RU2813150C2

RU2813150C2 - Выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа

Info

Publication number: RU2813150C2
Application number: RU2021121139A
Authority: RU
Inventors: Лариса Георгиевна Руденко; Ирина Николаевна Исакова-Сивак; Екатерина Алексеевна Степанова; Виктория Аркадьевна Матюшенко; Сергей Андреевич Нисканен; Богдан Олегович Нетеребский; Анна Константиновна Владимирова; Павел Андреевич Яковлев; Яков Юрьевич Устюгов; Тимур Мугдинович Шеуджен; Александр Николаевич Доронин; Татьяна Юрьевна Остроухова; Алексей Александрович Александров; Дмитрий Валентинович Морозов
Original assignee: Акционерное общество "БИОКАД"; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Институт экспериментальной медицины"
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2024-02-06

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный полипептид для увеличения титра антител к вирусу гриппа, включающий фрагменты из белков коронавируса (варианты), выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и коронавирусом, фармацевтическую композицию, вакцину, применение рекомбинантного вируса на основе вируса гриппа, фармацевтической композиции или вакцины для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и коронавирусом, и способ индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и коронавирусом. Изобретение расширяет арсенал средств для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и коронавирусом. 7 н. и 31 з.п. ф-лы, 19 ил., 9 табл., 5 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии, вирусологии, генетики и молекулярной биологии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантный полипептид для увеличения титра антител к вирусу гриппа (варианты), рекомбинантному вирусу на основе вируса гриппа для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа, фармацевтической композиции и вакцине, которые включают вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа, а также их применению для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Грипп - это острая вирусная инфекция, которая встречается во всем мире. Ежегодные эпидемии гриппа, которые могут поразить до 20% населения, обычно происходят осенью и зимой.

Смертность от респираторных заболеваний, связанных с сезонным гриппом, может быть весьма высокой. В частности, исследование 2017 года показало, что на глобальном уровне ежегодное число таких смертей может доходить до 650000.

В группы повышенного риска развития тяжелой болезни после заражения гриппом входят люди в возрасте 65 лет и старше, беременные женщины, дети младшего возраста, лица с ослабленным иммунитетом и лица с хроническими патологиями.

Существует 2 основных типа вирусов сезонного гриппа, которые вызывают заболевание у людей: тип А и тип В. Вирусы гриппа А далее подразделяются на подтипы, а вирусы гриппа В подразделяются на линии. Наиболее часто циркулирующие вирусы гриппа А принадлежат к подтипам A(H1N1) и A(H3N2), а наиболее часто циркулирующие вирусы гриппа В принадлежат к линиям Ямагата и Виктория.

Ежегодная вакцинация является наиболее эффективным методом предупреждения гриппа и его тяжелых осложнений. В связи с высокой изменчивостью вирусов гриппа ВОЗ обновляет рекомендации по составу вакцины против гриппа два раза в год: в феврале для северного полушария и в сентябре для южного полушария. Рекомендации относительно состава вакцины основаны на данных о вирусах, обнаруженных и охарактеризованных государствами-членами в ходе эпиднадзора.

В патентном документе RU92006182 описывается аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) для получения штаммов живой интраназальной гриппозной вакцины.

В патентном документе RU2556833C2 описывается аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа a/pr/8/59/m2 (hlnl), предназначенный для получения вакцинных штаммов вируса гриппа в качестве донора аттенуации, а также вакцинные штаммы вируса гриппа а/59/м2/калифорния/66/2211 (h2n2) и а/59/м2/токио/67/22111 (h2n2).

В патентном документе RU2563352C2 описывается штамм вируса гриппа А/17/Техас/2012/30 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.

Несмотря на множество известных вакцинных штаммов вируса гриппа, существует потребность в получение рекомбинантного вируса на основе вируса гриппа, который обладает улучшенными характеристиками, например, позволяет получать более высокий уровень антител к вирусу гриппа при введении млекопитающему, то есть быть более эффективными при использовании.

Кроме того, на дату подачи данной заявки, заболеваниями, вызванными коронавирусом SARS-CoV-2, заболело более 186 миллионов человек, более 4 миллионов человек умерли от заболеваний, вызванных коронавирусом SARS-CoV-2. Более того, пандемия COVID-19 продолжается и на дату подачи заявки. Существует острая общемировая потребность в эффективных средствах профилактики и лечения заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.

Таким образом, существует потребность в получение рекомбинантного вируса, который позволит сформировать специфический Т-клеточный иммунитет к коронавирусу и специфический иммунитет к вирусу гриппа, что позволит получить вакцинный штамм, который может быть использован для профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и заболеваний, вызванных коронавирусом.

Описание изобретения

Авторами изобретения была разработана нуклеиновая кислота, которая кодирует рекомбинантный полипептид на основе фрагментов белков коронавируса. Авторами изобретения был разработан рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа, который включает вышеуказанную нуклеиновую кислоту. Авторами изобретения были разработаны фармацевтическая композиция и вакцина, которые включают вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа, а также различные варианты их применения для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа. Авторы изобретения неожиданно установили, что разработанная нуклеиновая кислота, которая кодирует рекомбинантный полипептид на основе фрагментов белков коронавируса, при встраивании в ген нейраминидазы (NA) или ген NS вируса гриппа позволяет получить рекомбинантный вирус гриппа, который продуцирует более высокий уровень антител к вирусу гриппа при введении млекопитающему, чем вирус гриппа без вышеуказанной вставки. Более того, рекомбинантный вирус гриппа, включающий вышеуказанную нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбинантный полипептид на основе фрагментов белков коронавируса, позволяет формировать специфический Т-клеточный иммунитет к коронавирусу при введении млекопитающему.

Краткое описание изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантный полипептид для увеличения титра антител к вирусу гриппа, который включает:

по меньшей мере 1 фрагмент из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1;

по меньшей мере 1 фрагмент из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3;

и, при необходимости, 1 фрагмент из мембранного белка коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5,

где

по меньшей мере 1 фрагмент из гликопротеина S коронавируса выбирают из группы: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13;

по меньшей мере 1 фрагмент из нуклеопротеина коронавируса выбирают из группы: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 21;

фрагмент из мембранного белка коронавируса представляет собой SEQ ID NO: 22.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает от 1 до 4 фрагментов из гликопротеина S коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 1 фрагмент из гликопротеина S коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 2 фрагмента из гликопротеина S коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 3 фрагмента из гликопротеина S коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 4 фрагмента из гликопротеина S коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает от 1 до 4 фрагментов из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 1 фрагмент из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 2 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 3 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 4 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает фрагмент мембранного белка коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 36.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы, включающей нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 59-76.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантный полипептид для увеличения титра антител к вирусу гриппа, включающий фрагменты из белков коронавируса и содержащий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 23-40.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы, включающей нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 59-76, которые, соответственно, кодируют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 23-40.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид из коронавируса, где коронавирус представляет собой бета-коронавирус.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид из бета-коронавируса, где бета-коронавирус представляет собой вирус SARS-CoV-2.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенному рекомбинантному вирусу на основе вируса гриппа для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа, который включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа получают из аттенуированного вируса гриппа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа получают из холодоадаптивного вируса гриппа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа получают из вируса гриппа типа H2N2.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа получают из вируса А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) или его производных.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот по изобретению, которая находится в гене нейраминидазы (NA) или гене NS вируса гриппа.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа, включающая любой из вышеуказанных рекомбинантных вирусов в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе вируса гриппа или вышеуказанной композиции для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа.

В некоторых вариантах осуществления применения любой из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе вируса гриппа или вышеуказанная композиция используются для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и заболеваний, вызванных коронавирусом.

В некоторых вариантах осуществления применения специфический иммунитет к коронавирусу представляет собой специфический Т-клеточный иммунитет.

В некоторых вариантах осуществления применения коронавирус представляет собой бета-коронавирус.

В некоторых вариантах осуществления применения коронавирус выбирают из группы, которая включает коронавирус человека ОС43, коронавирус человека HKU1, MERS-CoV, SARS-CoV или SARS-CoV-2.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к вакцине для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа, которая включает любой из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе вируса гриппа в эффективном количестве.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцина используется для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и заболеваний, вызванных коронавирусом.

В некоторых вариантах осуществления вакцины коронавирус представляет собой бета-коронавирус.

В некоторых вариантах осуществления вакцины коронавирус выбирают из группы, которая включает коронавирус человека ОС43, коронавирус человека HKU1, MERS-CoV, SARS-CoV или SARS-CoV-2.

В некоторых вариантах осуществления вакцины специфический иммунитет к коронавирусу представляет собой специфический Т-клеточный иммунитет.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа, или индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу или комбинированной профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа, и заболеваний, вызванных коронавирусом, включающий введение в организм млекопитающих любого из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе вируса гриппа или вышеуказанной композиции или вышеуказанной вакцины, в эффективном количестве.

В некоторых вариантах осуществления способа коронавирус представляет собой бета-коронавирус.

В некоторых вариантах осуществления способа коронавирус выбирают из группы, которая включает коронавирус человека ОС43, коронавирус человека HKU1, MERS-CoV, SARS-CoV или SARS-CoV-2.

В некоторых вариантах осуществления способа специфический иммунитет к коронавирусу представляет собой специфический Т-клеточный иммунитет.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 представляет собой схему клонирования антигенных кассет данного изобретения, кодирующих трансген (полиэпитопные кассеты, состоящие из комбинаций фрагментов белков гликопротеина S (или Spike) (SEQ ID NO: 1), нуклеопротеина (или Nucleoprotein) (SEQ ID NO: 3), и, при необходимости, мембранного белка (или Membrane) (SEQ ID NO: 5) бета-коронавируса SARS-CoV-2) в гене NA вируса гриппа.

Фигура 2 представляет собой схему генетической конструкции на основе вектора для обратной генетики вируса гриппа pCIPoIISapIT, которая содержит последовательности шестого сегмента генома вируса гриппа, в том числе гена NA, а также трансген (полиэпитопную кассету, состоящую из комбинаций фрагментов белков гликопротеина S (или Spike) (SEQ ID NO: 1), нуклеопротеина (или Nucleoprotein) (SEQ ID NO: 3), и, при необходимости, мембранного белка (или Membrane) (SEQ ID NO: 5) бета-коронавируса SARS-CoV-2), для получения модифицированных частиц вируса гриппа вакцинного штамма.

Фигура 3 представляет собой схему клонирования антигенных кассет данного изобретения, кодирующих полиэпитопные кассеты, состоящие из комбинаций фрагментов белков гликопротеина S (или Spike) (SEQ ID NO: 1), нуклеопротеина (или Nucleoprotein) (SEQ ID NO: 3), и, при необходимости, мембранного белка (или Membrane) (SEQ ID NO: 5) бета-коронавируса SARS-CoV-2, в ген NS вируса гриппа.

Фигура 4 представляет собой схему генетической конструкции на основе вектора для обратной генетики вируса гриппа pCIPolISapIT, которая содержит последовательности восьмого сегмента генома вируса гриппа, в том числе модифицированного гена NS от донора аттенуации A/Leningrad/134/17/57 или его производных, а также трансгена (полиэпитопной кассеты, состоящей из комбинаций фрагментов белков гликопротеина S (или Spike) (SEQ ID NO: 1), нуклеопротеина (или Nucleoprotein) (SEQ ID NO: 3), и, при необходимости, мембранного белка (или Membrane) (SEQ ID NO: 5) бета-коронавируса SARS-CoV-2), для получения модифицированных частиц вируса гриппа вакцинного штамма.

Описание элементов для фигур 3-4

Фигура 5 представляет собой график, который показывает уровни сывороточных IgG антител в сыворотках крови мышей, привитых двукратно рекомбинантными вирусами гриппа, содержащими вставки полиэпитопных кассет коронавируса SARS-CoV-2, в сравнении с вирусным вектором. Указаны данные оптические плотности в ИФА в зависимости от разведения сыворотки. Сравнение данных AUC проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим множественным сравнением по критерию Тьюки. *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001; ****р<0.0001.

PBS - это фосфатно-солевой буфер.

ЖГВ H7N9 - это живой аттенуированный вирус гриппа H7N9.

