JP2023534840A - Ｍ２／ｂｍ２欠失インフルエンザベクターを使用したワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、インフルエンザウイルスバックボーンを含む組換えウイルスであって、当該インフルエンザバックボーンがＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントを含む、組換えウイルスであって、当該ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントの少なくとも１つが、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、組換えウイルスを提供する。本発明は、当該抗原がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、組換えウイルスを提供する。本発明はまた、免疫応答を誘起する医薬製剤および方法も提供する。【選択図】図１

Description

電子提出される材料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、以下のように、すなわち、２０２１年７月２０日作成の「７５５０２２ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の１つの２７１，１２１バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイルと同定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表が、全体として参照により本明細書により組み込まれている。

発明の背景
ワクチンは、感染症由来の疾病を予防するための重要なツールである。感染症は、世界中で何百万人もの人々を感染させることができる。したがって、多くの異なる種類の疾患に対してワクチンを開発すること、および迅速かつ効率的にそうすることが重要である。例えば、新規の新型コロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、新規に発生したウイルス性の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２型（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって生じた地球規模のパンデミックである。世界中で１０００万人を超える人々が当該疾患と診断されており、何十万人もが当該疾患により死亡している。その重症形態において、当該疾患は、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を特徴としており、いまのところ、これを治療または予防する標的指向の介在戦略はない。当該ウイルスに対する免疫応答は、当該疾患の発病に寄与しかつその解決の間に保護を提供すると考えられている。したがって、極めて大多数の個体を感作させるのに安全かつ有効なワクチンを開発する未曽有の必要性がある。

本発明は、インフルエンザウイルスのバックボーンを含む組換えウイルスであって、当該インフルエンザバックボーンがＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントを含む、組換えウイルスであって、当該ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントの少なくとも１つが、少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、組換えウイルスを提供する。好ましい実施形態において、抗原は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２型（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク受容体結合ドメイン融合タンパク質に対してＮＳ１を発現するよう操作されたインフルエンザＡ型ＮＳセグメントの概略図である。このコンストラクトは、完全長のインフルエンザＡ型ＰＲ／８／１９３４ ＮＳ１タンパク質と、第１のリンカー（ＧＳＧ１）と、ＲＢＤ（受容体結合ドメイン）をコードするＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクＳ１タンパク質のアミノ酸３３１～５３０と、第２のリンカー（ＧＳＧ２）と、開裂部位（Ｐ２Ａ）と、エキソン１および２をいずれも有する必須ＰＲ８核外輸送タンパク質（ＮＥＰまたはＮＳ２）のｃＤＮＡとを含む。 別個のポリペプチドとしてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク受容体結合ドメインを発現するよう操作されたインフルエンザＡ型ＮＳセグメントの概略図である。このコンストラクトは、完全長のインフルエンザＡ型ＰＲ／８／１９３４ ＮＳ１タンパク質と、第１のリンカー（ＧＳＧ１）と、第１の開裂部位（Ｔ２Ａ）と、ＲＢＤをコードするＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクＳ１タンパク質のアミノ酸３３１～５３０と、第２のリンカー（ＧＳＧ２）と、第２の開裂部位（Ｐ２Ａ）と、エキソン１および２をいずれも有する必須ＰＲ８核外輸送タンパク質（ＮＥＰまたはＮＳ２）のｃＤＮＡとを含む。 ＣｏＶ２ ＮＳ Ｍ２ＳＲ、Ｍ２ＳＲ対照、およびモック培地のみを感染させたＶｅｒｏ細胞の細胞溶解液の免疫ブロットの画像を示す。タンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分離し、免疫ブロット分析に供した。一次抗体は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）とし、二次抗体は、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）検出を用いる抗ウサギＩｇＧセイヨウワザビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とした。 ＣｏＶ２ ＮＳ１ Ｍ２ＳＲおよび標準的なＭ２ＳＲを感染させた細胞がいずれも、検出可能なレベルのインフルエンザＡ型ＮＰタンパク質を発現することを示す、１セットの画像である。その一方で、ＲＢＤのＦＩＴＣ標識付けは、有意な検出可能な蛍光を提供するＣｏＶ２ ＮＳ１ Ｍ２ＳＲ感染細胞においてのみ検出することができた。 ＢＭ２タンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端に対するＢＭ２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ融合を発現するよう操作されたインフルエンザＢ型Ｍセグメント７の概略図である（配列番号８４、配列番号９６）。このコンストラクトは、完全長のインフルエンザＢ型／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６Ｍ１タンパク質と、５マーの翻訳終止／開始部位と、アミノ酸１～８のＢＭ２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、ＲＢＤをコードするＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクＳ１タンパク質のアミノ酸３３０～５２４と、ＢＭ２ ＲＢＤ融合タンパク質とを含む。 ＢＭ２タンパク質のアミノ末端に対するＢＭ２ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ融合を発現するよう操作されたインフルエンザＢ型Ｍセグメント７の概略図である（配列番号８３、配列番号９５）。このコンストラクトは、完全長のインフルエンザＢ型／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６Ｍ１タンパク質と、５マーの翻訳終止／開始部位と、アミノ酸１～３のＢＭ２ ＯＲＦを含むＢＭ２ ＲＢＤ融合タンパク質と、ＲＢＤをコードするＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクＳ１タンパク質の３３０～５２４とを含む。 Ｖｅｒｏ細胞の細胞溶解液の免疫ブロットの画像を示す。２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＭ２ＳＲ株（配列番号８３、８４、９５、９６）ＢＭ２ＳＲを感染させた細胞の全細胞溶解液、およびモック培地のみの陰性対照を感染させた細胞の全細胞溶解液。タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、次いで、免疫ブロット分析へ供した。一次抗体は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）とし、二次抗体は、ＴＭＢ検出を用いる抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰとした。ＲＢＤ融合タンパク質の場所をナンバー記号によって画像に示す。 Ｍ２ＳＲ組換えウイルスによる感作後のマウスの体重変化の百分率を示すグラフである。 ＢＭ２ＳＲ組換えウイルスによる感作後のマウスの体重変化の百分率を示すグラフである。 免疫前のベースラインからの酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）力価における倍数増加を示す棒グラフである。 試験結果を示す１セットのグラフであって、マウス（Ｎ＝８）に一価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、二価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲおよびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲ、一価のＢＭ２ＳＲ－Ｖｉｃ、一価のＢＭ２ＳＲ－Ｙａｍ、二価のＢＭ２ＳＲ、三価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲおよびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲＶｉｃｔｏｒｉａもしくはＹａｍａｇａｔａ、または四価のＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲＶｉｃｔｏｒｉａおよびＹａｍａｇａｔａワクチン、あるいは対照（ＳＰＧ）を鼻内感作させた。図１０Ａは、抗Ｈ１ ＨＡ血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価データを示し、図１０Ｂは、抗Ｈ３ ＨＡデータを示し、図１０Ｃは、抗インフルエンザＢ型－Ｖｉｃ ＨＡデータを示し、図１０Ｄは、抗インフルエンザＢ型－Ｙａｍ ＨＡというデータを示す。 試験結果を示す１セットのグラフであって、マウス（Ｎ＝８）に一価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、二価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲおよびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲ、一価のＢＭ２ＳＲ－Ｖｉｃ、一価のＢＭ２ＳＲ－Ｙａｍ、二価のＢＭ２ＳＲ、三価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲおよびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲＶｉｃｔｏｒｉａもしくはＹａｍａｇａｔａ、または四価のＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲＶｉｃｔｏｒｉａおよびＹａｍａｇａｔａワクチン、あるいは対照（ＳＰＧ）を鼻内感作させた。図１０Ａは、抗Ｈ１ ＨＡ血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価データを示し、図１０Ｂは、抗Ｈ３ ＨＡデータを示し、図１０Ｃは、抗インフルエンザＢ型－Ｖｉｃ ＨＡデータを示し、図１０Ｄは、抗インフルエンザＢ型－Ｙａｍ ＨＡというデータを示す。 試験結果を示す１セットのグラフであって、マウス（Ｎ＝８）に一価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、二価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲおよびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲ、一価のＢＭ２ＳＲ－Ｖｉｃ、一価のＢＭ２ＳＲ－Ｙａｍ、二価のＢＭ２ＳＲ、三価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲおよびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲＶｉｃｔｏｒｉａもしくはＹａｍａｇａｔａ、または四価のＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲＶｉｃｔｏｒｉａおよびＹａｍａｇａｔａワクチン、あるいは対照（ＳＰＧ）を鼻内感作させた。図１０Ａは、抗Ｈ１ ＨＡ血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価データを示し、図１０Ｂは、抗Ｈ３ ＨＡデータを示し、図１０Ｃは、抗インフルエンザＢ型－Ｖｉｃ ＨＡデータを示し、図１０Ｄは、抗インフルエンザＢ型－Ｙａｍ ＨＡというデータを示す。 試験結果を示す１セットのグラフであって、マウス（Ｎ＝８）に一価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、二価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲおよびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲ、一価のＢＭ２ＳＲ－Ｖｉｃ、一価のＢＭ２ＳＲ－Ｙａｍ、二価のＢＭ２ＳＲ、三価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲおよびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲＶｉｃｔｏｒｉａもしくはＹａｍａｇａｔａ、または四価のＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲＶｉｃｔｏｒｉａおよびＹａｍａｇａｔａワクチン、あるいは対照（ＳＰＧ）を鼻内感作させた。図１０Ａは、抗Ｈ１ ＨＡ血清ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価データを示し、図１０Ｂは、抗Ｈ３ ＨＡデータを示し、図１０Ｃは、抗インフルエンザＢ型－Ｖｉｃ ＨＡデータを示し、図１０Ｄは、抗インフルエンザＢ型－Ｙａｍ ＨＡというデータを示す。 総クラスター計数対１クラスターにおけるヒット数のヒストグラムを示す。１０．０ヒットと２０．０ヒットとの間の灰色陰影付与によって示されるように、非常に少数のクラスターが１０を超えるヒットを有していた。 ウイルスの成長が、ＮＳ１およびＮＥＰを単一の自己開裂ペプチドとして発現する合成セグメントによって付与されないことを示す、２つの株についてのウイルス力価ＴＣＩＤ_５０曲線を示すグラフを示す。 非修飾ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヘリックス抗原に対するＮＳ１融合を有するセグメント８が、野生型と比較してウイルスの成長を損なうことを示す成長曲線を示すグラフを示す。 Ｍ２タンパク質のアミノ末端に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク受容体結合ドメイン融合を発現するよう操作されたインフルエンザＡ型Ｍセグメント７の概略図である。このコンストラクトは、完全長のインフルエンザＡ型／ＰＲ／８／３４ Ｍ１タンパク質、スプライシング部位、アミノ酸１～２５のＭ２ ＯＲＦと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＭＨＣ Ｉ適合性ＲＢＤ抗原と、ＦＬＡＧタグとを含むＭ２ ＲＢＤ ＦＬＡＧ融合タンパク質、および終止コドンを含む。 感染させた細胞の細胞外膜へ足場形成した抗原の発現を駆動することができるＭ２ＳＲインフルエンザウイルスの作製のためのインフルエンザＨＡ遺伝子セグメント設計の概略図である。図１５～図２０について、「ＵＴＲ」は「非翻訳領域」を指し、「２Ａ」は「２Ａ自己開裂ペプチド」を指し、「ＭＤ」は「多量体化ドメイン」を指し、「ＴＭ」は「膜貫通ドメイン」を指し、「ｎｃｒ」は「非コード領域」を指す。 感染させた細胞の細胞外膜へ足場形成した抗原の発現を駆動することができるＭ２ＳＲインフルエンザウイルスの作製のためのインフルエンザＨＡ遺伝子セグメント設計の概略図である。 感染させた細胞の細胞外膜へ足場形成した抗原の発現を駆動することができるＭ２ＳＲインフルエンザウイルスの作製のためのインフルエンザＮＳ遺伝子セグメント設計の概略図である。 感染させた細胞の細胞外膜へ足場形成した抗原の発現を駆動することができるＭ２ＳＲインフルエンザウイルスの作製のためのインフルエンザ遺伝子ＮＳセグメント設計の概略図である。 感染させた細胞の細胞外膜へ足場形成した抗原の発現を駆動することができるＭ２ＳＲインフルエンザウイルスの作製のためのインフルエンザ遺伝子ＮＡセグメント設計の概略図である。 感染させた細胞の細胞外膜へ足場形成した抗原の発現を駆動することができるＭ２ＳＲインフルエンザウイルスの作製のためのインフルエンザ遺伝子ＮＡセグメント設計の概略図である。 ＮＳ１ ＯＲＦおよびＮＥＰエキソン１をコードする重複した領域の配列を示す。小文字は、Ａ／ＰＲ／８／３４の突然変異を示す。塩基１～６は、ＮＥＰデルタ２Ｎ突然変異体について、ＮＥＰエキソン１の第２のコピーにおいて欠失している（配列番号１１０）。ＮＥＰエキソン１をコードするＮＳセグメントの重複した領域の第２のコピーは、スプライシングドナー部位を消滅させる単一のヌクレオチド突然変異を有する野生型Ａ／ＰＲ／８／３４ ＮＳセグメントｃＤＮＡ配列である第１のコピーと６３％同一である（配列番号１０９）。 ＮＳ１ ＯＲＦおよびＮＥＰエキソン２の配列を示す。小文字は、Ａ／ＰＲ／８／３４の突然変異を示す。ＮＥＰエキソン２のＮＳセグメントの重複した領域の第１のコピー（配列番号１１１）は、野生型Ａ／ＰＲ／８／３４ ＮＳセグメントのｃＤＮＡ配列である第２のコピー（配列番号１１２）と８８％同一である。 Ｔ２ＡおよびＰ２Ａ部位によってそれぞれ分離されたＮＳ１、ＥＧＦＰ、およびＮＥＰというペプチドの３部構成ポリタンパク質（配列番号１１３）を発現する操作されたＮＳセグメント（配列番号１１１、１１２、および１１４）を用いた、Ｍ２ＳＲによるＭＯＩ＝１０のＭ２ＶｅｒｏＡ細胞の接種後連続３日間の蛍光顕微鏡画像を示す。 Ｍ２ＳＲベクターウイルスのみによって、または１２個のアミノ酸と、Ｔ４ Ｆｏｌｄｏｎと、ＲＳＶ由来のＴＭと、のみのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクシグナル配列を用いて細胞表面でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤミニスパイクタンパク質三量体の発現を指向するよう設計したＮＳ１セグメントを有するＭ２ＳＲウイルスによって感染させた、免疫染色した生Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞のフローサイトメトリー解析を示す（配列番号１１５）。 Ｍ２ＳＲベクターウイルスのみによって、またはＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／２０１６ Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素のアミノ末端へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤの直接的な融合を有するＨＡセグメントを有するＭ２ＳＲウイルスによって感染させた、免疫染色した生Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞のフローサイトメトリー解析を示す（配列番号１１６）。 Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／２０１６ Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス由来の赤血球凝集素のアミノ末端への呼吸器合胞体ウイルス表面糖タンパク質Ｇ（ＲＳＶ Ｇ）抗原の直接的な融合をコードするＨＡセグメントを有するレプリコンＤＮＡプラスミド系を移入済みのヒト２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析を示す（配列番号１１７）。 Ｍ２ＳＲベクターウイルスのみによって、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質シグナル配列を用いて細胞表面におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ミニスパイクタンパク質の発現を指向するよう設計されたＮＳ１セグメントと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ＴＭを有するＳ２ヘリックス接続体ドメインとを有するＭ２ＳＲウイルスによって感染させた生Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞のフローサイトメトリー解析を示す（配列番号１１９）。 実施例６において説明するようなワクチン接種前ならびに初回抗原刺激および追加抗原刺激の投与の後に基づく４つの投薬計画の平均血清抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ ＩｇＧ力価のグラフである。

発明の詳細な説明
本発明の組換えウイルスは、任意の種類のウイルスであり得る。本明細書で使用する場合、組換えウイルス（例えば、リアソータントウイルスまたは異なるウイルス）は、遺伝子の異なるウイルス（例えば、異種性遺伝子セグメント）に由来する遺伝材料（例えば、遺伝子セグメント）を含むウイルスである。

本明細書で使用する場合、「遺伝子セグメント」という用語は、ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。この遺伝子セグメントは、ウイルスタンパク質をコードするウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、すなわち、配列番号４３～４７、５３、５６、５８、６０、６３～６７、および７３をコードするｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）配列によって表され得る。

本明細書で使用する場合、「バックボーン」という用語は、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ１、および／またはＮＳ２、ならびにＭというタンパク質をコードするインフルエンザ遺伝子セグメントを指す。本発明の遺伝子セグメントは、選択されたアミノ酸を有するタンパク質をコードする。このウイルスバックボーンは、インフルエンザウイルスバックボーンである。コアタンパク質に基づいて分類される４つの種類のインフルエンザウイルス（すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）があるが、季節性エピデミクスは、インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルスを循環させることによって生じることが最も多い。一実施形態では、インフルエンザウイルスバックボーンは、インフルエンザＡ型バックボーンである。別の実施形態では、インフルエンザウイルスバックボーンは、インフルエンザＢ型バックボーンである。

本明細書で使用する場合、「選択されたアミノ酸」という用語は、アミノ酸配列の特定の位置における具体的なアミノ酸を指す。いくつかの実施形態において、選択されたアミノ酸は、親アミノ酸配列への遺伝子突然変異の結果である。親アミノ酸配列は、選択されたアミノ酸に対応する位置を除き、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列と同一であり得る。

組換えウイルス
（Ａ）インフルエンザＡ型バックボーンタンパク質
本発明のＰＢ１（ポリメラーゼ塩基性タンパク質１）遺伝子セグメントは、少なくとも１つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、すなわち、ＰＢ１タンパク質をコードし得る。好ましい実施形態において、選択されたアミノ酸は、位置４０のロイシンと、位置１８０のトリプトファンとを含む。ＰＢ１タンパク質の選択されたアミノ酸はさらに、位置４６４のアスパラギンまたは位置６０７のセリンのうちの少なくとも１つを含む。ＰＢ１遺伝子セグメントは場合により、ヌクレオチド位置４での、シトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み得る。

選択されたアミノ酸は、親ＰＢ１配列、例えば、選択されたアミノ酸に対応する位置を除き、本発明のＰＢ１アミノ酸配列と同一の配列への遺伝子突然変異によって獲得され得る。ＰＢ１タンパク質のアミノ酸位置４６４は、インフルエンザＰＢ１タンパク質のパーム領域に位置し、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性ドメインを接続する。概して、位置４６４のアスパラギン酸は、卵およびＭＤＣＫ細胞において単離されたインフルエンザウイルスのうちで非常によく保存されている。このアミノ酸の役割は特定されていないが、この位置で観察されるアスパラギン（Ｎ）へのアミノ酸変化は、ＰＢ１タンパク質の立体配座に影響し得、宿主細胞因子との相互作用に影響し得、それゆえ、Ｖｅｒｏ細胞におけるインフルエンザポリメラーゼ活性に影響し得る。その上、インフルエンザＲＮＡポリメラーゼは、ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２というサブユニットから構成されるヘテロ三量体である。ＰＢ１タンパク質の位置４６５のヒスチジンは、ＰＡタンパク質の位置２４３のグルタミン酸と相互作用し、ＰＢ１の位置４６４のアミノ酸変化は、ＰＢ１とＰＡとの間にある相互作用を変化させ得る。ＰＢ１タンパク質の位置６０７のアミノ酸の機能も未知であるが、このアミノ酸は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ領域とＰＢ２結合領域との間に位置し、ＰＢ１とＰＢ２との間にある相互作用を変化させ、それによりＶｅｒｏ細胞におけるポリメラーゼ活性に影響を及ぼし得ることを示唆している。

