子セグメントは、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む場合もある。

実施形態の選択されたアミノ酸は、特にバックボーンの大抵のタンパク質において、同一条件下で、選択されたアミノ酸がないことを除いて同一であるインフルエンザウイルスと比較して、インフルエンザウイルスに亢進された増殖特性を付与する。例えば、本発明のインフルエンザウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞中において増殖の亢進を示す。

本発明のインフルエンザウイルスは、Ｍ（膜タンパク質）遺伝子セグメントを含む場合もある。本発明の一実施形態においては、Ｍ遺伝子セグメントは、ウイルスが機能的なＭ２タンパク質の発現を欠くような、Ａ型インフルエンザ由来の変異遺伝子セグメントであり得る。かかるウイルスは、本明細書中、「Ｍ２ＳＲ」ウイルスと称される。Ｍ２ＳＲウイルスは、単回複製（ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）インフルエンザウイルスである。Ｍ２ＳＲウイルスのＭ遺伝子セグメントは、配列番号１１によって表され得る。Ｍ遺伝子セグメントは、タンパク質、例、配列番号１２のアミノ酸配列を有する短縮型Ｍ２タンパク質、をコードし得る。Ｍ２ＳＲウイルスは、Ｍ２タンパク質を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞（即ち、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞）中において増殖させられ、マルチサイクル複製が可能になり得る。Ｖｅｒｏ細胞中における高収量は、Ｍ遺伝子セグメントにおける変異に依存していない。従って、本発明のインフルエンザウイルスは、機能的なＭ２タンパク質をコードするＭ遺伝子セグメントを含み得る。
（Ｂ）表面タンパク質

本発明の更なる実施形態においては、インフルエンザウイルスは、ＮＡ（ノイラミニダーゼ）及びＨＡ（ヘマグルチニン）遺伝子セグメントを含む。本発明の一実施形態においては、ＨＡ遺伝子セグメントは、タンパク質のＨＡ１サブユニット中に少なくとも１の選択されたアミノ酸（例、アミノ酸変異）、及び／又はタンパク質のＨＡ２サブユニット中に少なくとも１の選択されたアミノ酸（例、アミノ酸変異）を含むアミノ酸配列を有するＨＡタンパク質をコードし得る。例えば、ＨＡ２サブユニット中の少なくとも１のアミノ酸変異は、１０７位のアスパラギンであり得る。かかる変異は、産生中のウイルスの増殖の亢進にも寄与し得る。

本発明の一実施形態においては、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントは、単一のインフルエンザ株に由来する。ＨＡ遺伝子セグメントは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来し得る。同様に、ＮＡ遺伝子セグメントは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来し得る。従って、本発明のインフルエンザウイルスは、汎発性インフルエンザウイルス（例、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ９）又は季節性インフルエンザウイルス（例、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｂ型インフルエンザ）であり得る。
（Ｃ）インフルエンザウイルスの性質

本発明のインフルエンザウイルスのバックボーンは、インフルエンザウイルスのタイプ（例、季節性又は汎発性インフルエンザウイルス）に関係なく、インフルエンザウイルスに、特にＶｅｒｏ細胞において、高い増殖特性を付与する。本発明のインフルエンザウイルスは、低い感染多重度（ＭＯＩ）（例、０．００１）を用いる製造プロセスにおいてさえ、高い収量を示す。ＭＯＩは、感染標的（例、細胞）当たりの病原体（例、ウイルス）の平均数を指す。複数の感染サイクルが必要な場合（例、ウイルスワクチンの製造）、より低いＭＯＩが用いられる。現在の適正製造基準の規制はＦＤＡによって執行されており、一般に、ウイルスの高収量を生み出してなお最低のＭＯＩを使用する必要がある。これは、マスターシードストックにはコストがかかり、非感染性粒子や過剰な細胞タンパク質に起因する毒性がウイルス産生を減少させ得るからある。

本発明の更なる実施形態においては、インフルエンザウイルスは、バックボーンタンパク質、特にＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ１タンパク質の選択されたアミノ酸が、低ＭＯＩで増殖させられた場合でさえ高度に保存されるように、遺伝的に安定である。例えば、本発明の一実施形態においては、選択されたアミノ酸は、Ｖｅｒｏ細胞株における少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、又は１０回超の連続継代後、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰタンパク質のうちの少なくとも１において保存されている。一実施形態においては、Ｖｅｒｏ細胞株は、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２イオンチャネルタンパク質を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞（即ち、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞）を含み得る。本発明の別の実施形態においては、Ｖｅｒｏ細胞株は、Ｂ型インフルエンザウイルスのＢＭ２イオンチャネルタンパク質を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞（即ち、ＢＭ２Ｖｅｒｏ細胞）を含み得る。ＢＭ２は、Ａ型インフルエンザウイルスＭ２の機能的な対応物であると考えられている。かかる実施形態においては、インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである場合でさえ、選択されたアミノ酸が保存され得る。

遺伝子改変されたＶｅｒｏ細胞（即ち、インフルエンザＭ２又はＢＭ２タンパク質を発現するもの）は、正常なＶｅｒｏ細胞のように挙動し、正常なＶｅｒｏ細胞に匹敵するＡ型又はＢ型インフルエンザウイルスの増殖を支持する。Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞におけるＭ２ＳＲウイルスのウイルス力価は、未改変のＶｅｒｏ細胞株において、機能的なＭ２を発現する、複製しているインフルエンザウイルスに匹敵する。更に、ＢＭ２Ｖｅｒｏ細胞におけるＢＭ２ＳＲウイルス（即ち、Ｂ型インフルエンザからの変異Ｍ遺伝子セグメントを含み、その結果、機能的なＢＭ２タンパク質を発現しないインフルエンザウイルス）についてのウイルス力価は、未改変のＶｅｒｏ細胞株において、機能的なＢＭ２を発現する、複製しているインフルエンザウイルスに匹敵する。従って、Ｍ２ＳＲ及びＢＭ２ＳＲウイルスは、Ｍ２ＶｅｒｏＡ及びＢＭ２Ｖｅｒｏ細胞株において、複製しているインフルエンザウイルスのように挙動する。

本発明の一実施形態においては、インフルエンザウイルスは、ヒト細胞中において複製できる。
インフルエンザウイルスの作製方法

インフルエンザウイルスを作製する方法も本明細書中に提供され、作製されたインフルエンザウイルスは、選択されたアミノ酸を有するタンパク質、即ち本明細書に開示される通りの、本発明の組換えインフルエンザウイルスを発現する、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントを含む。

本発明の方法の一実施形態においては、組換えインフルエンザウイルスを作製する方法は、Ｖｅｒｏ細胞において組換えインフルエンザウイルス（例、第１のインフルエンザウイルス）を連続継代して、作製されたインフルエンザウイルス（例、第２のインフルエンザウイルス）を作製することを含む。第１のインフルエンザウイルスは、本発明のインフルエンザウイルスに関して記載した通りの、タンパク質、即ち、選択されたアミノ酸を有するＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ１タンパク質を発現するＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントを含み得る。例えば、第１のインフルエンザウイルスは、４０位のロイシン、１８０位のトリプトファン、４６４位のアスパラギン酸、及び６０７位のプロリンを含むタンパク質（即ち、ＰＢ１タンパク質）をコードするＰＢ１遺伝子セグメントを含み得る。第１のインフルエンザウイルスのＰＢ２遺伝子セグメントは、４６７位のメチオニン、５０４位のバリン、及び５２９位のイソロイシンを含むタンパク質（即ち、ＰＢ２タンパク質）をコードし得る。第１のインフルエンザウイルスのＰＡ遺伝子セグメントは、４０１位のリシンを含むタンパク質（即ち、ＰＡタンパク質）をコードし得る。第１のインフルエンザウイルスのＮＰ遺伝子セグメントは、１１６位のロイシン、２９４位のグルタミン酸、及び３１１位のグルタミンを含むタンパク質（即ち、ＮＰタンパク質）をコードし得る。第１のインフルエンザウイルスのＮＳ遺伝子セグメントは、３０位のプロリン及び１１８位のリシンを含むタンパク質（即ち、ＮＳ１タンパク質）をコードし得る。第１のインフルエンザウイルスのＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ遺伝子セグメントは、場合により、４位のヌクレオチドにウラシルを含む。本発明の一実施形態においては、第２のインフルエンザウイルス（例、作製されたインフルエンザウイルス）は、第１のインフルエンザウイルスの、Ｖｅｒｏ細胞中における少なくとも４回又は少なくとも５回の連続継代後に作製される。

本発明のインフルエンザウイルスは、標準的なウイルスレスキュー技術を使用して作製される場合もある。例えば、本発明の一実施形態においては、８のウイルス遺伝子セグメント（即ち、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、及びＮＡ）のそれぞれについてのｃＤＮＡがクローン化されており、各ｃＤＮＡ配列がＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター及びＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターに隣接している１以上のプラスミド（即ち、ｐＰｏｌＩプラスミド）が、真核生物宿主細胞にトランスフェクションされる。ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、並びにＮＳ１及び／又はＮＳ２タンパク質をコードする遺伝子セグメントは、本発明の選択されたアミノ酸を有するタンパク質をコードし得る。Ｍ２又はＢＭ２タンパク質をコードする遺伝子セグメントは、該遺伝子セグメントが機能的なＭ２又はＢＭ２をコードしないように、変異体Ｍ２又はＢＭ２遺伝子セグメントを含み得る。宿主細胞は、ウイルスタンパク質（例、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰタンパク質のうちの少なくとも１以上、又はＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ１及び／若しくはＮＳ２、ＨＡ、並びにＮＡタンパク質のうちの少なくとも１以上）をコードする１以上の発現プラスミドでトランスフェクションされる場合もある。次いで、少なくとも１以上のプラスミドを宿主細胞にトランスフェクション後、８のインフルエンザｖＲＮＡ（即ち、遺伝子セグメント）が合成される。共トランスフェクションされたウイルスポリメラーゼ及び核タンパク質は、ｖＲＮＡを、複製及び転写される、機能的なｖＲＮＰ（即ち、ウイルスリボ核タンパク質複合体）に集合させ、最終的に本発明の組換えインフルエンザウイルスを形成する。このプラスミドベースの逆遺伝学システムは、Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：９３４５－９３５０（１９９９）に更に詳述される。本発明のインフルエンザウイルスは、米国特許第９，２８４，５３３号に記載の通りに、リボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）トランスフェクションシステム等（限定されない）の当該技術分野で公知の他の方法を用いて作製される場合もある。
医薬製剤

本発明は、本明細書に記載の通りの本発明のインフルエンザウイルスを含む医薬製剤（例、ワクチン又は他の免疫原性組成物）を提供する。

医薬製剤は、少なくとも１の医薬的に許容される担体又は賦形剤を更に含み得る。本明細書で用いられる場合、「医薬的に許容される担体又は賦形剤」は、医薬製剤の、本発明のインフルエンザウイルス以外の任意の成分を指す。医薬的に許容される担体又は賦形剤は、望ましくは本発明のインフルエンザウイルスを著しく不活化することなく、本発明のインフルエンザウイルスの効力を増強するか、又は医薬製剤の安定性を持続させ得る。

少なくとも１の医薬的に許容される担体又は賦形剤は、任意の好適な医薬的に許容される担体又は賦形剤であり得、それらの多くは当該技術分野で公知である。例示的な医薬的に許容される担体又は賦形剤としては、医薬製剤のｐＨを維持する（例、緩衝液）、張度を調整する（例、無機塩等の張度改変剤）、タンパク質（例、ウイルス）の安定性及び／若しくは免疫原性を改善する、粘膜接着を改善する、タンパク質の凝集を防ぐ、並びに／又は医薬製剤を保存する（例、保存料）成分が挙げられる。例えば、医薬的に許容される担体又は賦形剤は、無機塩、界面活性剤、アミノ酸、ポリマー若しくはポリマー化合物（例、タンパク質、多糖、又はヒドロゲル）、キレート剤、糖、ポリオール、及び／又はアジュバント（例、特定の免疫応答を増大させる任意の物質）（それらの多くが当該技術分野で公知である）のうちの少なくとも１を含み得る。特定の担体又は賦形剤は、製剤において１超の目的に役立ち得るため、以下の実施形態は、本明細書に記載の説明に限定されない。

任意の好適な緩衝液が医薬製剤中に存在し得る。一実施形態においては、緩衝液は、イミダゾール緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（例、１×ＤＰＢＳ）、ヒスチジン緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、及びスクロースリン酸グルタミン酸（ＳＰＧ）緩衝液のうちの少なくとも１を含む。ＰＢＳ及び／又はＤＰＢＳ調製物は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム一塩基性、及びリン酸ナトリウム二塩基性を含み得、そして場合により、塩化カルシウム及び／又は塩化マグネシウムを更に含み得る。いくつかの実施形態においては、ＰＢＳ及び／又はＤＰＢＳ調製物は、１３６．９ｍＭの塩化ナトリウム、２．６７ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸カリウム一塩基性、及び８．１ｍＭのリン酸ナトリウム二塩基性を含むが、任意の好適なＰＢＳ及び／又はＤＰＢＳ調製物（当該技術分野においてそれらの多くが公知である）が、医薬製剤中の緩衝液として用いられ得る。

緩衝液は、医薬製剤中に、任意の好適な濃度で存在し得る。緩衝液は、医薬製剤中に、０．１ｍＭ以上、１ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１２０ｍＭ以上、１４０ｍＭ以上、１６０ｍＭ以上、１８０ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、２５０ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、３５０ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、４５０ｍＭ以上、又は５００ｍＭ以上の濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、緩衝液は、医薬製剤中に、１０００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、４５０ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３５０ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１８０ｍＭ以下、１６０ｍＭ以下、１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、又は１ｍＭ以下の濃度で存在し得る。緩衝液は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、緩衝液は、医薬製剤中に、０．１ｍＭ～１０００ｍＭ、０．１ｍＭ～５００ｍＭ、０．１ｍＭ～１００ｍＭ、１ｍＭ～１０００ｍＭ、１ｍＭ～５００ｍＭ、１ｍＭ～１００ｍＭ、１００ｍＭ～１０００ｍＭ、１００ｍＭ～５００ｍＭ等の濃度で存在し得る。

更なる実施形態においては、緩衝液は、医薬製剤中に、パーセンテージ濃度（例、体積／体積パーセンテージ（％ｖ／ｖ）；重量／体積パーセンテージ（％ｗ／ｖ）；又は重量／重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ））で存在する。緩衝液は、医薬製剤中に、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、又は５０％以上のパーセンテージ濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、緩衝液は、医薬製剤中に、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、又は１％以下のパーセンテージ濃度で存在し得る。緩衝液は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、緩衝液は、医薬製剤中に、０．１％～６０％、１％～６０％、１０％～６０％、０．１％～５０％、１％～５０％、１０％～５０％、２０％～６０％、２０％～５０％、２０％～４０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％等のパーセンテージ濃度で存在し得る。