Фигура 6 представляет собой график, который показывает уровени сывороточных IgG антител в сыворотках крови мышей, привитых двукратно рекомбинантными вирусами гриппа, содержащими вставки полиэпитопных кассет коронавируса SARS-CoV-2, в сравнении с вирусным вектором. Указаны данные оптические плотности в ИФА в зависимости от разведения сыворотки. Сравнение данных AUC проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим множественным сравнением по критерию Тьюки. *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001; ****р<0.0001.

PBS - это фосфатно-солевой буфер.

Фигура 7 представляет собой график, который показывает уровени сывороточных IgG антител в сыворотках крови мышей, привитых двукратно рекомбинантными вирусами гриппа, содержащими вставки полиэпитопных кассет коронавируса SARS-CoV-2, в сравнении с вирусным вектором. Указаны значения площади под кривой ОП450 для каждого животного. Сравнение данных AUC проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим множественным сравнением по критерию Тьюки. *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001; ****р<0.0001.

PBS - это фосфатно-солевой буфер.

Фигура 8 представляет собой график, который показывает уровни сывороточных IgG антител в сыворотках крови мышей, привитых двукратно рекомбинантными вирусами гриппа, содержащими вставки полиэпитопных кассет коронавируса SARS-CoV-2, в сравнении с вирусным вектором. Указаны значения площади под кривой ОП450 для каждого животного. Сравнение данных AUC проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим множественным сравнением по критерию Тьюки. *р<0.05; **р<0.01; ***р<0.001; ****р<0.0001.

PBS - это фосфатно-солевой буфер.

Фигура 9 представляет собой график, который показывает уровни вирус-специфических IFN-γ-продуцирующих CD4+ Т-клеток памяти в образцах мононуклеаров периферической крови COVID-19 реконвалесцентов после стимуляции вакцинным кандидатом CoVac-13 и вирусным вектором ЖГВ H7N9.

Фигура 10 представляет собой график, который показывает уровни вирус-специфических IFN-γ-продуцирующих CD4+ Т-клеток памяти в образцах мононуклеаров периферической крови COVID-19 реконвалесцентов после стимуляции вакцинным кандидатом CoVac-15 и вирусным вектором ЖГВ H7N9.

Фигура 11 представляет собой график, который показывает уровни вирус-специфических IFN-γ-продуцирующих CD4+ Т-клеток памяти в образцах мононуклеаров периферической крови COVID-19 реконвалесцентов после стимуляции вакцинным кандидатом CoVac-16 и вирусным вектором ЖГВ H7N9.

Фигура 12 представляет собой график, который показывает уровни вирус-специфических IFN-γ-продуцирующих CD4+ (слева) и CD8+ (справа) Т-клеток памяти в образцах мононуклеаров периферической крови COVID-19 реконвалесцентов после стимуляции вакцинным кандидатом CoVac-17 и вирусным вектором ЖГВ H7N9.

Фигура 13 представляет собой график, который показывает уровни вирус-специфических IFN-γ-продуцирующих CD4+ (слева) и CD8+ (справа) Т-клеток памяти в образцах мононуклеаров периферической крови COVID-19 реконвалесцентов после стимуляции вакцинным кандидатом CoVac-29 и вирусным вектором ЖГВ H7N9.

Фигура 14 представляет собой график, который показывает уровни вирус-специфических IFN-γ-продуцирующих CD4+ (слева) и CD8+ (справа) Т-клеток памяти в образцах мононуклеаров периферической крови COVID-19 реконвалесцентов после стимуляции вакцинным кандидатом CoVac-30 и вирусным вектором ЖГВ H7N9.

Фигура 15 представляет собой график, который показывает уровни вирус-специфических IFN-γ-продуцирующих CD4+ (слева) и CD8+ (справа) Т-клеток памяти в образцах мононуклеаров периферической крови COVID-19 реконвалесцентов после стимуляции вакцинным кандидатом CoVac-31 и вирусным вектором ЖГВ H7N9.

ЖГВ H7N9 - это живой аттенуированный вирус гриппа H7N9..

Фигура 16 представляет собой график, который показывает уровни вирус-специфических IFN-γ-продуцирующих CD4+ (слева) и CD8+ (справа) Т-клеток памяти в образцах мононуклеаров периферической крови COVID-19 реконвалесцентов после стимуляции вакцинным кандидатом CoVac-32 и вирусным вектором ЖГВ H7N9.

Фигура 17 представляет собой график, который показывает уровни вирус-специфических IFN-γ-продуцирующих CD4+ (слева) и CD8+ (справа) Т-клеток памяти в образцах мононуклеаров периферической крови COVID-19 реконвалесцентов после стимуляции вакцинным кандидатом CoVac-33 и вирусным вектором ЖГВ H7N9.

Фигура 18 представляет собой график, который показывает вирус-специфических IFN-γ-продуцирующих CD4+ (сверху) и CD8+ (снизу) Т-клеток памяти в образцах мононуклеаров периферической крови контрольных доноров после стимуляции вакцинными кандидатами и вирусным вектором ЖГВ H7N9.

Фигура 19 представляет собой сравнение последовательностей фрагментов гликопротеина S различных коронавирусов.

Определения и общие методы

Если иное не определено в настоящем документе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые обычно понятны специалистам в данной области.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы культивирования клеток, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики, аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

«Выделенный» означает измененный или удаленный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природе присутствующие в животном, не являются «выделенными», но те же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от материалов, сопутствующих им в их природном состоянии, являются «выделенными». Выделенная нуклеиновая кислота или белок могут существовать, по существу, в очищенной форме или могут существовать в неприродном окружении, таком как, например, генетически модифицированной клетке.

Определения «встречающийся в природе», «нативный» или «дикого типа» используют для описания объекта, который можно обнаружить в природе как отличающийся от получаемого искусственно. Например, белок или нуклеотидная последовательность, присутствующие в организме (включая вирус), которые можно изолировать из источника в природе, и которые не модифицированы умышленно специалистом в лаборатории, являются встречающимися в природе.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «включать» и «содержать» или их вариации, такие как «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых.

Белок (Пептид)

В настоящем описании термины «пептид», «полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо, и они относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и не существует ограничений по максимальному количеству аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Как применяют в настоящем описании, термин относится и к коротким цепям, также общепринято обозначаемым в этой области, например, как пептиды, олигопептиды и олигомеры, и к более длинным цепям, как правило, обозначаемым в этой области как белки, множество типов которых существует. «Полипептиды» включают, помимо прочего, например, биологически активные фрагменты, по существу, гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, слитные белки. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.

Молекулы нуклеиновых кислот

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность» или «нуклеиновокислотная последовательность», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», которые используются равнозначно в данном описании, обозначают четкую последовательность нуклеотидов, модифицированных или не модифицированных, определяющую фрагмент или участок нуклеиновой кислоты, содержащую или не содержащую неприродные нуклеотиды и являющуюся либо двухцепочечной ДНК или РНК, либо одноцепочечной ДНК или РНК, либо продуктами транскрипции указанных ДНК.

Специалист в этой области имеет общие знания о том, что нуклеиновые кислоты являются полинуклеотидами, которые можно гидролизовать до мономерных «нуклеотидов». Мономерные нуклеотиды можно гидролизовать в нуклеозиды. Как применяют в настоящем описании, полинуклеотиды включают, в качестве неограничивающих примеров, все последовательности нуклеиновой кислоты, получаемые любыми способами, доступными в этой области, включая, в качестве неограничивающих примеров, рекомбинантные способы, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновой кислоты из рекомбинантной библиотеки или генома клетки, использование обычной технологии клонирования и ПЦР и т.п., и способами синтеза.

Здесь также следует упомянуть, что данное изобретение не относится к нуклеотидным последовательностям в их природной хромосомной среде, т.е. в природном состоянии. Последовательности данного изобретения были выделены и/или очищены, т.е. были взяты прямо или косвенно, например, путем копирования, при этом их среда была по меньшей мере частично модифицирована. Таким образом, также здесь следует подразумевать изолированные нуклеиновые кислоты, полученные путем генетической рекомбинации, например, с помощью принимающих клеток (клеток-хозяев), или полученные путем химического синтеза.

Термин нуклеотидная последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.

Вектор

Термин «вектор» при использовании в настоящем документе означает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она соединена. Кроме того, термин «вектор» в данном настоящем документе означает вирусную частицу, способную транспортировать нуклеиновую кислоту.

Применение

Термин «профилактика» или «предупреждение» и подобные им означает замедление или предотвращение появления симптомов заболевания, расстройства или инфекции.

Термин «индукция иммунного ответа» как используют в настоящем изобретении, относится к специфическому контролю или к влиянию на активность иммунного ответа и включает активацию иммунного ответа, стимуляцию иммунного ответа, усиление иммунного ответа.

Термин «специфический иммунитет» как используют в настоящем изобретении, относится к состоянию невосприимчивости к заболеванию вследствие индукции иммунного ответа.

Термин «нарушение» означает любое состояние, которое можно улучшить в результате лечения по настоящему изобретению. В определение данного термина входят хронические и острые нарушения или заболевания, включающие в себя патологические состояния, которые вызывают предрасположенность млекопитающего к возникновению данного нарушения.

«Заболевание» является состоянием здоровья животного, где животное не может поддерживать гомеостаз, и где, если заболевание не облегчают, то здоровье животного продолжает ухудшаться.

Термин «субъект», «пациент», «индивидуум» и т.п. используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к любому животному, поддающемуся воздействию способами, представленными в настоящем описании. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления субъект, пациент или индивидуум является человеком. Вышеупомянутый субъект может быть мужского или женского пола любого возраста.

«Терапевтически эффективным количеством» или «эффективным количеством» считается количество вводимого терапевтического агента, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится профилактика.

Подробное описание изобретения

Рекомбинантный полипептид для увеличения титра антител к вирусу гриппа, и нуклеиновая кислота его кодирующая

по меньшей мере 1 фрагмент из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью

по меньшей мере 1 фрагмент из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью

и, при необходимости, 1 фрагмент из мембранного белка коронавируса с аминокислотной последовательностью

где

по меньшей мере 1 фрагмент из гликопротеина S коронавируса выбирают из группы:

DRLNEVA (SEQ ID NO: 7),

FIAGLIAIV (SEQ ID NO: 8),

APHGVVFLHVTYV (SEQ ID NO: 9),

GYQPYRVVVLSF (SEQ ID NO: 10),

ALNTLVKQL (SEQ ID NO: 11),

VLNDILSRL (SEQ ID NO: 12) или

по меньшей мере 1 фрагмент из нуклеопротеина коронавируса выбирают из группы:

ALALLLLDRLNQL (SEQ ID NO: 15),

LSPRWYFYYL (SEQ ID NO: 16),

ALNTPKDHI (SEQ ID NO: 17),

QLPQGTTL (SEQ ID NO: 18),

RQGTDYKHWP (SEQ ID NO: 19),

GMSRIGMEV (SEQ ID NO: 20) или

ILLNKHIDA (SEQ ID NO: 21);

фрагмент из мембранного белка коронавируса представляет собой FLWLLWPVTLACFVLAAVYRI (SEQ ID NO: 22).

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 2 фрагмента из гликопротеина S коронавируса и 1 фрагмент из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 3 фрагмента из гликопротеина S коронавируса, 1 фрагмент из нуклеопротеина коронавируса и фрагмент мембранного белка коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 2 фрагмента из гликопротеина S коронавируса и 3 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 1 фрагмент из гликопротеина S коронавируса и 3 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 3 фрагмента из гликопротеина S коронавируса и 2 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 2 фрагмента из гликопротеина S коронавируса и 4 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 4 фрагмента из гликопротеина S коронавируса и 3 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 3 фрагмента из гликопротеина S коронавируса и 4 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 2 фрагмента из гликопротеина S коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, a также 1 фрагмент из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 3 фрагмента из гликопротеина S коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, 1 фрагмент из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 15 и фрагмент мембранного белка коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 2 фрагмента из гликопротеина S коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, а также 3 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 2 фрагмента из гликопротеина S коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, а также 3 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 21.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 1 фрагмент из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10 и 3 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 1 фрагмент из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10 и 3 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 21.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 3 фрагмента из гликопротеина S коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, а также 2 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 21.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 2 фрагмента из гликопротеина S коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 и 4 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 4 фрагмента из гликопротеина S коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, а также 3 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота кодирует полипептид, который включает 3 фрагмента из гликопротеина S коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, а также 4 фрагмента из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 59-76.