本発明のＰＢ２（ポリメラーゼ塩基性タンパク質２）遺伝子セグメントもまた、少なくとも１つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、すなわち、ＰＢ２タンパク質をコードし得る。好ましい実施形態において、選択されたアミノ酸は、位置５０４のバリン、ならびに場合により、位置４６７のイソロイシンおよび位置５２９のバリンを含む。ＰＢ２遺伝子セグメントは場合により、ヌクレオチド位置４でのシトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み得る。ＰＢ２タンパク質の位置４６７および５２９のアミノ酸は、ＰＢ２－Ｃタンパク質中にある。具体的には、位置４６７のアミノ酸は、ＰＢ２タンパク質のキャップ結合領域に位置し、位置５２９のアミノ酸は、キャップ－６２７リンカードメインに位置する。いくつかのインフルエンザウイルスにおいて、ＰＢ２タンパク質は、宿主によりキャッピングされたＲＮＡのキャップ構造を結合し、インフルエンザｍＲＮＡを生成するために、宿主ＲＮＡ由来のキャップを利用する。このプロセスは、「キャップスナッチング（ｃａｐ－ｓｎａｔｃｈｉｎｇ）」として公知である。その上、ＰＢ２の位置６２７のアミノ酸は、宿主範囲およびウイルス病原性における鍵となる決定因子であることが公知である。それゆえ、キャップ結合領域に最も近いアミノ酸変化は、ウイルスｍＲＮＡ合成の効率に影響を及ぼし得る。

本発明のＰＡ（ポリメラーゼ酸性タンパク質）遺伝子セグメントもまた、少なくとも１つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、すなわち、ＰＡタンパク質をコードし得る。好ましい実施形態において、選択されたアミノ酸は、位置４０１のリジンを含む。ＰＡ遺伝子セグメントは場合により、ヌクレオチド位置４でのシトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み得る。

本発明のＮＰ（核タンパク質）遺伝子セグメントもまた、少なくとも１つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、すなわち、ＮＰタンパク質をコードし得る。好ましい実施形態において、選択されたアミノ酸は、位置１１６のロイシンと、位置２９４のリジンまたは位置３１１のアルギニンのうちの少なくとも１つとを含む。ＮＰタンパク質の位置２９４および位置３１１のアミノ酸は、ＮＰタンパク質の本体の中に位置しており、それにより、核局在化シグナルとしても、核外輸送シグナルとしても機能しない。

本発明のＮＳ（非構造的）遺伝子セグメントもまた、少なくとも１つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、すなわち、ＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質をコードし得る。好ましい実施形態において、選択されたアミノ酸は、位置３０（ＮＳ１タンパク質）のプロリンと、位置１１８（ＮＳ１タンパク質）のリジンとを含む。

本発明の一実施形態において、インフルエンザウイルスバックボーンは、位置４０、１８０、および４６４の選択されたアミノ酸、すなわち、位置４０のロイシン、位置１８０のトリプトファン、および位置４６４のアスパラギンを有するタンパク質、すなわち、ＰＢ１タンパク質をコードするＰＢ１遺伝子セグメントを含む。ＰＢ１遺伝子セグメントは、配列番号４４によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＢ１遺伝子セグメントは、配列番号４９のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＰＢ１タンパク質をコードし得る。この実施形態の別の態様において、インフルエンザウイルスバックボーンは、位置５０４の選択されたアミノ酸、すなわち、位置５０４のバリンを有するタンパク質、すなわち、ＰＢ２タンパク質をコードするＰＢ２遺伝子セグメントを含み得る。ＰＢ２遺伝子セグメントは、配列番号５６によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＢ２遺伝子セグメントは、配列番号５７のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＰＢ２タンパク質をコードし得る。この実施形態のＮＰ遺伝子セグメントは、位置１１６および位置２９４の選択されたアミノ酸、すなわち、位置１１６のロイシンおよび位置２９４のリジンを有するタンパク質、すなわち、ＮＰタンパク質をコードし得る。ＮＰ遺伝子セグメントは、配列番号４３によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＰ遺伝子セグメントは、配列番号４８のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＮＰタンパク質をコードし得る。この実施形態のＰＡ遺伝子セグメントおよびＮＳ遺伝子セグメントはまた、位置４０１（ＰＡタンパク質）、位置３０（ＮＳ１タンパク質）、および位置１１８（ＮＳ１タンパク質）の選択されたアミノ酸、すなわち、位置４０１（ＰＡタンパク質）のリジン、位置３０（ＮＳ１タンパク質）のプロリン、および位置１１８（ＮＳ１タンパク質）のリジンを含むタンパク質、すなわち、ＰＡタンパク質ならびにＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質をコードし得る。ＰＡ遺伝子セグメントは、配列番号５８によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＡ遺伝子セグメントは、配列番号５９のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＰＡタンパク質をコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号６０によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号６１のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＮＳ１タンパク質をコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号６２のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＮＳ２タンパク質をコードし得る。この実施形態のＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡという遺伝子セグメントはまた、ヌクレオチド位置４でのシトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み得る。

本発明の別の実施形態において、インフルエンザウイルスバックボーンは、位置４０、１８０、および６０７の選択されたアミノ酸、すなわち、位置４０のロイシン、位置１８０のトリプトファン、および位置６０７のセリンを有するタンパク質、すなわち、ＰＢ１タンパク質をコードするＰＢ１遺伝子セグメントを含む。ＰＢ１遺伝子セグメントは、配列番号４６によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＢ１遺伝子セグメントは、配列番号５１のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＰＢ１タンパク質をコードし得る。この実施形態の別の態様において、インフルエンザウイルスバックボーンは、位置５０４、４６７、および５２９の選択されたアミノ酸、すなわち、位置５０４のバリン、位置４６７のイソロイシン、および位置５２９のバリンを有するタンパク質、すなわち、ＰＢ２タンパク質をコードするＰＢ２遺伝子セグメントを含み得る。ＰＢ２遺伝子セグメントは、配列番号４７によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＢ２遺伝子セグメントは、配列番号５２のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＰＢ２タンパク質をコードし得る。この実施形態のＮＰ遺伝子セグメントは、位置１１６および３１１の選択されたアミノ酸、すなわち、位置１１６のロイシンおよび位置３１１のアルギニンを有するタンパク質、すなわち、ＮＰタンパク質をコードし得る。ＮＰ遺伝子セグメントは、配列番号４５によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＰ遺伝子セグメントは、配列番号５０のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＮＰタンパク質をコードし得る。ＰＡおよびＮＳという遺伝子セグメントはまた、位置４０１（ＰＡタンパク質）、位置３０（ＮＳ１タンパク質）、および位置１１８（ＮＳ１タンパク質）の選択されたアミノ酸、すなわち、位置４０１（ＰＡタンパク質）のリジン、位置３０（ＮＳ１タンパク質）のプロリン、および位置１１８（ＮＳ１タンパク質）のリジンを含むタンパク質、すなわち、ＰＡタンパク質ならびにＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質をコードし得る。ＰＡ遺伝子セグメントは、配列番号５８によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＡ遺伝子セグメントは、配列番号５９のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＰＡタンパク質をコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号６０によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号６１のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＮＳ１タンパク質をコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号６２のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＮＳ２タンパク質をコードし得る。この実施形態のＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡという遺伝子セグメントはまた、ヌクレオチド位置４でのシトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み得る。

この実施形態の選択されたアミノ酸は、特にバックボーンのほとんどのタンパク質において、同じ条件下で、選択されたアミノ酸を有さないことを除いて同じであるインフルエンザウイルスバックボーンと比較して、インフルエンザウイルスバックボーンへと増強した成長特性を付与する。例えば、本発明のインフルエンザウイルスバックボーンは、Ｖｅｒｏ細胞における増強した成長を呈する。

本発明のインフルエンザウイルスバックボーンはまた、Ｍ（マトリックスタンパク質）遺伝子セグメントも含み得る。本発明の一実施形態において、Ｍ遺伝子セグメントは、インフルエンザＡ型由来の突然変異体の遺伝子セグメントであり得、それにより、このウイルスは機能的Ｍ２タンパク質の発現を欠いている。かかるウイルスは、本明細書では「Ｍ２ＳＲ」ウイルスと称される。本明細書で使用する場合、「Ｍ２ＳＲ」および「ＡＭ２ＳＲ」は相互交換可能である。Ｍ２ＳＲウイルスは、単一複製インフルエンザウイルスである。Ｍ２ＳＲウイルスのＭ遺伝子セグメントは、配列番号５３によって表され得る。Ｍ遺伝子セグメントは、配列番号５４のアミノ酸配列を有するタンパク質、例えば、切断型Ｍ２タンパク質をコードし得る。Ｍ２ＳＲウイルスは、野生型Ｍ２タンパク質を安定して発現するＶｅｒｏ細胞（すなわち、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞）において増殖して、多重周期の複製を許容し得る。Ｖｅｒｏ細胞における高い収率は、Ｍ遺伝子セグメントにおける突然変異に依存しない。それゆえ、本発明のインフルエンザウイルスバックボーンは、機能的Ｍ２タンパク質（配列番号１）をコードするＭ遺伝子セグメントを含み得る。

（Ｂ）インフルエンザＢ型バックボーンタンパク質
本発明の一実施形態において、組換えウイルスは、ＰＡ、ＮＰ、およびＮＳという遺伝子セグメントを含むインフルエンザウイルスバックボーンであって、（ａ）ＰＡ遺伝子セグメントがヌクレオチド位置２２７２のチミンを含み、（ｂ）ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質であって、選択されたアミノ酸が位置４０のセリンと、位置１６１のアスパラギンまたはグリシンと、位置２０４のトレオニンと、場合により位置９３のバリンとを含む、ＮＰタンパク質をコードし、かつ（ｃ）ＮＳ遺伝子セグメントが、ヌクレオチド位置３９のグアニンを含み、ＮＳ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＳタンパク質であって、選択されたアミノ酸が位置１７６のグルタミンを含む、ＮＳタンパク質をコードする、インフルエンザウイルスバックボーンを含む。

本発明のＰＢ１（ポリメラーゼ塩基性タンパク質１）遺伝子セグメントは、少なくとも１つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、すなわち、ＰＢ１タンパク質をコードし得る。選択されたアミノ酸は、親ＰＢ１配列、例えば、選択されたアミノ酸に対応する位置を除き、本発明のＰＢ１アミノ酸配列と同一の配列に対する遺伝子突然変異によって獲得され得る。本発明のＰＢ２（ポリメラーゼ塩基性タンパク質２）遺伝子セグメントもまた、少なくとも１つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、すなわち、ＰＢ２タンパク質をコードし得る。

本発明のＰＡ（ポリメラーゼ酸性タンパク質）遺伝子セグメントもまた、少なくとも１つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、すなわち、ＰＡタンパク質をコードし得る。好ましい実施形態において、遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置２２７２のチミンを含む。

本発明のＮＰ（核タンパク質）遺伝子セグメントもまた、少なくとも１つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、すなわち、ＮＰタンパク質をコードし得る。好ましい実施形態において、ＮＰセグメントは、位置１７７のチミンと、位置５４０のアデニンと、位置６７０のチミンとを含み、ＮＰ遺伝子セグメントは、位置４０のセリンと、位置１６１のアスパラギンまたはグリシンと、位置２０４のトレオニンと、場合により、位置９３のバリンとを含む、選択されたアミノ酸を有するタンパク質をコードする。

本発明のＮＳ（非構造的）遺伝子セグメントもまた、少なくとも１つの選択されたアミノ酸を含むタンパク質、すなわち、ＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質をコードし得る。好ましい実施形態において、ＮＳセグメントは、ヌクレオチド位置３９のグアニンと、位置５７０のシトシンとを含み、ＮＳ遺伝子セグメントは、位置１７６（ＮＳ１タンパク質）のグルタミンを含む選択されたアミノ酸を有するＮＳタンパク質をコードする。

本発明の一実施形態において、インフルエンザウイルスは、選択されたアミノ酸を有するタンパク質、すなわち、ＰＢ１タンパク質をコードするＰＢ１遺伝子セグメントを含む。ＰＢ１遺伝子セグメントは、配列番号６３によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＢ１遺伝子セグメントは、配列番号６８のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＰＢ１タンパク質をコードし得る。この実施形態の別の態様において、インフルエンザウイルスは、選択されたアミノ酸を有するタンパク質、すなわち、ＰＢ２タンパク質をコードするＰＢ２遺伝子セグメントを含み得る。ＰＢ２遺伝子セグメントは、配列番号６４によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＢ２遺伝子セグメントは、配列番号６９のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＰＢ２タンパク質をコードし得る。この実施形態の別の態様において、インフルエンザウイルスは、位置４０、１６１、および２０４の選択されたアミノ酸、すなわち、位置４０のセリン、位置１６１のアスパラギンまたはグリシン、位置２０４のトレオニン、および場合により、位置９３のバリンを有するタンパク質、すなわち、ＮＰタンパク質をコードするＮＰ遺伝子セグメントを含み得る。ＮＰ遺伝子セグメントは、配列番号６６によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＰ遺伝子セグメントは、配列番号７１のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＮＰタンパク質をコードし得る。この実施形態の別の態様において、インフルエンザウイルスは、位置１７６の選択されたアミノ酸、すなわち、位置１７６のグルタミンを有するタンパク質、すなわち、ＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質をコードするＮＳ遺伝子セグメントを含み得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、ヌクレオチド位置３９のグアニンと、位置５７０のシトシンとを含み得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号６７によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号７２のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＮＳ１および／またはＮＳ２タンパク質をコードし得る。この実施形態の別の態様において、インフルエンザウイルスは、タンパク質、すなわち、ＰＡタンパク質をコードするＰＡ遺伝子セグメントを含み得る。ＰＡ遺伝子セグメントは、配列番号６５によって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＰＡ遺伝子セグメントは、配列番号７０のアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわち、ＰＡタンパク質をコードし得る。

この実施形態の選択されたアミノ酸は、特にバックボーンのほとんどのタンパク質において、同じ条件下で、選択されたアミノ酸を有さないことを除いて同じであるインフルエンザウイルスと比較して、インフルエンザウイルスへと増強した成長特性を付与する。例えば、本発明のインフルエンザウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞において増強した成長を呈する。

本発明のインフルエンザウイルスはまた、Ｍ（マトリックスタンパク質）遺伝子セグメントも含み得る。本発明の一実施形態において、Ｍ遺伝子セグメントは、インフルエンザＢ型由来の突然変異体の遺伝子セグメントであり得、それにより、このウイルスは機能的ＢＭ２タンパク質の発現を欠いている。かかるウイルスは、本明細書では「ＢＭ２ＳＲ」ウイルスと称される。ＢＭ２ＳＲウイルスは、単一複製インフルエンザウイルスである。ＢＭ２ＳＲウイルスのＭ遺伝子セグメントは、配列番号７３によって表され得る。Ｍ遺伝子セグメントは、配列番号７８のアミノ酸配列を有するタンパク質、例えば、切断型ＢＭ２タンパク質をコードし得る。ＢＭ２ＳＲウイルスは、ＢＭ２タンパク質を安定して発現するＶｅｒｏ細胞（すなわち、ＢＭ２ＶｅｒｏＡ細胞）において増殖して、多重周期の複製を許容し得る。Ｖｅｒｏ細胞における高い収率は、Ｍ遺伝子セグメントにおける突然変異に依存しない。それゆえ、本発明のインフルエンザウイルスは、機能的ＢＭ２タンパク質（配列番号２）をコードするＭ遺伝子セグメントを含み得る。

（Ｃ）インフルエンザＡ型表面タンパク質
本発明のさらなる実施形態において、インフルエンザウイルスバックボーンは、ＮＡ（ノイラミニダーゼ）およびＨＡ（赤血球凝集素）遺伝子セグメントを含む。本発明の一実施形態において、ＨＡ遺伝子セグメントは、ＨＡタンパク質のＨＡ１サブユニットにおける少なくとも１つの選択されたアミノ酸（例えば、アミノ酸突然変異）、および／または当該ＨＡタンパク質のＨＡ２サブユニットにおける少なくとも１つの選択されたアミノ酸（例えば、アミノ酸突然変異）を含むアミノ酸配列を有する当該ＨＡタンパク質をコードし得る。例えば、ＨＡ２サブユニットにおける少なくとも１つのアミノ酸突然変異は、位置１０７のアスパラギンであり得る。かかる突然変異はまた、生成中のウイルスの増強した成長に寄与し得る。

本発明の一実施形態において、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、およびＮＳという遺伝子セグメントは、単一のインフルエンザ株に由来する。ＨＡ遺伝子セグメントは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、およびＮＳという遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来し得る。同様に、ＮＡ遺伝子セグメントは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、およびＮＳという遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来し得る。したがって、本発明の組換えウイルスは、パンデミックウイルス（例えば、Ｈ５Ｎ１およびＨ７Ｎ９）または季節性ウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびインフルエンザＢ型）であり得る。

（Ｄ）インフルエンザＢ型表面タンパク質
本発明のさらなる実施形態において、組換えウイルスは、ＮＡ（ノイラミニダーゼ）およびＨＡ（赤血球凝集素）遺伝子セグメントをさらに含む、インフルエンザウイルスバックボーンを含む。本発明の一実施形態において、ＨＡ遺伝子セグメントは、ＨＡタンパク質のＨＡ１サブユニットにおける少なくとも１つの選択されたアミノ酸（例えば、アミノ酸突然変異）、および／または当該ＨＡタンパク質のＨＡ２サブユニットにおける少なくとも１つの選択されたアミノ酸（例えば、アミノ酸突然変異）を含むアミノ酸配列を有する当該ＨＡタンパク質をコードし得る。例えば、ＨＡ２サブユニットにおける少なくとも１つのアミノ酸突然変異は、位置６１のグルタミン酸であり得る。別の実施形態において、ＨＡ２サブユニットにおける少なくとも１つのアミノ酸突然変異は、位置１１２のグルタミン酸であり得る。このアミノ酸突然変異は、インフルエンザＢ型ウイルスの亜型または系統のいずれか（すなわち、ＶｉｃｔｏｒｉａまたはＹａｍａｇａｔａ）において存在し得る。好ましい実施形態において、ＨＡ２サブユニットにおけるアミノ酸突然変異は、インフルエンザＢ型ウイルスのＶｉｃｔｏｒｉａ系統における位置６１のグルタミン酸であり得る。別の好ましい実施形態において、ＨＡ２サブユニットにおけるアミノ酸突然変異は、インフルエンザＢ型ウイルスのＹａｍａｇａｔａ系統における位置１１２のグルタミン酸であり得る。かかる突然変異はまた、生成中のウイルスの増強した成長にも寄与し得る。

本発明の一実施形態において、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、およびＮＳという遺伝子セグメントは、単一のインフルエンザ株に由来する。ＨＡ遺伝子セグメントは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、およびＮＳという遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来し得る。同様に、ＮＡ遺伝子セグメントは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、およびＮＳという遺伝子セグメントが由来する単一のインフルエンザ株とは異なるインフルエンザ株に由来し得る。したがって、本発明のインフルエンザウイルスは、季節性インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＢ型）であり得る。

（Ｅ）抗原
一実施形態において、組換えウイルスは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントを含むインフルエンザウイルスバックボーンを含み、ＰＢ２、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つは、１つ以上の抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、ＨＡ遺伝子セグメントに関して異種性の抗原を指す。この抗原は、ウイルス性（インフルエンザを含む）、細菌性、真菌性、または原生動物性であり得る。例えば、遺伝子セグメント（例えば、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、またはＮＡという遺伝子セグメント）へと挿入されたウイルス抗原またはエピトープ配列は、当該ウイルスについての抗原であろう。一実施形態において、当該抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（例えば、Ｓ１タンパク質）の免疫原性断片である。別の実施形態において、当該抗原は、インフルエンザウイルスバックボーンにおけるＨＡ遺伝子セグメントに対して異種性であるインフルエンザ遺伝子セグメントまたはその断片（すなわち、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、もしくはＮＡという遺伝子セグメント、またはその断片）である。別の実施形態において、当該抗原は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）またはその断片である。別の実施形態において、当該抗原は、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはその断片である。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原は、ウイルス遺伝子セグメント内から発現する。