緩衝液は、医薬製剤のｐＨを、任意の好適なｐＨに維持できる。緩衝液は、医薬製剤のｐＨを、例えば、４以上、４．５以上、５以上、５．５以上、６以上、６．５以上、７以上、又は７．５以上のｐＨに維持できる。代替的に、又は追加的に、緩衝液は、医薬製剤のｐＨを、例えば、８以下、７．５以下、７以下、６．５以下、６以下、５．５以下、５以下、又は４．５以下のｐＨに維持できる。緩衝液は、医薬製剤のｐＨを、前述の端点のいずれかが境界である範囲内のｐＨに維持できる。例えば、緩衝液は、医薬製剤のｐＨを４～８、４．５～８、５～８、５．５～８、６～８、６．５～８、７～８、７．５～８、４～７．５、５～７．５、６～７．５、７～７．５、４～７、５～７、６～７等のｐＨに維持できる。

任意の好適な張度改変剤が医薬製剤中に存在し得る。特定の実施形態においては、１以上の無機塩が、医薬製剤中に、張度改変剤として存在する。無機塩（複数可）は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）、及び塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）のうちの少なくとも１であり得る。張度改変剤、例、無機塩（複数可）は、医薬製剤中に、任意の好適な量で存在し得る。張度改変剤、例、無機塩（複数可）は、医薬製剤中に、０．１ｍＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．４ｍＭ以上、０．６ｍＭ以上、０．８ｍＭ以上、１ｍＭ以上、１．２ｍＭ以上、１．４ｍＭ以上、１．６ｍＭ以上、１．８ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、１０００ｍＭ以上、又は１５００ｍＭ以上の濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、張度改変剤、例、無機塩（複数可）は、医薬製剤中に、２０００ｍＭ以下、１５００ｍＭ以下、１０００ｍＭ以下、９００ｍＭ以下、８００ｍＭ以下、７００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、４５０ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３５０ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１．８ｍＭ以下、１．６ｍＭ以下、１．４ｍＭ以下、１．２ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．８ｍＭ以下、０．６ｍＭ以下、０．４ｍＭ以下、又は０．２ｍＭ以下の濃度で存在し得る。張度改変剤、例、無機塩（複数可）は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、張度改変剤、例、無機塩（複数可）は、医薬製剤中に、０．１ｍＭ～２０００ｍＭ、０．１ｍＭ～１５００ｍＭ、０．１ｍＭ～１０００ｍＭ、０．１ｍＭ～５００ｍＭ、０．１ｍＭ～２５０ｍＭ、０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．１～５０ｍＭ、０．１ｍＭ～１０ｍＭ、１ｍＭ～２０００ｍＭ、１ｍＭ～１５００ｍＭ、１ｍＭ～１０００ｍＭ、１ｍＭ～５００ｍＭ、１ｍＭ～２５０ｍＭ、１ｍＭ～１００ｍＭ、１ｍＭ～５０ｍＭ、１ｍＭ～１０ｍＭ、１０ｍＭ～２０００ｍＭ、１０ｍＭ～１５００ｍＭ、１０ｍＭ～１０００ｍＭ、１０ｍＭ～５００ｍＭ、１０ｍＭ～２５０ｍＭ、１０ｍＭ～１００ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、１００ｍＭ～２０００ｍＭ、１００ｍＭ～１５００ｍＭ、１００ｍＭ～１０００ｍＭ、１００ｍＭ～５００ｍＭ、１００ｍＭ～２５０ｍＭ、５００ｍＭ～２０００ｍＭ、５００ｍＭ～１５００ｍＭ、５００ｍＭ～１０００ｍＭ等の濃度で存在し得る。

更なる実施形態においては、無機塩は、医薬製剤中に、パーセンテージ濃度（例、体積／体積パーセンテージ（％ｖ／ｖ）；重量／体積パーセンテージ（％ｗ／ｖ）；又は重量／重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ））で存在する。張度改変剤、例、無機塩（複数可）は、医薬製剤中に、０．１％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、又は１０％以上のパーセンテージ濃度で存在する。代替的に、又は追加的に、張度改変剤、例えば、例、無機塩（複数可）は、医薬製剤中に、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下のパーセンテージ濃度で存在し得る。張度改変剤、例、無機塩（複数可）は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意のパーセンテージ濃度で存在し得る。例えば、張度改変剤、例、無機塩（複数可）は、医薬製剤中に、０．１％～１％、０．１％～２％、０．１％～５％、０．１％～１０％、１％～２％、１％～５％、１％～１０％、２％～１０％、３％～１０％、４％～１０％、５％～１０％等のパーセンテージ濃度で存在し得る。

任意の好適な界面活性剤が医薬製剤中に存在し得る。特定の実施形態においては、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、デオキシコール酸ナトリウム、及びポロキサマー１８８のうちの少なくとも１を含み得る。界面活性剤は、医薬製剤中に、任意の好適な量で存在し得る。いくつかの実施形態においては、界面活性剤は、医薬製剤中に、パーセント濃度（例、体積／体積パーセンテージ（％ｖ／ｖ）；重量／体積パーセンテージ（％ｗ／ｖ）；又は重量／重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ）で存在する。界面活性剤は、医薬製剤中に、０．０１％以上、０．０２％以上、０．０３％以上、０．０４％以上、０．０５％以上、０．０６％以上、０．０７％以上、０．０８％以上、０．０９％以上、０．１％以上、０．２％以上、０．３％以上、０．４％以上、０．５％以上、０．６％以上、０．７％以上、０．８％以上、０．９％以上、又は１％以上のパーセンテージ濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、界面活性剤は、医薬製剤中に、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、又は０．１％以下のパーセンテージ濃度で存在し得る。界面活性剤は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意のパーセンテージ濃度で存在し得る。例えば、界面活性剤は、医薬製剤中に、０．０１％～１％、０．０１％～０．１％、０．０５％～１％、０．０５％～０．１％、０．１％～１％、０．１％～０．５％、０．２％～１％、０．５％～１％等のパーセンテージ濃度で存在し得る。

任意の好適なアミノ酸が医薬製剤中に存在し得る。特定の実施形態においては、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン酸又はグルタミン酸塩、アスパラギン、ヒスチジン、及びグリシンのうちの１以上であり得る。アミノ酸（複数可）は、医薬製剤中に、任意の好適な量で存在し得る。アミノ酸（複数可）は、医薬製剤中に、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ、９ｍＭ以上、又は１０ｍＭ以上の濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、アミノ酸（複数可）は、医薬製剤中に、約１００ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、又は１０ｍＭ以下の濃度で存在し得る。アミノ酸（複数可）は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、アミノ酸（複数可）は、医薬製剤中に、１ｍＭ～１０ｍＭ、１ｍＭ～５０ｍＭ、１ｍＭ～１００ｍＭ、５ｍＭ～５０ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、２０ｍＭ～５０ｍＭ等の濃度で存在し得る。

いくつかの実施形態においては、アミノ酸（複数可）は、医薬製剤中に、パーセンテージ濃度（例、体積／体積パーセンテージ（％ｖ／ｖ）；重量／体積パーセンテージ（％ｗ／ｖ）；又は重量／重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ））で存在する。アミノ酸（複数可）は、医薬製剤中に、０．１％以上、０．２％以上、０．３％以上、０．４％以上、０．５％以上、０．６％以上、０．７％以上、０．８％以上、０．９％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、又は５％以上のパーセンテージ濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、アミノ酸（複数可）は、医薬製剤中に、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下のパーセンテージ濃度で存在し得る。アミノ酸（複数可）は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意のパーセンテージ濃度で存在し得る。例えば、アミノ酸（複数可）は、医薬製剤中に、０．１％～１０％、０．２％～１０％、０．５％～１０％、０．１％～５％、０．１％～２％、０．２％～２％、０．５％～１％等のパーセンテージ濃度で存在し得る。

任意の好適なポリマー又はポリマー化合物が医薬製剤中に存在し得る。ポリマー又はポリマー化合物は、例えば、タンパク質、多糖、ヒドロゲル、又は任意の他の好適なポリマー若しくはポリマー化合物であり得、それらの多くが当該技術分野で公知である。例えば、ポリマー又はポリマー化合物は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、血清アルブミン（ＳＡ）、ゼラチン、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、キトサン、デキストラン（ＤＥＸ７０Ｋ、ＤＥＸ４０Ｋ）、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ４０Ｋ）であり得る。

ポリマー（複数可）又はポリマー化合物（複数可）は、医薬製剤中に、任意の好適な量で存在し得る。ポリマー（複数可）又はポリマー化合物（複数可）は、医薬製剤中に、パーセンテージ濃度（例、体積／体積パーセンテージ（％ｖ／ｖ）；重量／体積パーセンテージ（％ｗ／ｖ）；又は重量／重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ））で存在し得る。ポリマー（複数可）又はポリマー化合物（複数可）は、医薬製剤中に、０．１％以上、０．２％以上、０．３％以上、０．４％以上、０．５％以上、０．６％以上、０．７％以上、０．８％以上、０．９％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、又は５％以上のパーセンテージ濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、ポリマー（複数可）又はポリマー化合物（複数可）は、医薬製剤中に、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下のパーセンテージ濃度で存在し得る。ポリマー（複数可）又はポリマー化合物（複数可）は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意のパーセンテージ濃度で存在し得る。例えば、ポリマー（複数可）又はポリマー化合物（複数可）は、医薬製剤中に、０．１％～１０％、０．２％～１０％、０．５％～１０％、０．１％～５％、０．１％～２％、０．２％～２％、０．５～２％、０．１％～１％、０．２％～１％、０．５％～１％等のパーセンテージ濃度で存在し得る。

任意の好適なキレート剤が医薬製剤中に存在し得る。キレート剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、アミドキシム化合物（ＡＯＸ）、及び／又はジチオスレイトール（ＤＴＴ）であり得る。キレート剤は、医薬製剤中に、任意の好適な濃度で存在し得る。キレート剤は、医薬製剤中に、１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、４０μＭ以上、５０μＭ以上、６０μＭ以上、７０μＭ以上、８０μＭ以上、９０μＭ以上、１００μＭ以上、１２０μＭ以上、又は１５０μＭ以上の濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、キレート剤は、医薬製剤中に、５００μＭ以下、４００μＭ以下、３００μＭ以下、２００μＭ以下、１５０μＭ以下、１４０μＭ以下、１３０μＭ以下、１２０μＭ以下、１１０μＭ以下、１００μＭ以下、８０μＭ以下、７０μＭ以下、６０μＭ以下、又は５０μＭ以下の濃度で存在し得る。キレート剤は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、キレート剤は、医薬製剤中に、１０μＭ～５００μＭ、１０μＭ～２００μＭ、１０μＭ～１５０μＭ、１０μＭ～１００μＭ、５０μＭ～５００μＭ、５０μＭ～２００μＭ、５０μＭ～１５０μＭ、５０μＭ～１００μＭ等の濃度で存在し得る。

任意の好適な糖が医薬製剤中に存在し得る。糖は、例えば、スクロース、トレハロース、マンノース、及びラクトースのうちの１以上であり得る。糖（複数可）は、医薬製剤中に、任意の好適な濃度で存在し得る。糖（複数可）は、医薬製剤中に、０．１ｍＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．４ｍＭ以上、０．６ｍＭ以上、０．８ｍＭ以上、１ｍＭ以上、１．２ｍＭ以上１．４ｍＭ以上１．６ｍＭ以上１．８ｍＭ以上、２ｍＭ以上３ｍＭ以上４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上、又は１００ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、６００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、８００ｍＭ以上、９００ｍＭ以上、１０００ｍＭ以上、又は１５００ｍＭ以上の濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、糖（複数可）は、医薬製剤中に、２０００ｍＭ以下、１５００ｍＭ以下、１０００ｍＭ以下、９００ｍＭ以下、８００ｍＭ以下、７００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、４５０ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３５０ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１．８ｍＭ以下、１．６ｍＭ以下、１．４ｍＭ以下、１．２ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．８ｍＭ以下、０．６ｍＭ以下、０．４ｍＭ以下、又は０．２ｍＭ以下の濃度で存在し得る。糖（複数可）は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、糖（複数可）は、医薬製剤中に、０．１ｍＭ～２０００ｍＭ、０．１ｍＭ～１５００ｍＭ、０．１ｍＭ～１０００ｍＭ、０．１ｍＭ～５００ｍＭ、０．１ｍＭ～２５０ｍＭ、０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．１～５０ｍＭ、０．１ｍＭ～１０ｍＭ、１ｍＭ～２０００ｍＭ、１ｍＭ～１５００ｍＭ、１ｍＭ～１０００ｍＭ、１ｍＭ～５００ｍＭ、１ｍＭ～２５０ｍＭ、１ｍＭ～１００ｍＭ、１ｍＭ～５０ｍＭ、１ｍＭ～１０ｍＭ、１０ｍＭ～２０００ｍＭ、１０ｍＭ～１５００ｍＭ、１０ｍＭ～１０００ｍＭ、１０ｍＭ～５００ｍＭ、１０ｍＭ～２５０ｍＭ、１０ｍＭ～１００ｍＭ、１０ｍＭ～５０ｍＭ、１００ｍＭ～２０００ｍＭ、１００ｍＭ～１５００ｍＭ、１００ｍＭ～１０００ｍＭ、１００ｍＭ～５００ｍＭ、１００ｍＭ～２５０ｍＭ、５００ｍＭ～２０００ｍＭ、５００ｍＭ～１５００ｍＭ、５００ｍＭ～１０００ｍＭ等の濃度で存在し得る。

他の実施形態においては、糖（複数可）は、医薬製剤中に、パーセンテージ濃度（例、体積／体積パーセンテージ（％ｖ／ｖ）；重量／体積パーセンテージ（％ｗ／ｖ）；又は重量／重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ））で存在する。糖（複数可）は、医薬製剤中に、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上のパーセンテージ濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、糖（複数可）は、医薬製剤中に、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、又は１％以下のパーセンテージ濃度で存在し得る。糖（複数可）は、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意のパーセンテージ濃度で存在し得る。例えば、糖（複数可）は、医薬製剤中に、０．１％～５０％、１％～５０％、１０％～５０％、０．１％～２０％、１％～２０％、１０％～２０％、０．１％～１０％、１％～１０％等のパーセンテージ濃度で存在し得る。

任意の好適なポリオールが医薬製剤中に存在し得る。ポリオールは、例えば、ソルビトール及び／又はマンニトールであり得る。ポリオールは、医薬製剤中に、任意の好適な濃度で存在し得る。ポリオールは、医薬製剤中に、０．１ｍＭ以上、１ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１２０ｍＭ以上、１４０ｍＭ以上、１６０ｍＭ以上、１８０ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、２５０ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、３５０ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、４５０ｍＭ以上、又は５００ｍＭ以上の濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、ポリオールは、医薬製剤中に、１０００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、４５０ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３５０ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１８０ｍＭ以下、１６０ｍＭ以下、１４０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、又は１ｍＭ以下の濃度で存在し得る。ポリオールは、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意の濃度で存在し得る。例えば、ポリオールは、医薬製剤中に、０．１ｍＭ～１０００ｍＭ、０．１ｍＭ～５００ｍＭ、０．１ｍＭ～１００ｍＭ、１ｍＭ～１０００ｍＭ、１ｍＭ～５００ｍＭ、１ｍＭ～１００ｍＭ、１００ｍＭ～１０００ｍＭ、１００ｍＭ～５００ｍＭ等の濃度で存在し得る。