Любая из вышеуказанных нуклеиновых кислот кодирует рекомбинантный полипептид для увеличения титра антител к вирусу гриппа. Данный полипептид является полиэпитопной кассетой для Т-клеточного ответа на белки коронавируса. В материалах заявки данный полипептид также называется кассетой по изобретению.

Кассеты по изобретению включают по меньшей мере одну последовательность, которая выбрана из группы:

1) фрагмент (1184-1190 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области heptad repeat 2, принимающей участие в проникновении вируса в заражаемую клетку: DRLNEVA (SEQ ID NO: 7).

Данный фрагмент может быть представлен в кассетах в составе, например, следующих вариантов:

фрагмент (1180-1197 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области heptad repeat 2, принимающей участие в проникновении вируса в заражаемую клетку: QKEIDRLNEVAKNLNESL (SEQ ID NO: 95);

фрагмент (1164-1178 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области heptad repeat 2, принимающей участие в проникновении вируса в заражаемую клетку: EIDRLNEVAKNLNES (SEQ ID NO: 96).

2) Фрагмент (1220-1228 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): FIAGLIAIV (SEQ ID NO: 8).

фрагмент (1199-1213 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): WLGFIAGLIAIVMVT (SEQ ID NO: 97);

фрагмент (1220-1231 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): FIAGLIAIVMVT (SEQ ID NO: 98);

фрагмент (1220-1229 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): FIAGLIAIVM (SEQ ID NO: 99).

3) Фрагмент (1056-1068 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): APHGVVFLHVTYV (SEQ ID NO: 9).

фрагмент (1035-1062 а.о.) гликопротеина S вируса SARS-CoV-1, частично совпадающей с таковой у гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): PQAAPHGVVFLHVTYVPSQERNFTTAPA (SEQ ID NO: 100);

фрагмент (1056-1078 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): APHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTA (SEQ ID NO: 101);

фрагмент (1056-1073 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): APHGVVFLHVTYVPAQEK (SEQ ID NO: 102);

фрагмент (1055-1073 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): SAPHGVVFLHVTYVPAQEK (SEQ ID NO: 103);

фрагмент (1055-1070 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): SAPHGVVFLHVTYVPA (SEQ ID NO: 104).

4) Фрагмент (504-515 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области рецептор-связывающего домена (RBD), отвечающего за связывание с рецепторами на поверхности заражаемых клеток: GYQPYRVVVLSF (SEQ ID NO: 10).

5) Фрагмент (504-522 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области рецептор-связывающего домена (RBD), отвечающего за связывание с рецепторами на поверхности заражаемых клеток: GYQPYRVVVLSFELLHAPA (SEQ ID NO: 105).

6) Фрагмент (504-516 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области рецептор-связывающего домена (RBD), отвечающего за связывание с рецепторами на поверхности заражаемых клеток: GYQPYRVVVLSFE (SEQ ID NO: 106).

7) Фрагмент (958-966 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области heptad repeat 1, принимающей участие в проникновении вируса в заражаемую клетку: ALNTLVKQL (SEQ ID NO: 11).

фрагмент (946-971 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1), частично из области heptad repeat 1, принимающей участие в проникновении вируса в заражаемую клетку: GKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFG (SEQ ID NO: 107);

фрагмент (947-970 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области heptad repeat 1, принимающей участие в проникновении вируса в заражаемую клетку: KLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNF (SEQ ID NO: 108).

8) Фрагмент (976-984 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): VLNDILSRL (SEQ ID NO: 12).

9) Фрагмент (996-1008 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1

10) Фрагмент (996-1004 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): LITGRLQSL (SEQ ID NO: 14).

1) Фрагмент (218-230 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): ALALLLLDRLNQL (SEQ ID NO: 15).

фрагмент (216-234 а.о.) нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-1, частично совпадающей с таковой у нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): GETALALLLLDRLNQLESK(SEQ ID NO: 109);

фрагмент (214-234 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): GGDAALALLLLDRLNQLESKM (SEQ ID NO: 110);

фрагмент (216-235 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): DAALALLLLDRLNQLESKMS (SEQ ID NO: 111);

фрагмент (216-234 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): DAALALLLLDRLNQLESKM (SEQ ID NO: 112);

фрагмент (216-233 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): DAALALLLLDRLNQLESK (SEQ ID NO: 113);

2) Фрагмент (104-113 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): LSPRWYFYYL (SEQ ID NO: 16).

фрагмент (92-118 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): RRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPE (SEQ ID NO: 114);

фрагмент (92-117 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): RRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGP (SEQ ID NO: 115);

фрагмент (98-119 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): DGKMKDLSPRWYFYYLGTGPE (SEQ ID NO: 116).

3) Фрагмент (138-146 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): ALNTPKDHI (SEQ ID NO: 17).

4) Фрагмент (160-167 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): QLPQGTTL (SEQ ID NO: 18).

5) Фрагмент (293-302 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): RQGTDYKHWP (SEQ ID NO: 19).

6) Фрагмент (316-324 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): GMSRIGMEV (SEQ ID NO: 20).

Данный фрагмент может быть представлен в кассетах в составе, например, следующего варианта:

фрагмент (303-337 а.о.) нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-1, частично совпадающей с таковой у нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): PQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGA (SEQ ID NO: 117).

7) Фрагмент (351-359 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): ILLNKHIDA (SEQ ID NO: 21).

фрагмент (340-365 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): DDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPP (SEQ ID NO: 118);

фрагмент (341-359 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): DKDPNFKDQVILLNKHIDA (SEQ ID NO: 119);

фрагмент (340-359 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): DDKDPNFKDQVILLNKHIDA (SEQ ID NO: 120).

Кассеты по изобретению включают, при необходимости, последовательность фрагмент (53-73 а.о.) описанного выше мембранного белка М вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 5): FLWLLWPVTLACFVLAAVYRI (SEQ ID NO: 22).

фрагмент (40-75 а.о.) мембранного белка М вируса SARS-CoV-1, частично совпадающей с таковой у мембранного белка М вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 5): NRNRFLYIIKLVFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWV (SEQ ID NO: 121);

фрагмент (42-75 а.о.) описанного выше мембранного белка М вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 5): RNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINW (SEQ ID NO: 122);

фрагмент (50-79 а.о.) описанного выше мембранного белка М вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 5): KLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGG (SEQ ID NO: 123);

фрагмент (50-77 а.о.) описанного выше мембранного белка М вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 5): KLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWIT (SEQ ID NO: 124).

В отдельных вариантах перечисленные выше последовательности использовались в составе конкретных антигенных кассет:

Кассета 1 включает следующие эпитопные фрагменты:

Фрагмент (1184-1190 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области heptad repeat 2, принимающей участие в проникновении вируса в заражаемую клетку: DRLNEVA (SEQ ID NO: 7);

Фрагмент (1220-1228 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): FIAGLIAIV (SEQ ID NO: 8);

Фрагмент (1056-1068 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): APHGVVFLHVTYV (SEQ ID NO: 9);

Фрагмент (218-230 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): ALALLLLDRLNQL (SEQ ID NO: 15);

Фрагмент (53-73 а.о.) описанного выше мембранного белка М вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 5): FLWLLWPVTLACFVLAAVYRI (SEQ ID NO: 22).

Антигенную кассету 1 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 1 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный Слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 41 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

Ссылка на нуклеотидную последовательность охватывает его комплемент, если не указано иное. Таким образом, ссылка на нуклеиновую кислоту, имеющую определенную последовательность следует понимать как охватывающие ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 1, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 1 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 2 включает следующие эпитопные фрагменты:

Фрагмент (316-324 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): GMSRIGMEV (SEQ ID NO: 20).

Антигенную кассету 2 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 2 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 42 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 2, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 2 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 3 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 3 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 3 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептйд имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25 или SEQ ID NO: 43 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 3, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 3 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 4 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 4 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 4 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 44 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 4, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 4 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 5 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 5 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 5 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 45 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 5, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 5 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 6 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 6 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 6 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 28 или SEQ ID NO: 46 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 6, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 6 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 7 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 7 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 7 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 29 или SEQ ID NO: 47 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 7, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 7 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 8 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 8 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 8 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 48 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 8, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 8 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 9 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 9 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 9 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 49 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 9, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 9 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 10 включает следующие эпитопные фрагменты:

Фрагмент (958-966 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области heptad repeat 1, принимающей участие в проникновении вируса в заражаемую клетку: ALNTLVKQL (SEQ ID NO: 11);

Фрагмент (504-515 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области рецептор-связывающего домена (RBD), отвечающего за связывание с рецепторами на поверхности заражаемых клеток: GYQPYRVVVLSF (SEQ ID NO: 10);

Фрагмент (104-113 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): LSPRWYFYYL (SEQ ID NO: 16);

Фрагмент (138-146 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): ALNTPKDHI (SEQ ID NO: 17);

Фрагмент (160-167 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): QLPQGTTL (SEQ ID NO: 18).

Антигенную кассету 10 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 10 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 50 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 10, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 10 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 11 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 11 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 11 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 51 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 11, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 11 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 12 включает следующие эпитопные фрагменты:

Фрагмент (976-984 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): VLNDILSRL (SEQ ID NO: 12);

Фрагмент (996-1008 а.о.) описанного выше гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1): LITGRLQSLQTYV (SEQ ID NO: 13);

Фрагмент (351-359 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): ILLNKHIDA (SEQ ID NO: 21).

Антигенную кассету 12 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 12 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 52 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 12, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 12 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 13 включает следующие эпитопные фрагменты:

Фрагмент (160-167 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): QLPQGTTL (SEQ ID NO: 18);

Фрагмент (351-359 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2

(SEQ ID NO: 3): ILLNKHIDA (SEQ ID NO: 21).

Антигенную кассету 13 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 13 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 53 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 13, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 13 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 14 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 14 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 14 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 54 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 14, включает нуклеотидную последовательность

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 14 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 15 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 15 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 15 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 55 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 15, включает нуклеотидную последовательность

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 15 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 16 включает следующие эпитопные фрагменты:

Фрагмент (351-359 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): ILLNKHIDA (SEQ ID NO: 21);

Фрагмент (293-302 а.о.) описанного выше нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3): RQGTDYKHWP (SEQ ID NO: 19);

Антигенную кассету 16 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 16 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 56 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 16, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 16 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 17 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 17 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 17 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 57 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 17, включает нуклеотидную последовательность:

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 17 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

Кассета 18 включает следующие эпитопные фрагменты:

Антигенную кассету 18 описывает следующая последовательность:

При этом следует учитывать, что вышеуказанная антигенная кассета 18 в составе вектора слита с саморасщепляемым пептидом. Данный слитый полипептид имеет следующую последовательность:

Специалисту в данной области будет очевидно, что полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или SEQ ID NO: 58 может быть кодирован широким рядом различных ДНК-последовательностей с учетом вырожденности генетического кода. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же аминокислотные последовательности. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения.

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 18, включает нуклеотидную последовательность

В частном варианте нуклеиновая кислота, которая кодирует антигенную кассету 18 и саморасщепляемый пептид, включает нуклеотидную последовательность:

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантный полипептид для увеличения титра антител к вирусу гриппа, который содержит аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 23-40.

Рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа

Термин «рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа» (или «вирусоподобная частица на основе вируса гриппа», или «рекомбинантный штамм вируса гриппа») в контексте настоящего описания относится к вирусу гриппа, который включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот, которая кодирует вышеуказанный рекомбинантный полипептид, для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа. Благодаря своей конструктивной особенности рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа способен продуцировать более высокий уровень антител к вирусу гриппа при введении млекопитающему. Более того, рекомбинантный вирус гриппа, включающий вышеуказанную нуклеиновую кислоту, которая кодирует рекомбинантный полипептид на основе фрагментов белков коронавируса, позволяет формировать специфический Т-клеточный иммунитет к коронавирусу при введении млекопитающему и, таким образом, данный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа может быть использован для комбинированной профилактики заболеваний, вызванных вирусом коронавирусом и заболеваний, вызванных вирусом гриппа.