本発明の一実施形態において、１つ以上の抗原をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの遺伝子セグメントはさらに、少なくとも１つの可撓性リンカータンパク質、少なくとも１つの開裂可能な開裂性配列、および／または少なくとも１つのＦＬＡＧタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。かかる遺伝子セグメントは、少なくとも２つの可撓性リンカータンパク質、少なくとも２つの開裂可能な開裂性配列、および／または少なくとも２つのＦＬＡＧタンパク質をコードし得る。

本発明の一実施形態において、開裂可能な開裂性配列は、「自己開裂する」配列を含む。一実施形態において、「自己開裂する」配列とは、「自己開裂する」２Ａペプチドである。一実施形態において、「自己開裂する」配列とは、「自己開裂する」２Ａペプチドである。「自己開裂する」２Ａペプチドは、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，７（１）：２１９３（２０１７）、およびＳｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２（５）：５８９－５９４（２００４）において説明されている。この２Ａペプチドは、真核細胞における翻訳中にポリペプチドの開裂に介在するウイルス性オリゴペプチドである。「２Ａ」という名称は、ウイルスゲノムの特定の領域を指す。特定の理論または機序に結び付けられるものではないが、２Ａ介在性「自己開裂」の機序は、２ＡペプチドのＣ末端のグリシル－プロリルペプチド結合の形成のリボソームスキッピングであると考えられている。異なる２Ａペプチドは、Ｃ末端でＧＤＶＥＸＮＰＧＰ（配列番号１９）というコンセンサスアミノ酸配列を含み得、式中、配列番号１９のＸは、任意の天然に生じるアミノ酸残基である。本発明の一実施形態において、開裂可能なリボソームスキップ配列とは、ブタテッショウウイルス１型２Ａ（Ｐ２Ａ）アミノ酸配列、ウマ鼻炎Ａ型ウイルス（Ｅ２Ａ）アミノ酸配列、テセアアシグナウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）アミノ酸配列、または口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）アミノ酸配列である。本発明の一実施形態において、リボソームスキップ配列とは、Ｐ２Ａのアミノ酸配列を含む、当該アミノ酸配列からなる、または当該アミノ酸配列から本質的になる２Ａペプチドアミノ酸配列である。

本発明の一実施形態において、可撓性リンカータンパク質とは、独立して、グリシンおよびセリンからなる群から選択される１～２０個のアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、可撓性リンカータンパク質は、（Ｘａａ１）_ｒと定義され、ここで、各Ｘａａ１は独立して、グリシンおよびセリンから選択され、ｒは、１から２０までの整数である。かかるリンカーの例としては、ＧＳＧ（配列番号７５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７６）、および（Ｇ４Ｓ）_３があるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、抗原をコードするアミノ酸配列を含む少なくとも１つの遺伝子セグメントはさらに、少なくとも１つの可撓性リンカータンパク質を含む。別の実施形態において、かかる遺伝子セグメントはさらに、少なくとも２つの可撓性リンカータンパク質を含む。

好ましい実施形態において、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（例えば、Ｓ１タンパク質）の免疫原性断片である。一実施形態において、Ｍ遺伝子セグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の少なくとも１つの免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列をコードする。Ｍ遺伝子セグメントは、突然変異したＭ２タンパク質またはＢＭ２タンパク質をコードし得る。Ｍ遺伝子セグメントはさらに、少なくとも１つの可撓性リンカータンパク質および少なくとも１つのＦＬＡＧタンパク質をコードし得る。一実施形態において、Ｍ遺伝子セグメントは、突然変異したＭ２タンパク質と、可撓性リンカータンパク質と、ＦＬＡＧエピトープタグタンパク質とを含む融合タンパク質をコードする。例えば、Ｍ遺伝子セグメントは、配列番号７９および８１～８４のうちのいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列を有し得る。Ｍ遺伝子セグメントは、配列番号１～１４および９２～９６のうちのいずれか１つを含むタンパク質をコードし得る。

別の実施形態において、ＮＳ遺伝子セグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の少なくとも１つの免疫原性断片をコードするヌクレオチド配列をコードする。ＮＳ遺伝子セグメントは、ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２（すなわち、ＮＥＰ）タンパク質、またはそれらの断片をコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントはまた、少なくとも１つの可撓性リンカータンパク質またはその断片もコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントはまた、少なくとも１つの開裂可能な開裂性配列もコードし得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号８０および８５～９１のうちのいずれか１つによって表されるヌクレオチド配列を有し得る。ＮＳ遺伝子セグメントは、配列番号９７～１０４を含むタンパク質をコードし得る。

本発明の一実施形態において、開裂可能な開裂性配列とは、Ｐ２Ａペプチド配列である。かかる実施形態において、Ｐ２Ａペプチド配列は、片側の末端でＮＳ１タンパク質のＣ末端へ、もう片側で抗原へ結合する。かかる実施形態において、抗原は、ＮＥＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）へ結合することができる。本発明の別の実施形態において、Ｐ２Ａペプチド配列は、片側の末端でＮＳ１タンパク質のＣ末端へ、もう片側の末端で第１の可撓性リンカータンパク質へ結合する。かかる実施形態において、第１の可撓性リンカータンパク質は、抗原へ結合することができ、当該抗原が、ＮＥＰ ＯＲＦへ付着する。別の実施形態において、第２の開裂可能な開裂性配列が存在する。一実施形態において、第２の開裂可能な開裂性配列とは、Ｐ２ＡまたはＴ２Ａというペプチド配列である。任意の第２の開裂可能な開裂性配列は、片側の末端で抗原へ、もう片側の末端でＮＥＰ ＯＲＦへ結合し得る。別の実施形態において、第２の開裂可能な開裂性配列は、可撓性リンカータンパク質へ結合し得、次いで、これが抗原またはＮＥＰ ＯＲＦのいずれかへ結合する。

一実施形態において、少なくとも１つの（すなわち、ＰＢ２、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、またはＮＡ）遺伝子セグメントは、１つ以上の抗原をコードするヌクレオチド配列をコードするであろう。いくつかの実施形態において、８つのインフルエンザウイルスバックボーンセグメントのうちの少なくとも２つ（すなわち、ＰＢ１およびＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡ、ＰＢ１およびＮＰ、ＰＢ１およびＭ、ＰＢ１およびＮＳ、ＰＢ１およびＨＡ、ならびにＰＢ１およびＮＡ、ＰＢ２およびＰＡ、ＰＢ２およびＮＰ、ＰＢ２およびＭ、ＰＢ２およびＮＳ、ＰＢ２およびＨＡ、ＰＢ２およびＮＡ、ＰＡおよびＮＰ、ＰＡおよびＭ、ＰＡおよびＮＳ、ＰＡおよびＨＡ、ＰＡおよびＮＡ、ＮＰおよびＭ、ＮＰおよびＮＳ、ＮＰおよびＨＡ、ＮＰおよびＮＡ、ＭおよびＮＳ、ＭおよびＨＡ、ＭおよびＮＡ、ＮＳおよびＨＡ、ＮＳおよびＮＡ、またはＨＡおよびＮＡという遺伝子セグメント）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（例えば、Ｓ１タンパク質）の免疫原性断片など、１つ以上の抗原をコードするヌクレオチド配列をコードするであろう。

いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む遺伝子セグメントはさらに、下流の重複を含み、ここで、下流の重複は、少なくとも１つのサイレントヌクレオチド突然変異を含む。一実施形態において、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む遺伝子セグメントは、さらに、下流の直接的な縦列重複を含み、ここで、下流の重複は、少なくとも１つのサイレントヌクレオチド突然変異を含む。下流の重複は、ヌクレオチド配列の一部分が同じ向きで１回以上反復される当該ヌクレオチド配列を指す。反復ヌクレオチド配列は、次々と直接的につながることができ、または反復ヌクレオチド配列の各々の間にある、任意のヌクレオチド配列を含有することができる。加えて、重複する塩基の数は制限されない。

いくつかの実施形態において、遺伝子セグメントのヌクレオチド配列の下流の重複は、抗原をコードするヌクレオチド配列の挿入の間に生じる。いくつかの実施形態において、下流の重複は、ヌクレオチド配列、ならびにコードされたアミノ酸配列およびタンパク質の安定性を低減させることができる。安定性を改善するために、少なくとも１つのサイレント突然変異（すなわち、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に影響しない突然変異）を導入して、第１のヌクレオチド配列と、第２の下流で重複したヌクレオチド配列との間にある相同性を低減させる。例えば、好ましい実施形態において、ＮＳ遺伝子セグメントは、抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。抗原をコードするヌクレオチド配列の挿入の間に、ヌクレオチド配列の一部分が重複され、下流の重複を創出する。ヌクレオチド配列の第１のコピーは、パッケージング配列の一部であり、第２のコピーは、パッケージングに干渉することができる。干渉を防止するために、サイレント突然変異を下流の重複へ加えて、第１のコピーとの相同性を低減させる。一実施形態において、下流の重複は、少なくとも１個（すなわち、少なくとも１個、少なくとも２個少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個）のサイレント突然変異を有する。

組換えウイルスは、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつさらに、下流の重複であって、少なくとも１つのサイレントヌクレオチド突然変異を含む下流の重複を含む、１つ以上（すなわち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、または少なくとも８つ）の遺伝子セグメントを有し得る。例えば、一実施形態において、かかる１つ以上の遺伝子セグメントは、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、ＮＳ、Ｍ、ＨＡ、またはＮＡという遺伝子セグメントであり得る。別の実施形態において、かかる１つ以上の遺伝子セグメントは、ＰＢ１およびＰＢ２、ＰＢ２およびＰＡ、ＰＢ１およびＮＰ、ＰＢ１およびＮＳ、ＰＢ１およびＭ、ＰＢ１およびＨＡ、ＰＢ１およびＮＡ、ＰＢ２およびＰＡ、ＰＢ２およびＮＰ、ＰＢ２およびＮＳ、ＰＢ２およびＭ、ＰＢ２およびＨＡ、ＰＢ２およびＮＡ、ＰＡおよびＮＰ、ＰＡおよびＮＳ、ＰＡおよびＭ、ＰＡおよびＨＡ、ＰＡおよびＮＡ、ＮＰおよびＮＳ、ＮＰおよびＭ、ＮＰおよびＨＡ、ＮＰおよびＮＡ、ＮＳおよびＭ、ＮＳおよびＨＡ、ＮＳおよびＮＡ、ＭおよびＨＡ、ＭおよびＮＡ、またはＨＡおよびＮＡという遺伝子セグメントであり得る。

（Ｆ）インフルエンザウイルスバックボーンの特性
本発明の組換えウイルスのバックボーンは、インフルエンザウイルスの種類（例えば、インフルエンザＡ型またはＢ型、季節性またはパンデミックのインフルエンザウイルス）に関わらず、特にＶｅｒｏ細胞においてインフルエンザウイルスへと高い成長特性を付与する。本発明のインフルエンザウイルスは低い感染多重度（ＭＯＩ）（例えば、０．００１）を用いた製造プロセスにおいてでさえ、高い収率を呈する。ＭＯＩは、感染標的（例えば、細胞）当たりの作用因子（例えば、ウイルス）の平均数を指す。多重周期の感染が必要とされるとき（例えば、ウイルスワクチン製造）、より低いＭＯＩを用いる。現行の医薬品の製造管理および品質管理の基準に関する省令は、米国食品医薬品局によって施行されており、概して、高い収率のウイルスを依然として製造する最も低いＭＯＩの使用を必要とする。この理由は、マスターシードストックが高価であり、非感染性粒子および過剰の細胞性タンパク質から結果として生じる毒性がウイルス産生を低下させる可能性があるからである。

本発明のさらなる実施形態において、インフルエンザウイルスは概して安定であり、それにより、バックボーンタンパク質、特にＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、およびＮＳ１というタンパク質の選択されたアミノ酸は、低いＭＯＩで増殖するときでさえ、高度に保存されている。例えば、本発明の一実施形態において、選択されたアミノ酸は、Ｖｅｒｏ細胞株における少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、または１０回を超える連続継代後のＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰというタンパク質のうちの少なくとも１つにおいて保存されている。一実施形態において、Ｖｅｒｏ細胞株は、インフルエンザＡ型ウイルスのＭ２イオンチャネルタンパク質を安定して発現するＶｅｒｏ細胞（すなわち、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞）を含み得る。本発明の別の実施形態において、Ｖｅｒｏ細胞株は、インフルエンザＢ型ウイルスのＢＭ２イオンチャネルタンパク質（配列番号７４）を安定して発現するＶｅｒｏ細胞（すなわち、ＢＭ２Ｖｅｒｏ細胞）を含み得る。ＢＭ２は、インフルエンザＡ型ウイルスＭ２に対する機能的対応物であることが公知である。インフルエンザＢ型ウイルスＭ２タンパク質は、ウイルス複製を促進する上でのそのインフルエンザＡ型ウイルス対応物を機能的に置き換えることができる（Ｗａｎｉｔｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４９８：９９－１０８（２０１６））。かかる実施形態において、選択されたアミノ酸は、インフルエンザウイルスがインフルエンザＡ型ウイルスであるときでさえ、保存され得る。

遺伝子修飾されたＶｅｒｏ細胞（すなわち、インフルエンザＭ２またはＢＭ２タンパク質を発現するＶｅｒｏ細胞）は、正常なＶｅｒｏ細胞と同様に挙動し、正常なＶｅｒｏ細胞に匹敵するインフルエンザＡ型またはＢ型ウイルスの成長を支援する。Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞におけるＭ２ＳＲウイルスについてのウイルス力価は、非修飾のＶｅｒｏ細胞株における機能的Ｍ２を発現するインフルエンザウイルスを複製することに匹敵している。さらに、ＢＭ２Ｖｅｒｏ細胞におけるＢＭ２ＳＲウイルス（すなわち、インフルエンザＢ型由来の突然変異体Ｍ遺伝子セグメントを含みかつ機能的ＢＭ２タンパク質を結果的に発現しないインフルエンザウイルス）についてのウイルス力価は、非修飾のＶｅｒｏ細胞株における機能的ＢＭ２を発現するインフルエンザウイルスを複製することに匹敵している。したがって、Ｍ２ＳＲウイルスおよびＢＭ２ＳＲウイルスは、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞株およびＢＭ２Ｖｅｒｏ細胞株におけるインフルエンザウイルスを複製することと同様に挙動する。

本発明の一実施形態において、インフルエンザウイルスは、ヒト細胞において複製することができる。

医薬製剤
本発明は、本明細書に説明するような本発明の組換えウイルスを含む医薬製剤（例えば、ワクチンまたは他の免疫原性組成物）を提供する。

当該医薬製剤はさらに、少なくとも１つの医薬として許容され得る担体または医薬品添加物を含むことができる。本明細書で使用する場合、「医薬として許容され得る担体または医薬品添加物」という用語は、本発明のインフルエンザウイルス以外の医薬製剤の任意の構成要素を指す。医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、望ましくは本発明の組換えウイルスを有意に不活性化することなく、本発明の組換えウイルスの有効性を増強することができ、または医薬製剤の安定性を維持することができる。

少なくとも１つの医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、任意の適切な医薬として許容され得る担体または医薬品添加物であり得、これらの多くは当該技術分野において公知である。例示的な医薬として許容され得る担体または医薬品添加物としては、医薬製剤のｐＨを維持する構成要素（例えば、緩衝剤）、張性を調整する構成要素（例えば、無機塩などの張性調節剤）、タンパク質（例えば、ウイルス）の安定性および／もしくは免疫原性を改善する構成要素、粘膜付着を改善する構成要素、タンパク質の凝集を防止する構成要素、ならびに／または医薬製剤を保持する構成要素（例えば、防腐剤）がある。例えば、医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、無機塩、界面活性剤、アミノ酸、ポリマーもしくはポリマー化合物（例えば、タンパク質、多糖、もしくはヒドロゲル）、キレート剤、糖、ポリオール、および／またはアジュバント（例えば、特異的な免疫応答を増強する任意の物質）のうちの少なくとも１つを含み得、これらの多くは当該技術分野において公知である。特定の担体または医薬品添加物は、医薬製剤における１つを超える目的を機能し得、したがって、以下の実施形態は本明細書で列挙される説明に制限されない。

任意の適切な緩衝剤は、医薬製剤において存在し得る。一実施形態において、緩衝剤は、イミダゾール緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（例えば、１×ＤＰＢＳ）、ヒスチジン緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、およびスクロースホスファートグルタマート緩衝液（ＳＰＧ）のうちの少なくとも１つを含む。ＰＢＳ調製物および／またはＤＰＢＳ調製物は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、一塩基性リン酸カリウム、および二塩基性リン酸ナトリウムを含み得、場合によりさらに、塩化カルシウムおよび／または塩化マグネシウムを含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＢＳ調製物および／またはＤＰＢＳ調製物は、約１３６．９ｍＭ塩化ナトリウム、約２．６７ｍＭ塩化カリウム、約１．４７ｍＭ一塩基性リン酸カリウム、および約８．１ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウムを含むが、その多くが当該技術分野において公知である任意の適切なＰＢＳ調製物および／またはＤＰＢＳ調製物は、医薬製剤における緩衝剤として使用され得る。

当該緩衝剤は、任意の適切な濃度で医薬製剤中に存在し得る。当該緩衝剤は、約０．１ｍＭ以上、約１ｍＭ以上、約１０ｍＭ以上、約２０ｍＭ以上、約３０ｍＭ以上、約４０ｍＭ以上、約５０ｍＭ以上、約６０ｍＭ以上、約７０ｍＭ以上、約８０ｍＭ以上、約９０ｍＭ以上、約１００ｍＭ以上、約１２０ｍＭ以上、約１４０ｍＭ以上、約１６０ｍＭ以上、約１８０ｍＭ以上、約２００ｍＭ以上、約２５０ｍＭ以上、約３００ｍＭ以上、約３５０ｍＭ以上、約４００ｍＭ以上、約４５０ｍＭ以上、または約５００ｍＭ以上の濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、当該緩衝剤は、約１，０００ｍＭ以下、約５００ｍＭ以下、約４５０ｍＭ以下、約４００ｍＭ以下、約３５０ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約２５０ｍＭ以下、約２００ｍＭ以下、約１８０ｍＭ以下、約１６０ｍＭ以下、約１４０ｍＭ以下、約１２０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下、約９０ｍＭ以下、約８０ｍＭ以下、約７０ｍＭ以下、約６０ｍＭ以下、約５０ｍＭ以下、約４０ｍＭ以下、約３０ｍＭ以下、約２０ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、または約１ｍＭ以下の濃度で医薬製剤中に存在し得る。当該緩衝剤は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、当該緩衝剤は、約０．１ｍＭ～約１０００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１００ｍＭ～約５００ｍＭなどの濃度で医薬製剤中に存在し得る。

さらなる実施形態において、緩衝剤は、百分率濃度（例えば、体積／体積百分率（％ｖ／ｖ）、重量／体積百分率（％ｗ／ｖ）、または重量／重量百分率（％ｗ／ｗ））で医薬製剤中に存在する。緩衝剤は、約０．１％以上、約１％以上、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、または約５０％以上の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、緩衝剤は、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、または約１％以下の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。緩衝剤は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、緩衝剤は、約０．１％～約６０％、約１％～約６０％、約１０％～約６０％、約０．１％～約５０％、約１％～約５０％、約１０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約５０％、約２０％～約４０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％などの百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。