他の実施形態においては、ポリオールは、医薬製剤中に、パーセンテージ濃度（例、体積／体積パーセンテージ（％ｖ／ｖ）；重量／体積パーセンテージ（％ｗ／ｖ）；又は重量／重量パーセンテージ（％ｗ／ｗ））で存在する。ポリオールは、医薬製剤中に、０．１％以上、１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、又は５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上のパーセンテージ濃度で存在し得る。代替的に、又は追加的に、ポリオールは、医薬製剤中に、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下のパーセンテージ濃度で存在し得る。ポリオールは、医薬製剤中に、前述の端点のいずれかが境界である範囲内の任意のパーセンテージ濃度で存在し得る。例えば、ポリオールは、医薬製剤中に、０．１％～５０％、１％～５０％、５％～５０％、１０％～５０％、１５％～５０％、０．１％～２５％、１％～２５％、５％～２５％、１０％～２５％、１５％～２５％、０．１％～１５％、１％～１５％、５％～１５％、１０％～１５％、０．１％～１０％、１％～１０％、５％～１０％、０．１％～５％、１％～５％等のパーセンテージ濃度で存在し得る。

一実施形態においては、医薬製剤は、本発明のインフルエンザウイルス、０．５Ｍスクロース、０．１Ｍ又は０．５Ｍマンノース、０．３Ｍ又は０．５Ｍトレハロース、５０％ＳＰＧ、及び０．０５％ポリソルベート２０を含む。別の実施形態においては、医薬製剤は、本発明のインフルエンザウイルス、０．５Ｍスクロース、０．３Ｍトレハロース、及び０．０５％ポリソルベート２０を含む。

少なくとも１の医薬的に許容される担体又は賦形剤は、医薬製剤の成分を結合するのに役立つ成分（例、結合剤）であり得る。結合剤としては、タンパク質（例、ゼラチン）、ポリマー（例、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン）、及び／若しくは多糖類又はそれらの誘導体（例、デンプン及びセルロース）が挙げられ得るが、これらに限定されない。少なくとも１の医薬的に許容される担体又は賦形剤は、医薬製剤の嵩を増加させる成分（例、増量剤、希釈剤、及び／又は充填剤）であり得る。かかる増量剤としては、多糖若しくはその誘導体、糖、及び／又は無機化合物が挙げられ得るが、これらに限定されない。医薬的に許容される担体又は賦形剤は、医薬製剤の味及び／又は外観を強化する成分（例、香味剤、甘味剤、及び／又は着色剤）であり得る。医薬的に許容される担体又は賦形剤は、液体又は気体を吸収又は吸着することによって医薬製剤を防湿する成分（例、吸着剤）であり得る。吸着剤としては、デンプン、リン酸カルシウム、及び／又はコロイド状二酸化ケイ素が挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容される担体又は賦形剤は、デンプン、セルロース及び／若しくは当該技術分野で公知の他の任意のポリマー、又はそれらの誘導体（例、架橋ポリビニルピロリドン又はカルボキシメチルセルロースナトリウム）等の、医薬製剤の溶解を促進する成分（例、崩壊剤）であり得る。

いくつかの実施形態においては、医薬的に許容される担体又は賦形剤は、粒子間接着を低減する、及び／又は医薬製剤の製造中及び製造時の生成物の流れを最適化する成分（例えば、流動促進剤）である。流動促進剤の例としては、タルク、コロイド状二酸化ケイ素、及びコーンスターチが挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容される担体又は賦形剤は、特に、医薬製剤が経口調製物として製剤化される場合、医薬製剤の製造中及び製造時に、成分と、例えば、穿孔器面との間の接着を低減する、即ち滑沢剤等の、非粘着性を提供する成分（例、付着防止剤）であり得る。例えば、付着防止剤は、ステアリン酸マグネシウムを含み得る。他の実施形態においては、医薬的に許容される担体又は賦形剤は、製造中、成分の凝集を低減する、及び／又は、例えば、医薬製剤（即ち、経口調製物として製剤化された）の表面とダイ壁との間の摩擦を低減する成分（例、滑沢剤）であり得る。特定の実施形態により、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、植物油、鉱油、ポリエチレングリコール、及び／又はラウリル硫酸ナトリウム等の、水溶性又は水不溶性の両方の滑沢剤が用いられ得る。医薬的に許容される担体又は賦形剤は、コーティング剤として作用する成分であり得る。コーティング剤としては、ゼラチン及び／又はセルロースベースのコーティング剤（例、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）が挙げられるが、これらに限定されない。

他の好適な結合剤、香味剤、甘味剤、着色剤、崩壊剤、流動促進剤、接着防止剤、滑沢剤、及びコーティング剤は、当技術分野で周知であり、容易に同定可能である。

医薬製剤は、治療剤（例、化学療法剤又は抗炎症剤）を更に含み得る。医薬製剤は、インフルエンザウイルスとは別に免疫応答を誘発する剤も含み得る。本発明のインフルエンザウイルス以外のかかる更なる成分は、任意の好適な量（複数可）で存在し得る。

更なる成分は、他の成分と混合されて、免疫系に提示する前に医薬製剤を形成し得る。更なる成分は、医薬製剤とは別個に免疫系に提示される場合もある。例えば、更なる成分及び医薬製剤は、免疫系に別々に提示され得る（例、生物に投与される）。更なる成分及び医薬製剤が別々に投与される場合、更なる成分及び医薬製剤は、免疫される生物の同一の部位に投与され得る。

医薬製剤の一実施形態においては、医薬製剤はウイルスワクチンである。ウイルスワクチンは、生の弱毒化ウイルスワクチン又は不活化ウイルスワクチン（例、全ウイルスワクチン、分割ウイルスワクチン、又はサブユニットワクチン）であり得る。ウイルスワクチンは、一価ワクチン、二価ワクチン、三価ワクチン、又は四価ワクチンとして製剤化され得る。例えば、ワクチンは、本発明のインフルエンザウイルスの複数の実施形態を含み得る。いくつかの実施形態においては、ワクチンは、本発明のインフルエンザウイルスとは異なる少なくとも１のインフルエンザウイルスを更に含み得る。

ウイルスワクチンは、投与の任意の好適な手段のための組成物に製剤化され得る。例えば、ウイルスワクチンは、経口調製物（例、カプセル、錠剤、又は経口フィルム）、スプレー（例えば、鼻スプレー）、或いは、水性若しくは非水性の乳濁液、溶液、又は懸濁液等の、鼻腔内投与、又は非経口投与、例、静脈内、筋肉内若しくは皮下投与、に好適な任意の組成物として製剤化され得る。
免疫応答を誘発する方法

本発明は、本発明のインフルエンザウイルスを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において免疫応答を誘発する方法を提供する。一実施形態においては、インフルエンザウイルスは、選択されたアミノ酸を含む、タンパク質、即ち、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質、ＮＰタンパク質、及びＮＳ１タンパク質をそれぞれコードする、ＰＢ１遺伝子セグメント、ＰＢ２遺伝子セグメント、ＰＡ遺伝子セグメント、ＮＰ遺伝子セグメント、及びＮＳ遺伝子セグメント、即ち、本明細書に記載の本発明のインフルエンザウイルスを含む。

哺乳動物は、例えば、ヒト又は霊長類であり得るが、それに限定されない。

本発明の一実施形態においては、本発明のインフルエンザウイルスは、本明細書に記載の通り、医薬製剤（例、ワクチン又は他の免疫原性組成物）で投与される。医薬製剤は鼻腔内投与され得る。別の実施形態においては、医薬製剤は筋肉内投与される。医薬製剤は、皮下又は経口投与される場合もある。

医薬製剤、例、ウイルスワクチンの投薬計画は、哺乳動物の齢、体重、性別、及び病歴に依存し得る。例えば、一実施形態においては、ヒトへの弱毒化ウイルスワクチンの単回用量は、約１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、若しくは１０^１２、又は前述の値のうちの２の間の任意の範囲の、本発明のインフルエンザウイルスの粒子形成単位（ＰＦＵ）、フォーカス形成単位（ＦＦＵ）、又はＴＣＩＤ_５０を含有し得る。いくつかの実施形態においては、インフルエンザウイルスを予防又は治療するための該計画は、一回の治療として医薬製剤を投与することを含む。医薬製剤は、１回超投与されることもでき、例えば、投薬計画は、追加免疫投与を含み得る。例えば、医薬製剤の追加免疫用量は、初回投与後、７日以上、例、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、３週間以上、４週間以上、１ヶ月以上、２ヶ月以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、５ヶ月以上、６ヶ月以上、７ヶ月以上、８ヶ月以上、９ヶ月以上、１０ヶ月以上、１１ヶ月以上、１年以上、２年以上、３年以上、４年以上、又は５年以上、の範囲の期間にわたって投与され得る。
実施形態

本発明は、以下の実施形態を提供する：

（１） ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントを含むインフルエンザウイルスであって、（ａ）ＰＢ１遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、４０位のロイシン及び１８０位のトリプトファン、並びに４６４位のアスパラギン又は６０７位のセリンのうちの少なくとも１を含み、ＰＢ１遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；（ｂ）ＰＢ２遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ２タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、５０４位のバリン、並びに場合により、４６７位のイソロイシン及び５２９位のバリンを含み、ＰＢ２遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；（ｃ）ＰＡ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＡタンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、４０１位のリシンを含み、ＰＡ遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；（ｄ）ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、１１６位のロイシン、及び２９４位のリシン又は３１１位のアルギニンのうちの少なくとも１を含む；並びに（ｅ）ＮＳ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＳ１タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、３０位のプロリン及び１１８位のリシンを含む、インフルエンザウイルス。

（２）（ａ）ＰＢ１遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、４０位のロイシン、１８０位のトリプトファン、及び４６４位のアスパラギンであり、ＰＢ１遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；（ｂ）ＰＢ２遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ２タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、５０４位のバリンであり、ＰＢ２遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；（ｃ）ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、１１６位のロイシン及び２９４位のリシンである、実施形態（１）のインフルエンザウイルス。

（３）ＰＢ１遺伝子セグメントが、配列番号２によって表されるヌクレオチド配列を有する、実施形態（１）又は（２）のインフルエンザウイルス。

（４）ＮＰ遺伝子セグメントが、配列番号１によって表されるヌクレオチド配列を有する、実施形態（１）～（３）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（５）ＰＢ１遺伝子セグメントが、配列番号７のアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードする、実施形態（１）～（４）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（６）ＮＰ遺伝子セグメントが、配列番号６のアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードする、実施形態（１）～（５）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（７）選択されたアミノ酸が、Ｖｅｒｏ細胞株における少なくとも１０回の連続継代後に、ＰＢ１及びＮＰタンパク質のうちの少なくとも１において保存される、実施形態（１）～（６）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（８）選択されたアミノ酸が、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２イオンチャネルタンパク質を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞株において少なくとも１０回の連続継代後にＰＢ１及びＮＰタンパク質のうちの少なくとも１において保存される、実施形態（１）～（７）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（９）インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスであり、選択されたアミノ酸が、Ｖｅｒｏ細胞株における少なくとも１０回の連続継代後、ＰＢ１及びＮＰタンパク質のうちの少なくとも１において保存される、実施形態（１）～（８）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（１０）（ａ）ＰＢ１遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、４０位のロイシン、１８０位のトリプトファン、及び６０７位のセリンであり、ＰＢ１遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；（ｂ）ＰＢ２遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ２タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、５０４位のバリン、４６７位のイソロイシン及び５２９位のバリンであり、ＰＢ２遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；及び（ｃ）ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、１１６位のロイシン及び３１１位のアルギニンである、実施形態（１）のインフルエンザウイルス。

（１１）ＰＢ１遺伝子セグメントが、配列番号４によって表されるヌクレオチド配列を有する、実施形態（１）又は（１０）のインフルエンザウイルス。

（１２）ＰＢ２遺伝子セグメントが、配列番号５によって表されるヌクレオチド配列を有する、実施形態（１）、（１０）、及び（１１）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（１３）ＮＰ遺伝子セグメントが、配列番号３によって表されるヌクレオチド配列を有する、実施形態（１）及び（１０）～（１２）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（１４）ＰＢ１遺伝子セグメントが、配列番号９のアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードする、実施形態（１）及び（１０）～（１３）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（１５）ＰＢ２遺伝子セグメントが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＰＢ２タンパク質をコードする、実施形態（１）及び（１０）～（１４）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（１６）ＮＰ遺伝子セグメントが、配列番号８のアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードする、実施形態（１）及び（１０）～（１５）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（１７）選択されたアミノ酸が、ウイルスの、Ｖｅｒｏ細胞株における少なくとも１０回の連続継代後、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰタンパク質のうちの少なくとも１において保存される、実施形態（１）及び（１０）～（１６）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（１８）選択されたアミノ酸が、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２イオンチャネルタンパク質を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞株において少なくとも１０回の連続継代後に少なくともＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰタンパク質において保存される、実施形態（１）及び（１０）～（１７）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（１９）ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１が、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む、実施形態（１）～（１８）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（２０）インフルエンザウイルスが組換えインフルエンザウイルスである、実施形態（１）～（１９）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（２１）ウイルスが、ＮＡ遺伝子セグメント及びＨＡ遺伝子セグメントを更に含む、実施形態（１）～（２０）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（２２）ＨＡ遺伝子セグメントが、ＨＡ１において少なくとも１のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有するＨＡタンパク質をコードする、実施形態（２１）のインフルエンザウイルス。

（２３）ＨＡ遺伝子セグメントが、ＨＡ２において少なくとも１のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有するＨＡタンパク質をコードする、実施形態（２１）又は（２２）のインフルエンザウイルス。

（２４）ＨＡ２における少なくとも１のアミノ酸の変異が１０７位のアスパラギンである、実施形態（２３）記載のインフルエンザウイルス。

（２５）ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントが、単一のインフルエンザ株に由来する、実施形態（２１）～（２４）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（２６）ＨＡ遺伝子セグメントが、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来する、実施形態（２５）のインフルエンザウイルス。

（２７）ＮＡ遺伝子セグメントが、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来する、実施形態（２５）又は（２６）のインフルエンザウイルス。

（２８）変異型Ｍ遺伝子セグメントを更に含む、実施形態（１）～（２７）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（２９）インフルエンザウイルスが機能的なＭ２タンパク質をコードしない、実施形態（２８）のインフルエンザウイルス。

（３０）ウイルスがヒト細胞中において複製し得る、実施形態（１）～（２９）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（３１）ウイルスが、選択されたアミノ酸がないことを除いて同一であるインフルエンザウイルスと比較して、Ｖｅｒｏ細胞中において同一条件下で増殖が亢進している、実施形態（１）～（３０）のいずれかのインフルエンザウイルス。