Под признаком «вирус гриппа» подразумевается вирус из семейства ортомиксовирусов (Orthomyxoviridae), включающее в себя монотипные роды Alphainfluenzavirus (ранее - вирус гриппа типа A), Betainfluenzavirus (ранее - вирус гриппа типа В), Gammainfluenzavirus (ранее - вирус гриппа типа С) и Deltainfluenzavirus (ранее - вирус гриппа типа D), у которых разделение по родам определяется за счет антигенных свойств рибонуклеопротеинового комплекса. Вирус гриппа представляет собой оболочечный вирус сферической формы диаметром 100-120 нм, внешний слой которого состоит из липидной мембраны, на которой экспонированы основные гликопротеины вируса - гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), - и матриксный белок М2, формирующий ионные каналы. Под липидной мембраной расположен матриксный белок 1 (Ml), определяющий форму вирусной частицы. Геном вируса гриппа сегментирован и представлен минус-нитевой РНК, которая находится внутри вириона в виде рибонуклеопротеинового комплекса (РНП). У вируса гриппа типа А 8 фрагментов РНК кодируют, по меньшей мере, 12 белков: НА, M1, М2, NA, NP, NS1, NS2, PA, РА-Х, РВ1, PB1-F2, РВ2. На основании антигенных свойств поверхностных антигенов НА и NA вирусы гриппа А делятся на сероподтипы, например, H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1 и т.д.

В некоторых вариантах выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа представляет собой вакцинные штаммы вируса гриппа.

Вакцинные штаммы характеризуются тем, что содержат гены, кодирующие внутренние и неструктурные белки вируса гриппа (M1, М2, NP, NS1, NS2, РА, РА-Х, РВ1, PB1-F2, РВ2), от специального лабораторного штамма А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) или его производных. Штамм А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) был получен методом холодовой адаптации эпидемического вируса А/Ленинград/134/57 (H2N2), путем его 17-кратного пассирования в развивающихся куриных эмбрионах при пониженной до 25°C температуре [Alexandrova G.I., Smorodintsev A.A. Obtaining of an additionally attenuated vaccinating cryophilic influenza strain // Rev Roum Inframicrobiol. - 1965. - V. 2. - №. - p. 179-189]. В результате пассажей вирус А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) приобрел набор мутаций в генах, кодирующих поверхностные и внутренние белки вириона (таблица А), которые обусловили его температурочувствительный, холодоадаптированный и аттенуированный фенотип. У штамма была определена первичная нуклеотидная последовательность (номер изолята в базе GISAID EPI ISL 169836, коды доступа генов EPI555079 до EPI555086). Ранее было показано, что мутантный белок РВ2 является основным определяющим фактором аттенуированного фенотипа у штамма А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а полимеразные гены РВ1 и РА дополняют этот признак [Klimov A.I., Kiseleva I.V., Alexandrova G.I., Сох N.J. Genes coding for polymerase proteins are essential for attenuation of the cold-adapted A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) influenza virus, in Options for the Control of Influenza IV. 2001. Okinawa, Japan: Elsevier Science BV.]. Также была определена роль индивидуальных мутаций в геноме штамма А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) в проявлении основного фенотипического признака вируса - чувствительности к повышенным температурам инкубации [Isakova-Sivak I, Chen LM, Matsuoka Y, Voeten JT, Kiseleva I, Heldens JG, den Bosch Hv, Klimov A, Rudenko L, Cox NJ, Donis RO. Genetic bases of the temperature-sensitive phenotype of a master donor virus used in live attenuated influenza vaccines: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2). Virology. 2011 Apr 10; 412(2):297-305. doi: 10.1016/j.virol.2011.01.004].

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа получают из вируса А/Ленинград/134/17/5 7 (H2N2) или его производных.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа включает любую из вышеуказанных нуклеиновых кислот по изобретению, которая находится в гене нейраминидазы (NA) или гене NS вируса гриппа. Под производными вируса А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) понимают:

1) вирусы гриппа типа А, у которых поверхностные антигены НА и NA принадлежат ранее циркулировавшим, потенциально пандемическим, пандемическим или сезонным эпидемическим вирусам гриппа А подтипов H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H5N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, H17N10, H18N11, а гены внутренних и неструктурных белков - штамму А/Ленинград/134/17/57 (H2N2);

2) вирусы гриппа типа А, у которых один и более генов А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) заменены на соответствующие гены любого другого вируса гриппа типа А;

3) вирусы гриппа типа А, имеющие идентичную с А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) аминокислотную последовательность вирусных белков, кодируемых любой нуклеотидной последовательностью (учитывается вырожденность кодонов для ряда аминокислот);

4) вирусы гриппа типа А любого сероподтипа, содержащие аминокислотные остатки во внутренних и неструктурных белках, описанные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (PB2-Leu478; PB1-Asn265; PB1-Ile591; PA-Pro28; PA-Leu341; M1-Va115; M1-Leu144; NS2-Ile100), в полном объеме или в различных комбинациях;

5) вирусы гриппа типа А, последовательность внутренних и неструктурных белков которых (M1, М2, NP, NS1, NS2, РА, РА-Х, РВ1, PB1-F2, РВ2) отличается от вируса А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) на ряд аминокислот;

6) вирус гриппа А любого сероподтипа, содержащий модифицированные гены штамма А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (учитывается укорочение рамки считывания NS1 гена).

Фармацевтическая композиция/вакцина

В некоторых вариантах осуществления изобретения действующее вещество в вышеуказанных композициях находится в эффективном количестве, например, в биологически эффективном количестве.

В некоторых вариантах осуществления изобретения действующее вещество в вышеуказанных композициях находится в эффективном количестве, например, в терапевтически эффективном количестве.

В конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по изобретению в фармацевтически приемлемом носителе или в других фармацевтических агентах, адъювантах, разбавителях и т.д. Носитель для инъекций обычно является жидким. Носитель для других способов введения может быть или твердым, или жидким, таким как стерильная апирогенная вода или стерильный апирогенный фосфатно-солевой буферный раствор. Для введения путем ингаляции носитель является вдыхаемым и предпочтительно находится в твердой или жидкой дисперсной форме. В качестве инъекционной среды предпочтительно использовать воду, содержащую добавки, общепринятые для инъекционных растворов, такие как стабилизирующие агенты, соли или солевые растворы и/или буферы.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по изобретению и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых эксипиентов, таких как наполнители, растворители, разбавители, носители, вспомогательные, распределяющие, средства доставки, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, регуляторы пролонгированной доставки, выбор и соотношение которых зависит от природы и способа назначения и дозировки. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению и способы их изготовления будут бесспорно очевидными для специалистов в этой области. Производство фармацевтических композиций предпочтительно должно соответствовать требованиям GMP (надлежащей производственной практики). Композиция может включать буферную композицию, тонические агенты, стабилизаторы и солюбилизаторы.

«Фармацевтически приемлемым» считается материал, который не имеет биологических или других противопоказаний, например, материал можно вводить субъекту без каких-либо нежелательных биологических эффектов. Таким образом, такие фармацевтические композиции можно использовать, например, для трансдукции клетки ех vivo или для введения in vivo рекомбинантного вируса на основе вируса гриппа по изобретению непосредственно субъекту.

Термин «эксципиент» или «вспомогательное вещество» используется в данном документе для описания любого компонента, отличающегося от ранее описанных по данному изобретению. Это вещества неорганического или органического происхождения, используемые в процессе производства, изготовления лекарственных препаратов для придания им необходимых физико-химических свойств.

Под «стабилизатором» понимается вспомогательное вещество или смесь двух и более вспомогательных веществ, которые обеспечивают физическую и/или химическую стабильность активного агента.

Под термином «буфер», «буферная композиция», «буферный агент» понимается раствор, способный сохранять значение рН, благодаря взаимодействию кислотных и щелочных компонентов, входящих в его состав, который дает возможность препарату вектора на основе вируса гриппа, проявлять устойчивость к изменениям рН. В общем случае, преимущественными являются значения рН фармацевтической композиции от 4,0 до 8,0. В качестве буферных агентов могут быть использованы, например, ацетатный, фосфатный, цитратный, гистидиновый, сукцинатный и т.п. буферные растворы, но, не ограничиваясь ими.

Фармацевтическая композиция является «стабильной», если активный агент сохраняет свою физическую стабильность и/или химическую стабильность и/или биологическую активность в течение заявленного срока годности при температуре хранения, например, при 2-8°C. Предпочтительно, чтобы активный агент сохранял и физическую, и химическую стабильность, а также биологическую активность. Период хранения выбирается на основании результатов исследования стабильности при ускоренном и естественном хранении.

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может изготавливаться, упаковываться или широко продаваться в виде единичной стандартной дозы или множества единичных стандартных доз в виде готовой лекарственной формы. Используемый в данном документе термин «единичная стандартная доза» означает дискретное количество фармацевтической композиции, содержащей заранее определенное количество активного ингредиента. Количество активного ингредиента обычно равно дозировке активного ингредиента, который будет вводиться субъекту, или удобной части такой дозировки, например, половине или трети такой дозировки.

Под коронавирусом подразумеваются вирусы из семейства коронавирусы (Coronaviridae).

Данное семейство включает род альфа-коронавирусы (Alphacoronavirus) и род бета-коронавирусы (Betacoronavirus).

Род альфа-коронавирусы (Alphacoronavirus) включает:

1) коронавирус человека 229Е - вызывает ОРВИ;

2) Коронавирус человека NL63 - вызывает ОРВИ. Род бета-коронавирусы (Betacoronavirus) включает:

1) коронавирус человека ОС43 - вызывает ОРВИ;

2) коронавирус человека HKU1 - вызывает ОРВИ;

3) MERS-CoV;

4) SARS-CoV;

5) SARS-CoV-2.

Вышеуказанная фармацевтическая композиция или вакцина могут быть использованы для профилактики заболеваний, вызванных любым из вышеуказанных коронавирусов.

Термин «вакцина» относится к иммуногенной композиции, включающей антиген, полученный от патогена, который используется для индуцирования иммунного ответа против патогена, который обеспечивает защитный иммунитет (например, иммунитет, который защищает субъекта от инфекции, вызываемой патогеном, и/или ослабляет тяжесть заболевания или состояния, вызываемого инфекцией вследствие патогена). Защитный иммунитет может включать формирование антител и/или клеточно-опосредованный ответ.

В зависимости от контекста термин «вакцина» может также относиться к суспензии или раствору антигена, который вводят позвоночному для выработки защитного иммунитета.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцина включает рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа, который содержится предпочтительно в биологически эффективном количестве.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцина включает рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа, который содержится предпочтительно в терапевтически эффективном количестве.

Все определения и пояснения, относящиеся к фармацевтической композиции, также относятся и к вакцине.

Применение

Любой из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе вируса гриппа или вышеуказанная композиция могут применяться для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и заболеваний, вызванных коронавирусом, где под коронавирусом подразумеваются вирусы из семейства коронавирусы (Coronaviridae), в частности, альфа-коронавирусы, которые включают коронавирус человека 229Е или коронавирус человека NL63, и бета-коронавирусы, которые включают коронавирус человека ОС43, коронавирус человека HKU1, MERS-CoV, SARS-CoV, SARS-CoV-2.

Любой способ введения рекомбинантного вируса на основе вируса гриппа, принятый в данной области, может соответствующим образом использоваться для вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе вируса гриппа по данному изобретению.

Примеры способов введения включают в себя местное применение, интраназальное, ингаляционное, чрезслизистое, трансдермальное, энтеральное (например, пероральное, ректальное), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутримышечное) введения, а также инъекции непосредственно в ткань или в орган.

Предпочтительным способом введения вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе вируса гриппа по данному изобретению является интраназальное введение.

Инъекционные препараты могут быть приготовлены в общепринятых лекарственных формах: в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для приготовления растворов или суспензий в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Альтернативно, можно вводить вышеуказанный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по данному изобретению локально, а не системно, например, в виде депо или в композиции с замедленным высвобождением.

Рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по данному изобретению вводят в организм в эффективном количестве.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по данному изобретению предпочтительно вводят в организм в биологически эффективном количестве.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по данному изобретению предпочтительно вводят в организм в терапевтически эффективном количестве.