緩衝剤は、任意の適切なｐＨで医薬製剤のｐＨを維持することができる。緩衝剤は、例えば、約４以上、約４．５以上、約５以上、約５．５以上、約６以上、約６．５以上、約７以上、または約７．５以上のｐＨで医薬製剤のｐＨを維持することができる。あるいは、または加えて、緩衝剤は、例えば、約８以下、約７．５以下、約７以下、約６．５以下、約６以下、約５．５以下、約５以下、または約４．５以下のｐＨで医薬製剤のｐＨを維持することができる。緩衝剤は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内のｐＨで医薬製剤のｐＨを維持することができる。例えば、緩衝剤は、約４～約８、約４．５～約８、約５～約８、約５．５～約８、約６～約８、約６．５～約８、約７～約８、約７．５～約８、約４～約７．５、約５～約７．５、約６～約７．５、約７～約７．５、約４～約７、約５～約７、約６～約７などのｐＨで医薬製剤のｐＨを維持することができる。

任意の適切な張性調節剤は、医薬製剤中に存在し得る。ある特定の実施形態において、１つ以上の無機塩は、張性調節剤として医薬製剤中に存在する。無機塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）、および塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）のうちの少なくとも１つであり得る。張性調節剤、例えば、無機塩は、任意の適切な量で医薬製剤中に存在し得る。張性調節剤、例えば、無機塩は、約０．１ｍＭ以上、約０．２ｍＭ以上、約０．４ｍＭ以上、約０．６ｍＭ以上、約０．８ｍＭ以上、約１ｍＭ以上、約１．２ｍＭ以上、約１．４ｍＭ以上、約１．６ｍＭ以上、約１．８ｍＭ以上、約２ｍＭ以上、約３ｍＭ以上、約４ｍＭ以上、約５ｍＭ以上、約６ｍＭ以上、約７ｍＭ以上、約８ｍＭ以上、約９ｍＭ以上、約１０ｍＭ以上、約２０ｍＭ以上、約３０ｍＭ以上、約４０ｍＭ以上、約５０ｍＭ以上、約１００ｍＭ以上、約２００ｍＭ以上、約３００ｍＭ以上、約４００ｍＭ以上、約５００ｍＭ以上、約６００ｍＭ以上、約７００ｍＭ以上、約８００ｍＭ以上、約９００ｍＭ以上、約１０００ｍＭ以上、または約１５００ｍＭ以上の濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、張性調節剤、例えば、無機塩は、約２０００ｍＭ以下、約１５００ｍＭ以下、約１０００ｍＭ以下、約９００ｍＭ以下、約８００ｍＭ以下、約７００ｍＭ以下、約６００ｍＭ以下、約５００ｍＭ以下、約４５０ｍＭ以下、約４００ｍＭ以下、約３５０ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約２５０ｍＭ以下、約２００ｍＭ以下、約１５０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下、約５０ｍＭ以下、約４５ｍＭ以下、約４０ｍＭ以下、約３５ｍＭ以下、約３０ｍＭ以下、約２５ｍＭ以下、約２０ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、約９ｍＭ以下、約８ｍＭ以下、約７ｍＭ以下、約６ｍＭ以下、約５ｍＭ以下、約４ｍＭ以下、約３ｍＭ以下、約２ｍＭ以下、約１.８ｍＭ以下、約１.６ｍＭ以下、約１.４ｍＭ以下、約１.２ｍＭ以下、約１ｍＭ以下、約０.８ｍＭ以下、約０.６ｍＭ以下、約０.４ｍＭ以下、または約０.２ｍＭ以下の濃度で医薬製剤中に存在し得る。張性調節剤、例えば、無機塩は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、張性調節剤、例えば、無機塩は、約０．１ｍＭ～約２０００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１０００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約２５０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１００ｍＭ、約０．１～約５０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約２０００ｍＭ、約１ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、約１ｍＭ～約２５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２０００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭ、約５００ｍＭ～約２０００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１０００ｍＭなどの濃度で医薬製剤中に存在し得る。

さらなる実施形態において、無機塩は、百分率濃度（例えば、体積／体積百分率（％ｖ／ｖ）、重量／体積百分率（％ｗ／ｖ）、または重量／重量百分率（％ｗ／ｗ））で医薬製剤中に存在する。張性調節剤、例えば、無機塩は、約０．１％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、または約１０％以上の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、張性調節剤、例えば、無機塩は、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。張性調節剤、例えば、無機塩は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、張性調節剤、例えば、無機塩は、約０．１％～約１％、約０．１％～約２％、約０．１％～約５％、約０．１％～約１０％、約１％～約２％、約１％～約５％、約１％～約１０％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約４％～約１０％、約５％～約１０％などの百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。

任意の適切な界面活性剤は、医薬製剤中に存在し得る。ある特定の実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、デオキシコール酸ナトリウム、およびポロキサマー１８８のうちの少なくとも１つを含むことができる。界面活性剤は、任意の適切な量で医薬製剤中に存在し得る。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、百分率濃度（例えば、体積／体積百分率（％ｖ／ｖ）、重量／体積百分率（％ｗ／ｖ）、または重量／重量百分率（％ｗ／ｗ））で医薬製剤中に存在する。界面活性剤は、約０．０１％以上、約０．０２％以上、約０．０３％以上、約０．０４％以上、約０．０５％以上、約０．０６％以上、約０．０７％以上、約０．０８％以上、約０．０９％以上、約０．１％以上、約０．２％以上、約０．３％以上、約０．４％以上、約０．５％以上、約０．６％以上、約０．７％以上、約０．８％以上、約０．９％以上、または約１％以上の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、界面活性剤は、約１％以下、約０．９％以下、約０．８％以下、約０．７％以下、約０．６％以下、約０．５％以下、約０．４％以下、約０．３％以下、約０．２％以下、または約０．１％以下の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。界面活性剤は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、界面活性剤は、約０．０１％～約１％、約０．０１％～約０．１％、約０．０５％～約１％、約０．０５％～約０．１％、約０．１％～約１％、約０．１％～約０．５％、約０．２％～約１％、約０．５％～約１％などの百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。

任意の適切なアミノ酸は、医薬製剤中に存在し得る。ある特定の実施形態において、アミノ酸は、アルギニン、グルタミン酸またはグルタミン酸塩、アスパラギン、ヒスチジン、およびグリシンのうちの１つ以上であり得る。アミノ酸は、任意の適切な量で医薬製剤中に存在し得る。アミノ酸は、約１ｍＭ以上、約２ｍＭ以上、約３ｍＭ以上、約５ｍＭ以上、約６ｍＭ以上、約７ｍＭ以上、約８ｍＭ以上、約９ｍＭ以上、または約１０ｍＭ以上の濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、アミノ酸は、約約１００ｍＭ以下、約９０ｍＭ以下、約８０ｍＭ以下、約７０ｍＭ以下、約６０ｍＭ以下、約５０ｍＭ以下、約４０ｍＭ以下、約３０ｍＭ以下、約２０ｍＭ以下、または約１０ｍＭ以下の濃度で医薬製剤中に存在し得る。アミノ酸は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、アミノ酸は、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約５０ｍＭなどの濃度で医薬製剤中に存在し得る。

いくつかの実施形態において、アミノ酸は、百分率濃度（例えば、体積／体積百分率（％ｖ／ｖ）、重量／体積百分率（％ｗ／ｖ）、または重量／重量百分率（％ｗ／ｗ））で医薬製剤中に存在する。アミノ酸は、約０．１％以上、約０．２％以上、約０．３％以上、約０．４％以上、約０．５％以上、約０．６％以上、約０．７％以上、約０．８％以上、約０．９％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、または約５％以上の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、アミノ酸は、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。アミノ酸は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、アミノ酸は、約０．１％～１０％、約０．２％～約１０％、約０．５％～約１０％、約０．１％～約５％、約０．１％～約２％、約０．２％～約２％、約０．５％～約１％などの百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。

任意の適切なポリマーまたはポリマー化合物は、医薬製剤中に存在し得る。ポリマーまたはポリマー化合物は、例えば、タンパク質、多糖、ヒドロゲル、または任意の他の適切なポリマーもしくはポリマー化合物であり得、それらの多くは当該技術分野で公知である。ポリマーは好ましくは、カルボキシメチルセルロースまたはポリ（アクリル酸）などのポリアニオン性であり得る。例えば、ポリマーまたはポリマー化合物は、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、血清アルブミン（ＳＡ）、ゼラチン、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）、キトサン、デキストラン（ＤＥＸ７０Ｋ、ＤＥＸ４０Ｋ）、およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ４０Ｋ）であり得る。

ポリマーまたはポリマー化合物は、任意の適切な量で医薬製剤中に存在し得る。ポリマーまたはポリマー化合物は、百分率濃度（例えば、体積／体積百分率（％ｖ／ｖ）、重量／体積百分率（％ｗ／ｖ）、または重量／重量百分率（％ｗ／ｗ））で医薬製剤中に存在し得る。ポリマーまたはポリマー化合物は、約０．１％以上、約０．２％以上、約０．３％以上、約０．４％以上、約０．５％以上、約０．６％以上、約０．７％以上、約０．８％以上、約０．９％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、または約５％以上の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、ポリマーまたはポリマー化合物は、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。ポリマーまたはポリマー化合物は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、ポリマーまたはポリマー化合物は、約０．１％～約１０％、約０．２％～１約０％、約０．５％～約１０％、約０．１％～約５％、約０．１％～約２％、約０．２％～約２％、約０．５～約２％、約０．１％～約１％、約０．２％～約１％、約０．５％～約１％などの百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。

任意の適切なキレート剤は、医薬製剤中に存在し得る。キレート剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、アミドオキシム化合物（ＡＯＸ）、および／またはジチオトレイトール（ＤＴＴ）であり得る。キレート剤は、任意の適切な濃度で医薬製剤中に存在し得る。キレート剤は、１０μＭ以上、約２０μＭ以上、約３０μＭ以上、約４０μＭ以上、約５０μＭ以上、約６０μＭ以上、約７０μＭ以上、約８０μＭ以上、約９０μＭ以上、約１００μＭ以上、約１２０μＭ以上、または約１５０μＭ以上の濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、キレート剤は、約５００μＭ以下、約４００μＭ以下、約３００μＭ以下、約２００μＭ以下、約１５０μＭ以下、約１４０μＭ以下、約１３０μＭ以下、約１２０μＭ以下、約１１０μＭ以下、約１００μＭ以下、約８０μＭ以下、約７０μＭ以下、約６０μＭ以下、または約５０μＭ以下の濃度で医薬製剤中に存在し得る。キレート剤は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、キレート剤は、約１０μＭ～約５００μＭ、約１０μＭ～約２００μＭ、約１０μＭ～約１５０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約５０μＭ～約５００μＭ、約５０μＭ～約２００μＭ、約５０μＭ～約１５０μＭ、約５０μＭ～約１００μＭなどの濃度で医薬製剤中に存在し得る。

任意の適切な糖は、医薬製剤中に存在し得る。糖は、例えば、スクロース、トレハロース、マンノース、およびラクトースのうちの１つ以上であり得る。糖は、任意の適切な濃度で医薬製剤中に存在し得る。糖は、約０．１ｍＭ以上、約０．２ｍＭ以上、約０．４ｍＭ以上、約０．６ｍＭ以上、約０．８ｍＭ以上、約１ｍＭ以上、約１．２ｍＭ以上、約１．４ｍＭ以上、約１．６ｍＭ以上、約１．８ｍＭ以上、約２ｍＭ以上、約３ｍＭ以上、約４ｍＭ以上、約５ｍＭ以上、約６ｍＭ以上、約７ｍＭ以上、約８ｍＭ以上、約９ｍＭ以上、約１０ｍＭ以上、約２０ｍＭ以上、約３０ｍＭ以上、約４０ｍＭ以上、約５０ｍＭ以上、約６０ｍＭ以上、約７０ｍＭ以上、約８０ｍＭ以上、約９０ｍＭ以上、または約１００ｍＭ以上、約２００ｍＭ以上、約３００ｍＭ以上、約４００ｍＭ以上、約５００ｍＭ以上、約６００ｍＭ以上、約７００ｍＭ以上、約８００ｍＭ以上、約９００ｍＭ以上、約１０００ｍＭ以上、または約１５００ｍＭ以上の濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、糖は、約２０００ｍＭ以下、約１５００ｍＭ以下、約１０００ｍＭ以下、約９００ｍＭ以下、約８００ｍＭ以下、約７００ｍＭ以下、約６００ｍＭ以下、約５００ｍＭ以下、約４５０ｍＭ以下、約４００ｍＭ以下、約３５０ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約２５０ｍＭ以下、約約２００ｍＭ以下、約１５０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下、約５０ｍＭ以下、約４５ｍＭ以下、約４０ｍＭ以下、約３５ｍＭ以下、約３０ｍＭ以下、約２５ｍＭ以下、約２０ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、約９ｍＭ以下、約８ｍＭ以下、約７ｍＭ以下、約６ｍＭ以下、約５ｍＭ以下、約４ｍＭ以下、約３ｍＭ以下、約２ｍＭ以下、約１．８ｍＭ以下、約１．６ｍＭ以下、約１．４ｍＭ以下、約１．２ｍＭ以下、約１ｍＭ以下、約０．８ｍＭ以下、約０．６ｍＭ以下、約０．４ｍＭ以下、または約０．２ｍＭ以下の濃度で医薬製剤中に存在し得る。糖は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、糖は、約０．１ｍＭ～約２０００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１０００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約５００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約２５０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１００ｍＭ、約０．１～約５０ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約２０００ｍＭ、約１ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、約１ｍＭ～約２５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０００ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５００ｍＭ、v１０ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５００ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１００ｍＭ～約２０００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭ、約５００ｍＭ～約２０００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１５００ｍＭ、約５００ｍＭ～約１０００ｍＭなどの濃度で医薬製剤中に存在し得る。

他の実施形態において、糖は、百分率濃度（例えば、体積／体積百分率（％ｖ／ｖ）、重量／体積百分率（％ｗ／ｖ）、または重量／重量百分率（％ｗ／ｗ））で医薬製剤中に存在する。糖は、約０．１％以上、約１％以上、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、糖は、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、または約１％以下の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。糖は、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、糖は、約０．１％～約５０％、約１％～約５０％、約１０％～約５０％、約０．１％～約２０％、約１％～約２０％、約１０％～約２０％、約０．１％～約１０％、約１％～約１０％などの百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。

任意の適切なポリオールは、医薬製剤中に存在し得る。ポリオールは、例えば、ソルビトールおよび／またはマンニトールであり得る。ポリオールは、任意の適切な濃度で医薬製剤中に存在し得る。ポリオールは、約０.１ｍＭ以上、約１ｍＭ以上、約１０ｍＭ以上、約２０ｍＭ以上、約３０ｍＭ以上、約４０ｍＭ以上、約５０ｍＭ以上、約６０ｍＭ以上、約７０ｍＭ以上、約８０ｍＭ以上、約９０ｍＭ以上、約１００ｍＭ以上、約１２０ｍＭ以上、約１４０ｍＭ以上、約１６０ｍＭ以上、約１８０ｍＭ以上、約２００ｍＭ以上、約２５０ｍＭ以上、約３００ｍＭ以上、約３５０ｍＭ以上、約４００ｍＭ以上、約４５０ｍＭ以上、または約５００ｍＭ以上の濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、ポリオールは、約１０００ｍＭ以下、約５００ｍＭ以下、約４５０ｍＭ以下、約４００ｍＭ以下、約３５０ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約２５０ｍＭ以下、約２００ｍＭ以下、約１８０ｍＭ以下、約１６０ｍＭ以下、約１４０ｍＭ以下、約１２０ｍＭ以下、約１００ｍＭ以下、約９０ｍＭ以下、約８０ｍＭ以下、約７０ｍＭ以下、約６０ｍＭ以下、約５０ｍＭ以下、約４０ｍＭ以下、約３０ｍＭ以下、約２０ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、または約１ｍＭ以下の濃度で医薬製剤中に存在し得る。ポリオールは、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、ポリオールは、約０.１ｍＭ～約１０００ｍＭ、約０.１ｍＭ～約５００ｍＭ、約０.１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１００ｍＭ～約５００ｍＭなどの濃度で医薬製剤中に存在し得る。

他の実施形態において、ポリオールは、百分率濃度（例えば、体積／体積百分率（％ｖ／ｖ）、重量／体積百分率（％ｗ／ｖ）、または重量／重量百分率（％ｗ／ｗ））で医薬製剤中に存在する。ポリオールは、約０．１％以上、約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、または約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。あるいは、または加えて、ポリオールは、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。ポリオールは、上述の終点のうちのいずれかによって境界を定められた範囲内の任意の百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。例えば、ポリオールは、約０．１％～約５０％、約１％～約５０％、約５％～約５０％、約１０％～約５０％、約１５％～約５０％、約０．１％～約２５％、約１％～約２５％、約５％～約２５％、約１０％～約２５％、約１５％～約２５％、約０．１％～約１５％、約１％～約１５％、約５％～約１５％、約１０％～約１５％、約０．１％～約１０％、約１％～約１０％、約５％～約１０％、約０．１％～約５％、約１％～約５％などの百分率濃度で医薬製剤中に存在し得る。

一実施形態において、医薬製剤は、本発明のインフルエンザウイルス、約０．５Ｍのスクロース、約０．１Ｍまたは約０．５Ｍのマンノース、約０．３Ｍまたは約０．５Ｍのトレハロース、約５０％のＳＰＧ、および約０．０５％のポリソルベート２０を含む。別の実施形態において、医薬製剤は、本発明のインフルエンザウイルス、約０．５Ｍのスクロース、約０．３Ｍのトレハロース、および約０．０５％のポリソルベート２０を含む。

少なくとも１つの医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、医薬製剤の成分を結合させるよう機能する構成要素（例えば、結合剤）であり得る。結合剤としては、タンパク質（例えば、ゼラチン）、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン）、および／または多糖もしくはその誘導体（例えば、澱粉およびセルロース）があり得るが、これらに限定されない。少なくとも１つの医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、医薬製剤のかさを増大させる構成要素（例えば、増量剤、希釈剤、および／または充填剤）であり得る。かかる増量剤としては、多糖もしくはその誘導体、糖、および／または無機化合物があり得るが、これらに限定されない。医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、医薬製剤の味および／または外観を増強する構成要素（例えば、香料、甘味料、および／または着色料）であり得る。医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、液体または気体を吸収することまたは吸着することによって医薬製剤を耐湿性とする構成要素（例えば、吸着材）であり得る。吸着材としては、澱粉、リン酸カルシウム、および／またはコロイド状二酸化ケイ素があるが、これらに限定されない。医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、澱粉、セルロースおよび／もしくは当該技術分野で公知の任意の他のポリマー、またはそれらの誘導体（例えば、架橋ポリビニルピロリドンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム）など、医薬製剤の溶解を促進する構成要素（例えば、崩壊剤）であり得る。

いくつかの実施形態において、医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、医薬製剤の製造においておよび当該製造の間に粒子間付着を低減させおよび／または生成物の流れを最適化する構成要素（例えば、流動化剤）である。流動化剤の例としては、タルク、コロイド状二酸化ケイ素、およびトウモロコシ澱粉があるが、これらに限定されない。医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、成分間の付着を低減させることなど、非粘着特性を提供する構成要素、例えば、医薬製剤の製造におけるおよび当該製造の間の、特に医薬製剤が経口調製物として製剤化されるときの、パンチフェイスまたは滑沢剤であり得る。例えば、付着防止剤は、ステアリン酸マグネシウムを含み得る。他の実施形態において、医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、成分の集塊を低減させおよび／または、例えば、医薬製剤、すなわち経口調製物として製剤化される医薬製剤の表面と製造中のダイス壁との間にある摩擦を低減させる構成要素であり得る（例えば、滑沢剤）。ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、植物油、鉱油、ポリエチレングリコール、および／またはラウリル硫酸ナトリウムなど、水溶性または水不溶性の滑沢剤はいずれも、ある特定の実施形態により使用され得る。医薬として許容され得る担体または医薬品添加物は、コーティング剤として作用する構成要素であり得る。コーティング剤としては、ゼラチンおよび／またはセルロース系コーティング剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）があるが、これらに限定されない。