（３２）実施形態（１）～（３２）のいずれかのインフルエンザウイルスを含む医薬製剤。

（３３）医薬製剤がワクチンである、実施形態（３２）の医薬製剤。

（３４）ワクチンが一価ワクチンとして製剤化される、実施形態（３３）の医薬製剤。

（３９）ワクチンが二価ワクチンとして製剤化される、実施形態（３３）の医薬製剤。

（４０）ワクチンが３価ワクチンとして製剤化される、実施形態（３３）の医薬製剤。

（４１）ワクチンが四価ワクチンとして製剤化される、実施形態（３３）の医薬製剤。

（４２）哺乳動物において免疫応答を誘発する方法であって、実施形態（１）～（３１）のいずれかのインフルエンザウイルス又は実施形態（３２）～（４１）のいずれかの医薬製剤を哺乳動物に投与することを含み、それによって、哺乳動物において免疫応答を誘発する、方法。

（４３）哺乳動物がヒトである、実施形態（４２）の方法。

（４４）Ｖｅｒｏ細胞株においてインフルエンザウイルスを連続的に継代することを含む、実施形態（１）～（１３）のいずれかの、インフルエンザウイルスを生成する方法。

実施例
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、当然ながら、決してその範囲を制限するとして解釈してはならない。

実施例１
本実施例は、種々のバックボーンを有するウイルスの、Ｖｅｒｏ細胞中における増殖を比較する。

Ａ型インフルエンザ Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４（「ＰＲ８」）株に由来する変異バックボーン遺伝子セグメントを含む、Ｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，６：８１４８（２０１５）に記載の高収量ＰＲ８（「ＰＲ８－ＨＹ」）バックボーンを用いて、季節性ワクチン中に存在する２のＡ型インフルエンザ亜型を代表する２の異なるインフルエンザウイルス：Ａ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／１５／２０１３（ＭＡ１５；Ｈ１Ｎ１）及びＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｂｒｉｓ１０，Ｈ３Ｎ２）由来のＨＡ及びＮＡをコードするＭ２ＳＲウイルスを作製した。

具体的には、これらのウイルス由来のＨＡ及びＮＡ遺伝子セグメントをコードするｃＤＮＡを、ＰＲ８－ＨＹバックボーン遺伝子セグメント及びＭ２ＳＲ Ｍ遺伝子セグメント（配列番号１１）をコードするｃＤＮＡと共にトランスフェクションした。実施例８に記載の通りに、ＭＡ１５に由来するＨＡはＶｅｒｏ適応（ＭＡ１５Ｖ）であった。２ウイルス、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＢｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ－ＨＹを作製した。ウイルスは、本明細書に記載の通り、標準的なウイルスレスキュー技術によって作製し、Ｍ２を安定的に発現するＭＤＣＫ細胞（即ち、Ｍ２ＣＫ細胞）中において増幅した。

Ａ型インフルエンザウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）セグメント、即ち、インフルエンザＰＲ８－ＨＹバックボーン由来の、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ ｖＲＮＡセグメント、及びＭ２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体を欠くＭ ｖＲＮＡセグメント、並びにインフルエンザ Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７（Ｂｒｉｓ１０、Ｈ３Ｎ２）又はＡ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／１５／２０１３（ＭＡ１５Ｖ）のＨＡ及びＮＡ ｖＲＮＡセグメントを、ＲＮＡポリメラーゼＩ発現カセットにクローン化した（Ｓａｒａｗａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ、３４：５０９０－５０９８（２０１６）及びＮｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：９３４５－９３５０（１９９９））。得られたプラスミドをウイルスポリメラーゼサブユニット及びＮＰ発現プラスミドとともに２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、上清に放出されたウイルスをＭ２ＣＫ細胞中において増幅した。

ＰＲ８－ＨＹバックボーン及び、やはりＰｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，６：８１４８（２０１５）に記載の高増殖（「ＨＧ」）Ｍ２ＳＲバックボーン（即ち、「ＵＷ－ＰＲ８バックボーン」）を有する初代のインフルエンザウイルスの増殖を、Ｍ２ Ｖｅｒｏ細胞中において比較した。比較用にこれらのウイルスの増殖を調べるため、６ｃｍディッシュ中のＭ２ＶｅｒｏＡ細胞単層を標準的な手順を用いて０．００１のＭＯＩで各ウイルスに感染させた。感染した細胞を３５℃で５日間インキュベーションした。毎日上清からアリコートを採取し、ウイルス力価を、リード・ミュンヒ法（Ｒｅｅｄ＆Ｍｕｅｎｃｈ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇｉｅｎｅ，２７：４９３－４９７（１９３８））を用いるＴＣＩＤ_５０アッセイによって測定した。

結果を、増殖曲線として図１Ａ及び図１Ｂに示す。これらの結果により、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５ＶもＢｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ－ＨＹも、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞中において、ＵＷ－ＰＲ８バックボーンよりも良好に増殖しなかったことが実証される。これは、ＰＲ８－ＨＹバックボーンが、Ｖｅｒｏ細胞中におけるウイルス増殖を亢進しないことを示す。

Ｈ３Ｎ２ウイルス（即ち、Ｂｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ－ＨＹ及びＢｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ－ＨＧ）は、Ｈ１Ｎ１ウイルス（即ち、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＨＧ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５）よりも高い力価に増殖することが観察されたので、血球凝集（ＨＡ）アッセイによってＨ３Ｎ２ウイルスの上清を評価して、ＰＲ８－ＨＹ及びＵＷ－ＰＲ８バックボーンにより、ＨＡ力価の差が実証されるか否かを決定した。図１Ｃに示すように、Ｂｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ－ＨＹのＨＡ力価は、Ｂｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ－ＨＧのそれよりも低く、このことにより、ＰＲ８－ＨＹバックボーンがＶｅｒｏ細胞中におけるウイルス増殖を亢進しないことが更に示唆された。

ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＢｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ－ＨＹが外れ値ではなく、むしろＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２亜型を有する他のウイルスの代表であることを確認するために、更なる株を用いて、ＰＲ８－ＨＹ及びＵＷ－ＰＲ８バックボーンを有するＭ２ＳＲウイルスを作製した。次いで、これらのウイルスを、本明細書に記載のＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＢｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ－ＨＹウイルスの増殖を検証するための同一方法を用いて、増殖について試験した。表１に、試験したすべての株の総括を記載する。

表１に提示された結果から明らかなように、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、及びＨ５Ｎ１ウイルス株に関して、ＰＲ８－ＨＹバックボーンは、ＵＷ－ＰＲ８バックボーンと比較して、Ｖｅｒｏ細胞中におけるウイルス増殖を亢進しない。これらの結果により、ＰＲ８－ＨＹバックボーンが、インフルエンザワクチンの製造に好適なバックボーンではないことも実証される。

実施例２
この実施例は、Ｖｅｒｏ細胞中における増殖を亢進できるウイルスの作製を実例で示す。これらのウイルスを作製するために、Ａ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／１５／２０１３（即ち、ＭＡ１５Ｖ Ｍ２ＳＲウイルス）に由来するＮＡ及びベロ適応ＨＡ又はＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（即ち、ＣＡ０７ Ｍ２ＳＲウイルス）に由来するＮＡ及びＨＡのいずれかを含み、ＰＲ８－ＨＹバックボーン（即ち、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７）を含む２のＭ２ＳＲウイルスを、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞中において連続継代した。

ウイルスを１０倍に段階希釈し、標準的なインフルエンザウイルス技術を用いて、ＴＣ－６プレート中のＭ２ＶｅｒｏＡ細胞に吸着させた。しかし、ウイルス感染の前に、細胞培養培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。３５℃で６０分間吸着後、トリプシン／ＴＰＣＫを含有するウイルス増殖培地を添加した。培養物を３５℃で４～７日間インキュベーションした。細胞変性効果及びＨＡ活性を示した最大希釈のウェルから培養上清を回収した。細胞変性効果（ＣＰＥ）は、丸まりやその他の構造的変化を検出するための、単層の、光学顕微鏡の低倍率での目視検査によって決定した。ＨＡ活性は、ＷＨＯマニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ，２０１１）に記載の通りの標準的な赤血球凝集アッセイによって決定した。シチメンチョウ赤血球（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｎｏｖｉ，ＭＮ）の０．５％懸濁液５０μＬを培養上清の段階的２倍希釈液に添加し、次いで、室温で３０分間インキュベーション後に血球凝集を評価した。赤血球を凝集させた培養上清の最大希釈の逆数を、その試料についてのＨＡ力価として記録した。

次いで、回収上清を再び段階希釈して用いて新鮮なＭ２ＶｅｒｏＡ単層を感染させた。継代履歴を表２に記載する。

継代数が増加するにつれて、ウイルスはより高希釈度で回収された。このことにより、ウイルスがＶｅｒｏ細胞中においてより高い力価に増殖することが示された。従って、過程を継代５で停止し、継代５（ｐ５）ウイルスが実際に開始（ｐ０）ウイルスよりも高い力価に増殖したか否かを増殖曲線研究において評価した。

ｐ０ウイルス及び（ｐ５）ウイルスを、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞中における増殖曲線において評価した。（ｐ０）ウイルスは、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７ウイルスであった。（ｐ５）ウイルスは、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７ウイルスと名付けた。ＦＧＨＹ１及びＦＧＨＹ２は、特にｐ５ウイルスのバックボーンを指す。

増殖曲線を評価するために、細胞単層をＭＯＩ＝０．００１で感染させ、３５℃のＣＯ_２インキュベーター内で６日間インキュベーションした。ＴＣＩＤ_５０アッセイを用いるウイルス力価測定のために、毎日アリコートを採取した。得られた増殖曲線を図２に示す。図２において破線で示されるように、継代５（ｐ５）ウイルスは、開始（ｐ０）ウイルスよりも高いウイルス力価及びより速い増殖動態を実証した。

実施例３
本実施例は、実施例２のＭ２ＶｅｒｏＡ細胞に中おける継代５ウイルス（即ち、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７）に関連する増殖特性の増加をもたらした変異を特定する。

ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７を、実施例２の方法に従って連続継代し、全ウイルスゲノム配列を、継代６（ｐ６）ウイルス、即ち、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７について決定した。具体的には、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてウイルス感染細胞の上清からウイルスＲＮＡを抽出し、ウイルスゲノムの８セグメントすべてをマルチセグメント逆転写反応で増幅する１２塩基対のユニバーサルプライマーによってｃＤＮＡを作製し、Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４６：２２７５－２２８９（２００１）に記載の通りのプライマーを用いてインフルエンザ遺伝子を増幅した。遺伝子特異的プライマーを用いて、バルクｃＤＮＡ配列を得た。次いで、得られたｃＤＮＡ配列を、同一でない残基を強調するように指定されたプログラムパラメーターによる配列比較アルゴリズムを用いて、参照配列として機能する開始プラスミド配列にアラインメントした。表３は、ＵＷ－ＰＲ８バックボーン及びＰＲ８－ＨＹバックボーンと比較して各遺伝子で観察されたアミノ酸の変化を示す。

表３に見られるように、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７ウイルスのバックボーンは、異なる変異を含み、ＦＧＨＹ１及びＦＧＨＹ２バックボーンは異なる。例えば、ＦＧＨＹ１は、ＰＲ８－ＨＹバックボーンと比較して、ＰＢ１タンパク質中４６４位のアミノ酸、及びＮＰタンパク質中２９４位のアミノ酸での変異を含み、一方ＦＧＨＹ２は、ＰＲ８－ＨＹバックボーンと比較して、ＰＢ１タンパク質中６０７位のアミノ酸、ＰＢ２タンパク質中、４６７位及び５２９位のアミノ酸、及びＮＰタンパク質中、３１１位のアミノ酸での変異を含む。

ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７は、ＨＡ２におけるＶｅｒｏ適応変異を更に含んだ。具体的には、実施例８に記載の通り、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖは、ＨＡ２中の１０７位に、スレオニンがアスパラギンに変化したＶｅｒｏ適応変異を含んだ。Ｖｅｒｏ適応ＨＡ－ＭＡ１５Ｖのアミノ酸配列は配列番号１３である。連続継代後、ＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７は、表５Ｂに示す通り、ＨＡ中の４９６位に変異を生じさせた。

ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７ウイルスにおいて観察されたアミノ酸変化が高収量特性を付与することを確認するために、本明細書中に記載のウイルスレスキュー技術を使用して、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖウイルスを再作製した。

具体的には、当該技術分野で公知の標準的な分子的技術を用いて、個々のバックボーン遺伝子を、ｐＰｏｌＩプラスミドにクローン化した。これらの遺伝子としては、それぞれ配列番号２及び配列番号１によって識別される、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ ｐ６のＰＢ１及びＮＰ遺伝子（即ち、ＦＧＨＹ－ＰＢ１及びＦＧＨＹ１－ＮＰ）並びに、それぞれ、配列番号４、配列番号５、及び配列番号３によって識別される、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７のＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰ遺伝子（即ち、ＦＧＨＹ２－ＰＢ１、ＦＧＨＹ２－ＰＢ２、及びＦＧＨＹ２－ＮＰ）が挙げられる。次いで、実施例１に記載の方法と同様のプラスミドベースのインフルエンザウイルスレスキュー方法を用いることにより、Ｍ２ＳＲウイルスを作製した。該ウイルスは、ＨＡ－ＭＡ１５Ｖ及びＮＡ－ＭＡ１５を更に含んだ。

次いで、作製したＭ２ＳＲウイルス（即ち、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ）を、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞における増殖動態について評価した。比較の基準として、標準のＭ２ＳＲバックボーン（ＵＷ－ＰＲ８）及びＰＲ８－ＨＹウイルス（即ち、それぞれＨＧ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ）を用いた。６ｃｍディッシュ中において増殖したＭ２ＶｅｒｏＡ細胞を感染多重度（ＭＯＩ）０．００１で感染させた。トリプシン／ＴＰＣＫ（１μｇ／ｍＬ）を含有するウイルス増殖培地を添加し、細胞を３５℃で７日間インキュベーションした。アリコートを毎日採取し、ウイルス力価の測定まで－８０℃で保存した。

得られた増殖曲線を図３に示す。図３に示すように、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖは、ＨＧ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖよりも速く増殖した。ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖは、ピーク力価にも、ＨＧ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖ及びＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５Ｖより早く到達し、２～３日早く頭打ちになった。これらの結果により、継代したウイルス（即ち、ＦＧＨＹ１及びＦＧＨＹ２バックボーンを有するウイルス）に見られるアミノ酸変異が高収量の特徴を付与し、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞において低い感染多重度で感染を促進することが示される（これはワクチン製造において非常に望ましい特性である）。

実施例４
本実施例は、ＦＧＨＹ１についてのＰＢ１及びＮＰタンパク質並びにＦＧＨＹ２についてのＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰタンパク質における変異が、ＨＡ及びＮＡ亜型とは無関係に、インフルエンザウイルスの高増殖特性の付与に関与することを示す。従って、本実施例は、ＦＧＨＹ１及びＦＧＨＹ２バックボーンを、季節性及び汎発性インフルエンザのワクチンの製造のために、種々のインフルエンザＨＡ及びＮＡで更新できることを示す。