Дозировки вышеуказанного рекомбинантного вируса на основе вируса гриппа по данному изобретению будут зависеть от способа введения, конкретного вирусного вектора и их можно определять рутинными способами. Примерными дозами для достижения терапевтического эффекта являются вирусные титры, составляющие по меньшей мере примерно 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ инфекционных единиц или больше, предпочтительно от 10⁷ до 10⁸ инфекционных единиц.

Любой из вышеуказанных рекомбинантных вирусов на основе вируса гриппа или вышеуказанная композиция может применяться для индукции специфического иммунитета к вирусам из семейства коронавирусы (Coronaviridae), которые выбирают из группы: коронавирус человека 229Е, коронавирус человека NL63, коронавирус человека ОС43, коронавирус человека HKU1, MERS-CoV, SARS-CoV или SARS-CoV-2. Универсальность вышеуказанного рекомбинантного вируса по изобретению, как средства для профилактики любого коронавируса из вышеуказанной группы, достигается за счет следующего.

В антигенных кассетах настоящего изобретения, используемых для индукции клеточного иммунного ответа против SARS-CoV-2, использовалось как минимум 102 фрагмента аминокислотных последовательностей, совпадающих у белков SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2, зарегистрированных в базе данных IEDB (iedb.org) в качестве иммуногенных: GYQPYRVVVL, QPYRVVVLSF, PYRVVVLSF, LQDVVNQNAQALNTL, DVVNQNAQALNTLVKQL, AQALNTLVK, QALNTLVKQLSSNFGAI, ALNTLVKQL, LNTLVKQLSSNFGAI, SSNFGAISSVLNDIL, AISSVLNDILSRLDKVE, SVLNDILSR, VLNDILSRL, ILSRLDKVEAEVQIDRL, RLDKVEAEV, EAEVQIDRLITGRLQSL, AEVQIDRLIT, AEVQIDRLI, VQIDRLITGR, IDRLITGRLQSLQTY, RLITGRLQSLQTYVTQQ, LITGRLQSL, TGRLQSLQTYVTQQL, GRLQSLQTY, RLQSLQTYV, LQSLQTYVTQQLIRA, SLQTYVTQQLIRAAEIR, LQTYVTQQLIRAAEI, QTYVTQQLIRAAEIR, APHGVVFLHV, GVVFLHVTY, VVFLHVTYV, EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY, EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY, RLNEVAKNL, EVAKNLNESLIDLQELG, NLNESLIDL, SLIDLQELGK, LIDLQELGKY, QELGKYEQYI, YEQYIKWPWY, WLGFIAGLIAIVMVT, LGFIAGLIAIVMVTI, FIAGLIAIV, GLIAIVMVTI, LSPRWYFYY, SPRWYFYYL, ATEGALNTPK, ALNTPKDHI, VLQLPQGTTLPKGFY, VLQLPQGTTL, LQLPQGTTL, QLPQGTTLPKGFYAEGSR, QLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQ, QLPQGTTLPKGFYAE, QLPQGTTLPK, LPQGTTLPKG, GTTLPK, GTTLPKGFY, ALALLLLDR, LALLLLDRL, LLLLDRLNQ, LLLLDRLNQL, LLLDRLNQL, IRQGTDYKHWPQIAQFA, QGTDYKHW, KHWPQIAQFAPSASAFF, AQFAPSASAFFGMSR, AQFAPSASA, AQFAPSASAFFGMSRIGM, QFAPSASAFFGMSRIGM, APSASAFFGM, SASAFFGMSR, ASAFFGMSR, AFFGMSRIGMEVTPSGTW, FFGMSRIGMEVTPSGTW, GMSRIGMEV, MSRIGMEVTPSGTWL, GMEVTPSGTWL, MEVTPSGTWL, VTPSGTWLTY, TPSGTWLTY, ILLNKHID, ILLNKHIDA, LLNKHIDAYKTFPPTEPK, LNKHIDAYKTFPPTEPK, NKHIDAYKTFPPTEP, TFPPT, KTFPPTEPKK, KTFPPTEPK, TFPPTEPK, FLWLLWPVT, FLWLLWPVTLACFVL, FLWLLWPVTL, LWLLWPVTL, WLLWPVTLA, LWPVTLACF, WPVTLACFVL, TLACFVLAA, TLACFVLAAV, FVLAAVYRI.

В ряде случаев эпитопы накладывались друг на друга с образованием более протяженных иммунногенных областей (соответственно, также совпадающих у SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2):

LQDVVNQNAQALNTL VKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTY VTQQLIRAAEIR, EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWY, GYQPYRVVVLSF, WLGFIAGLIAIVMVTI, IRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTY, VLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQ, ILLNKHIDAYKTFPPTEPKK, ALALLLLDRLNQL, ATEGALNTPKDHI, LSPRWYFYYL, FLWLLWPVTLACFVLAAVYRI.

В большинстве из этих регионов можно заметить консенсусные гидрофобные мотивы, характерных для антигенных пептидов, связываемых белками главного комплекса гистосовместимости (ГКГ; Major Histocompatibility Complex, МНС) разных классов, например (гидрофобные остатки выделены подчеркиванием). Из-за этой характерной особенности некоторые фрагменты коронавирусных белков, содержащие наиболее универсальные мотивы, распознаются несколькими аллельными вариантами HLA. Например, эпитоп LSPRWYFYY связывается как минимум с семью аллельными формами HLA (http://www.iedb.org/epitope/39576). А для эпитопа показано связывание со всеми вариантами HLA группы А2, в том числе с самым распространенным в мировой популяции HLA-A* 02:01 (http://www.iedb.Org/epitope/16156).

Среди отобранных ранее последовательностей, используемых в данном изобретении, было найдено как минимум 10 антигенных фрагментов, обладающих значительной гомологией с последовательностями других пандемических и эпидемических штаммов коронавирусов, в том числе вызывающих сезонные ОРВИ (бета-коронавирусов HKU1 и ОС43, альфа-коронавирусов 229Е и NL63).

Большая часть консервативных участков, использованных в изобретении, относится к С-концевому региону гликопротеина S. Они обладают наибольшей иммуногенностью у здоровых людей из-за большей схожести с последовательностями коронавирусов, вызывающих сезонные ОРВИ: HKU1, ОС43, 229Е и NL63 [Braun, J., Loyal, L., Frentsch, M. et al. SARS-CoV-2-reactive T cells in healthy donors and patients with COVID-19. Nature 587, 270-274 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2598-9].

Так, фрагмент ILSRLDKVEAEVQIDRLITGRL гликопротеина S SARS-CoV-2 на 81.8% совпадает с аналогичным фрагментом бета-коронавирусов HKU1 и ОС43, вызывающих острые респираторные инфекции человека; участок VVNQNAQALNTLVKQL - на 81.2%, а участок AEVQIDRLITGR - на 83.3%:

Общая последовательность (948-1012 а.о. гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2) включает следующие использованные в изобретении фрагменты: ALNTLVKQL (IEDB ID: 2801), VLNDILSRL (IEDB ID: 69657), RLDKVEAEV (IEDB ID: 54507), LITGRLQSL (IEDB ID: 36724), RLQSLQTYV (IEDB ID: 54725).

Для всех перечисленных фрагментов описано связывание с наиболее распространенным в мировой популяции аллельным вариантом HLA-A*02:01, для которого характерно взаимодействие с пептидами, которые имеют структуры, указанные в БД The Immune Epitope Database (IEDB) (https://www.iedb.org/mhc/143).

Для эпитопов RLDKVEAEV, LITGRLQSL, RLQSLQTYV также описано связывание с аллельным вариантом HLA-A*02:02 (а для LITGRLQSL - со всеми HLA группы А*02), для которого характерно взаимодействие с пептидами, которые имеют структуры, указанные в БД The Immune Epitope Database (IEDB) (https://www.iedb.orR/mhc/200).

И наконец, для эпитопов RLDKVEAEV и RLQSLQTYV также описано связывание с аллельными вариантами HLA-A*02:03, HLA-A*02:06 и HLA-A*68:02.

Для HLA-A*02:03 характерно взаимодействие с пептидами, которые имеют структуры, указанные в БД The Immune Epitope Database (IEDB) (https://www.iedb.org/mhc/201).

Для HLA-A*02:06 характерно взаимодействие с пептидами, которые имеют структуры, указанные в БД The Immune Epitope Database (IEDB) (https://www.iedb.org/mhc/204).

Для HLA-A*68:02 характерно взаимодействие с пептидами, которые имеют структуры, указанные в БД The Immune Epitope Database (IEDB) (https://www.iedb.org/mhc/231).

Все ключевые остатки данных консенсусных последовательностей, выполняющих роль «гидрофобного якоря» для связывания с HLA (в девятом, втором и, в одном случае, первом положении), обнаруживаются у всех соответствующих эпитопов (за исключением RLDKVEAEV) всех рассматриваемых коронавирусов (здесь и далее подчеркиванием выделены совпадающие с SARS-CoV-2 остатки, жирным шрифтом - ключевые остатки для связывания с HLA):

По данным IEDB, остальные аминокислотные вариации последовательностей разных штаммов либо не оказывают заметного влияния на связывание с соответствующим HLA, либо дополнительно усиливают взаимодействие с ним (например, для HLA-A*02:01, замена четвертого остатка лизина в RLDKVEAEV у SARS-CoV-2 на остаток аспарагина у HKU1 и аланина у ОС43; или замена седьмого остатка лизина в ALNTLVKQL у SARS-CoV-2 на остаток серина или глутамина у остальных штаммов). Подробные карты эффективности связывания для каждого остатка аминокислоты в каждом положении антигена размещены на сайте IEDB: HLA-A*02:01 (www.iedb.org/motif_output/HLA-A-02:01-9.html), HLA-A*02:02 (www.iedb.org/motif output/HLA-A-02:02-9.htmn. HLA-A*02:03 (www.iedb.org/motif output/HLA-A-02:03-9.htmn, HLA-A*02:06 (www.iedb.org/motif output/HLA-A-02:06-9.html), HLA-A*68:02 (www.iedb.org/motif output/HLA-A-68:02-9.html).

Еще одним консервативным С-концевым участком гликопротеина S, использованным в настоящем изобретении, является последовательность KNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWL (1191-1218 а.о. у SARS-CoV-2):

Этот участок в том числе включает использованные в изобретении фрагменты NLNESLIDL (IEDB ID: 44814) и YEQYIKWPWY (IEDB ID: 73751). Для NLNESLIDL описано связывание с HLA-А*02:01 (консенсусную последовательность связываемого антигена см. выше), для YEQYIKWPWY - с HLA-B* 18:01, HLA-B*40:01, HLA-B*44:02, HLA-B*44:03 и HLA-B*45:01, но консенсусные последовательности антигена описаны только для HLA-B*44:03 и HLA-B*45:01.

Для HLA-B*44:03 характерно взаимодействие с пептидами, которые имеют структуры, указанные в БД The Immune Epitope Database (IEDB) (https://vAvw.iedb.org/mhc/34).

Для HLA-B*45:01 характерно взаимодействие с пептидами, которые имеют структуры, указанные в БД The Immune Epitope Database (IEDB) (https:// www. iedb.org/mhc/36).

Все ключевые остатки данных консенсусных последовательностей, выполняющих роль «гидрофобного якоря» для связывания с HLA, либо обнаруживаются у всех соответствующих эпитопов всех рассматриваемых коронавирусов (за исключением MERS), либо совпадают с таковыми у SARS-CoV-2:

По данным IEDB, остальные аминокислотные вариации последовательностей разных штаммов не оказывают заметного влияния на связывание с соответствующим HLA (www.iedb.org/motif_output/HLA-A-02:01-9.html; www.iedb.org/motif_output/HLA-B-44:03-10.html; www.iedb.org/motif output/HLA-B-45:01-10.html).

Также в С-концевом районе гликопротеина S расположены использованные в изобретении фрагменты APHGVVFLHVTYV (1056-1068 а.о. у SARS-CoV-2) и FIAGLIAIV (1220-1228 а.о. у SARS-CoV-2).

Для иммуногенных последовательностей VVFLHVTYV (IEDB ID: 71663) и FIAGLIAIV (IEDB ID: 16156) описано связывание с HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:06, HLA-A*68:02 (консенсусные последовательности связываемых антигенов см. выше).