他の適切な結合剤、香料、甘味料、着色料、崩壊剤、流動化剤、付着防止剤、滑沢剤、およびコーティング剤は、当該技術分野で周知であり、容易に同定可能である。

医薬製剤はさらに、治療薬（例えば、化学治療薬または抗炎症薬）を含むことができる。医薬製剤はまた、免疫応答をインフルエンザウイルスとは別個に惹起する作用因子も含むことができる。本発明のインフルエンザウイルス以外のかかる追加の構成要素は、任意の適切な量で存在することができる。

追加の構成要素は、免疫系に対する提示に先立って、医薬製剤を形成するために他の構成要素と混合することができる。追加の構成要素はまた、医薬製剤とは別個に免疫系に対して提示することもできる。例えば、追加の構成要素および医薬製剤は別個に、免疫系に対して提示する（例えば、生物へ投与する）ことができる。追加の構成要素および医薬製剤を別個に投与するとき、追加の構成要素および医薬製剤は、免疫化される生物の同じ部位へ投与することができる。

医薬製剤の一実施形態において、医薬製剤は、ウイルスワクチンである。ウイルスワクチンは、生の弱毒化ウイルスワクチン、または不活化ウイルスワクチン（例えば、全ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、またはサブユニットワクチン）であり得る。ウイルスワクチンは、複数のインフルエンザウイルスバックボーンサブタイプを用いて（すなわち、インフルエンザＡ型については異なる赤血球凝集素サブタイプおよびノイラミニダーゼサブタイプ、ならびにインフルエンザＢ型についてはＹａｍａｇａｔａ系統またはＶｉｃｔｏｒｉａ系統のいずれかを用いて）、一価のワクチン、二価のワクチン（例えば、Ｈ１Ｈ３、Ｈ１Ｂｙ、Ｈ１Ｂｖ、Ｈ３Ｂｖ、またはＢｖＢｙ）、三価のワクチン（例えば、Ｈ１Ｈ３Ｂｙ、Ｈ１Ｈ３Ｂｖ、ＢｖＢｙＨ１、またはＢｖＢｙＨ３）、または四価のワクチン（例えば、Ｈ１Ｈ３ＢｙＢｖ）として製剤化され得る。例えば、ワクチンは、本発明の組換えウイルスの複数の実施形態を含み得る。いくつかの実施形態において、ワクチンはさらに、本発明の組換えウイルスとは異なる少なくとも１つの組換えウイルスを含み得る。

ウイルスワクチンは、任意の適切な投与手段のための組成物へと製剤化することができる。例えば、ウイルスワクチンは、経口調製物（例えば、カプセル剤、錠剤、または口腔フィルム剤）、噴霧剤（例えば、鼻内噴霧剤）、または、水性もしくは非水性のエマルション剤、液剤、もしくは懸濁剤など、鼻内投与、または非経口投与、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与もしくは皮下投与に適した任意の組成物として製剤化することができる。

実施形態：
（１）インフルエンザウイルスバックボーンを含む組換えウイルスであって、インフルエンザウイルスバックボーンが、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントを含み、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントのうちの少なくとも１つが、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ（ａ）ＰＢ１遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードし、ここで、選択されたアミノ酸が、位置４０のロイシンおよび位置１８０のトリプトファン、ならびに位置４６４のアスパラギン、位置５６３のイソロイシン、または位置６０７のセリンのうちの少なくとも１つを含み、かつＰＢ１遺伝子セグメントが場合により、ヌクレオチド位置４でのシトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み、（ｂ）ＰＢ２遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ２タンパク質をコードし、ここで、選択されたアミノ酸が、位置５０４のバリン、ならびに場合により、位置４６７のイソロイシンおよび位置５２９のバリンを含み、かつＰＢ２遺伝子セグメントが場合により、ヌクレオチド位置４でのシトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み、（ｃ）ＰＡ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＡタンパク質をコードし、ここで、選択されたアミノ酸が、位置４０１のリジンを含み、かつＰＡ遺伝子セグメントが場合により、ヌクレオチド位置４でのシトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み、（ｄ）ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードし、ここで、選択されたアミノ酸が、位置１１６のロイシン、および位置２９４のリジンまたは位置３１１のアルギニンのうちの少なくとも1つを含み、かつ（ｅ）ＮＳ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＳ１タンパク質をコードし、ここで、選択されたアミノ酸が、位置３０のプロリン、位置５５のリジン、および位置１１８のリジンを含む、組換えウイルス。

（２）抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、実施形態１の組換えウイルス。

（３）Ｍ遺伝子セグメントが、抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、実施形態１または２の組換えウイルス。

（４）Ｍ遺伝子セグメントが、突然変異したＭ２タンパク質をコードする、実施形態１～３のいずれかの組換えウイルス。

（５）Ｍ遺伝子セグメントが、少なくとも１つのリンカータンパク質およびＦＬＡＧエピトープタグを含むタンパク質をコードする、実施形態４の組換えウイルス。

（６）Ｍセグメントが、配列番号１～１４および９２～９６のいずれか１つを含むタンパク質をコードする、実施形態１～５のいずれか１つの組換えウイルス。

（７）インフルエンザウイルスバックボーンを含む組換えウイルスであって、インフルエンザウイルスバックボーンが、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントを含み、ここで、（ａ）ＰＡ遺伝子セグメントが、ヌクレオチド位置２２７２のチミンを含み、（ｂ）ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードし、ここで、選択されたアミノ酸が、位置４０のセリン、位置１６１のアスパラギンまたはグリシン、位置２０４のトレオニン、および場合により位置９３のバリンを含み、かつ（ｃ）ＮＳ遺伝子セグメントが、ヌクレオチド位置３９のグアニンを含み、ここで、ＮＳ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＳタンパク質をコードし、ここで、選択されたアミノ酸が、位置１７６のグルタミンを含む、組換えウイルス。

（８）抗原が、ＳＡＲＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、実施形態７の組換えウイルス。

（９）Ｍ遺伝子セグメントが、抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片であり、かつさらに、突然変異したＢＭ２タンパク質をコードする、実施形態７または８の組換えウイルス。

（１０）ＮＳ遺伝子セグメントが、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、実施形態１～９のいずれか１つの組換えウイルス。

（１１）抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、実施形態１～１０のいずれか１つの組換えウイルス。

（１２）（ＮＳ遺伝子セグメントが、（１）ＮＳ１タンパク質、（２）少なくとも１つの可撓性リンカータンパク質、（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片、（４）少なくとも１つの開裂可能な開裂性配列、および（５）ＮＥＰタンパク質をコードする、実施形態１～１１のいずれか１つの組換えウイルス。

少なくとも１つの開裂可能な開裂性配列が、Ｔ２Ａペプチド配列またはＰ２Ａペプチド配列である、実施形態１２の組換えウイルス。

（１４）ＮＳ遺伝子セグメントが、配列番号９７～１０４のいずれか１つを含むタンパク質をコードする、実施形態１～１３のいずれか１つの組換えウイルス。

（１５）ＭおよびＮＳという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、実施形態１または７の組換えウイルス。

（１６）ＮＡおよびＮＳという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質の免疫原性断片である、実施形態１または７の組換えウイルス。

（１７）ＭおよびＮＡという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質の免疫原性断片である、実施形態１または７の組換えウイルス。

（１８）ＭおよびＨＡという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質の免疫原性断片である、実施形態１または７の組換えウイルス。

（１９）ＮＳおよびＮＡという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質の免疫原性断片である、実施形態１または７の組換えウイルス。

（２０）ＮＳおよびＨＡという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、実施形態１または７の組換えウイルス。

（２１）ウイルスが、ヒト細胞において複製することができる、実施形態１～２０のいずれか１つの組換えウイルス。

（２２）同じ条件下で、選択されたアミノ酸をＶｅｒｏ細胞において有さないことを除いて同じである組換えウイルスと比較して、増強した成長を有する、実施形態１～２１のいずれか１つの組換えウイルス。

（２３）１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む遺伝子セグメントがさらに、下流の重複を含み、かつ、下流の重複が、少なくとも１つのサイレントヌクレオチド突然変異を含む、実施形態１～２２のいずれか１つの組換えウイルス。

（２４）実施形態１～２３のいずれか１つの組換えウイルスを含む、医薬製剤。

（２５）ワクチンが、一価のワクチンとして製剤化される、実施形態２４の医薬製剤。

（２６）ワクチンが、二価のワクチンとして製剤化される、実施形態２４の医薬製剤。

（２７）ワクチンが、三価のワクチンとして製剤化される、実施形態２４の医薬製剤。

（２８）ワクチンが、四価のワクチンとして製剤化される、実施形態２４の医薬製剤。

（２９）実施形態１～２３のいずれか１つの組換えウイルスまたは実施形態２４～２８のいずれか１つの医薬製剤を哺乳動物へ投与し、それにより、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘起することを含む、哺乳動物において免疫応答を誘起する方法。

（３０）哺乳動物がヒトである、実施形態２９の方法。

以下の実施例はさらに、本発明を説明するが、当然ではあるが、いかなる方法においても本発明の範囲を制限するものとして解釈されないものとする。

実施例１
本実施例は、インフルエンザベクターにおいて使用されるＭＨＣ Ｉペプチドを選択するために使用される方法を実証する。ペプチドは、Ｍ２、ＢＭ２、およびＮＳという遺伝子への挿入に適していた。

ワクチンのためのペプチド抗原を、最も広範な起こり得る数のＭＨＣ遺伝子型からの免疫応答を刺激する能力に基づいて選択し、したがって、最大の起こり得る数の有力なワクチンに対する利益を提供した。このアプローチを採用した理由は、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子と、免疫エフェクターＴ細胞への提示のために結合および表示される同族抗原ペプチドとの相互作用に対して、高い特異性があるからであった。特異的ＭＨＣ Ｉ親和性がより高い抗原ペプチドは、ワクチン接種のときにより強い免疫応答を誘起する。所与のＭＨＣクラスＩ分子に対する任意のペプチド配列の親和性を予測することができる多くのモデルを開発した。この相互作用はまた、異なる遺伝的背景に由来する個体内で、世界中で認められた多くの公知のＭＨＣクラスＩ遺伝子型のうちで対立遺伝子特異的でもある。したがって、どの単一ペプチドも、個々のＭＨＣ Ｉ遺伝子型に依存するＭＨＣクラスＩ受容体に対する異なる親和性を有するであろう。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのＳ１またはスパイク表面糖タンパク質を、最良のペプチドの特定のための標的抗原タンパク質として使用した。Ｓ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号７７）を、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２型単離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１の完全ゲノム配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＮＣ＿０４５５１２．２）から、標準的なコドン使用表によって予測した。一次Ｓ１タンパク質配列を使用して、最良のＭＨＣクラスＩ適合性９マーペプチドを、２７員のヒトＭＨＣクラスＩ対立遺伝子パネルにわたるペプチド親和性の予測によって同定した。ペプチド予測を、予測因子全部にわたってまとまって、予測されたコンセンサスパーセンタイル順位によって順位づけし、１以下のパーセンタイル順位をもつものを選択した。クラスター解析をこれらのペプチドへ公知の方法を用いて適用し（例えば、Ｄｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：１３６９（２０１８）を参照されたい）、高い遺伝的多様性由来の多くのＭＨＣクラスＩ分子に対する高い親和性を有すると予測されるエピトープクラスターを拾った。上位スコアのペプチドを、２段階プロセスを用いて順位づけした。まず、ペプチドをクラスター連結度によって順位づけして、複数の９マーがタイル表示された（すなわち、ペプチドが整列しかつ部分的に重なっている）高い予測された親和性の領域であるペプチド親和性「スミア」を位置づけた。この方法で、９残基よりも長いペプチドスミアを特定し、ワクチン内での封入のためのターゲットとすることができる。所与のペプチドが上位１％においてスコアリングされた回数を表にして、累積的なヒット数および中央値エピトープ順位をスコアリングして、高い遺伝的多様性を持つヒト対象内でＭＨＣ Ｉを結合すると予測される上位ペプチドスミアを選択した。この方法は、以下でより詳細に説明する。

ＭＨＣ－Ｉ活性を用いたエピトープの予測
免疫エピトープデータベースおよび解析リソース（Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＩＥＤＢ））のＴｅｐｉＴｏｏｌを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質についてのアミノ酸配列からＭＨＣ Ｉ関連エピトープ予測を抽出した。ヒトＭＨＣ－Ｉ対立遺伝子についてエピトープを、２７対立遺伝子パネルを用いて予測し、エピトープの大きさを８マーから１１マーまでの範囲とすることができた。重複するペプチドを除去し、ＩＥＤＢ推奨の予測法を使用した。予測されるコンセンサスパーセンタイル順位が１以下のペプチドを選択し、順位条件に適合する６４７個のエピトープ、および１３６５６６個の全体的な要素セット（ｔｕｐｌｅ）（エピトープ、対立遺伝子、予測因子、順位）を生じさせた。

スミアへのエピトープのクラスター化
ＩＥＤＢのエピトープクラスター解析ツールを用いて、既に選択されたエピトープを、「エピトープスミア」と本明細書で称される、関連エピトープのクラスターへとクラスター化した。７０％の最小限の配列同一性閾値を選択し、エピトープリスト上にはサイズフィルタは配置しなかった。予測されるエピトープをスミアへと、１以下のコンセンサスパーセンタイル順位をもつものとしてクラスター化した。クラスター破壊性クラスター化アルゴリズムを使用し、エピトープアラインメントをもつクラスターをコンマ区切り値（ＣＳＶ）ファイル形式へと出力した。この使用の場合、連結性を低下させることによって、クラスターを効果的に順序立てた。この方法を使用して、辞書式順序クラスター－下位クラスターで選別される順序でクラスターを順位づけした。

スミア解析
パイソンスクリプトを使用して、クラスターを取り込み、正規化し、次いで、ＧｅｎＢａｎｋ ＲｅｆＳｅｑゲノムＮＣ０４５５１２．２から得られたスパイクＳ１タンパク質オープンリーディングフレームに対して整列させた。様々な定性的統計解析を、ヒットの分布、配列長などに関して実行して、スミア選別を得た。ヒット計数（１クラスターあたりのエピトープ数）および順位中央値（クラスターにおける各エピトープについてのコンセンサスパーセンタイル順位の中央値）を列として付加した。ヒット総数は、上位候補のスミア配列を選択するための有用な指標であった。小さな部分セットのペプチドスミアのみが、１クラスターあたり１０を超えるヒットを含有することがわかった（図１１）。１クラスターあたり９ヒットという任意のカットオフを設定することによって、８つの総スミアのみが１２７３個のアミノ酸長のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１タンパク質内で同定された。

統計解析からの結果を編集し、可視化のためにＣＳＶ形式へ再出力した。上位候補スミアを互いに比較し、手動で選別した。３つの場合、候補スミアは、重複またはほぼ隣接しており、２つの候補配列にわたるスーパーコンセンサススミア配列への結合を可能にした。選択した８個の候補スミアを表１に示す。

最適なスペーサーの設計
エピトープを、Ｆｒｅｄ２（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３２（１３）：１３６７－４８０３，２０４４（２０１６））において既に実施された公表アルゴリズム（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８（１）：９（２０１６））からの伸長によってコンカテマーへと集合させた。スペーサーおよびエピトープの順序づけはいずれもが、ネオエピトープ形成を最小限にしかつスペーサー領域におけるＭＨＣプロセシング切断確率を最大限にするために最適化されるものとする。理論上、コストマトリックスにおいて注意深く選択されたエントリーをプラスまたはマイナスの無限大に操作することは、最適化されたスペーサーを提供し得るが、使用中のＩＬＰソルバ（ＣＢＣ）は、目的物において無限の係数をもつ問題を解決し損なう。この新たな方法において、ｋマーのスペーサーをｋｍａｘ＝｛３，６｝について最適化した。存在するアミノ酸ストリングによってＣ末端またはＮ末端で結合したエピトープ鎖挿入物の両末端で切断およびネオエピトープ形成を適切に最適化するために、４部分修飾を設計して、従来法について改善した。
１．Ｃ末端／Ｎ末端結合ストリングを、Ｔｒａｖｅｌｉｎｇ Ｓａｌｅｓｍａｎモデル（Ｍｉｌｌｅｒ－Ｔｕｃｋｅｒ－Ｚｅｍｌｉｎ形式におけるＩＬＰとして定式化）においてペプチドセットに付加し、
２．スペーサーの最適化を修飾して、すべてのエピトープペプチドについての正確な末端において、境界を定めている配列に対してスペーサーを生成し、
３．制約をこのモデルへ付加して、エピトープおよび境界を定めている配列の正確な順序づけを強化し、
４．目的物を修飾して、境界を定めている配列によって導入されたＴＳＰコストマトリックスにおいて欠落しているエントリーを無視した。

実施例２
本実施例は、インフルエンザＡ型Ｍ２ＳＲベクター由来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）抗原の発現の成功を実証する。

インフルエンザＡ型Ｍ２ＳＲベクターからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ抗原を発現するために、操作されたＮＳセグメント８を合成で構築した（図１）。次いで、設計された遺伝子を陰性センスｖＲＮＡとしての発現のためのＲＮＡ ＰｏｌＩベクター内へと挿入した。セグメント８を設計して、３つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、すなわち、第１に、完全インフルエンザＡ型ＰＲ／８／１９３４ ＮＳ１タンパク質、可撓性ＧＳＧリンカー、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクＳ１タンパク質のアミノ酸３３１～５３０、別のＧＳＧリンカー、およびＰＲ８核外輸送タンパク質（ＮＥＰまたはＮＳ２）ＯＲＦの単一の融合ポリペプチドを発現させた。ＮＳ１とＲＢＤとの融合タンパク質をＮＥＰから、ブタテッショウウイルス１型２Ａ由来のＰ２Ａペプチドによって分離した。翻訳の間、Ｐ２Ａ部位は、下流のＮＥＰタンパク質の発現を、別個のポリペプチドとして、リボソームスリッページを包含すると考えられる未知の機序によって可能にする。例えば、ＮＥＰタンパク質は、配列番号１０８によって表され得る。したがって、ＮＥＰの必要とされる機能は維持されたが、ＮＳ１の機能性は、ＮＳ１ ＯＲＦ全体も維持されたので、保存されているものとする。人工的なセグメント８は、少なくとも２つの理由により不安定であり得る。配列の安定性を改善するために、２つの変化を実行した。スプライシングを除去すると、ＮＥＰエキソン１とエキソン２の一部とをコードするセグメントの一部は複製されなければならなかった（図２１および図２２を参照されたい）。そのため、いくつかのサイレント突然変異をＮＳ１およびＮＥＰの両ＯＲＦじゅうに導入して、これらの複製の間にある相同性を低減させた。加えて、ＧＳＧおよびＰ２Ａ部位の両配列を最適化して、インフルエンザのＡ－Ｔリッチコドンバイアスを反映した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、それがすでに６０％を超えるＡ－Ｔであったので、変化させられなかった。

ＮＳ１－ＲＢＤ融合がＮＳ１機能を実行し得ないか、またはＮＳ１機能が損なわれている可能性がある。その場合、組換えウイルスは、ｍＲＮＡポリアデニル化およびスプライシングを同様に変更させてインターフェロンおよびＲＩＧ－Ｉの両方が介在する生得的応答を抑制する能力が欠失していることがある。この可能性に対処するために、ＮＳ１とＲＢＤとの間にテセアアシグナウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）由来の切断部位をもつ別のコンストラクトを構築した（図２）。この設計は、３つの別個のポリペプチド、すなわち、ＮＳ１、ＲＢＤおよびＮＥＰの発現を可能にするよう企図した。