季節性インフルエンザＨ３Ｎ２のＨＡ及びＮＡ（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７）を有するＭ２ＳＲウイルスを、本明細書に記載の標準的なインフルエンザウイルスレスキュー技術によって作製した。Ｍ２ＳＲの４ウイルス、即ち、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０に加えて、比較の基準、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０（ＰＲ８－ＨＹバックボーン）及びＨＧ－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０（ＵＷ－ＰＲ８バックボーン）を作製した。すべてのウイルスはＨ３Ｎ２のＨＡ及びＮＡタンパク質を発現した。ＨＡ及びＮＡタンパク質は、Ｖｅｒｏ適応変異を含まなかった。

ＭＯＩ＝０．００１で感染させたＭ２ＶｅｒｏＡ細胞において、ウイルス増殖評価を行った。アリコートを毎日回収し、ウイルス力価をＴＣＩＤ_５０アッセイによって測定した。ＨＡ産生を評価するために、赤血球凝集アッセイによって上清も評価した。得られた増殖曲線を、ウイルス力価及びＨＡ力価に関して、それぞれ図４Ａ及び４Ｂに示す。図４Ａに示すように、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０の両方が、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０及びＨＧ－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０よりも早く、より高いウイルス力価に増殖した。更に、図４Ｂに示すように、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－Ｂｒｉｓ１０の両方が、他の２ウイルスと比較して迅速なＨＡ力価動態を実証した。

これらの結果により、ＦＡＧＨＹ１及びＦＧＨＹ２バックボーンを含むウイルスが、ＨＡ及びＮＡ表面タンパク質の亜型とは無関係に、ＵＷ－ＰＲ８又はＰＲ８－ＨＹバックボーンのいずれかを含むウイルスよりも速く増殖することが実証される。ＦＧＨＹ１及びＦＧＨＹ２バックボーンにより、季節性Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ及びＮＡを有するウイルスは、感染性ウイルスの製造とＨＡの製造（即ち、生ワクチン又は不活化ワクチン）の両方に関して、Ｖｅｒｏ細胞中においてより速く増殖することが可能になる。ＦＧＨＹ１及びＦＧＨＹ２バックボーンにより、汎発性のＨＡ及びＮＡを有するウイルスが、Ｖｅｒｏ細胞中においてより速く増殖することも可能になる。

ＦＧＨＹ１バックボーン、並びに複数のＡ型インフルエンザの亜型、即ち、季節性（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２）及び汎発性（Ｈ５Ｎ１）のＨＡ及びＮＡを含むＭ２ＳＲウイルスを作製した。ＭＯＩ＝０．００１で、前述のようにＭ２ＶｅｒｏＡ細胞で増殖研究を行い、それをＵＷ－ＰＲ８、ＰＲ８－ＨＹ、及びＦＧＨＹ１バックボーンを含むＭ２ＳＲウイルスを比較した。得られた増殖曲線を、Ｈ１Ｎ１（ＭＩ４５）、Ｈ３Ｎ２（ＨＫ４８０１）、及びＨ５Ｎ１（ａｖＶＮ１２０３）ウイルスについて、それぞれ図５Ａ、５Ｂ、及び５Ｃに示す。

提示したデータから明らかなように、ＦＧＨＹ１バックボーンは、より速い増殖動態及びより高い力価を示した。このことにより、ＦＧＨＹ１バックボーンが増殖の利点を提供することが更に示され、それがワクチン製造のために用られるのに好適であることが示された。

図５Ａは更に、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＩ４５ウイルス及びＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＩ４５Ｖウイルスの間の比較、即ち、スレオニンがアスパラギンに変更された、ＨＡ２中の１０７位にＶｅｒｏ適応変異を更に含むウイルスを示す。従って、図５Ａに示す結果により、ＨＡタンパク質におけるＶｅｒｏ適応変異が、本明細書に記載のバックボーンの増殖効果の増強を更に提供し得ることも実証される。

実施例５
本実施例は、ＵＷ－ＰＲ８及びＨＹ－ＰＲ８バックボーンを含むウイルスがＭＤＣＫ細胞中において増殖する一方で、かかるウイルスはＶｅｒｏ細胞中において示す増殖がより弱いことを実証する。一方、ＦＧＨＹ１バックボーンを含むウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞中においてより多い収量を示す。

図６は、Ｍ２ＣＫ及びＭ２ＶｅｒｏＡ細胞中において４日間増殖した、種々のバックボーン（即ち、ＵＷ－ＰＲ８、ＨＹ－ＰＲ８、及びＦＧＨＹ１）を含むＭ２ＳＲウイルス（即ち、Ｂｒｉｓ１０（Ｈ３Ｎ２）、ＨＫ４８０１（Ｈ３Ｎ２）、ＭＡ１５Ｖ（Ｈ１Ｎ１）、及びａｖＶＮ１２０３（Ｈ５Ｎ１））のウイルス力価を示す。ウイルスを、標準的なインフルエンザウイルスレスキュー技術を用いて作製し、実施例１～４に詳述されている方法と同様の方法を用いて評価した。図６に提示したデータにより、ＦＧＨＹ１バックボーンが、ＭＤＣＫ細胞と比較して、Ｖｅｒｏ細胞中における季節性及び汎発性インフルエンザ亜型ウイルスの増殖を特異的に支持することが示される。

同様に、表４に提示するデータにより、ＦＧＨＹ１が、Ｖｅｒｏ細胞中において複数の亜型のウイルスの増殖を亢進し、それにより、ＭＤＣＫ細胞において産生される力価により近い力価がもたらされることが実証される。

これらの結果により、ＦＧＨＹ１バックボーンにおける変異が、Ｖｅｒｏ細胞中における宿主制限を克服し、Ｖｅｒｏ細胞が、ワクチン製造に関して、よりＭＤＣＫ細胞のように挙動し得ることが示される。

実施例６Ａ
本実施例は、ＦＧＨＹ１及びＦＧＨＹ２バックボーンの遺伝的安定性を評価する。

本明細書に記載のウイルスレスキュー技術によって作製したＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５及びＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７ウイルスを、Ｍ２ＣＫ細胞中において２回、次いで、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞中においてそれぞれ２０回及び９回継代した。各継代で、前の継代から回収した組織培養上清を１：１０から１：１０，０００，０００まで段階的に１０倍希釈して用い、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞の新鮮な単層に感染させた。感染後、ＣＰＥ及びＨＡ力価について、培養上清を検証した。感染後３日目から７日目の間のどこかでＣＰＥ及びＨＡ力価を示した最大希釈から上清を回収した。ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７は、Ｖｅｒｏ細胞中において継代４で作製した。

継代の終わりに、ウイルスゲノム全体についてヌクレオチド配列を決定し、Ｖｅｒｏ細胞中における継代４からの開始配列（即ち、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７）と比較した。結果を表５Ａ及び５Ｂに示す。

表５Ａに示す結果から明らかなように、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞中における更なる１６回の継代後、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＭＡ１５は、ＰＢ１及びＮＰタンパク質において同一のアミノ酸変化を保持した。ＮＰタンパク質は、５０位のアミノ酸に１の更なる変異、即ちセリンからアスパラギンへの変異を獲得した。表５Ｂに示す結果から明らかなように、ＨＹ－Ｍ２ＳＲ－ＣＡ０７も、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞中における更なる５回の継代後、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰタンパク質中に開始ウイルスと同一の変異を保持した。これらの結果により、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ及びＦＧＨＹ２－Ｍ２ＳＲバックボーンがＭ２ＶｅｒｏＡ細胞中において安定しており、従ってワクチンバックボーンとして用いるのに好適であることが実証される。

実施例６Ｂ
ＦＧＨＹ１バックボーンの安定性を更に実証するために、インフルエンザ Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４ ＦＧＨＹ１ Ｍ２ＳＲ（Ｈ３Ｎ２）を、ＢＭ２Ｖｅｒｏ細胞中において連続継代した。ＢＭ２Ｖｅｒｏ細胞は、インフルエンザＢＭ２タンパク質、即ちインフルエンザのＢ血清型のイオンチャネルタンパク質を発現するＶｅｒｏ細胞である。ＢＭ２タンパク質と相互作用するＡ型ウイルスに対する強い選択圧が予想された。しかし、１３継代後、ウイルスゲノムの配列が決定され、驚くべきことに、サイレントアミノ酸変異のみが観察された。表６に示す結果により、ＦＧＨＹ１バックボーンの安定性が更に例証される。

実施例７
本実施例は、Ｍ２ＳＲ－ＦＧＨＹ１ウイルスが、ヒト細胞中において複製することができ、Ｖｅｒｏ細胞における増殖の亢進が種特異的ではないことを実証する。

初代のＭ２ＳＲバックボーン（ＵＷ－ＰＲ８）は、ヒト被験者で試験され（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２８２２１０５）、免疫応答を誘発することが示されている。このことにより、それがヒト細胞中において機能的であることが示される。従って、初代のバックボーンを、Ｍ２ＳＲ－ＦＧＨＹ１がヒト細胞中において複製することができ、ひいては臨床候補として通用するか否かを判断するための比較の基準として用いた。

試験した２ウイルスは、Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス Ａ／香港／４８０１／２０１４（ＨＫ４８０１）のＨＡ及びＮＡについてコードしていた。２ウイルス、Ｍ２ＳＲ－Ｏｒｉｇｉｎａｌ－ＨＫ４８０１（ロット番号Ｂ１７Ａ１２ＹＨ１）及びＭ２ＳＲ－ＦＧＨＹ１－ＨＫ４８０１（ロット番号Ｂ１７Ａ２３ＹＨ１）を、ヒト肺上皮細胞株であるＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１８５）中における感染について、ＷＨＯインフルエンザマニュアルに記載の通りの感染細胞ＮＰ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プロトコルを用いて９６ウェルプレート中において試験した。

感染後２日目に、細胞を細胞内のインフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）について抗ＮＰモノクローナル抗体で染色し、ＥＬＩＳＡとして処理して、ＴＣＩＤ_５０力価を決定した。Ａ５４９力価をＭ２ＣＫ力価に正規化するために、Ｍ２ＣＫ細胞中において標準のＴＣＩＤ_５０アッセイを行い、各ウイルスについてウイルス力価を取得した。表７に、各細胞株における各ウイルスについてのウイルス力価及び２細胞株間の比を記載する。２ウイルスについて該比は類似しており、それにより、Ｍ２ＳＲ－ＦＧＨＹ１－ＨＫ４８０１が、Ｍ２ＳＲ－Ｏｒｉｇｉｎａｌ－ＨＫ４８０１と同様に、ヒト細胞株において増殖することが示される。

実施例８
本実施例は、Ｖｅｒｏ細胞中における野生型ウイルスの継代により、ＨＡ遺伝子セグメント（例、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍのＨＡ２領域）における変異を獲得することによって、より良好なウイルス増殖が可能になり得ることを実証する。

インフルエンザ Ａ／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／１５／２０１３（Ｈ１Ｎ１）（ＭＡ１５）（例、親ウイルス）を、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＩＲＲ，カタログ番号ＦＲ－１３１９、ロット番号６２５２５２０２）から入手し、Ｖｅｒｏ細胞中において継代し、ＭＤＣＫ細胞中において増幅した。継代８の組織培養上清中のウイルスＲＮＡを抽出し、ＨＡ及びＮＡセグメントのヌクレオチド及び対応するアミノ酸配列を決定した。継代８からのＨＡ配列は、４５１位（配列番号１３）（即ち、ＨＡ２における１０７位）のアミノ酸である、親ウイルスからの１のアミノ酸変化を含んでいた。具体的には、スレオニンがアスパラギンに変化した。独立したウェルからの２の別々の独立した継代が、同一の適応変異をもたらした。

ＭＡ１５（ＭＡ１５Ｖ）（配列番号１３）からのこのＶｅｒｏ適応ＨＡ２変異は、ＭＩ４５（ＭＩ４５Ｖ）に由来するベロ適応ＨＡに関して、実施例４に記載された変異と類似している。図５Ａから明らかなように、かかる変異はＶｅｒｏ細胞中におけるウイルス増殖を促進する。

Ｖｅｒｏで継代したインフルエンザＨＡ（例、Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ ＨＡ）のＨＡ（例、ＨＡ２）における他のアミノ酸変化により、ＨＡタンパク質が、より低いｐＨにおいて安定化され、ウイルスのＶｅｒｏ細胞への感染が更に促進されることが示されている。例えば、Ｃｏｔｔｅｒ，Ｊｉｎ，ａｎｄ Ｃｈｅｎ，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，１０（１）：ｅ１００３８３１（２０１４）；Ｍａｕｒｅｒ－Ｓｔｒｏｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｃｕｒｒ，２：ＲＲＮ１１６２（２０１０）；及び Ｒｕｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１３（６）：１６３６－１６４１（２０１６）を参照。従って、本明細書に記載のＨＡ変異は、より低いｐＨにおけるＨＡタンパク質の安定性にも影響し得る。

図７Ａは、Ｖｅｒｏ適応の間に出現したＨ１Ｎ１ウイルスにおけるＨＡタンパク質のアミノ酸配列における変異を示す表である。具体的には、表７Ａは、本明細書に記載のＭＡ１５Ｖ（２０１３ Ｍａｓｓ １５）及びＭ１４５Ｖ（２０１５ ＭＩ４５）由来のＶｅｒｏ適応変異を示す。図７Ａの表は更に、Ｖｅｒｏ細胞において６回継代されたインフルエンザウイルス、即ち、Ａ／Ｓｌｏｖｅｎｉａ／２９０３／２０１５（２０１５ Ｓｌｏｖｅｎｉａ）、Ａ／Ｌｉｓｂｏａ／３２／２０１５（２０１５ Ｌｉｓｂｏａ）、Ａ／Ｓｃｏｔｌａｎｄ／Ｐ２／２０１５（２０１５ Ｓｃｏｔｌａｎｄ）、及びＡ／Ｍｏｎｔａｎａ／５０／２０１６（２０１６ Ｍｏｎｔａｎａ ５０）に由来するＶｅｒｏ適応ＨＡを示す。

図７Ｂは、Ｈ３Ｎ２ウイルス（即ち、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６）に由来するＶｅｒｏ適応ＨＡの核酸配列における変異及びアミノ酸配列における結果的な変異を示す表である。図７Ｂの表から明らかなように、そこに示される各ＨＡについてのあり得るアミノ酸変異は、以下の通りである：Ｔ１７６Ｋ、Ｌ２１０Ｐ、Ｔ２１９Ｉ、Ｓ２２１Ｐ、Ｄ２４１Ｇ、Ｐ２４３Ｈ、Ｋ４０７Ｅ、Ｄ４３５Ｎ、Ｅ４５９Ｋ、及び／又はＲ４７２Ｇ。「臨床の」ＨＡは野生型ＨＡと相互に関連がある。ＨＡ名Ｖ１からＶ８は、様々な継代により取得した様々なＨＡの配列と相互に関連がある。影付きのボックスは、アミノ酸変異をもたらすヌクレオチド変異を示す。起源の列には、開始ウイルスの継代履歴を記載する。