Оба фрагмента обладают низкой консервативностью среди большинства коронавирусов, но сохраняют гомологию с отдельными штаммами (VVFLHVTYV SARS-CoV-2 с последовательностью альфа-коронавируса 229Е; FIAGLIAIV - с последовательностью MERS):

По данным IEDB, незначительные аминокислотные вариации последовательностей разных штаммов не оказывают заметного влияния на связывание с соответствующим HLA (карты эффективности связывания антигенов см. выше).

Из использованных в изобретении последовательностей нуклеопротеина коронавируса SARS-CoV-2 наиболее консервативным является фрагмент 104-118 а.о. (LSPRWYFYYLGTGPE): совпадение с последовательностями бета-коронавирусов HKU1 и ОС43 достигает 92.8%, с последовательностями MERS - 86.7%:

Общая последовательность в том числе включает в себя антигенный фрагмент SPRWYFYYL (IEDB ID: 60242), для которого описано связывание с HLA группы В: HLA-В*07:02, HLA-B*51:01, HLA-B*53:01, HLA-B*54:01. Консенсусные последовательности связываемого антигена описаны только для HLA-B*07:02 и HLA-B*51:01:

Для HLA-B*07:02 характерно взаимодействие с пептидами, которые имеют структуры, указанные в БД The Immune Epitope Database (IEDB) (https://www.iedb.org/mhc/251).

Для HLA-B*51:01 характерно взаимодействие с пептидами, которые имеют структуры, указанные в БД The Immune Epitope Database (IEDB) (https://www.iedb.org/mhc/40).

Ключевые остатки, выполняющие роль «гидрофобного якоря» для связывания с HLA (во втором и девятом положениях), остаются неизменными в последовательностях всех рассматриваемых коронавирусов (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, HKU1, ОС43, 229Е, NL63), а остальные замены значительного влияния на связывание не оказывают, кроме остатка пролина в первом положении для NL63, затрудняющего связывание с HLA-B*07:02 (https://ww.iedb.org/motif_output/HLA-B-07:02-9.html; https://www.iedb.org/motif output/HLA-B-51:01-9.html):

Для некоторых из использованных в изобретении фрагментов (ALNTLVKQL, VLNDILSRL, FIAGLIAIV) показан высочайший уровень консервативности среди широкого спектра известных коронавирусов: до 100% гомологии у 21 штамма коронавирусов летучих мышей, панголинов и циветт [Prakash S, Srivastava R, Coulon PG, et al. Genome-Wide В Cell, CD4+, and CD8+ T Cell Epitopes That Are Highly Conserved between Human and Animal Coronaviruses, Identified from SARS-CoV-2 as Targets for Preemptive Pan-Coronavirus Vaccines. J Immunol. 2021; 206(11):2566-2582. doi:10.4049/jimmunol.2001438. Supplementary 1], что позволяет рассчитывать на формирование клеток памяти против новых случаев зоонозных пандемий коронавирусов в будущем. На фигуре 19 представлено сравнение последовательностей фрагментов гликопротеина S различных коронавирусов и указан процент идентичности.

Точная оценка эффективности активации иммунной системы против широкого спектра коронавирусов затруднена оценкой схожести процессинга антигена для последовательностей белков разных коронавирусов из-за большого количества индивидуальных факторов, таких как разная вероятность образования иммунопротеасом с отличающейся протеолитической активностью в зависимости от интенсивности интерферонового ответа на вирус [Neefjes, J., Jongsma, М., Paul, P. et al. Towards a systems understanding of MHC class I and MHC class II antigen presentation. Nat Rev Immunol 11, 823-836 (2011). https://doi.org/10.1038/nri30841 [Seifert U, Bialy LP, Ebstein F, et al. Immunoproteasomes preserve protein homeostasis upon interferon-induced oxidative stress. Cell. 2010; 142(4):613-624. doi:10.1016/j.cell.2010.07.036], а также слабой изученностью данного вопроса. Тем не менее, в большинстве случаев последовательности, фланкирующие ключевые иммуногенные фрагменты коронавирусов, использованных в данном изобретении, также крайне схожи между собой.

Таким образом, использование вакцины, содержащей антигенные кассеты настоящего изобретения, может сформировать устойчивый клеточный иммунитет к SARS-CoV-2 и SARS-CoV-1 в равной степени, а также на все известные на момент публикации изобретения региональные варианты SARS-CoV-2, включая «британский» штамм SARS-CoV-2 В. 1.1.7, «бразильский» штамм SARS-CoV-2 Р.1, «южноафриканский» штамм SARS-CoV-2 В. 1.351 и «индийский» штамм SARS-CoV-2 В. 1.617.2 (варианты). Например, известно, что у более чем 70% переболевших COVID-19 обнаруживаются активированные Т-лимфоциты, распознающие эпитоп RLQSLQTYV [Shomuradova AS, Vagida MS, Sheetikov SA, et al. SARS-CoV-2 Epitopes Are Recognized by a Public and Diverse Repertoire of Human T Cell Receptors. Immunity. 2020; 53(6):1245-1257.e5. doi:10.1016/j.immuni.2020.11.004] [Liao, M., Liu, Y., Yuan, J. et al. Single-cell landscape of bronchoalveolar immune cells in patients with COVID-19. Nat Med 26, 842-844 (2020). https://doi.Org/10.1038/s41591-020-0901-91, входящий в состав антигенных кассет настоящего изобретения.

Помимо этого, для всех вышеописанных антигенных фрагментов, использованных в настоящем изобретении, не только показана высокая степень схожести с аналогичными фрагментами других штаммов семейства коронавирусов во взаимодействии с HLA разных групп, но и экспериментально подтверждена индукция Т-клеточного иммунитета с последующей активацией интерферонового ответа, что дает основания предполагать возможность формирования клеточного иммунитета также против потенциально пандемического штамма MERS и штаммов, вызывающих сезонные ОРВИ (бета-коронавирусов HKU1 и ОС43, альфа-коронавирусов 229Е и NL63).

Вышеуказанное расчеты подтверждаются последними научными публикациями в ведущих научных журналах. Например, в статье [Katja G. Schmidt et al., SARS-CoV-2-Seronegative Subjects Target CTL Epitopes in the SARS-CoV-2 Nucleoprotein Cross-Reactive to Common Cold Coronaviruses; Front Immunol. 2021; 12: 627568; doi: 10.3389/fimmu.2021.627568] показан кросс-реактивный клеточный иммунный ответ на SARS-CoV-2 и бета-коронавирусы, вызывающие ОРВИ человека: ОС43 и HKU1. В частности, подавляющее большинство Т-лимфоцитов, распознающих эпитопы из фрагмента DLSPRWYFYYL SARS-CoV-2, использованного в изобретении, показывало выраженный интерфероновый ответ и на пептид QLLSPRWYFYYL из белков ОС43 и HKU1. Также, в статье [Kevin О. Saunders ET ALL., Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses, Nature, 2021, 1-24, https://doi.org/10.1038/s41586-021-03594-0] описываются антитела от универсальной вакцины, которые успешно нейтрализовали четыре разных коронавируса. В данной статье указано, что проверка новой вакцины на наночастицах на макаках показала, что выработанные после вакцинации антитела могут эффективно нейтрализовать не только SARS-CoV-2, но и два близких коронавируса летучих мышей и SARS-1. Авторы данной статьи считают, что такая вакцина может защищать не только от SARS-CoV-2, но и от других потенциальных инфекций, которые могут перейти к человеку от животных, так как во всех случаях антитела нейтрализовывали не только SARS-CoV-2 (включая "британский" вариант В. 1.1.7, "южноафриканский" В.1.351 и "бразильский" Р.1), но и SARS-CoV-1 и два коронавируса летучих мышей.

Примеры

Для наилучшего понимания изобретения приводятся следующие примеры. Эти примеры приведены только в иллюстративных целях и не должны толковаться как ограничивающие сферу применения изобретения в любой форме.

Все публикации, патенты и патентные заявки, указанные в этой спецификации включены в данный документ путем отсылки. Хотя вышеупомянутое изобретение было довольно подробно описано путем иллюстрации и примера в целях исключения двусмысленного толкования, специалистам в данной области на основе идей, раскрытых в данном изобретении, будет вполне понятно, что могут быть внесены определенные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема прилагаемых вариантов осуществления изобретения.

Материалы и общие методы

Методы рекомбинантной ДНК

Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей. Вкратце, плазмидную ДНК нарабатывали для дальнейших манипуляций в клетках Е. coli, выращиваемых под селективным давлением с антибиотиками для того, чтобы плазмиды не терялись в клеточной популяции. Плазмидную ДНК выделяли из клеток коммерческими наборами, измеряли концентрацию и использовали для клонирования с помощью обработки эндонуклеазами рестрикции или методами ПЦР-амплификации. Фрагменты ДНК лигировали между собой с помощью лигаз и трансформировали в бактериальные клетки для отбора клонов и дальнейших наработок. Все полученные генетические конструкции подтверждали по паттернам рестрикции и полным секвенированием по Сэнгеру.

Синтез генов

Требуемые сегменты генов получали из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Генные сегменты длиной от 300 до 1000 п.н., которые фланкированы уникальными сайтами рестрикции, собирали путем ренатурации олигонуклеотидов друг на друге с последующей ПЦР-амплификацией с крайних праймеров. В результате получали смесь фрагментов, включая нужный. Фрагменты клонировали по сайтам рестрикции в промежуточные векторы, после чего последовательности ДНК субклонированных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.

Определение последовательностей ДНК

Последовательности ДНК определяли путем секвенирования по Сэнгеру. Анализ последовательностей ДНК и белков и обработку, данных о последовательностях осуществляли в программе SnapGene 4.2 и выше для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей.

Общее описание сборки и клонирования генетических конструкций, несущих рекомбинантные сегменты генома вакцинного штамма вируса гриппа на основе аттенуированного штамма A/Leningrad/134/17/57, кодирующих относящиеся к изобретению антигенные кассеты.

Все использованные в изобретении нуклеотидные последовательности, кодирующие те или иные иммуногенные фрагменты белков вируса SARS-CoV-2, а также различные служебные регуляторные последовательности, такие как сигнальные пептиды, линкеры, функциональные домены других белков, саморасщепляемые пептиды и т.д., были получены путем сборки de novo из отдельных олигонуклеотидных фрагментов длиной порядка 100 нуклеотидов, путем их ренатурации друг на друге с последующей ПЦР-амплификацией с крайних праймеров. Для оптимизации процесса сборки и стабильности итоговой вторичной структуры использовалось программное обеспечение, разработанное ЗАО «Биокад». В процессе синтеза последовательностей трансгенов к 5'- и 3'-концам молекулы были добавлены необходимые сайты рестрикции SapI или перекрытия (участки последовательности, одинаковые для вставки и вектора) длиной 20-40 нуклеотидов для дальнейшего молекулярного клонирования безлигазными методами (SLIC, метод Гибсона).

Полученные синтетические последовательности вносились в вектор для обратной генетики вируса гриппа pCIPolISapIT, содержащий последовательности того или иного сегмента генома вируса гриппа, различными методами:

1. Клонированием с помощью рестрикции и лигирования.

2. Методом одностадийного молекулярного клонирования с использованием Т4 полимеразы SLIC (sequence and ligase independent cloning), описанным повсеместно, в том числе в «Sambrook J. et al. Molecular cloning: A laboratory manual», и оптимизированным в ЗАО «Биокад».

3. Методом Гибсона.

Последовательности ДНК клонированных фрагментов подтверждали путем секвенирования векторов по методу Сэнгера.

В качестве стоп-кодонов для терминации трансляции антигенной кассеты использовалась одна из следующих последовательностей: TAATGATAA, TAAATGATTAA.

При использовании описанных рекомбинантных плазмид изобретения достигается выраженная индукция обеих ветвей иммунного ответа при сохранении функциональности вектора, в первую очередь его способности реплицироваться и многократно представлять целевые антигены SARS-CoV-2 иммунной системе.

Схемы генетических конструкций были получены с помощью программного обеспечения SnapGene и SnapGene Viewer (https://www.snapgene.com).

Пример 1. Сборка генетических конструкций, несущих рекомбинантный шестой сегмент генома штамма вируса гриппа A/Anhiu/1/2013 (H7N9), кодирующих модифицированный ген NA и антигенные кассеты.