新たなＣｏＶ２ ＮＳセグメントをコードするベクターを、標準的なプラスミド系のインフルエンザウイルス逆方向遺伝学的手順において使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤセグメント８をもつＭ２欠乏性単一複製（Ｍ２ＳＲ）ウイルスを救助した。両ウイルスは、Ａ／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６ＩＶＲ－１８６（Ｈ３Ｎ２）のＷＨＯ推奨ワクチン株からＨＡおよびＮＡというセグメントを使用して得ることに成功した。ウイルスを、動物起源非含有（ＡＯＦ）培地中で生育したＭ２ＳＲから失っているＭ２タンパク質（配列番号１、１５、１７）を構成的に発現するように操作したＭ２ＶｅｒｏＡ細胞を用いて回収した。このウイルス救助および培養系は、ヒト臨床治験において検査のために企図されたＭ２ＳＲワクチン候補のｃＧＭＰ産生のためのウイルス種子の調製に適していた。

ＮＳ１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合コンストラクトの発現を、１．０を超える高い感染多重度（ＭＯＩ）でＣｏＶ２ ＮＳ１ Ｍ２ＳＲウイルス株をＶｅｒｏ細胞に感染させることによって検査した。ウイルスなしのモック、およびＲＢＤインサート感染のないシンガポール２０１６Ｍ２ＳＲを両方とも実行した。接種11時間後、細胞を全細胞溶解液の免疫ブロット分析のために収集した。結果、ＳＡＲＳ ＲＢＤに対する抗血清は、予想した大きさのタンパク質を結合することが示された。バンドは、ＲＢＤウイルスに感染した細胞の抽出物においてのみ検出されたが、対照においては検出されなかった（図３）。

ＮＳ１ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合コンストラクトの発現を確認するために、同じＶｅｒｏ細胞を高ＭＯＩで感染させ、細胞をホルマリンで、免疫蛍光染色のために固定した。細胞をＳＡＲＳ ＲＢＤに対する抗血清に対する抗血清とともにインキュベートした。洗浄後、細胞を二次的に標識された抗ウサギフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、およびＡＬＥＸＡ ＦＬＯＵＲ（商標）６４７によって直接標識した抗インフルエンザＡ型ＮＰ抗体によって染色した。図４に示す画像は、ＣｏＶ－２ ＮＳ１ Ｍ２ＳＲおよび標準物Ｍ２ＳＲの両方に感染した細胞が、検出可能なレベルのインフルエンザＡ型ＮＰタンパク質を発現することを示す。その一方で、ＲＢＤのＦＩＴＣ標識は、ＣｏＶ－２ ＮＳ１ Ｍ２ＳＲ感染した細胞においてのみ検出することができ、当該細胞は、有意な検出可能な蛍光を生じた。この染色は、ＮＳ１－ＲＢＤ融合タンパク質が細胞質性であることを示す。

実施例３
本実施例は、インフルエンザＢ型ＢＭ２ＳＲベクターからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤの発現の成功を実証する。

インフルエンザＢ型ＢＭ２ＳＲベクターからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ抗原を発現するために、操作されたインフルエンザＢＭ２欠乏性セグメント７ｓを合成で構築した（図５～６、配列番号８３、８４）。次いで、設計した遺伝子セグメントを、陰性センスｖＲＮＡとしての発現のためにＲＮＡ ＰｏｌＩベクター内へと挿入した。セグメント７ｓを設計して、単一ウイルスｍＲＮＡ内から２つのポリペプチドＯＲＦ、すなわち、第１に、完全なインフルエンザＢ型／フロリダ／４／２００６Ｍ１タンパク質、５マーリボソーム終止－開始スリッページ部位、および第２に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクＳ１タンパク質のアミノ酸３３０～５２４に対するＢＭ２の融合タンパク質を発現させた。ＢＭ１とＢＭ２との間で天然に認められる５塩基（５マー）配列モチーフＴＴ（以上、太字）Ａ（以上、斜字太字）ＴＧ（以上、斜字）（配列番号２０）は、ＢＭ１ ＯＲＦ翻訳終止コドン（太字）と、ＢＭ２ ＯＲＦについての開始コドン（斜字）との両方を含有する。翻訳のリボソームスリッページおよび再開は、インフルエンザＡ型セグメント７とは対照的に、スプライシングについての必要性なしで第２のリーディングフレームにおけるＢＭ２のウイルス発現を可能にする。インフルエンザＢ型セグメント７を含有する合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤにおいて、ＢＭ２ ＯＲＦのわずかな部分をＳ１ ＲＢＤへ融合させた（配列番号９５、９６）。

製造と不適合な培養においてウイルスの乏しい成長につながる人工インフルエンザセグメントは、不安定であり得る。このことは、少なくとも２つの理由による。第１に、必須の活性の発現、この場合、Ｍ１マトリックスタンパク質が影響され得る。配列の安定性を維持するために、ほぼ５マーの局所的なＲＮＡ構造を、Ｍ１翻訳が影響されないように維持した。したがって、ＢＭ２ ＯＲＦのアミノ末端のアミノ酸をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤと融合させた。セグメントは、低いパッケージング効率により失われることがある。インフルエンザゲノムセグメントすべての末端は自己相補性であるので、ハイブリダイゼーションを介して対を形成することができ、当該セグメントの両端から１００ｂｐまでにある非翻訳のおよび翻訳済みの両配列により、複雑な３次構造の形成を開始する。セグメントの正確なＵＴＲの保存は最も重要であった。ワクチンセグメント７において、コロナウイルス配列をインフルエンザＢ型の３’ＵＴＲへ融合した（ｍＲＮＡセンス）。当該ＵＴＲは、８５ｂｐ長のインフルエンザＡ型のＵＴＲよりも長かった。２つのバージョンを構築した。より保存的なバージョンは、ＢＭ２へのＲＢＤの挿入をコードし、それにより、ＢＭ２ ＯＲＦの両端からのより長い鎖が保存された(図５、配列番号８４）。より長いバージョンはそれぞれ、ＢＭ２の１０個および１３個の末端のアミノ酸を保有している（図６、配列番号９６）。

より多くトリミングで縮小されたバージョンは、ＲＢＤへ（配列番号９５）、ついで セグメントＵＴＲへ（図６、配列番号８３）直接融合したＢＭ２のＮ末端の９ｂｐ、３残基のみを含有している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を、インフルエンザのＡ－Ｔリッチコドンバイアスを反映しているかどうかを見るために検討した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列は、それがすでに約６０％のＡ－Ｔであったので変化させられなかった。

２つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｍセグメントをコードするベクター（配列番号８３、８４）を、標準的なプラスミド系インフルエンザウイルス逆方向遺伝学手順において使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ ＢＭ２ＳＲセグメント７を含有するＢＭ２欠乏性単一複製（ＢＭ２ＳＲ）ウイルスを救助した。両ウイルスは、Ｂ／ＣＡ／１２／２０１５（ＹＬ）のＷＨＯ推奨ワクチン株からのＨＡおよびＮＡというセグメントを用いて入手に成功した。ウイルスを、動物起源非含有（ＡＯＦ）培地において生育させたＢＭ２ＳＲウイルスから失っているＢＭ２タンパク質を構成的に発現するよう操作したＢＭ２Ｖｅｒｏ細胞を用いて回収した（配列番号２、１６、１８）。このウイルス救助および培養系は、ヒト臨床治験において検査のために企図したＢＭ２ＳＲワクチン候補のｃＧＭＰ産生のためのウイルス種子の調製に適していた。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＢＭ２融合タンパク質コンストラクト（配列番号９５、９６）の発現を、ＣｏＶ－２ ＢＭ２ＳＲウイルス株に、１．０を超える高い感染多重度（ＭＯＩ）でＶｅｒｏ細胞を感染させることによって検査した。ウイルスなしのモック、およびＲＢＤインサート感染のないＣＡ１２ ＢＭ２ＳＲのみのベクターの両方も行った。接種１１時間後、細胞を全細胞溶解液の免疫ブロット分析のために回収した。結果は、ＳＡＲＳ ＲＢＤに対する抗血清が、予想した大きさのタンパク質を結合することを示す。このバンドは、ＲＢＤウイルスに感染した細胞の抽出物においてのみ検出され、対照の抽出物においては検出されなかった（図７）。これらの結果は、最小２２ｋＤａのＲＢＤコンストラクトが、より長い２４ｋＤａバージョンよりも高いレベルまで発現することを示唆する。

実施例４
本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の配列をコードするＭ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲというウイルスがインビボで弱毒化したことを実証する。

７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを表４に示すような以下のウイルスコンストラクトで鼻内免疫化した。Ｍ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲというバックボーン配列、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列をコードするセグメントについての配列を、配列番号４３～４７、５６、５８、６０、６３～６７、７３、８０、８３、９５、９７および１０７において説明する。これらのウイルスをマウス１匹あたり１×１０^６ＴＣＩＤ_５０の用量で投与した。対照群のマウスに、１０％スクロースおよび５ｍＭグルタミン酸ナトリウム（ＳＰＧＮａ)を含有するＤＰＢＳ（ｐＨ７．２）を与えた。マウスを免疫化後１４日間、体重および感染の症状においていかなる変化についても観察した。

感染の臨床症状または体重減少は、Ｍ２ＳＲもしくはＢＭ２ＳＲという突然変異体またはＳＰＧ対照で免疫化したマウスにおいて１４日間の期間にわたって観察されなかった。図８Ａは、Ｍ２ＳＲ組換えウイルスについての、図８Ｂは、ＢＭ２ＳＲ組換えウイルスについての、免疫化後のマウスの体重変化百分率を示す。その上、群間における体重の変化は、１４日間の期間にわたって同様であった。これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列を含有するＭ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲというウイルスがマウスにおいて弱毒化し、病原性ではなかったことを示す。

実施例５
本実施例は、実施例４のＭ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲというウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して抗体応答を誘起することを実証する。

血清を初回免疫刺激化の前および初回投与の約３週間後にマウスから回収した。各群についてプールした血清試料由来の抗スパイクＲＢＤ血清ＩｇＧ抗体力価を、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。

ＥＬＩＳＡは、２９３Ｔ細胞において発現し、かつＣＯＭＰＬＥＴＥ（商標）Ｈｉｓ－Ｔａｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ樹脂（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いることによって精製した、Ｃ末端ＨＩＳタグ付き可溶性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２組換えＲＢＤタンパク質を用いて行った。ＥＬＩＳＡプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）における２μｇ／ｍＬの濃度のＲＢＤタンパク質１００μＬを用いて、４℃で一晩コーティングした。プレートを、０．１％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）および冷水魚類皮膚由来１％ゼラチンでブロッキングした後、プレートを複製して、冷水魚類皮膚由来１％ゼラチン含有ＰＢＳ－Ｔ中で希釈したマウス血清とともにインキュベートした。室温で２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ－Ｔで６回洗浄し、次いで、セイヨウワザビペルオキシダーゼと複合体形成した抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＫＰＬ、冷水魚類皮膚由来１％ゼラチン含有ＰＢＳ－Ｔ中で１：２，０００希釈）とともにインキュベートした。二次抗体を用いた１時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ－Ｔで６回洗浄し、次いで、１－ＳＴＥＰ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で顕色させた。１０分間のインキュベーションの後、この反応を４Ｎ硫酸の添加により停止させた。吸光度を４５０ｎｍの波長（ＯＤ_４５０）で測定した。終点力価は、ブランクプラス６の平均値×標準偏差を減算することによって決定されたカットオフ値を上回る希釈の逆数とした。

免役前のベースラインからのＥＬＩＳＡ力価の倍数増加を図９に示す。スパイクＲＢＤ配列をコードしなかった空ベクターは、２１日目のＥＬＩＳＡ力価において上昇を示さなかった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列をコードしたＭ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲというウイルスは、ＲＢＤスパイクＥＬＩＳＡ力価の上昇を誘起した。

実施例６
本実施例は、初回刺激タンパク質またはスパイクタンパク質に使用するワクチンの第２の投与の後で全身性の抗体が生じることを実証する。

実施例４におけるウイルスの４つの投与処置計画、すなわち、（１）Ｍ２ＳＲ－ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン候補（すなわち、ＡＭ２ＳＲ－ＣｏｖｉｄＳ－１）またはＭ２ＳＲベクターウイルス（すなわち、Ｍ２ＳＲ－Ｓｉｎｇ Ｖ５）のうちの１つを用いて初回刺激し、次いで、初回刺激のおおよそ４週間後に鼻内で同じもの（すなわち、ＡＭ２ＳＲ－ＣｏｖｉｄＳ－１またはＭ２ＳＲ－Ｓｉｎｇ Ｖ５）を用いて追加刺激したマウス、（２）Ｍ２ＳＲ－ＣｏＶＩＤ－１９ワクチン候補（すなわち、ＡＭ２ＳＲ－ＣｏｖｉｄＳ－１）またはＭ２ＳＲベクターウイルス（すなわち、Ｍ２ＳＲ－Ｓｉｎｇ Ｖ５）のうちの１つを用いて鼻内で初回刺激し、初回刺激の約４週間後に、精製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質を用いて筋肉内で追加刺激したマウス、（３）ＢＭ２ＳＲ－ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン候補（すなわち、ＢＭ２ＳＲ－ＣｏｖｉｄＳ－１）またはＢＭ２ＳＲベクターウイルス（すなわち、ＢＭ２ＳＲ－ＣＡ１２）のうちの１つを用いて初回刺激し、次いで、初回刺激のおおよそ４週間後に鼻内で同じものを用いて追加刺激したマウス、および（４）ＢＭ２ＳＲ－ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン候補（すなわち、ＢＭ２ＳＲ－ＣｏｖｉｄＳ－１）またはＢＭ２ＳＲベクターウイルス（すなわち、ＢＭ２ＳＲ－ＣＡ１２）のうちの１つを用いて鼻内で初回刺激し、初回刺激の約４週間後に、精製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質を用いて筋肉内で追加刺激したマウスを評価した。マウスはすべて、二次免役化（追加刺激）の約３週間後に、末期で出血させ、次いで、安楽死させ、血清試料を分析のために回収した。

血清試料を実施例５に関して上述に説明した通り、ＥＬＩＳＡによって分析した。

抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ ＩｇＧ力価を図２８に示す。スパイクＲＢＤ配列（すなわち、Ｍ２５Ｒ－Ｓｉｎｇ Ｖ５およびＢＭ２ＳＲ－ＣＡ１２）をコードしていない空ベクターを２回投与（初回刺激－追加刺激）しても、ＲＢＤスパイクＥＬＩＳＡ力価の上昇を誘起しなかった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列（すなわち、ＡＭ２ＳＲ－ＣｏｖｉｄＳ－１およびＢＭ２ＳＲ－ＣｏｖｉｄＳ－１）をコードしたＭ２ＳＲウイルスおよびＢＭ２ＳＲウイルスを２回投与（初回刺激－追加刺激）すると、ＲＢＤスパイクＥＬＩＳＡ力価が上昇した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列（すなわち、ＡＭ２ＳＲ－ＣｏｖｉｄＳ－１およびＢＭ２ＳＲ－ＣｏｖｉｄＳ－１）をコードしたＭ２ＳＲウイルスおよびＢＭ２ＳＲウイルスでの初回刺激は実質的に、精製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質を用いて追加刺激したときにＲＢＤスパイクのＥＬＩＳＡ力価を上昇させたのに対し、空Ｍ２ＳＲベクターウイルスを用いた初回刺激は、精製されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いて追加刺激したときにＲＢＤスパイクのＥＬＩＳＡ力価の実質的な上昇を誘起しなかった。

実施例７
本実施例は、Ｍ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲというベクターが、多価製剤において使用することができかつ、各々に対して免疫原性を保有することができることを実証する。

インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲまたはＢＭ２ＳＲ－ＶｉｃまたはＢＭ２ＳＲ－Ｙａｍウイルスは、一価、二価、三価または四価のワクチンとして製剤化されると、抗体応答を誘起する。

７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Ｎ＝８）を、一価のＨ１Ｎ１ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、一価のＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲ、二価のＨ１Ｎ１ならびにＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＭＲ、一価のＢＭ２ＳＲ－Ｖｉｃｔｏｒｉａ、一価のＢＭ２ＳＲ－Ｙａｍａｇａｔａ、二価のＢＭ２ＳＲ、三価のＨ１Ｎ１ならびにＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲならびにＢＭ２ＳＲＶｉｃｔｏｒｉａもしくはＹａｍａｇａｔａ、または四価のＨ１Ｎ１ならびにＨ３Ｎ２ ＦＧＨＹ１－Ｍ２ＳＲならびにＢＭ２ＳＲＶｉｃｔｏｒｉａおよびＹａｍａｇａｔａというワクチンで鼻内免疫化した。マウスの対照群をＳＰＧでモック免役化した。ワクチン接種の２８日目に、マウスを初回刺激免役化のために投与したのと同じワクチンからなる追加刺激免役化で鼻内免疫化した。血清試料を初回刺激免役化後の７日目、１４日目、および２１日目、ならびに追加刺激免役化（２８日目）の３５日目、４２日目および４９日目に採取した。血清試料由来の抗Ｈ１ ＨＡ、抗Ｈ３ ＨＡ、抗インフルエンザＢ型－Ｖｉｃ ＨＡおよび抗インフルエンザＢ型－Ｙａｍ ＨＡという血清ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定した。

結果として得られた抗Ｈ１ ＨＡデータを図１０Ａに示す。結果として得られた抗Ｈ３ ＨＡデータを図１０Ｂに示す。結果として得られた抗インフルエンザＢ型－Ｖｉｃ ＨＡデータを図１０Ｃに示す。結果として得られた抗インフルエンザＢ型－Ｙａｍ ＨＡデータを図１０Ｄに示す。本結果は、ワクチンがすべて、ＳＰＧ対照を上回って抗インフルエンザウイルス抗体を上昇させることができたこと、およびこれらの上昇が複数のワクチン製剤にわたって同様であったことを実証した。さらに、これらの結果は、一価の構成要素が、多価のワクチンへと製剤化されると一価の構成要素に対する免疫応答を誘起するよう能力を維持することを実証する。

実施例８
本実施例は、Ｍ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンが宿主に対する毒性を持たない再投与の際に上昇したインビボでの抗体応答を誘起することを実証することが予期される。

Ｍ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンウイルスが、宿主に対する毒性を生じることなく構成要素に対して免疫応答を誘起することを実証するために、１５匹の雄および１５匹の雌のフェレットを、１×１０^８ＴＣＩＤ_５０（低用量）または１×１０^９ＴＣＩＤ_５０（高用量）の用量レベルのＭ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンで鼻内免疫化するであろう。第３の群のフェレットを偽薬対照としてのＳＰＧを鼻内モック免疫化するであろう。３回用量のワクチン接種処置計画を各処置群について利用するであろう。フェレットに初回刺激免役化（試験１日目）ならびに１３日後および２７日後（試験１４日目および試験２８日目）の２回の追加刺激免役化を投与するであろう。各免役化の後、フェレットを死亡に向けて７日間観察するとともに、体重、体温、および臨床徴候を毎日測定するであろう。試験前ならびに試験１４日目、１６日目、３０日目、および４９日目に、生存しているフェレット全部から血液を回収して臨床病理学的性質を評価するであろう。血清試料を試験前、ならびに試験１４日目、３０日目、および４９日目に回収して、抗体レベルをＥＬＩＳＡ、赤血球凝集阻止（ＨＡＩ）アッセイ、およびウイルス中和（ＶＮ）アッセイによって経時的に評価するであろう。剖検を１群あたり５匹の雄および５匹の雌について、身体の外表面、すべての開口、頭蓋腔、胸腔および腹膜腔、ならびにそれらの内容物の検査を含めて、試験３日目、３０日目、および４９日目に行うであろう。

ワクチンウイルス免役化。 フェレットを１×１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量または１×１０^９ＴＣＩＤ_５０のいずれかのＭ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの３回の投与で鼻内免疫化するであろう。凍結したワクチンウイルスストックのバイアルを室温で少なくとも１０分間解凍し、次いで、冷蔵で、または湿らせた氷の上で、使用時まで保存した。フェレットをケタミン／キシラジンで麻酔し、当該ウイルス用量を５００μＬ（１つの鼻孔あたり２５０μＬ）の量で鼻内投与した。