図７Ｃは、図７Ｂに示されるように、種々のＨＡ変異を含むＭ２ＳＲ Ｓｉｎｇ２０１６ウイルス（即ち、Ｍ２ＳＲ Ｓｉｎｇ２０１６ Ｖ５、Ｍ２ＳＲ Ｓｉｎｇ２０１６ Ｖ５ Ｒ２、及びＭ２ＳＲ Ｓｉｎｇ２０１６ Ｖ６）の、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞中における増殖曲線を示す。これらのウイルスは、ＦＧＨＹ１バックボーンも含んでいた。Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞単層を、０．００５のＭＯＩで各ウイルスに感染させた。表示した時点で感染性上清を採取し、ウイルス力価をＭ２ＣＫ細胞におけるＴＣＩＤ_５０アッセイによって決定した。最もＶｅｒｏに適応した変異を有するＭＳＲＳｉｎｇ２０１６（即ち、Ｍ２ＳＲ Ｓｉｎｇ２０１６ Ｖ６）が、最も高い増殖を示した。

実施例９
本実施例は、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスがインビボで弱毒化されることを実例で示す。

７週齢のＢＡＬＢ／ｃ、雌性マウスを、以下：Ｈ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ（これらは両方とも、配列番号１１に記載の変異体Ｍセグメントを含有していた）のウイルス変異体のうちの１で鼻腔内免疫した。これらの変異体は、マウスあたり１ｘ１０^６ＴＣＩＤ_５０の用量で投与した。マウスのコントロール群にはＳＰＧを与えた。免疫後１４日間、マウスを、体重及び感染症の症状の任意の変化について観察した。

ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ変異体やＳＰＧコントロールで免疫したマウスでは、感染の臨床症状や体重減少は、１４日の期間にわたって観察されなかった。図１０は、免疫後のマウスの体重変化率を示す。更に、群間の体重の変化は、１４日の期間にわたって同等であった。これらの結果により、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスが弱毒化されており、マウスにおいて病原性がないことが示される。

実施例１０
ある種由来の細胞中における増殖の利点を付与するバックボーンは、宿主制限を示し、標的宿主において抗原を複製及び／又は産生しないことが期待され得る。しかし、本実施例は、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスの抗原産生がヒト細胞株において制限されないことを実証する。

以下：Ａ５４９（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－１８５）ヒト肺がん；Ｃａｌｕ－３（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ－５５）ヒト肺腺がん；及びＭＲＣ－５（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－１７１）ヒト肺線維芽細胞、のヒト細胞株を試験した。これらの細胞株はヒトの気道に由来し、インフルエンザワクチンウイルスのための標的基体（ｔａｒｇｅｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を代表する。インフルエンザウイルスの増殖用に用いたコントロール細胞株は、ＭＤＣＫ（Ｓｉｇｍａ番号８４１２１９０３）細胞及びＶｅｒｏ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－８１）細胞であった。

感染の１日前に、細胞を６０ｍｍのディッシュ中に播種し、概ねＭＯＩ＝０．５の以下のウイルス：ＵＷ－ＰＲ８（「ＨＧ」）バックボーンを示す初代、ＦＧＨＹ１、及びＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のバックボーン遺伝子セグメントを含む、ＣＤＣからの、複製しているワクチン再集合ウイルスであるＩＶＲ－１４７で免疫した。これらのウイルスはすべて、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／２００７由来のＨＡ及びＮＡを発現していた。細胞のサブセットを、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６由来のＨＡ及びＮＡを発現する初代及びＦＧＨＹ１を含むウイルスに感染させた。３５℃でウイルス感染後１又は２日間、培養培地に１０％ＦＣＳを添加した。培養培地中及び培養表面上の細胞を回収し、１０％緩衝ホルマリンで固定した。細胞をＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ，カタログ番号５５４７１４）中において透過処理し、インフルエンザＮＰタンパク質をＦＩＴＣ標識マウス抗Ａ型インフルエンザＮＰモノクローナル抗体（Ｄ６７Ｊ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号ＭＡ１－７３２２）により染色した。フルオレセイン強度を、ＢＤ ＬＳＲＩＩで測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。

単一細胞集団を、前方散乱高（ＦＳＣ－Ｈ）対前方散乱面積（ＦＳＣ－Ａ）でゲートし、ＦＩＴＣ陽性及び陰性細胞を、側方散乱面積（ＳＳＣ－Ａ）対ＦＩＴＣで分離した。ＦＩＴＣ陽性細胞はウイルス感染細胞と考えられ、ＦＩＴＣ強度の強さは細胞中のＮＰ発現の量を反映する。

得られたＮＰ発現レベルデータを図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、及び９Ｂに示す。

図８Ａ及び８Ｂは、ＦＧＨＹ１ウイルスが、ＩＶＲ－１４７やＨＧウイルスと比較して、種々の細胞株において同様のレベルのＮＰを発現することを示す。

図９Ａ及び９Ｂは、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスが、ヒト細胞株において、他のウイルスと比較して同様又はより高い比率の、高いＮＰレベルを発現する細胞を有することを示す。これらの結果により、ＦＧＨＹ１ウイルスがヒト細胞株に感染し、インフルエンザ抗原を産生し得ることが実証される。従って、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスは、ヒト被験者に投与する場合、免疫を誘導すると予想される。

実施例１１
本実施例は、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンが、宿主への毒性なしに、反復投与時に増加する、インビボでの抗体応答を誘発することを実証する。
要約

ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンウイルスが、宿主に毒性を引き起こすことなく成分に対する免疫応答を誘発することを実証するために、１５匹の雄性及び１５匹の雌性のフェレットを、１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０（低用量）又は１ｘ１０^９ ＴＣＩＤ_５０（高用量）の用量レベルでＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンで鼻腔内免疫した。フェレットの第３の群は、プラセボコントロールとしてＳＰＧで鼻腔内に模擬免疫した。各治療群に、３回投与のワクチン接種計画を利用した。フェレットに、初回免疫（研究１日目）並びに、１３日後及び２７日後（研究１４日及び２８日）の２回の追加免疫を施した。各免疫後、フェレットを死亡率に関して７日間観察し、体重、体温、臨床症状を毎日測定した。臨床病理学を評価するために、研究前及び研究１４、１６、３０、及び４９日目に、生き残ったすべてのフェレットから血液を採取した。血清試料を、研究前及び研究１４、３０、及び４９日目に回収し、ＥＬＩＳＡ、赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイ、及びウイルス中和（ＶＮ）アッセイによって経時的な抗体レベルを評価した。体の外面、すべての開口部、頭蓋、胸腔、腹膜腔、及びそれらの内容物の検査を含む剖検を、研究３、３０、及び４９日目に、群あたりに５匹の雄及び５匹の雌に対して行った。
Ｂ．材料及び方法

ワクチンウイルス免疫。フェレットを、１ｘ１０^８ ＴＣＩＤ_５０の用量又は１ｘ１０^９ ＴＣＩＤ_５０の用量のいずれかで３回分のＨ３Ｎ２ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンで鼻腔内免疫した。凍結ワクチンウイルスストックのバイアルを室温で少なくとも１０分間解凍し、次いで使用するまで冷蔵又は湿った氷上で保管した。フェレットをケタミン／キシラジンで麻酔し、ウイルス１回分を体積５００μＬ（１鼻孔あたり２５０μＬ）で鼻腔内投与した。

インフルエンザ Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）のＨＡ及びＮＡ遺伝子をコードするＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンウイルスは、機能的なＭ２タンパク質を発現しない組換えＡ型インフルエンザウイルスである。Ａ型インフルエンザウイルスのＭ遺伝子セグメントは、配列番号１１で表される。

実験計画。研究開始時に１６～２２週齢の９０匹のフェレット（Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍｓ，Ｓａｙｒｅ ＰＡ）、４５匹の雄及び４５匹の雌を研究に利用した。すべての動物の手順は、ＩＩＴ研究所の動物管理及び使用委員会によって承認されたプロトコルに従って、動物のバイオセーフティーレベル２の施設で行われた。免疫前に、フェレットを４日間モニターして、基底値の体温を明らかにした。温度の測定値を、各フェレットにおいて皮下に埋め込まれたトランスポンダー（ＢｉｏＭｅｄｉｃ ｄａｔａ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅａｆｏｒｄ，ＤＥ）を介して毎日記録した。研究開始前に液血を採取し、インフルエンザ抗体について血清検査した。免疫前の血清試料を受容体破壊酵素（ＲＤＥ）（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で処理して非特異的阻害剤を除去し、次いで段階希釈して、定義された量のインフルエンザ Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１），Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６ （Ｈ３Ｎ２），Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（Ｙａｍａｇａｔａ系統）、及びＢ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／０６／２０１７（Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）ウイルスに対して試験し、０．５％のシチメンチョウ赤血球と混合した。抗体力価は、赤血球凝集の阻害を引き起こす最低の血清希釈によって定義した。ＨＡＩ力価が４０未満のフェレットのみを血清陰性と見なし、本研究に用いた。研究動物を無作為化し、３群に分けた（群あたり１５匹の雄及び１５匹の雌のフェレット）。

ワクチンの有効性及び毒性を評価するために、フェレットを、研究１、１４、及び２８日に、１×１０^８ ＴＣＩＤ_５０の用量３回分又は１×１０^９ ＴＣＩＤ_５０の用量３回分のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲで鼻腔内免疫した。コントロール群を、研究１、１４、及び２８日にＳＰＧで鼻腔内に模擬免疫した。フェレットの体温、体重、及び臨床症状を、免疫後７日間毎日モニターした。生存しているすべてのフェレットから、研究－５、１４、１６、３０、及び４９日目に血液を採取して臨床病理を評価した。血清試料を、研究－５、１４、３０、及び４９日目に回収し、ＥＬＩＳＡ、ウイルス中和アッセイ、及びＨＡＩアッセイによる抗体力価の測定まで約７０℃に保持した。すべての研究動物を、予定された日（３、３０、又は４９日目、群あたり５匹の雄及び５匹の雌）に安楽死させ、剖検した。剖検は、体の外面、すべての開口部、並びに頭蓋、胸腔、腹膜腔とその内容物の検査で構成した。組織を、有資格の獣医病理学者によって組織病理学的に収集、固定、及び評価した。
Ｃ．結果

罹患率／死亡率及び臨床的観察：すべてのフェレットは、予定したそれらの屠殺日まで生存した。Ｈ３Ｎ２ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲを受容した群において観察された最も一般的な臨床徴候は下痢であった。しかし、ＳＰＧコントロール群中の動物も下痢を示した。すべてのフェレットの活動レベルスコアは、１～４９日目の間に測定されたすべての時点について「０」（アラート（ａｌｅｒｔ）及びプレイフル（ｐｌａｙｆｕｌ））であった。ただし、ＳＰＧコントロール群由来の雄１匹及び雌１匹は、２０日目にスコア「１」（アラート、ただし刺激された場合のみプレイフル）を与えられた。

体重及び体重変化：いくつかの群で、ＳＰＧコントロールと比較した統計的に有意な平均体重変化の差が生じたが、これらの差は無作為に分布しているように見え、顕著ではなかった。

体温：いくつかの群において、ＳＰＧコントロール群と比較して統計的に有意な平均体温の上昇及び低下が生じたが、これらの差は無作為に分布しているように見え、顕著ではなかった。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：血清試料からの抗ＨＡ ＩｇＧ抗体力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＬＩＳＡプレートをＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）の組換えＨＡタンパク質でコーティングし、スキムミルクによりブロッキングし、試料を塗布した。フェレットＩｇＧ抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗フェレットＩｇＧ抗体（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）及び１－Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｍａｌｔｈａｍ，ＭＡ）基質によって検出した。

血清データにおいて得られた抗Ｈ３ ＨＡ ＥＬＩＳＡ ＩｇＧ力価を図１１に示す。免疫された各群中のフェレットは、血清中の抗Ｈ３ ＨＡ抗体の有意な上昇を示したが、ＳＰＧのみを投与された動物中の抗体レベルは基底値から変化しなかった。抗Ｈ３ ＨＡ抗体力価は、初回投与の２週間後に、免疫群の方がＳＰＧコントロール群よりも高かった。免疫群あたりの平均抗体力価は、ワクチンの１回目及び２回目の投与後に更に増加した。

血球凝集阻害（ＨＡＩ）アッセイ：ＥＬＩＳＡによって検出した抗体の機能的活性を実証するために、血清試料をＨＡＩアッセイによって分析した。非特異的血球凝集の阻害剤を排除するために、血清試料をＲＤＥで処理した。ＲＤＥは、製造業者の指示書に従って再構成した。血清をＲＤＥ中に１：３希釈し、３７℃±２℃の水浴中で１８～２０時間インキュベーションした。等量の２．５％（ｖ／ｖ）クエン酸ナトリウム添加後、試料を５６±２℃の水浴中で３０±５分間インキュベーションした。ＲＤＥ処理後の最終血清希釈率が１：１０になるまで、０．８５％のＮａＣｌで構成される溶液を各試料に加えた。次いで、試料をＰＢＳ中に更に２倍希釈（１：１０から１：１２８０）し、４の血球凝集ユニットのインフルエンザ Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）ウイルスとインキュベーションした。インキュベーション後、０．５％鳥類赤血球を各試料に加え、３０±５分間インキュベーションした。次いで、血球凝集の有無を点数化した。

血清データにおいて得られた抗Ｈ３ ＨＡＩ力価を図１２に示す。高用量（１ｘ１０^９ ＴＣＩＤ_５０）群は、低用量（１ｘ１０^８ ＴＣＩＤ_５０）群よりも高いＨＡＩ力価を示す傾向があった。ＳＰＧ（コントロール）群はＨＡＩ力価を生じさせなかった。１ｘ１０^９ ＴＣＩＤ_５０における雄１匹を除いて、Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ免疫フェレットは、すべて試験ウイルスに対して８０以上のＨＡＩ力価を実証した。ＣＤＣは、４０の血清ＨＡＩ抗体力価は、集団におけるインフルエンザ感染又は疾患のリスクの少なくとも５０％の減少に関連していると述べている。従って、これらの結果により、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスが防御免疫応答を誘発できることが示唆される。

ウイルス中和アッセイ：研究前及び治療段階の血清試料（研究３、１４、３０、及び４９日目から）を、ウイルス中和アッセイにおいて、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルスに対して試験した。血清試料を、５６℃で３０分間不活化した。次いで、血清を段階的に２倍希釈し、標準化されたウイルス（８０～１４０ＰＦＵの濃度）とともに３７±２℃、５．０±１％ＣＯ_２で６０分間インキュベーションした。次いで、１００マイクロリットル（１００μＬ）の各血清とウイルスとの混合物を、ＭＤＣＫ細胞の単層を含有する９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに移した。次いで、プレート（試料を含む）を５．０±１％ＣＯ_２中３７±２℃で１８～２２時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、抗Ａ型インフルエンザ核タンパク質モノクローナル抗体プール（１パートのＭＡＢ８２５７：１パートのＭＡＢ８２５８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））、続いてペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。スポットを、ＴｒｕｅＢｌｕｅ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して発色させた。プラークは、ＥＬＩＳＰＯＴ装置（ＡＩＤ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて視覚化及び計数した。５０％プラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ_５０）を、コントロールプラークの逆滴定を基にするように、プラークを計数し、最終の血清希釈の逆数として力価を記録して、インプットのコントロールのウイルスプラーク数の５０％減少を示すことによって算出した。