Нуклеотидные последовательности по данному изобретению, кодирующие полиэпитопные антигенные кассеты, состоящие из комбинаций фрагментов белков гликопротеина S (или Spike) (SEQ ID NO: 1), нуклеопротеина (или Nucleoprotein) (SEQ ID NO: 3), и, при необходимости, мембранного белка (или Membrane) (SEQ ID NO: 5) бета-коронавируса SARS-CoV-2, описанные в соответствующем разделе подробного описания изобретения (конкретные варианты указаны в SEQ ID NO: 59-94), использующиеся для индукции клеточного иммунного ответа, были получены описанным выше путем синтеза de novo. В процессе синтеза последовательностей трансгенов к 5'- и 3'-концам молекулы были добавлены необходимые сайты рестрикции SapI.

Полученные последовательности были внесены методом рестрикции и лигирования, описанным выше, в универсальный вектор для обратной генетики вируса гриппа pCIPolISapIT_NA-AnhuiN9, содержащий последовательности шестого сегмента генома вируса гриппа, в том числе ген NA (N9), кодирующий нейраминидазу девятого типа штамма A/Anhiu/1/2013 (H7N9), после последнего 3'-концевого кодона белок-кодирующей части гена (etc) с сохранением открытой рамки считывания для совместной трансляции с белками модифицированного вируса гриппа, перед защитной 3'-нетранслируемой областью из 157 нуклеотидов (фигура 1).

Таким образом, при трансляции образуется полноразмерная нейраминидаза, отделяющаяся от гибридной полипептидной цепи за счет саморасщепляемого пептида Р2А, что позволяет ей выполнять свои функции в полном объеме, а также антигенная кассета, содержащая несколько целевых эпитопов SARS-CoV-2, в дальнейшем расщепляемая в протеасомах клетки на заданные эпитопы, которые затем презентируются на поверхности клетки в комплексе с белками ГКГ I класса.

Итоговые генетические конструкции имеют размер от 6333 до 6577 п.н. и отличаются только уникальными последовательностями трансгенов, указанными выше, а в остальном полностью идентичны. В качестве примера на фигуре 2 приведена карта вектора общим размером 6577 п.н., кодирующего в качестве трансгена вставку размером 597 п.н.

Конечный вектор содержит все необходимые элементы для экспрессии нативных генов вируса гриппа и целевых трансгенов, а также сборки и заданного функционирования рекомбинантного вакцинного штамма.

Пример 2. Сборка генетических конструкций, несущих рекомбинантный восьмой сегмент генома аттенуированного штамма вируса гриппа A/Leningrad/134/17/57, кодирующих модифицированный ген NS и антигенные кассеты.

Нуклеотидные последовательности данного изобретения, кодирующие рецептор-связывающий домен (RBD) белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, его производные или полиэпитопные антигенные кассеты, состоящие из комбинаций фрагментов белков гликопротеина S (или Spike) (SEQ ID NO: 1), нуклеопротеина (или Nucleoprotein) (SEQ ID NO: 3), и, при необходимости, мембранного белка (или Membrane) (SEQ ID NO: 5) бета-коронавируса SARS-CoV-2, описанные в соответствующих пунктах подробного описания изобретения (конкретные варианты указаны в SEQ ID NO: 59-94), использующиеся для индукции иммунного ответа, были получены описанным выше путем синтеза de novo. В процессе синтеза последовательностей трансгенов к 5'- и 3'-концам молекулы были добавлены необходимые перекрытия (участки последовательности, одинаковые для вставки и вектора) длиной 30-40 нуклеотидов для дальнейшего молекулярного клонирования безлигазными методами.

Полученные последовательности были внесены методом Гибсона, описанным выше, в универсальный вектор для обратной генетики вируса гриппа pCIPolISapIT_NS-Lenl7, содержащий последовательность восьмого сегмента генома вируса гриппа, в том числе модифицированного гена NS от донора аттенуации A/Leningrad/134/17/57.

С учетом сложного строения и регуляции альтернативного сплайсинга гена NS, а также важности белков NS1 и NS2 (NEP) для полноценного функционирования вируса гриппа, при данном клонировании может быть использована следующая схема:

Целевые последовательности встраиваются в первую рамку считывания, на 3'-конце от 126-го кодона кодирующей белок NS1 части (aag), при этом не меняя регуляторные последовательности гена NS, управляющие его сплайсингом (фигура 3).

В любом случае, при трансляции образуется три отдельных полипептидных цепи: укороченная версия белка NS1 (1-126 а.о.), полноценно выполняющая необходимые функции для поддержания репликативной активности рекомбинантного вируса гриппа, составляющего основу изобретения; полноразмерный белок NS2; а также последовательность целевой вставки, кодирующая комбинацию фрагментов белков гликопротеина S (или Spike) (SEQ ID NO: 1), нуклеопротеина (или Nucleoprotein) (SEQ ID NO: 3), и, при необходимости, мембранного белка (или Membrane) (SEQ ID NO: 5) бета-коронавируса SARS-CoV-2.

Активация иммунной системы при использовании описанных рекомбинантных плазмид изобретения достигается разными способами, в зависимости от используемых регуляторных элементов и функциональных доменов, описанных в разделе «Подробное описание изобретения», и в том числе включает: презентацию иммуногенных эпитопов на мембране заражаемых клеток в комплексе с белками ГКГ обоих классов.

Итоговые генетические конструкции имеют размер от 5656 до 6286 п.н. и в пределах одной схемы клонирования отличаются только уникальными последовательностями трансгенов, указанными выше, а в остальном полностью идентичны. В качестве примеров приведена карта вектора общим размером 5899 п.н., созданная по вышеуказанной схеме клонирования соответственно; кодирующая в качестве трансгена вставку размером 597 (фигура 4).

Конечные вектора содержат все необходимые элементы для экспрессии нативных генов вируса гриппа и целевых трансгенов, а также сборки и заданного функционирования рекомбинантного вакцинного штамма.

Пример 3. Сборка вакцинных кандидатов на основе аттенуированного вируса гриппа.

Рекомбинантные вирусы гриппа, несущие в своем геноме иммуногенные участки нового коронавируса SARS-CoV-2, получали на основе обратно-генетической системы, разработанной для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (Isakova-Sivak, I. et al., "Characterization of reverse genetics-derived cold-adapted master donor virus A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) and reassortants with H5N1 surface genes in a mouse model.", 2014, Clin Vaccine Immunol 21(5): 722-731 и Isakova-Sivak, I. et al., "Genetic bases of the temperature-sensitive phenotype of a master donor virus used in live attenuated influenza vaccines: A/Leningrad/134/17/57 (H2N2).", 2011, Virology 412(2): 297-305). Вакцинные кандидаты получали методом электропорации сертифицированной линии клеток Vero (WHO). В данном примере показано получение жизнеспособных рекомбинантных вирусов гриппа, несущих различные полиэпитопные кассеты коронавируса, закодированных в одном из трех генов вируса гриппа.

В опытах использовались следующие материалы:

• Плазмиды (вектор для обратной генетики вируса гриппа), со вставкой, кодирующей гены донора аттенуации живой гриппозной вакцины A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) (таблица 1).

• Плазмиды, кодирующие гены вируса гриппа A/Anhui/1/2013 (H7N9) (таблица 2).

• Плазмиды, кодирующие гены вируса гриппа A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019 (H1N1) (таблица 3).

• Плазмиды, кодирующие модифицированные гены вируса гриппа A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) (таблица 4).

• Плазмиды, кодирующие модифицированные гены вируса гриппа A/Anhui/01/2013 (H7N9) (таблица 5).

• Клеточная линия Vero

• Бессывороточная питательная среда для культивирования клеток

• Реагент для диссоциации клеток Раствор антибиотика-антимикотика

• Добавка для роста клеток

• Трипсин

• Флакон для адгезионных клеточных культур

• Фосфатно-солевой раствор Дальбекко

• 6-луночный планшет для культур клеток

• Этанол 70%

• Трис-ЭДТА буфер

• Натрий-ацетатный буфер, содержащий 3 М NaOAc (рН 4.8). Для приготовления буфера смешать 95 мл 100% этанола с 4 мл 3 М NaOAc (рН 4.8) и 1 мл стерильной воды. Перемешать переворачиванием флакона и хранить на -20. Для подготовки 10 мл 3 М NaOAc раствора растворить 4.08 г NaOAc*3H₂O в 8.38 мл H2O до полного растворения

• Система трансфекции

• Набор реагентов для проведения процедуры электропорации

• 10-11-дневные развивающиеся куриные эмбрионы (SPF)

• Планшеты 96-луночные круглодонные для иммунологических реакций

• Фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Подготовка клеточной линии Vero. Клеточную линию Vero выводили из криохранилища заблаговременно. Для этого клетки, извлеченные из криохранилища, отмывали от диметилсульфоксида в 10 мл разогретой среды А, центрифугировали при 1500 rpm 20°C в течение 15 минут, затем вносили осадок клеток во флакон для культивирования Т-75 и добавляли среду А для культивирования, клетки инкубировали в термостате при 37°C и 5% СО₂. После достижения клеточным монослоем конфлюентности 95-100% приступали к выполнению дальнейшего протокола.

Подготовка клеток Vero к трансфекции. Готовили среду В, без добавления антибиотика, среду фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Среду А удаляли из флакона с клетками, дважды отмывали флакон теплым раствором DPBS и снимали клетки с субстрата аккутазой (1 мл на флакон Т-75), для этого в течение 1 минуты инкубировали флакон при 37°C в CO₂ инкубаторе. % клеток переносили в новый N150 флакон (Nunc), добавляли 100 мл среды В, инкубировали в течение 16-18 часов при 37°C в CO₂ инкубаторе.

На следующий день клетки снимали с субстрата аккутазой, следуя тому же протоколу. Добавляли 10 мл разогретой до 37°C среды В, переносили клетки в среде в стерильную пробирку и центрифугировали 15 минут 1500 rpm при 20°C.

Подготовка плазмид для получения вируса гриппа (сборка и концентрирование). Накануне трансфекции плазмиды, кодирующие 8 генов вируса гриппа, смешивали в 1 пробирке типа эппендорф, из расчета 2 мкг каждой плазмиды, далее добавляли 120 мкл натрий-ацетатного буфера (в случае низкой концентрации плазмид - объем буфера из расчета 2,5 объема раствора пДНК). Перемешивали на вортексе в течение 5 секунд, после чего инкубировали на -20 в течение 16-18 часов, далее приступали к протоколу концентрирования.

Для концентрирования эппендорфы с плазмидами центрифугировали при 4°C, 13.2×10³ rpm 15 минут, немедленно после центрифугирования полностью отбирали супернатант, не задевая осадок. При отсутствии осадка протокол прерывали и начинали заново с момента сборки плазмид.

В пробирки добавляли по 120 мкл 70% этанола, аккуратно воздействуя на осадок, чтобы отмыть его от стенки пробирки, при этом не ресуспендировали пипеткой. Далее центрифугировали при 4°C, 13.2×10³ rpm 5 минут, после чего полностью отбирали супернатант, не задевая осадок. Далее подсушивали осадок при комнатной температуре в течение 15 минут в пробирках с открытыми крышками для удаления остатков этанола.

Осадок ресуспендировали в 8 мкл ТЕ-буфера и приступали к протоколу трансфекции.

Трансфекции клеток Vero плазмидами, кодирующими 8 генов вируса гриппа.

Перед проведением трансфекции дозатор, кюветы Neon, аппарат для проведения электропорации помещали в ламинар и облучали УФ для обеспечения стерильности манипуляций. В 6-луночный планшет для культивирования клеток добавляли по 3 мл разогретой среды В. В кювету Neon для трансфекции наливали 3 мл буфера Е2 и помещали в аппарат для проведения электропорации (Neon Pipette Station). После центрифугирования клеток удаляли среду В и аккуратно ресуспендировали клетки в буфере R из расчета 110 мкл суспензии на 1 вирус.