Ｍ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンウイルスは、機能的Ｍ２タンパク質を発現しない、インフルエンザＡ型／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）のＨＡおよびＮＡという遺伝子ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤをコードする組換えインフルエンザＡ型ウイルスである。

実験デザイン： ４５匹の雄および４５匹の雌で試験開始時に１６～２２週齢の９０匹のフェレット（Ｔｒｉｐｌｅ Ｆ Ｆａｒｍｓ，Ｓａｙｒｅ，ＰＡ）を本試験に利用するであろう。動物への手技はすべて、ＩＩＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って動物バイオセーフティレベル２施設において行うであろう。免疫化に先立って、フェレットを４日間監視して、ベースライン体温を確立するであろう。温度の読み取りは、各フェレットにおいて皮下に植え込まれたトランスポンダー（ＢｉｏＭｅｄｉｃ ｄａｔａ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅａｆｏｒｄ，ＤＥ）を通じて毎日記録するであろう。血液を回収した後に試験を開始し、血清をインフルエンザ抗体について検査するであろう。免疫化前血清試料を受容体破壊酵素（ＲＤＥ）（デンカ生研、東京都、日本）を用いて処理して、非特異的阻止因子を除去し、次いで、連続希釈し、規定量のインフルエンザＡ型／ミシガン／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ型／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ型／プーケット／３０７３／２０１３（Ｙａｍａｇａｔａ系統）、およびＢ型／コロラド／０６／２０１７（Ｖｉｃｔｏｒｉａ系統）というウイルスに対して検査し、０．５％シチメンチョウ赤血球と混合するであろう。抗体力価を、赤血球凝集の阻止を生じる最低血清希釈によって規定するであろう。４０未満のＨＡＩ力価をもつフェレットのみが、血清学的陰性とみなされ、本試験において使用されるであろう。試験動物をランダム化し、３群（１群あたり１５匹の雄フェレットおよび１５匹の雌フェレット）へと分けるであろう。

ワクチンの有効性および毒性を評価するために、フェレットを、Ｍ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１×１０^８ＴＣＩＤ_５０の３回投与または１×１０^９ＴＣＩＤ_５０の３回投与で試験１日目、１４日目、および２８日目に鼻内免疫化するであろう。対照群を、試験１日目、１４日目、および２８日目にＳＰＧで鼻内モック免役化するであろう。フェレットの体温、体重、および臨床症状を免疫化後７日間毎日監視するであろう。試験５日前、１４日目、１６日目、３０日目、および４９日目に生存しているフェレット全部から血液を回収して、臨床病理学的性質を評価するであろう。血清試料を試験５日目、１４日目、３０日目、および４９日目に回収して、ＥＬＩＳＡ、ウイルス中和アッセイおよびＨＡＩアッセイによる抗体力価の測定までおおよそ－７０℃で凍結保存した。試験動物はすべて、計画された日（３日目、３０日目、または４９日目、１群あたり５匹の雄および５匹の雌）に安楽死させ、剖検するであろう。剖検は、身体の外表面、すべての開口、ならびに頭蓋腔、胸腔および腹膜腔、ならびにそれらの内容物の検査からなる。組織を回収し、固定し、委員会認定の動物病理学者によって組織病理学的に評価するであろう。

瀕死／死亡および臨床所見： フェレットはすべて、計画された屠殺日まで生存すると予期される。フェレットはすべて、１日目～４９日目の間に測定されるすべての時点について「０」（敏捷かつ遊び好き）という活動レベルスコアを有することが予期される。

体重および体重変化： 差異は、観察されるとは予期されない。

体温： 差異は、観察されるとは予期されない。

酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）： 血清試料由来の抗ＨＡ ＩｇＧ抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定するであろう。ＥＬＩＳＡプレートをＡ型／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）またはスパイクＲＢＤに由来の組換えＨＡタンパク質によってコーティングするであろうし、脱脂乳によってブロッキングするであろうし、試料を適用した。フェレットＩｇＧ抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗フェレットＩｇＧヤギ抗体（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）および１－ＳＴＥＰ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）基質によって検出した。

免役化した群の各々におけるフェレットは、血清中の抗Ｈ３ ＨＡ抗体の有意な上昇を示すと予期されるが、ＳＰＧのみを受けた動物における抗体レベルは、ベースラインから変化するとは予期されない。抗Ｈ３ ＨＡ抗体力価は、初回刺激投与の２週間後に、ＳＰＧ対照群よりも免疫化群において高いであろう。免疫化群あたりの平均抗体力価は、ワクチンの第１および第２の投与後にさらに上昇するであろう。

赤血球凝集阻止（ＨＡＩ）アッセイ： ＥＬＩＳＡによって検出される抗体の機能的活性を実証するために、血清試料をＨＡＩアッセイによって分析するであろう。血清試料をＲＤＥで処理して、非特異的赤血球凝集の阻止因子を除去するであろう。ＲＤＥを、製造元の説明書によって再構成するであろう。血清をＲＤＥ中で１：３に希釈し、３７℃±２℃の水浴中で１８～２０時間インキュベートするであろう。等量の２．５％（ｖ／ｖ）クエン酸ナトリウムの添加後、試料を５６±２℃の水浴中で、３０±５分間インキュベートするであろう。０．８５％ＮａＣｌから構成される溶液を各試料へ、ＲＤＥ処理後に１：１０の最終血清希釈となるよう添加するであろう。次いで、試料をＰＢＳ中でさらに２倍希釈し（１；１０～１；１，２８０）、４赤血球凝集単位のインフルエンザＡ型／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）ウイルスとともにインキュベートするであろう。インキュベーション後、０．５％トリ赤血球を各試料へ添加し、３０±５分間インキュベートするであろう。次いで、赤血球凝集の有無を点数化するであろう。

高用量（１×１０^９ＴＣＩＤ_５０）群は、低用量（１×１０^８ＴＣＩＤ_５０）群よりも高いＨＡＩ力価を示すと予期され、ＳＰＧ（対照）群は、いかなるＨＡＩ力価も誘起するとは予期されない。Ｍ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫化フェレットは、検査ウイルスに対して８０ＨＡＩ力価と同等かまたはそれより高いことを実証すると予期される。ＣＤＣは、４０という血清ＨＡＩ抗体力価が、集団におけるインフルエンザ感染またはインフルエンザ疾患についてのリスクの少なくとも５０％低減と関係していたと述べている。それゆえ、これらの結果は、Ｍ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、保護的免疫応答を誘起することができることを示すと予期される。

ウイルス中和アッセイ： 試験前および（試験３日目、１４日目、３０日目、および４９日目の）処理段階の血清試料を、ウイルス中和アッセイにおいてＡ型／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルスに対して検査するであろう。血清試料を５６℃で３０分間不活性化するであろう。次いで、血清を２倍連続希釈し、標準化されたウイルス（８０～１４０ＰＦＵの濃度）とともに３７±２℃、５．０±１％ＣＯ_２において６０分間インキュベートするであろう。次いで、１００マイクロリットル（１００μＬ）の各血清およびウイルス混合物を、単層のＭＤＣＫ細胞を含有する９６ウェルプレートの個々のウェル内へと移すであろう。次いで、プレート（試料含有）を３７±２℃で５．０±１％ＣＯ_２において１８～２２時間インキュベートするであろう。インキュベーション後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、抗インフルエンザＡ型核タンパク質モノクローナル抗体プール（１部分のＭＡＢ８２５７：１部分のＭＡＢ８２５８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））、続いてペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧで染色するであろう。スポットをＴｒｕｅＢｌｕｅペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて顕色させるであろう。プラークを可視化し、酵素結合免役スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ（商標））機器（ＡＩＤ ＧｍｂＨ，Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計数するであろう。５０％プラーク低減中和力価（ＰＲＮＴ_５０）を、プラークを計数し、力価を最終血清希釈の逆数として報告することによって計算して、対照プラークの逆滴定に基づいて入力された対照ウイルスプラーク計数の５０％低減を示すであろう。

ＳＰＧ群内でのフェレットは、本試験の持続期間の間、陰性(力価≦１００）に留まると予期される。１×１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量でＭ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で免疫化されたフェレットは、高い幾何平均力価（ＧＭＴ）を有すると予期される。１×１０^９ＴＣＩＤ_５０の用量でＭ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で免疫化したフェレットは、より高いＧＭＴ ＶＮ力価を有すると予期される。１×１０^９ＴＣＩＤ_５０でＨ３Ｎ２ Ｍ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３回投与で免疫化されたフェレットはすべて、最も高いＰＲＮＴ_５０力価を呈すると予期される。

臨床病理学的検討：生存しているフェレットすべてについて、臨床化学的検討、血液学的検討および凝固パラメータの分析のための血液試料を、頚静脈または大静脈から試験前、ならびに３日目、１４日目、１６日目、３０日目、および４９日目に回収するであろう。動物を血液回収前の４～６時間絶食させるであろう。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を血液学的検討の試料のための抗凝固薬として使用するであろう一方で、クエン酸ナトリウムを凝固試料に対して使用するであろう。臨床化学的検討のための試料を抗凝固薬なしで回収するであろう。尿試料を、剖検で各フェレットの膀胱から直接回収するであろう。

処置関連のまたは毒素学的に有意な所見は、本試験の間に評価される臨床化学的性質または血液学的性質のパラメータのいかなるものに対しても特筆されるとは全く予期されない。

肉眼剖検および組織病理学的性質：肉眼剖検および組織病理学的検討を、１群あたり５匹の雄および５匹の雌について、試験３日目、３０日目、および４９日目に行った。１×１０^８ＴＣＩＤ_５０の用量でのフェレットに対するＭ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の鼻内免疫化は、肉眼での所見がない結果を生じると予期される。１×１０^９ＴＣＩＤ_５０の用量で、肉眼での所見は、肺において特筆されると予期され（色素沈着、濃いまたは斑状）、顕微鏡所見は、肺において３日目および３０日目に特筆されると予期される（混合型細胞浸潤）。３週間の回復後、試験４９日目に検査項目関連の肉眼病変が観察されるとはまったく予期されない。

本実施例は、Ｍ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２のワクチンウイルスの鼻内免疫化が、ワクチン接種した宿主において伝播せず、いかなるワクチン関連有害事象（例えば、体温の上昇、体重の減少、または臨床徴候）とも関係していないことを示すと予期される。これらの結果は、Ｍ２ＳＲ－ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルスが、再投与とともにさらに上昇できる単回投与後の相同検査ウイルスに対する防御免疫応答を誘起し、鼻内コロナウイルスワクチンとして有用であることを示すと予期される。

実施例９
本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に由来する様々な抗原を発現するいくつかのＭ２ＳＲウイルス株の設計および発生の成功を実証する。

２つの非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＥＰ（核外輸送タンパク質）をコードするインフルエンザＡ型ＮＳセグメント８は、抗原を発現するためのワクチンベクターとしてインフルエンザＡ型を使用するよう修飾することができる。ＮＥＰが必要とされるのに対し、ＮＳ１ ＯＲＦは、ウイルス複製のために無くても済む可能性がある。ＮＳ１切断は、Ｖｅｒｏ細胞培養において繰返し継代によって単離することができ、完全なＮＳ１欠失株でさえ、構築することができる。ＮＳ１は、スプライシング及び宿主細胞の生得的応答の遮断に対する変動を含め、インフルエンザ感染を促進する上で非常に重要な役割を担っている。ＮＳ１突然変異は、製造を困難にするウイルス力価を低減させ、より重要なことに、初代細胞においておよびインビボでウイルス複製を損なう。ＮＳセグメントをベクター化することに対する第２の主な障害は、セグメント８ｍＲＮＡのスプライシングした形態から必須ＮＥＰタンパク質が発現することである。スプライシングは、スプライシングを受けていないｍＲＮＡによってコードされるＮＳ１ ＯＲＦと重複する代替的な翻訳リーディングフレームにおいて、短いエキソン１配列をエキソン２へ接合する。

抗原をコードするために、２つの重要な変化をＮＳセグメントに対して行う。第１に、スプライスドナー（配列番号１０９）およびアクセプター位置を消滅させる。次いで、ＮＥＰエキソン１およびエキソン２をコードする配列を結合し、イントロンを持たないＮＥＰ ＯＲＦを構築する。結果として、単一のポリペプチドをコードするＯＲＦとなり、ここで、ＮＳ１のＣ末端は、ブタテッショウウイルス１型２ＡおよびＧＳＧ可撓性リンカーに由来するＮＳ１ Ｐ２Ａペプチドによって分離されるＮＥＰ ＯＲＦへ融合する（配列番号８０、８５、８７～９１、９７～１０４）。翻訳の間、Ｐ２Ａ部位は、別個のポリペプチドとして、リボソームスリッページを包含すると考えられる未知の機序によってＮＥＰタンパク質の発現を可能にする。所望のワクチン抗原をコードする遺伝情報は、ＮＳ１への融合によって、または第２のＰ２ＡもしくはＴ２Ａというペプチドの付加によってのいずれかで発現するインフルエンザＯＲＦ間に挿入されて、抗原の両側を開裂させる（配列番号８６、９９）。この配置は結果として、ＮＳ１ ＯＲＦ内からのヌクレオチド配列の長い反復を担持する拡大されたセグメント８を生じる。

不運なことに、かかる複製は遺伝子が不安定である。ゲノム複製中のセグメントの２つの部分の間の非定型ハイブリッド形成は、欠失および挿入に典型的につながるインフルエンザＲＮＡポリメラーゼエラー、ならびに欠陥のあるゲノムＲＮＡ合成を誘導し得る。この不安定性は、この場合、悪化し得、その理由は、遺伝子重複が、セグメント８末端から２６ｂｐだけＮＥＰエキソン１配列を含んでおり、このＮＥＰエキソン１配列が、ゲノムパッケージングに重要である可能性が高いからである。ビリオンへのインフルエンザゲノムセグメントの集合は、５’および３’ＵＴＲにおける逆反復配列のハイブリッド形成によって形成される二本鎖の「全ハンドル」ＲＮＡ構造を介して介在する。セグメント末端近くのコード配列はまた、パッケージングにも関与し、セグメント末端近くにあるサイレント突然変異は、ウイルス複製を遮断することが示された。このセグメントに対して内部の二重になった領域は、ウイルス集合を損なう末端のＵＴＲパッケージング配列との必須のハイブリッド形成と競合し得る。結果として、ウイルスの成長は乏しく、ウイルス力価は低く、導入遺伝子の発現は喪失する。

操作されたセグメントにおける縦列重複間にある相同性を低減させることによって遺伝子の安定性を改善するために、重要な突然変異を、ＮＳ１およびＮＥＰの両ＯＲＦをコードする配列へ導入した（配列番号１１０、１１１）。サイレント突然変異を、ＮＳ１をコードするコドンの第３の位置に対して行って、開始コドンを除去し、いずれかの有力な代替的な翻訳リーディングフレームへ終止コドンを付加することによって、意図せぬ発現についての能力をカットした。このことは、ベクターおよびインサート配列の両方または両方からの意図せぬネオ抗原の産生についての機会を低減させる。

ＮＥＰの１０個のＮ末端アミノ酸についてコードするエキソン１配列の重複を、２つの方法で有意に変化させて、コピー間の配列同一性を低減させた（図２１、配列番号８０、９７、１１０）。ＮＥＰをこのコンストラクトによって、Ｐ２Ａ開裂部位を介して発現させる。機序はわかってはいないが、開裂はいつでも、開裂した下流ペプチドのＮ末端へ付いたタンパク質痕として単一のプロリル残基を残す。ＮＥＰの第３のアミノ酸はすでにプロリンであり、これら第１の２つの残基が構造上関連性のないことを示唆している。したがって、構築されたＮＳセグメントを、痕のない、プロリンで始まるＮＥＰの６ｂｐ欠失Ｎ末端突然変異体を発現するよう設計した（配列番号１１７）。有害な相同性をさらに、高％Ａ－Ｔを依然として維持するコドンの第３の位置を変化させることによって改善した。加えて、ＧＳＧおよびＰ２Ａの両部位配列をコドン最適化して、インフルエンザのＡ－Ｔリッチコドンバイアスを反映させた。

重複を含有するスプライス陰性ＮＳセグメント（配列番号８５、９８）を、ＲＮＡ ＰｏｌＩプラスミドベクターへと、陰性センスｖＲＮＡとしての発現のために挿入した。標準的なプラスミド系インフルエンザウイルスの逆方向遺伝学手順を使用して、操作されたおよび対照のＡ型ＰＲ／８／１９３４セグメント８を含有するＭ２欠失単一複製（Ｍ２ＳＲ）ウイルスを救出した。回収したウイルス株をＭ２ＶｅｒｏＡ細胞において増幅させ、ウイルス力価を決定した。この株を使用して、成長動態の比較のために、ＭＯＩ＝０．００１で三つ組の培養物を接種した。接種の４日後、ウイルス培養物をサンプリングし、一定分量をその後の力価分析のために凍結保存した。ＴＣＩＤ_５０によるウイルス力価の決定の後、毎日の平均力価を計算した。２つの株についての曲線のプロット（図１２）は、ウイルスの成長が、ＮＳ１およびＮＥＰを単一の自己開裂ペプチドとして発現する合成セグメントによって損なわれないことを示す。

表５に付与するようなＭ２ＶｅｒｏＡ細胞において生育したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に由来する様々な抗原を発現するよう設計される、いくつかのＭ２ＳＲウイルス株を発生させた。

実施例１０
本実施例は、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１タンパク質のスパイクらせんである抗原を発現するためのＮＳベクターセグメントの機能性を実証する。

ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓ１タンパク質のスパイクらせんは、ウイルス膜と細胞膜との間に融合を駆動する大きな立体配座変化を受けることが公知である。ＲＳＶおよびＰＩＶのものを含む他のウイルススパイクタンパク質らせんの研究は、スパイクタンパク質を組換え抗原として安定させることによって性能を改善する１セットの２タンデムプロリン突然変異を同定した。これら２つのプロリン残基（２Ｐ）は順に、２つのより短いらせんの間にあり、これらのらせんは、スパイクタンパク質の融合前立体配座において存在する。この変化は、融合前立体配座におけるタンパク質をロックし、その結果、はるかにより良好な組換えタンパク質発現の二重の利点が生じ、ワクチン接種に対する免疫学的応答が中和される。図１３における成長曲線は、非修飾のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２らせん抗原へのＮＳ１融合を有するセグメント８が、野生型と比較してウイルス成長（配列番号８８、１０１）を損なうことを示す。融合前形態へとスパイクらせんをロックするための、ターン残基の２Ｐへの置き換えは、おそらくＮＳ１の機能性を改善することによって、成長を改善する（配列番号８８、１０２）。

実施例１１
本実施例は、インフルエンザＡ型Ｍ２ＳＲセグメントからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の発現の成功を実証する。

さまざまなＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ＲＢＤ抗原を、合成で構築した操作されたインフルエンザＡ型Ｍ２ＳＲインフルエンザＡ型Ｍ２欠乏ベクターセグメント７（配列番号１２２～１２４）から発現させた（図１４）。次いで、設計した遺伝子セグメントを陰性センスｖＲＮＡとしての発現のためにＲＮＡ Ｐｏｌ Ｉベクターへと挿入した。セグメント７は、スプライシングを受けたウイルスｍＲＮＡから２つのポリペプチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、すなわち、第１に完全なインフルエンザＡ型／ＰＲ／８／３４ Ｍ１タンパク質、および第２に、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１スパイクＳ１タンパク質の抗原とのＭ２の融合タンパク質を発現するよう設計されている。インフルエンザＡ型セグメント７の第２のリーディングフレームにおけるＭ２のウイルス発現は、スプライシングによって生じる。インフルエンザＡ型セグメント７を含有する合成ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの必須Ｍ１タンパク質機能を維持すために、Ｍ２ ＯＲＦの一部をＳ１ ＲＢＤと融合させる（配列番号６、８、１０、７９）。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｍ２ＳＲセグメントをコードするベクターを標準的なプラスミド系インフルエンザウイルス逆方向遺伝学手順において使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ Ｍ２ＳＲセグメント７を含有するＭ２欠乏性単一複製（Ｍ２ＳＲ）ウイルスを救助した。両ウイルスは、Ａ型／シンガポール／２０１６（Ｈ３Ｎ２）のＷＨＯ推奨ワクチン株由来のＨＡおよびＮＡというセグメントを用いて得ることに成功した。ＡＯＦ培地中で生育させたＭ２ＳＲウイルスから失っているＭ２タンパク質を構成的に発現するよう操作されたＭ２Ｖｅｒｏ細胞を用いて、ウイルスを回収した。このウイルス救助および培養系は、ヒト臨床治験における検査のために企図されたＭ２ＳＲワクチン候補のｃＧＭＰ産生のためのウイルス種子の調製に適している。

実施例１２
本実施例は、Ｍ２ＳＲインフルエンザウイルスが、感染した細胞の細胞外膜へ固着した抗原の発現を駆動することができることを実証する(図１５～図２０および図２４～図２７を参照されたい）。

支持的なＭ２発現基質細胞において産生されるパッケージングされたウイルスを、抗原が、赤血球凝集素ＨＡなど、組み合わされるインフルエンザサブユニットと直接融合しない限り、目的の遺伝子、多量体化ドメイン、または膜貫通ドメインによってコードされるタンパク質を実質的に欠くよう、予期された。目的の遺伝子（ＧＯＩ）は、ウイルス（インフルエンザを含む）起源、細菌起源、真菌起源、または原生動物起源の抗原として関連のある要素であり得る。

細胞表面上での抗原の適切な発現は、ウイルスによってコードされる意図したワクチン抗原に特異的なモノクローナル抗体を感染させた細胞のフローサイトメトリーによって解析される免疫蛍光染色によって確認することができる。異なるセグメントを使用して、同じ抗原を発現することができる。例となる抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質ヒトＡＣＥ２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）である。ＲＢＤ抗原は、別の膜タンパク質のＴＭドメインを用いて細胞表面で発現することができる。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質のＴＭとのＲＢＤの融合を、３つのペプチド、すなわち、ＮＳ１、ＮＥＰおよびＴ４三量体ドメインとのＲＢＤ－ＲＳＶ ＴＭ融合を生じるＰ２ＡおよびＴ２Ａという翻訳スリッページ部位を含有する単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮＳ１セグメントによってコードした。代替的なアプローチは、ＨＡタンパク質自体への直接的な融合である。ＨＡは、そのように融合した抗原が、感染した細胞の表面上の三量体として表示され、ビリオンへと組み込まれるであろう膜タンパク質である。

Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞に１～１０の間の感染多重度（ＭＯＩ）で、ＮＳ１セグメントまたはＨＡセグメントのいずれかから膜でＲＢＤを発現するＭ２ＳＲウイルスを接種した。感染した細胞を、４℃のＦＡＣＳ緩衝液（１×ＤＰＢＳ、１％ＦＢＳ）において接種後１８時間でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１ ＲＢＤの表面発現について免疫染色した。未処置生細胞を、回復期ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１患者から単離した中和モノクローナル抗体ＣＲ３０２２を一次として使用して染色し（ｔｅｒ Ｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｍｅｄ． ３（７）： ｅ２３７ （２００６））、続いて、図２４～図２５でみられるように、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体によって検出した。バックグラウンドを上回る表面発現は、ＮＳセグメントまたはＨＡセグメントのいずれかからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ抗原を発現するウイルスを感染させた細胞から検出された。

標的とすることができる別の呼吸器ウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である。ＲＳＶの２つの主な表面タンパク質である融合（Ｆ）および表面糖タンパク質（Ｇ）はいずれも、ＲＳＶを中和することができるモノクローナル抗体にとって重要な結合部位である。ヒト２９３Ｔ細胞を４つのＤＮＡプラスミドのインフルエンザＡ型レプリコンによって化学的に移入して、インフルエンザＲＮＡセグメントによって、およびＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターからインフルエンザＨＡゲノムセグメントを発現する単一のプラスミドによってコードされるタンパク質を発現するのに必要とされるＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰというウイルスサブユニットを構成的に過剰発現させた。ＲＳＶ Ｇタンパク質抗原を、細胞膜上のＲＳＶ Ｇ抗原の発現につながるＨＡ糖タンパク質と直接融合させた。未処置生細胞を移入４８時間後にＲＳＶ Ｇ表面糖タンパク質抗原の表面発現について移入４８時間後に免疫染色した。染色は、一次マウスモノクローナル抗体１３１－２Ｇ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を用いるＦＡＣＳ緩衝液中であり、続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出した。バックグラウンドを上回る表面発現は、ＲＳＶ Ｇタンパク質抗原を発現するウイルスを感染させた細胞から検出した。

単一の病原体からの複数の抗原を膜上に表示し得る。ＭＯＩ＝１でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２抗原をコードするＭ２ＳＲウイルスを接種した細胞は、図２７に示すように、表面上にＲＢＤ以外の第２の代替的なＣＯＶＩＤワクチン標的を発現する。ＭＯＩ＝１でウイルスに感染した未処置生Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞を、接種１８時間後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ２サブユニット抗原の表面発現について免疫染色した。染色は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２免疫原に対して生じた一次ウサギモノクローナル抗体３Ｃ４（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いるＦＡＣＳ緩衝液中であり、続いて、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識抗ウサギＩｇＧ二次抗体により検出した。バックグラウンドを上回る表面発現を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２接続因子およびＴＭ抗原を発現するウイルスを感染させた細胞から検出した。

パッケージングシグナルを、ＨＡおよびＮＳという両セグメントについてのコンストラクトのためのＧＯＩの上流で維持し、ＨＡの場合、パッケージングシグナルを複製して、適切なＨＡプロセシングを維持することができる。重複したパッケージングシグナルは、５’パッケージングシグナルとの二次的な相互作用を除去し、望ましくない組換え事象を防止するのを助けるためのサイレント突然変異を有するものとする。他の実施形態は、ＨＡ自体との抗原の直接的な融合を採用し得（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）もしくは糖タンパク質（Ｇ）の配列またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク配列）、この場合、パッケージング配列は重複していない（図２４～図２７、配列番号１１６～１１８）。多くの場合、多量体化ドメイン（ＭＤ）の使用は、免疫原性を亢進するのに好ましいであろう。かかるＭＤは、Ｔ４フィブリチン（配列番号１１５、Ｆｏｌｄｏｎ）のＣ末端ドメインまたはＧＣＮ４－ｐｌロイシンジッパードメインのようなさまざまなモチーフから選択することができる。膜貫通ドメイン（ＴＭ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクと推定される膜貫通ヘリックスアミノ酸１２１４～１２４６（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号：ＹＰ＿００９７２４３９０．１、配列番号３６～４１、７７、１１９）のものであり得、少なくともアミノ酸１２０１～１２４６の使用は、表１における上位に順位づけされるＭＨＣ Ｉ適合性エピトープ（配列番号２１）を演繹的に含むであろう。他のＴＭは、ＲＳＶ融合タンパク質のものを含み得る（配列番号１１５）

表６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１タンパク質の部分であるミニスパイクタンパク質、またはＳｐｉｋｅ ＴＭを用いて膜固着するよう設計されたＳ１の部分の融合を示す。Ｓ１シグナル配列（配列番号３９～４１、４２、１１５、１１９）の使用は、細胞表面膜上での表示のために、およびＮ連結型グリコシル化などの翻訳後修飾のために、細胞分泌装置へペプチドを指向させるであろう。

実施例１３
本実施例は、マーカー遺伝子（配列番号１１４）であるＥＧＦＰ蛍光タンパク質でもある抗原（配列番号１１３）を発現するサイレント突然変異（図２１～図２２）を含有するＭ２ＳＲのＮＳベクターセグメントの機能性を実証する。ＥＧＦＰを発現するよう設計されたＮＳセグメントを含有するＭ２ＳＲウイルスを使用して、Ｍ２ＶｅｒｏＡ細胞をＭＯＩ＝１０で感染させた。接種後３日間の期間にわたる蛍光顕微鏡検査は、強いＥＧＦＰ発現が、２４時間以内に検出することができ、細胞のほぼ１００％が４８時間で抗原を発現することがみられるまで広がることを示した。７２時間までに、細胞を基材から脱離させ、インフルエンザ感染により予期された通り、強い細胞変性効果（ＣＰＥ）を呈した（図２３）。３日目に観察された強いＣＰＥは、ウイルス複製が、挿入されたＥＧＦＰ遺伝子によって実質的に阻止されなかったことを示す。

実施例１４
本実施例は、実施例４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列をコードするＭ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲというウイルスが、インフルエンザＨＡ（赤血球凝集素）表面タンパク質に対する抗体応答を誘起する能力を保有することを実証する。

血清を初回刺激免役化の前および初回投与の約３週間後にマウスから回収した。血清試料を各群についてプールし、抗ＨＡ ＩｇＧ抗体力価を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。

ＥＬＩＳＡを、捕捉抗原として組換えＨＡタンパク質を使用して行った。組換えＨ３ ＨＡ（ΔＴＭ）（Ａ型／シンガポール／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２００６）（Ｈ３Ｎ２）［Ｉｍｍｕｎｅ－Ｔｅｃｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ］を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列をコードする、マウスに投与したＭ２ＳＲベクターウイルスまたはＭ２ＳＲウイルスの血清ＥＬＩＳＡ分析に使用した。組換えＩｎｆ Ｂ型ＨＡ１（Ｂ型／プーケット／３０７３／２０１３）［Ｉｍｍｕｎｅ－Ｔｅｃｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ］）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２配列をコードする、マウスに投与したＢＭ２ＳＲベクターウイルスまたはＢＭ２ＳＲウイルスの血清ＥＬＩＳＡ分析に使用した。

ＥＬＩＳＡプレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の２μｇ／ｍＬの濃度の１００μＬの捕捉抗原で、４℃で一晩コーティングした。プレートを０．１％ポリソルベート２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）および冷水魚類皮膚由来の１％ゼラチンでブロッキングした後、プレートを、冷水魚類皮膚由来の１％ゼラチン含有ＰＢＳ－Ｔ中で希釈したマウス血清とともに二つ組でインキュベートした。室温で２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ－Ｔで６回洗浄し、次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼと結合した抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＫＰＬ；冷水魚類皮膚由来１％ゼラチン含有ＰＢＳ－Ｔ中で１：２，０００希釈）とともにインキュベートした。二次抗体を用いた１時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ－Ｔで６回洗浄し、次いで、１－ＳＴＥＰ（商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で顕色させた。１０分間のインキュベーションの後、この反応を４Ｎの硫酸の添加により停止させた。吸光度を４５０ｎｍの波長（ＯＤ_４５０）で測定した。終点力価は、ブランクプラス０．３ＯＤ_４５０の平均値を減算することによって決定されたカットオフ値を上回った希釈の逆数とした。

血清抗ＨＡ ＩｇＧレベルの差異は、表７に示すように、ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２配列をコードするＭ２ＳＲおよびＢＭ２ＳＲならびにそれらの対応するベクターウイルスの間で観察されなかった。

本明細書で引用されている参考文献は、公表物、特許出願、及び特許を含め、すべて、各参考文献が個々にかつ具体的に参照により組み込まることが示され、およびその全体が本明細書で説明されていた場合と同程度まで、参照により本明細書により組み込まれる。

「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および「少なくとも１つの」という用語ならびに本発明を説明する文脈における（特に、後述の特許請求の範囲の文脈における）同様の指示対象の使用は、本明細書で別段に示されない限りまたは文脈によって明確に矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅するよう解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストが後続する「少なくとも１つの」という用語（例えば、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」）の使用は、本明細書で別段に示されない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、列挙された項目から選択される１つの項目（ＡまたはＢ）、または列挙された項目のうちの２つ以上の任意の組み合わせ（ＡおよびＢ）を意味すると解釈されるべきである。「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を有する」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「を含有する」という用語は、別段の記載がない限り、オープンエンドの用語として解釈されるべきである（すなわち、「を含むが、それらに限定されない」を意味する）。本明細書での値の範囲の列挙は単に、本明細書で別段に示されない限り、当該範囲内に収まる各個別の値に対して個々に指す簡便な方法として機能するよう意図するものであり、各個別の値は、本明細書で個々に列挙されているかのように、本明細書内へと組み込まれる。本明細書で説明される方法はすべて、本明細書で別段に示されない限り、または文脈によって別段に明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供されるいかなるおよびすべての例の使用、または例示的な言語（例えば、「のような」）は単に、本発明をより良好に説明するよう意図しており、別段に主張されない限り、本発明の範囲に制限を付与するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、本発明の実施に対して必須であるようないずれの特許請求の範囲に記載されていない要素をも示すものとして解釈されないものとする。

本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するための本発明者が知る最良の様式を含め、本明細書で説明される。当該好ましい実施形態の変形は、上述の説明を読み取る際に当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が、かかる変形を適切なものとして使用することを期しており、本発明者らは、本明細書で具体的に説明される以外に、本発明が実施されるよう意図している。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許可されるような、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される対象の変更物および等価物をすべて含む。その上、その起こり得る変化物すべてにおける上述で説明した要素のいかなる組み合わせも、本明細書で別段に示されない限り、または文脈によって別段に明確に矛盾しない限り、本発明によって包含される。

配列決定の決まりは、４つのヌクレオチド、すなわち、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）を指すＤＮＡに基づいている。ＲＮＡまたはインフルエンザウイルスを指すとき、Ｔはウラシル（Ｕ）を意味する。

Claims (30)

1. インフルエンザウイルスバックボーンを含む、組換えウイルスであって、前記インフルエンザウイルスバックボーンが、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントを含む、組換えウイルスであって、前記ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントの少なくとも１つが、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、組換えウイルスであって、
   （ａ）前記ＰＢ１遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ１タンパク質をコードし、ここで、前記選択されたアミノ酸が、位置４０のロイシンと、位置１８０のトリプトファンと、位置４６４のアスパラギン、位置５６３のイソロイシン、または位置６０７のセリンのうちの少なくとも１つとを含み、かつ、前記ＰＢ１遺伝子セグメントが場合により、ヌクレオチド位置４でのシトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み、
   （ｂ）前記ＰＢ２遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＢ２タンパク質をコードし、ここで、前記選択されたアミノ酸が、位置５０４のバリンと、場合により、位置４６７のイソロイシンおよび位置５２９のバリンとを含み、かつ、前記ＰＢ２遺伝子セグメントが場合により、ヌクレオチド位置４でのシトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み、
   （ｃ）前記ＰＡ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＰＡタンパク質をコードし、ここで、前記選択されたアミノ酸が、位置４０１のリジンを含み、かつ、前記ＰＡ遺伝子セグメントが場合により、ヌクレオチド位置４でのシトシンからウラシルへのプロモーター突然変異を含み、
   （ｄ）前記ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードし、ここで、前記選択されたアミノ酸が、位置１１６のロイシンと、位置２９４のリジンまたは位置３１１のアルギニンのうちの少なくとも１つとを含み、かつ
   （ｅ）前記ＮＳ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＳ１タンパク質をコードし、ここで、前記選択されたアミノ酸が、位置３０のプロリンと、位置５５のリジンと、位置１１８のリジンとを含む、組換えウイルス。
2. 前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、請求項１に記載の組換えウイルス。
3. 前記Ｍ遺伝子セグメントが、抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、請求項１または２に記載の組換えウイルス。
4. 前記Ｍ遺伝子セグメントが、突然変異したＭ２タンパク質をコードする、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
5. 前記Ｍ遺伝子セグメントが、少なくとも１つのリンカータンパク質と、ＦＬＡＧエピトープタグとを含むタンパク質をコードする、請求項４のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
6. 前記Ｍセグメントが、配列番号１～１４および９２～９６のいずれか１つを含むタンパク質をコードする、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
7. インフルエンザウイルスバックボーンを含む、組換えウイルスであって、前記インフルエンザウイルスバックボーンが、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＨＡ、およびＮＡという遺伝子セグメントを含む、組換えウイルスであって、
   （ａ）前記ＰＡ遺伝子セグメントが、ヌクレオチド位置２２７２のチミンを含み、
   （ｂ）前記ＮＰ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＰタンパク質をコードし、ここで、前記選択されたアミノ酸が、位置４０のセリンと、位置１６１のアスパラギンまたはグリシンと、位置２０４のトレオニンと、場合により位置９３のバリンとを含み、かつ、
   （ｃ）前記ＮＳ遺伝子セグメントが、ヌクレオチド位置３９のグアニンを含み、ここで、前記ＮＳ遺伝子セグメントが、選択されたアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するＮＳタンパク質をコードし、前記選択されたアミノ酸が、位置１７６のグルタミンを含む、組換えウイルス。
8. 前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、請求項7に記載の組換えウイルス。
9. 前記Ｍ遺伝子セグメントが、抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、ここで、前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片であり、さらに、突然変異したＢＭ２タンパク質をコードする、請求項７または８に記載の組換えウイルス。
10. 前記ＮＳ遺伝子セグメントが、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
11. 前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
12. 前記ＮＳ遺伝子セグメントが、（１）ＮＳ１タンパク質、（２）少なくとも１つの可撓性のあるリンカータンパク質、（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片、（４）少なくとも１つの開裂可能な開裂性配列、および（５）ＮＥＰタンパク質をコードする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
13. 前記少なくとも１つの開裂可能な開裂性配列が、Ｔ２Ａペプチド配列またはＰ２Ａペプチド配列である、請求項１２に記載の組換えウイルス。
14. 前記ＮＳ遺伝子セグメントが、配列番号９７～１０４のいずれか１つを含むタンパク質をコードする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
15. 前記ＭおよびＮＳという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、請求項１または７に記載の組換えウイルス。
16. 前記ＮＡおよびＮＳという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質の免疫原性断片である、請求項１または７に記載の組換えウイルス。
17. 前記ＭおよびＮＡという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質の免疫原性断片である、請求項１または７に記載の組換えウイルス。
18. 前記ＭおよびＨＡという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質の免疫原性断片である、請求項１または７に記載の組換えウイルス。
19. 前記ＮＳおよびＮＡという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質の免疫原性断片である、請求項１または７に記載の組換えウイルス。
20. 前記ＮＳおよびＨＡという遺伝子セグメントの各々が、１つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、かつ、前記抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質の免疫原性断片である、請求項１または７に記載の組換えウイルス。
21. 前記ウイルスが、ヒト細胞において複製することができる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
22. 前記ウイルスが、同じ条件下で、選択されたアミノ酸をＶｅｒｏ細胞において有さないことを除いて同じである組換えウイルスと比較して、増強した成長を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
23. １つ以上の抗原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む前記遺伝子セグメントがさらに、下流の重複を含み、かつ、前記下流の重複が、少なくとも１つのサイレントヌクレオチド突然変異を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
24. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む、医薬製剤。
25. 前記ワクチンが、一価のワクチンとして製剤化される、請求項２４に記載の医薬製剤。
26. 前記ワクチンが、二価のワクチンとして製剤化される、請求項２４に記載の医薬製剤。
27. 前記ワクチンが、三価のワクチンとして製剤化される、請求項２４に記載の医薬製剤。
28. 前記ワクチンが、四価のワクチンとして製剤化される、請求項２４に記載の医薬製剤。
29. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の組換えウイルスまたは請求項２４～２８のいずれか一項に記載の医薬製剤を哺乳動物へ投与し、それにより、前記哺乳動物において前記抗原に対する免疫応答を誘起することを含む、前記哺乳動物において免疫応答を誘起する方法。
30. 前記哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載の方法。