血清データにおいて得られた抗Ｈ３ ＰＲＮＴ５０力価を図１３に示す。ＳＰＧ群内のすべてのフェレットは、研究期間の間、陰性

のままであった。１ｘ１０^８ ＴＣＩＤ_５０の用量でＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲで免疫したフェレットは、１４、３０、及び４９日目に、それぞれ１９１６、１８３８、及び１９７０の幾何平均力価（ＧＭＴ）のＶＮ力価を示した。１ｘ１０^９ ＴＣＩＤ５０の用量でＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲで免疫されたフェレットは、１４、３０、及び４９日目に、それぞれ４４３４、５５７２、及び６４００のＧＭＴ ＶＮ力価を示した。血清は最大１：６４００に希釈されたため、６４００超のＰＲＮＴ_５０力価は特異的に測定されなかった。３回分の１ｘ１０^９ ＴＣＩＤ_５０のＨ３Ｎ２ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲで免疫したフェレットは、すべて６４００以上のＰＲＮＴ_５０力価を示した。

臨床病理学：生存しているすべてのフェレットについて、臨床化学、血液学及び凝固パラメーターの分析のための血液試料を、頸静脈又は大静脈から、研究前及び３、１４、１６、３０、及び４９日目に採取した。血液採取前に動物を４～６時間絶食させた。ＥＤＴＡを、血液学試料用の抗凝固剤として用い、クエン酸ナトリウムを、凝固試料用に用いた。臨床化学用の試料は、抗凝固剤なしで採取した。尿試料は、剖検時に各フェレットの膀胱から直接採取した。

研究の間に評価された臨床化学又は血液学パラメーターのいずれについても、治療に関連する又は毒物学的に意味のある所見は認められなかった。ワクチン治療群において観察されたフィブリノーゲンの増加は、免疫原性物質による治療後の「予想される炎症反応」と考えられた。フィブリノーゲンは、１４日及び２１日の回復期間後にコントロールレベルに戻った。このことにより、この効果が急性且つ可逆的であることが示唆された。プロトロンビン時間（ＰＴ）の減少は、投薬の中止後に元に戻せた。従って、この影響は毒性学的な重要性は殆どないと考えられた。

肉眼的剖検及び組織病理学：肉眼的剖検及び組織病理学は、群あたり５匹の雄及び５匹の雌について、研究３、３０及び４９日目に実施した。１ｘ１０^８ ＴＣＩＤ_５０の用量でのフェレットへのＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲの鼻腔内免疫は、肉眼的所見をもたらさず、３日目及び３０日目に、肺に顕微鏡所見（混合細胞浸潤）が認められた。１ｘ１０^９ ＴＣＩＤ５０の用量では、肺に肉眼的所見が認められ（色素沈着、暗色又はまだら）、３日目及び３０日目に、肺に顕微鏡的所見（混合細胞浸潤）が認められた。３週間の回復後、研究４９日目には、試験物に関連する肉眼的病変は観察されなかった。

従って、本実施例は、Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンウイルスの鼻腔内免疫がワクチン接種された宿主に伝播せず、ワクチン関連の有害事象（例、体温の上昇、体重の減少、又は臨床的兆候）のいずれとも関連しないことを示す。これらの結果により、Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスが、単回投与後に相同な試験ウイルスに対する防御免疫応答を誘発することが示される。これは、反復投与で更に上昇させられ得、また、鼻腔内インフルエンザワクチンとして有用である。

実施例１２
本実施例は、多価ワクチンで製剤化されたＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスに対する抗体応答を誘発することを実証する。

Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１又はＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスは、一価、二価、三価、又は四価のワクチンとして製剤化した場合、抗体応答を誘発する。

７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（Ｎ＝８）を、一価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、二価のＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲ、三価のＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ並びにＢＭ２ＳＲ Ｖｉｃｔｏｒｉａ若しくはＹａｍａｇａｔａ、又は四価のＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ並びにＢＭ２ＳＲ Ｖｉｃｔｏｒｉａ及びＹａｍａｇａｔａワクチンで鼻腔内免疫した。コントロール群のマウスをＳＰＧで模擬免疫した。ワクチン接種の２８日後、マウスを、初回免疫のために投与された同一のワクチンからなる追加免疫で鼻腔内免疫した。血清試料を、初回免疫後７、１４、及び２１日目、並びに追加免疫（２８日目）後３５、４２、及び４９日目に採取した。血清試料からの抗Ｈ１ ＨＡ及び抗Ｈ３ ＨＡ血清ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定した。

得られた抗Ｈ１のＨＡデータを図１４Ａに示す。得られた抗Ｈ３のＨＡデータを図１４Ｂに示す。結果は、すべてのワクチンが抗インフルエンザウイルス抗体をＳＰＧコントロールよりも高くすることができ、これらの増加はワクチン製剤全体で同等であることを示した。これらの結果により、多価ワクチンに製剤化された場合、一価成分間に干渉がないことが実証される。

実施例１３
本実施例は、鼻腔内投与された一価又は四価のＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンが、ワクチンに含有されていない致死的なＡ型インフルエンザウイルスからマウスを防御することを示す。

実施例１２に記載のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスに、最初の免疫の７０日後（追加免疫の６週間後）に、致死量のインフルエンザ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス（＞１０マウスの５０％致死量（ＭＬＤ_５０））を接種した。一価のＨ１Ｎ１（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｍｏｎｔａｎａ／５０／２０１６）又はＨ３Ｎ２（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６） ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ及び四価のＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ及びＢＭ２ＳＲワクチンで免疫したマウスはすべて接種を生き延びた。一価のＨ１Ｎ１ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ並びに、四価のＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ及びＢＭ２ＳＲワクチンで免疫したマウスは、体重減少なしに健康を維持した。得られた体重減少データを図１５に示す。一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲで免疫したマウスは、一時的に体重減少させたが、完全に回復した。ＳＰＧのみで模擬免疫したコントロールマウスは、体重が減少し、接種後５日以内に感染症で死亡した。接種後３日目に、群あたり３匹のマウスから肺を取得し、ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイによってウイルス負荷を測定した。表８に示すように、一価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ及び四価ワクチンで免疫されたマウスの肺中のウイルス力価は検出限界未満（肺あたり７６プラーク形成単位（ＰＦＵ）未満）であった。Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲで免疫したマウスにおいてウイルス負荷が検出された（６．６０ ｌｏｇ ＰＦＵ／ｇ）。しかし、３匹のマウスの平均ウイルス力価はナイーブコントロールＳＰＧマウスよりも約１ｌｏｇ低かった（７．５２ ｌｏｇ ＰＦＵ／ｇ）。これらの結果により、Ｍ２ＳＲの一価及び四価ワクチンが交差防御を付与し、どのワクチン成分とも一致しない接種ウイルスの複製を制限することが示される。

実施例１４
本実施例は、四価のＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲが、認可された鼻腔内インフルエンザワクチンと比較して好ましい安全性プロファイルを提供し、及び、認可された筋肉内不活化インフルエンザワクチンに、ワクチンに含有されないインフルエンザウイルスに対する優れた防御を提供することを示す。抗原不連続変異の一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンは、致死的なＡ型インフルエンザウイルスからのマウスの防御において、抗原的に一致した認可ワクチンと同等の防御を提供する。

７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（Ｎ＝１３）を、以下のワクチン：一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価のＦＧＨＹ－Ｍ２ＳＲ、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ（Ｓａｎｏｆｉ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）又はＦｌｕｚｏｎｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ（Ｓａｎｏｆｉ）のうちの１で免疫した。各ワクチンについての株構成成分を表９に示す。ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ及びＦｌｕＭｉｓｔは鼻腔内投与し、両方のＦｌｕｚｏｎｅワクチンは筋肉内投与した。マウスのコントロール群を、ＳＰＧで鼻腔内に模擬免疫した。免疫後１４日間、体重の任意の変化についてマウスを観察した。

得られた体重減少データを図１６に示す。一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、四価のＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ、又はＳＰＧコントロールで免疫されたマウスは、１４日間にわたって体重減少を経なかった。しかし、ＦｌｕＭｉｓｔで免疫されたマウスは、ワクチン接種後３日目に体重が平均７％減少し、回復するのに１４日かかった。これらのデータにより、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンが、認可された弱毒生インフルエンザワクチンであるＦｌｕＭｉｓｔよりも優れた安全性プロファイルを有することが示される。

初回免疫後２８日目に、マウスを追加免疫で免疫した。追加免疫は、マウスが初回免疫で免疫されたのと同一のワクチンから構成された。初回免疫及び追加免疫の後に血清試料を毎週採取し、各ワクチン成分に対するプールされた血清ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡによって決定した。得られた抗インフルエンザ Ａ／Ｈ１ ＨＡ血清（ｓｅｒｉｕｍ）ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価データを図１７Ａに示す。得られた抗インフルエンザ Ａ／Ｈ３ ＨＡ血清（ｓｅｒｉｕｍ）ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価データを図１７Ｂに示す。得られた抗インフルエンザ Ｂ／Ｙａｍ ＨＡ血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価データを図１７Ｃに示す。得られた抗インフルエンザ Ｂ／Ｖｉｃ ＨＡ血清（ｓｅｒｉｕｍ）ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価データを図１７Ｄに示す。結果により、一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲを除くすべてのワクチンが、Ａ型インフルエンザＨ１及びＨ３ ＨＡに対する血清ＩｇＧ力価を、ＳＰＧコントロールよりも上昇させることができ、これらの上昇はワクチン製剤全体で同等であったことが示される。Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ及びＦｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅは、生ワクチンと比較して、Ｂ型インフルエンザＨＡ抗原に対する、より低い血清ＩｇＧ力価を誘発した。一価のＨ３Ｎ２ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンは、予想通り、Ｈ３ ＨＡ抗原に対してのみ血清ＩｇＧの上昇を引き起こした。

気管－肺洗浄液を、初回免疫後４９日目（追加後２１日目）に群あたり４匹のマウスから得て、ＩｇＧ及びＩｇＡ力価を、ＥＬＩＳＡによって決定し、粘膜免疫応答を評価した。得られたＩｇＧ力価データを図１８Ａに、そして得られたＩｇＡ力価データを図１８Ｂに示す。四価のＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ及びＦｌｕＭｉｓｔは、すべての試験抗原に対してＩｇＧ及びＩｇＡの両方の力価を誘発した。一価のＨ３Ｎ２ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲで免疫したマウスは、Ｈ３ ＨＡ抗原に対してＩｇＧ及びＩｇＡの力価を示したが、Ｈ１又はＢ型インフルエンザＨＡ抗原に対してはしなかった。４の抗原すべてに対するＩｇＧ力価は、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ及びＦｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅワクチンで免疫した群において上昇したが、どの抗原に対してもＩｇＡ抗体力価は検出されなかった。これらのデータにより、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンが、認可された弱毒生インフルエンザワクチンであるＦｌｕＭｉｓｔに匹敵する粘膜免疫応答を誘発するのに対し、認可された筋肉内インフルエンザワクチンは粘膜免疫応答を何ら誘発しないことが示される。

追加免疫の６週間後、マウスに致死量のインフルエンザ Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９ （Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）を接種した。ＳＰＧコントロールで模擬免疫したマウスは、接種後５日目までに感染して死亡したが、ワクチン群はすべて生存した。接種後に生じた体重変化を図１９に示す。表１０に見られるように、四価のＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ及びＦｌｕＭｉｓｔ群は、体重を何ら減少させず、接種後３日目に、肺又は鼻甲介中に接種ウイルスは検出されなかった。このことにより、これらの鼻腔内ワクチンが、連続変異インフルエンザウイルスによる致死的感染に対する殺ウイルス免疫を提供することが示唆された。一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ（接種ウイルスに対するヘテロ亜型）群、Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔ群、及びＦｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅ群中のマウスは、接種後３日目又は４日目に平均体重が１５％超減少し、次いで、接種後２１日目までに回復した。感染性ウイルスは、一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲとＦｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔでワクチン接種したマウスの肺及び鼻甲介中で検出された。Ｆｌｕｚｏｎｅ Ｈｉｇｈ Ｄｏｓｅワクチンで免疫したマウスは、一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ及びＦｌｕｚｏｎｅ Ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｔワクチンで免疫したマウスと同等の体重減少を示したが、感染性ウイルスは、肺や鼻甲介から回収されなかった。これらのデータにより、鼻腔内投与した一価のヘテロ亜型Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ（即ち、Ｈ１Ｎ１構成成分を欠いている）ワクチンが、Ｈ１Ｎ１構成成分を含有する、筋肉内投与された認可不活化ワクチンと同様にマウスを防御することが示される。

実施例１５
本実施例は、ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスの製造がＭ２ＶｅｒｏＡ細胞において拡張可能であり、宿主細胞のＤＮＡレベルが、細胞基体（ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）において産生されるワクチンについてのＷＨＯ及びＦＤＡガイドラインによって推奨されるレベルに低下することを示す。

Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞（Ａ型インフルエンザ Ｍ２タンパク質を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞）を、ＯｐｔｉＶｅｒｏ培地（ＩｎＶｉｔｒｉａ，Ａｕｒｏｒａ，ＣＯ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気で加湿インキュベーター中で培養した。ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）－５ Ｃｈａｍｂｅｒ（ＣＳ５；Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中の約２億４２００万細胞、ロットあたり３又は４のＣｅｌｌＳＴＡＣＫを、ＯｐｔｉＶｅｒｏ培地中で、インフルエンザ Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６Ｉ （Ｈ３Ｎ２）のＨＡ及びＮＡ遺伝子をコードするＨ３Ｎ２ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスに、感染多重度（ＭＯＩ）０．０１で感染させた。３５℃、５％ＣＯ_２で２～３日後、上清のＨＡ力価が少なくとも３２ＨＡＵ／５０μＬであったときに、培養培地を回収し、低速遠心分離によって細胞及び細胞残渣を除去した。上清を更に清澄化し、０．２μＭ孔のＰＥＳメンブレンを通す吸引ろ過により滅菌した。次いで、清澄化した上清を非特異的ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ，５ユニット／ｍＬ）で３７℃で２時間処理し、残留細胞ＲＮＡ及びＤＮＡを消化／加水分解した。次いで、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ消化物質を、２３５ｃｍ^２ ３００ｋＤ ＭＷＣＯ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ（ｍＰＥＳ）ＭｉｄｉＫｒｏｓ（登録商標）中空糸フィルターモジュール（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いるタンジェンシャルフローフィルター（ＴＦＦ）により精製した。該物質を１０～２０倍に濃縮した。次いで、混入した宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び残留ＤＮＡ断片を、少なくとも１５カラム体積のＳＰＧを用いる透析濾過によって除去した。ＳＰＧ緩衝液中の精製ウイルスを、２５％スクロースＰＢＳクッションによる２５，０００ｒｐｍでの超遠心分離により、更に１０～１００倍濃縮した。得られたウイルスペレットをＳＰＧ中に再懸濁し、等分し、次いで液体窒素中で瞬間冷凍した後、－８０℃で保存した。

濃縮及び精製したＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ遺伝子の配列相同性を、Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスシードストックの参照配列のものと比較した。精製したウイルスから抽出したウイルスＲＮＡを、逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）に供し、ｃＤＮＡを作製して、サンガーシーケンシングを行った。８のウイルスセグメントによってコードされたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の解析により、すべてのセグメントが、参照に対して１００％のヌクレオチド配列同一性を有することが示された。

濃縮及び精製したＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスの感染力価を、Ｍ２ＣＫ細胞（Ａ型インフルエンザＭ２を安定的に発現するＭＤＣＫ細胞）を用いる、少なくとも３回の独立した測定による５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）アッセイによって決定した。手順においては、ワクチン試料の段階希釈を９６ウェルプレート中でレプリケートのＭ２ＣＫ細胞に適用し、３５℃、５％ＣＯ_２雰囲気で４日間培養した。接種後４日目に、細胞単層を目視で検査し、ＣＰＥについて点数化する。ウイルスの力価を、リード・ミュンヒ法を用いて算出し、ＴＣＩＤ_５０／ｍＬとして表した。更に、ＨＡ活性を各ウェル上清のアリコート中で試験して、ＣＰＥによって決定されたウイルス力価を検証した。表１１に示すように、濃縮及び精製後、Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲウイルスは一貫して１０^９．８ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬを超える高力価に達した。

Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンウイルスが、濃縮及び精製後に複製欠損表現型を維持することを確認するために、任意の複製ウイルスの存在を、野生型インフルエンザウイルスについては許容するが、Ｍ２ＳＲウイルスについては許容しないＭＤＣＫ細胞における、試験物の３回連続継代によって評価した。初回の感染においては、試験ウイルスを段階希釈し、細胞単層に接種した。次いで、感染させた細胞を３５℃、５％ＣＯ_２雰囲気で４日間培養した。次いで、感染させた細胞の培養上清を新鮮なＭＤＣＫ単層に移し、３５℃、５％ＣＯ_２雰囲気で４日間インキュベーションした。３回目及び最終回の継代に関しては、この感染させた細胞の培養培地を別の新鮮なＭＤＣＫ単層に移し、３５℃、５％ＣＯ_２雰囲気で更に４日間インキュベーションした。ＭＤＣＫ細胞を、４日の３５℃培養後ごとにＣＰＥについて観察し、培養上清中のＨＡ活性を測定して、子孫ウイルス粒子の存在を確認した。感染の各回について、複製欠損参照ウイルスであるＢｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲを陽性コントロールとして試験した。ネガティブコントロール接種材料は培地のみであった。結果により、コントロールが期待通りに機能し、４の試験物のいずれを正常細胞に接種した後も、感染性の子孫が検出されなかったことが示された。従って、Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンウイルス調製物は、複製能力がなく、複製できないことが実証された。

濃縮、精製したＦＨＧＹ１－Ｍ２ＳＲ中の残留宿主細胞ＤＮＡの断片サイズを、２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）におけるキャピラリー電気泳動を用いることによって測定した。全試料ＤＮＡを、Ａｘｙｇｅｎ（登録商標）ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｉｌｉｃａ ｂｅａｄｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を用いて抽出した。試料から精製したＤＮＡをＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ）にロードし、自動キャピラリー電気泳動に供した。２１００ Ｅｘｐｅｒｔソフトウェアを用いて、データを解析し、断片を検出し、断片濃度、全ＤＮＡの相対パーセンテージを取得し、抽出した残留ＤＮＡについてサイズを塩基対（ｂｐ）で測定した。３ロットの濃縮、精製したＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲの４連の測定から得られた結果により、２１００ Ｅｘｐｅｒｔにおいて蛍光シグナル強度が低いかまったくないことが実証された。このことにより、それらに、正確なサイズ決定には不十分な残留ＤＮＡが含まれることが示された。

市販のＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 品番Ｆ５００，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ）を、濃縮、精製したＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンロット中に存在するベロ宿主ＨＣＰの定量に使用した。得られた存在するＨＣＰのデータを表１２に示す。キット中の抗体は、Ｖｅｒｏ溶解物を用いて作製及びアフィニティー精製し、ウイルス生成物の生成に用いた多くの市販のＶｅｒｏ細胞株からＨＣＰを検出することが示されている。従って、このキットは、ＶｅｒｏＨＣＰ混入物質のレベルをモニターするためのツールとして用いられ得る。キットは、製造業者のアッセイプロトコルに従って用いた。各試料の複数の希釈液を試料希釈液（Ｃｙｇｎｕｓ カタログ番号Ｉ０２８）により調製し、分析（デュプリケートで）して、試料がキットに付属の標準の範囲内で希釈直線性を示す（即ち、高用量フック効果がない）ことを確認した。４パラメーターのロジスティック回帰を用いて、標準曲線を作成し、試料の値を補間するために用いた。

試験したワクチン調製物中のＨＣＰの平均量は、１．４±１．０μｇ／ｍＬであった。これらの値は、以前に臨床試験材料（Ｂｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ、ロット番号１５１００２５１）で検出されたＨＣＰのレベルと一致する。３のワクチン調製物のＨＣＰは９９．９８％～９９．９９％減少した。

ワクチン調製物の無菌性を、医薬調製物に関するＷＨＯ規格に基づく手順によって検証した。ワクチン調製物を無菌条件下で、ルリア－ベルターニブロス（ＬＢ）、トリプシンソイブロス（ＴＳＢ）、及びチオグリコレート培地（ＴＧＭ）の３種類の液体培地に接種した。培養物を、３７℃（ＬＢ及びＴＳＢ）及び周囲温度（ＴＧＭ）で培養した。培養物を１４日間増殖させ、次いで、微生物の増殖について目視で調べた。試験したすべての調製物は、すべての増殖条件で微生物増殖について陰性であった。

Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンロットの浸透圧値を、Ｆｉｓｋｅ Ｍｏｄｅｌ ２１０ Ｍｉｃｒｏ－Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ｆｉｓｋｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）を用いて測定した。得られた浸透圧データを表１３に示す。毎日使用する前に３ポイント（５０、８５０、及び２０００ｍＯｓｍ／ｋｇ）の較正を行い、５ポイントの直線性チェック（１００、５００、９００、１５００、及び２０００ｍＯｓｍ）を毎週評価して、これらの基準が製造業者によって指定された予想値内にあることを確認した。較正及び測定は、Ｆｉｓｋｅ Ｍｏｄｅｌ ２１０Ｍｉｃｒｏ－Ｏｓｍｏｍｅｔｅｒの利用者ガイドに従って行った。試験したすべてのワクチン試料は、６０４～６１６ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内で、ＳＰＧビヒクルで検出された５９５～６２６ｍＯｓｍ／ｋｇと同様の浸透圧測定値であるとわかった。これらの値は、臨床試験材料（Ｂｒｉｓ１０ Ｍ２ＳＲ、ロット番号１５１００２５１）について得られた値と一致している。

Ｈ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲワクチンのロットは、目的の臨床材料と同様のプロセスを用いて、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞中で製造し、目的の臨床材料と同様のＳＰＧ緩衝液中で製剤化した。特性試験は、精製過程が宿主細胞の不純物（ＤＮＡ及びタンパク質）の除去に成功し、臨床材料の純度をシミュレートしたことを示したが、感染力価は高く保たれ、ワクチンウイルスのゲノム配列及び複製欠損表現型は維持された。

刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書に引用したすべての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書に組込まれる。

本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１以上の事項の列挙の後での用語「少なくとも１」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１」）は、本明細書に特記しないか又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項から選択された１の事項（Ａ若しくはＢ）又は列挙した事項のうち２以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「～を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書の値の範囲の記述は、本明細書に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書に個々に記述されているかのように本明細書に組込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に特記しないか又は文脈と特に明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書に提供される任意の及びすべての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書のすべての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。

発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載の主題のすべての改変及び均等物を含む。更に、そのすべての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書に特記しないか又は文脈と特に明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。

Claims (40)

1. ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントを含むインフルエンザウイルスであって、
   （ａ）ＰＢ１遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、４０位のロイシン及び１８０位のトリプトファン、並びに４６４位のアスパラギン又は６０７位のセリンのうちの少なくとも１を含み、ＰＢ１遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；
   （ｂ）ＰＢ２遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ２タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、５０４位のバリン、並びに場合により、４６７位のイソロイシン及び５２９位のバリンを含み、ＰＢ２遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；
   （ｃ）ＰＡ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＡタンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、４０１位のリシンを含み、ＰＡ遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；
   （ｄ）ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、１１６位のロイシン、及び２９４位のリシン又は３１１位のアルギニンのうちの少なくとも１を含む；並びに
   （ｅ）ＮＳ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＳ１タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、３０位のプロリン及び１１８位のリシンを含む
   インフルエンザウイルス。
2. （ａ）ＰＢ１遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、４０位のロイシン、１８０位のトリプトファン、及び４６４位のアスパラギンであり、ＰＢ１遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；
   （ｂ）ＰＢ２遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ２タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、５０４位のバリンであり、ＰＢ２遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；
   （ｃ）ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、１１６位のロイシン及び２９４位のリシンである
   請求項１のインフルエンザウイルス。
3. ＰＢ１遺伝子セグメントが、配列番号２によって表されるヌクレオチド配列を有する、請求項１又は２のインフルエンザウイルス。
4. ＮＰ遺伝子セグメントが、配列番号１によって表されるヌクレオチド配列を有する、請求項１～３のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
5. ＰＢ１遺伝子セグメントが、配列番号７のアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードする、請求項１～４のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
6. ＮＰ遺伝子セグメントが、配列番号６のアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードする、請求項１～５のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
7. 選択されたアミノ酸が、Ｖｅｒｏ細胞株における少なくとも１０回の連続継代後に、ＰＢ１及びＮＰタンパク質のうちの少なくとも１において保存される、請求項１～６のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
8. 選択されたアミノ酸が、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２イオンチャネルタンパク質を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞株において少なくとも１０回の連続継代後にＰＢ１及びＮＰタンパク質のうちの少なくとも１において保存される、請求項１～１７のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
9. インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスであり、選択されたアミノ酸が、Ｖｅｒｏ細胞株における少なくとも１０回の連続継代後、ＰＢ１及びＮＰタンパク質のうちの少なくとも１において保存される、請求項１～８のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
10. （ａ）ＰＢ１遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、４０位のロイシン、１８０位のトリプトファン、及び６０７位のセリンであり、ＰＢ１遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；
    （ｂ）ＰＢ２遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ２タンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、５０４位のバリン、４６７位のイソロイシン及び５２９位のバリンであり、ＰＢ２遺伝子セグメントが、場合により、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む；及び
    （ｃ）ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードし、選択されたアミノ酸が、１１６位のロイシン及び３１１位のアルギニンである
    請求項１のインフルエンザウイルス。
11. ＰＢ１遺伝子セグメントが、配列番号４によって表されるヌクレオチド配列を有する、請求項１又は１０のインフルエンザウイルス。
12. ＰＢ２遺伝子セグメントが、配列番号５によって表されるヌクレオチド配列を有する、請求項１、１０、及び１１のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
13. ＮＰ遺伝子セグメントが、配列番号３によって表されるヌクレオチド配列を有する、請求項１及び１０～１２のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
14. ＰＢ１遺伝子セグメントが、配列番号９のアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードする、請求項１及び１０～１３のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
15. ＰＢ２遺伝子セグメントが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＰＢ２タンパク質をコードする、請求項１及び１０～１４のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
16. ＮＰ遺伝子セグメントが、配列番号８のアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードする、請求項１及び１０～１５のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
17. 選択されたアミノ酸が、ウイルスの、Ｖｅｒｏ細胞株における少なくとも１０回の連続継代後、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰタンパク質のうちの少なくとも１において保存される、請求項１及び１０～１６のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
18. 選択されたアミノ酸が、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２イオンチャネルタンパク質を安定的に発現するＶｅｒｏ細胞株において少なくとも１０回の連続継代後に少なくともＰＢ１、ＰＢ２、及びＮＰタンパク質において保存される、請求項１及び１０～１７のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
19. ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ遺伝子セグメントのうちの少なくとも１が、４位のヌクレオチドの、プロモーターの、シトシンからウラシルへの変異を含む、請求項１～１８のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
20. インフルエンザウイルスが組換えインフルエンザウイルスである、請求項１～１９のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
21. ウイルスが、ＮＡ遺伝子セグメント及びＨＡ遺伝子セグメントを更に含む、請求項１～２０のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
22. ＨＡ遺伝子セグメントが、ＨＡ１において少なくとも１のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有するＨＡタンパク質をコードする、請求項２１のインフルエンザウイルス。
23. ＨＡ遺伝子セグメントが、ＨＡ２において少なくとも１のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有するＨＡタンパク質をコードする、請求項２１又は２２のインフルエンザウイルス。
24. ＨＡ２における少なくとも１のアミノ酸の変異が１０７位のアスパラギンである、請求項２３記載のインフルエンザウイルス。
25. ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントが、単一のインフルエンザ株に由来する、請求項２１～２４のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
26. ＨＡ遺伝子セグメントが、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来する、請求項２５のインフルエンザウイルス。
27. ＮＡ遺伝子セグメントが、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、及びＮＳ遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来する、請求項２５又は２６のインフルエンザウイルス。
28. 変異型Ｍ遺伝子セグメントを更に含む、請求項１～２７のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
29. インフルエンザウイルスが機能的なＭ２タンパク質をコードしない、請求項２８のインフルエンザウイルス。
30. ウイルスがヒト細胞中において複製し得る、請求項１～２９のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
31. ウイルスが、選択されたアミノ酸がないことを除いて同一であるインフルエンザウイルスと比較して、Ｖｅｒｏ細胞中において同一条件下で増殖が亢進している、請求項１～３０のいずれか１項のインフルエンザウイルス。
32. 請求項１～３１のいずれか１項のインフルエンザウイルスを含む医薬製剤。
33. 医薬製剤がワクチンである、請求項３２の医薬製剤。
34. ワクチンが一価ワクチンとして製剤化される、請求項３３の医薬製剤。
35. ワクチンが二価ワクチンとして製剤化される、請求項３３の医薬製剤。
36. ワクチンが３価ワクチンとして製剤化される、請求項３３の医薬製剤。
37. ワクチンが四価ワクチンとして製剤化される、請求項３３の医薬製剤。
38. 哺乳動物において免疫応答を誘発する方法であって、請求項１～３１のいずれか１項のインフルエンザウイルス又は請求項３２～４１のいずれか１項の医薬製剤を哺乳動物に投与することを含み、それによって、哺乳動物においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発する、方法。
39. 哺乳動物がヒトである、請求項４２の方法。
40. Ｖｅｒｏ細胞株においてインフルエンザウイルスを連続的に継代することを含む、請求項１～１３のいずれか１項の、インフルエンザウイルスを生成する方法。

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