110 мкл суспензии клеток Vero в буфере R добавляли в эппендорф с плазмидной ДНК (8 мкл). Аккуратно перемешивали суспензию клеток с раствором плазмид, используя дозатор Neon с одноразовым наконечником для проведения трансфекции, далее набирали суспензию в наконечник и помещали дозатор Neon в аппарат для электропорации с подготовленной кюветой. Проводили электропорацию по протоколу 1150 V, 20ms, 2 импульса. Далее суспензию раскапывали по подготовленной культуральной чашке (лунке планшета) со средой В.

После проведения электропорации, планшет помещали в CO₂ инкубатор на 37°C на 6 часов для прикрепления клеток, спустя 6 часов удаляли среду В, дважды отмывали клетки теплым раствором DPBS и добавляли по 3 мл среды С, далее планшет инкубировали при 33°C в CO₂ инкубаторе в течение 64-72 часов.

Заражение развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) материалом после трансфекции. Трансфецированные клетки Vero снимали с планшета с помощью скрепера для клеток. Клетки ресуспендировали в среде. 10-11-дневные куриные эмбрионы заражали неразведенной средой с трансфецированными клетками в объеме 0,2 мл/эмбрион по стандартной методике. Остатки трансфецированных клеток в питательной среде переносили в виалу и хранили на -70°C. Эмбрионы инкубировали при температуре 33°C в термостате.

Детекция вируса в реакции гемагглютинации.

Спустя 72 часа эмбрионы охлаждали в течение 3 часов при температуре +4°C и вскрывали скорлупу для отбирания хориоаллантоисной жидкости (ХАЖ). В 7 рядов 96-луночного круглодонного планшета для иммунологических реакций вносили по 50 мкл PBS, в верхний ряд по 100 мкл ХАЖ из каждого эмбриона. Титровали по 50 мкл двукратными разведениями в 7 рядах, после чего добавляли в каждую лунку планшета по 50 мкл суспензии 1% куриных эритроцитов. Наличие вируса фиксировали через 20-30 минут по наличию агглютинации эритроцитов в лунках. Титр вируса по гемагглютинации определяли по последнему разведению вируса, в котором наблюдалась агглютинация эритроцитов.

Слепой пассаж. В случае, если ни в одной лунке не наблюдалась агглютинация эритроцитов, по 0,3 мл ХАЖ из каждого эмбриона пассажа Е1 шприцом переносилась в новый эмбрион для возможного накопления вируса при недостаточном для детекции количества. Эмбрионы инкубировали в течение 72 часов при температуре 33°C. Всего после каждой трансфекции предпринималось до 3 последовательных слепых пассажей.

Накопление и клонирование вируса в РКЭ. В случае, если агглютинация эритроцитов была детектирована, ХАЖ собирали, осветляли низкоскоростным центрифугированием (3000 rpm, 15 мин), аликвотили в виалы по 1 мл и хранили на -70°C. Далее производилось клонирование вируса в РКЭ методом предельных разведений, из отдельных клонов стерильно собирали ХАЖ в отдельные виалы. Далее на основе одного из клонов, не содержащего мутаций, копили рабочий сток вируса методом титрования в РКЭ.

Контроль сборки вируса методом ПЦР и секвенирования. Для контроля сборки вируса в первом пассаже, в котором было обнаружено наличие вируса методом гемагглютинации, из 140 мкл ХАЖ выделяли РНК для проверки наличия у вируса специфической вставки в ген (гены) методом ПЦР со специфическими праймерами. Анализ отдельных клонов производился методом ПЦР с последующим сэнгеровским секвенированием последовательности гена, содержащего вставку. Рабочий сток также анализировали методом секвенирования.

В таблице 6 приведен список вакцинных кандидатов, сборка которых производилась, с датами трансфекции и данными о результате сборки. В последнем столбце таблицы приведены данные о дате получения рабочего стока, а также данные о тех кандидатах, работа с которыми была прекращена на раннем этапе по различным причинам.

С использованием указанного дизайна конструкций сборка химерных вирусов гриппа прошла успешно. Кассеты данного размера, встроенные в данные участки генов вируса гриппа, не мешают сборке жизнеспособного вируса гриппа.

Пример 4. Индукция гуморального иммунного ответа к вирусу гриппа при интраназальной иммунизации мышей

Вакцинные вирусы накапливали в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Инфекционную активность вирусов определяли в РКЭ методом предельных разведений, вычисляли по методу Reed&Muench и выражали в 50%-ных эмбриональных инфекционных дозах (ЭИД₅₀). Оценку иммуногенных свойств вакцинных кандидатов ЖГВ H7N9, несущих полиэпитопные Т-клеточные кассеты от вируса SARS-CoV-2, в отношении вируса гриппа проводили в экспериментах на трансгенных мышах линии HLA-A2.1 RANDOM TRANSGENIC (Taconic, США). Проводили два независимых эксперимента с вакцинными вирусами, указанными в Таблице 7. В первом опыте изучалась иммуногенность четырех рекомбинантных вирусов гриппа со вставками фрагментов SARS-CoV-2, в сравнении с векторным контролем - штаммом ЖГВ H7N9 [PMID: 30903496]. Отрицательным контролем служили мыши, получившие препарат плацебо (физиологический раствор, PBS). Во втором эксперименте изучалась иммуногенность одного рекомбинантного штамма в сравнении с векторным контролем группой плацебо. В каждую группу входило 6 мышей в возрасте 6-10 недель. Животных иммунизировали интраназально вакцинными вирусами в дозе 10⁶ ЭИД₅₀, двукратно, с интервалом 21 день, в объеме 50 мкл/мышь под легкой ингаляционной анестезией препаратом изофлюран.

Сыворотки крови мышей собирали через 10 дней после второй иммунизации и оценивали уровни антител к гриппу в иммуноферментном анализе (ИФА). В качестве антигена в ИФА использовали цельный вирус гриппа ЖГВ H7N9, очищенный на градиенте плотности сахарозы, в концентрации 50 нг/лунку. Планшеты с антигеном трижды промывали раствором PBS с 0.05% Tween 20 (PBS-T), после чего проводили блокировку неспецифического связывания 1%-ным раствором BSA на PBS. Двукратные разведения сывороток на PBS вносили в лунки планшетов в объеме 50 мкл, начиная с разведения 1:100. После инкубации 1 час при 37°C планшеты промывали 3 раза PBS-T, вносили 50 мкл вторичных антител против IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich А9044, США), разведенных 1:10000. После 30-минутной инкубации планшеты промывали 4 раза раствором PBS-T, просушивали и добавляли 50 мкл субстрата ТМВ (1-Step™ Ultra TMB-ELISA Substrate Solution, Thermo, США). Планшеты инкубировали в темном месте в течение 5-10 мин, затем реакцию останавливали 25 мкл 1М серной кислоты. Результаты считывали на спектрофотометре xMark Microplate (BIORAD) при длине волны 450 нм. В результате эксперимента определяли уровни вырабатываемых IgG антител по параметру «площадь под кривой» оптической плотности (Area Under the Curve, AUC), который вычисляли по правилу трапеций отдельно для каждой сыворотки. Визуализацию полученных результатов и статистическую обработку проводили с помощью GraphPad Prism 5. Статистическую разницу между группами определяли методом однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с последующим множественным сравнением по критерию Тьюки.

На фигурах 5-8 приведены результаты оценки уровней IgG антител к цельному вирусу гриппа. Все вакцинные варианты индуцировали высокие уровни aHTH-H7N9 IgG антител, достоверно отличаясь от контрольной группы PBS (р<0.0001). Кроме того, рекомбинантные вирусы, содержащие полиэпитопные кассеты от вируса SARS-CoV-2, были более иммуногенны по сравнению с контрольным вакцинным штаммом ЖГВ H7N9, использованным в качестве вирусного вектора. Эти данные указывают на усиление иммуногенных свойств живой гриппозной вакцины в отношении вируса гриппа при встраивании в геном вакцинного штамма полиэпитопных Т-клеточных кассет нового коронавируса, при этом независимо от того, какой из участков генома вируса гриппа был модифицирован (ген NA или ген NS1).

Пример 5. Оценка уровней вирус-специфических Т-клеток памяти в in vitro тесте на мононуклеарах периферической крови добровольцев, перенесших COVID-19 в естественных условиях.

Данный эксперимент предназначен для подтверждения правильного процессинга встроенных в геном вакцинного вируса гриппа полиэпитопных Т-клеточных кассет SARS-CoV-2 иммунными клетками человека. Поскольку у COVID-19 реконвалесцентов присутствует пул Т-клеток памяти к различным эпитопам нового коронавируса, инкубация in vitro РВМС этих доноров с вакцинными кандидатами может дать представление о способности рекомбинантных вирусов экспрессировать встроенные Т-клеточные эпитопы и, соответственно, стимулировать пролиферацию SARS-CoV-2-специфических Т клеток. Обязательным условием постановки эксперимента является параллельная стимуляция мононуклеарных клеток исследуемым рекомбинантный вирусом и классическим штаммом ЖГВ, использованным в качестве вирусного вектора. Разница в уровнях субпопуляций Т клеток после такой стимуляции позволит судить об активации Т клеток к встроенным Т-клеточным эпитопам коронавируса. Было проведено два независимых эксперимента с рекомбинантными вирусами гриппа и векторным контролем (Таблица 8). Вирусы были накоплены в РКЭ и очищены на градиенте плотности сахарозы для очистки вируссодержащей жидкости от куриных белков. Инфекционный титр очищенного вируса гриппа определяли в РКЭ десятикратными разведениями вируса в 3-5 повторах по методике Reed & Meunch [1938] и выражали в 50% эмбриональных инфекционных дозах на мл (ЭИД₅₀/мл).

В эксперименте 1 участвовало 13 добровольцев, в эксперименте 2-17 добровольцев. Демографические данные участников приведены в Таблице 9. Наличие COVID-19 в анамнезе было подтверждено положительным тестом на вирусную РНК в мазках (метод ОТ-ПЦР в режиме реального времени) и/или наличием SARS-CoV-2-специфических IgG антител в сыворотках крови (метод ИФА к белку RBD SARS-CoV-2). Эксперимент был одобрен на заседании Локального этического комитета ФГБНУ «ИЭМ» (выписка из протокола заседания ЛЭК №2/20 от 07.04.2020 г.), и все добровольцы подписали информированное согласие на проведение исследования. Кроме того, в качестве отрицательного контроля использовались образцы РВМС от добровольцев, никогда не контактировавших с вирусом SARS-CoV-2 (подтвержденное отсутствие антител к коронавирусу в ИФА).

Для получения культуры РВМС цельную кровь COVID-19 реконвалесцентов забирали в вакуумные пробирки с ЭДТА, затем смешивали с раствором Хенкса в соотношении 1:1 и выделяли путем центрифугирования на градиенте плотности фиколла. Выделенную фракцию мононуклеарных клеток ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей антибиотик-антимикотик, 10 мМ HEPES, β-меркаптоэтанол и 20 U Ронколейкина, и полученную суспензию в концентрации 4×10⁷ кл/мл использовали для стимуляции исследуемыми вирусами (50 мкл/лунку клеточной взвеси или 2×10⁶ клеток на пробу). Для стимуляции клеток использовали очищенные вирусы гриппа, а также форбол и иономицин в качестве положительного контроля. Вакцинные кандидаты добавляли в лунки планшета с лимфоцитами в объеме 50 мкл с множественностью заражения 3 (количество инфекционных единиц на клетку), после чего клетки инкубировали в среде, содержащей 30% эмбриональной бычьей сыворотки, в течение 16-18 часов при 37°C и 5% CO₂. Внутриклеточное окрашивание цитокинов, индуцированных антигенной стимуляцией, проводили в несколько этапов: остановка белкового транспорта клетки, покраска поверхностных антигенов, фиксация и пермеабилизация клеток, покраска внутриклеточных антигенов - цитокинов. Для остановки белкового транспорта использовали Брефельдин А в разведении 1:1000, после чего клетки инкубировали дополнительно 5 часов при 37°C и 5% CO2 и далее проводили окрашивание поверхностных антигенов антителами к маркерам CD4, CD8, CD3, CD45RA, CCR7, а также реагентом Zombie Aqua для выявления живых клеток. Для проведения фиксации и пермеабилизации клеток добавляли (использовали) Fix/Perm буфер, и далее фиксированные и пермеабилизированные клетки окрашивали антицитокиновыми антителами к IFN-γ. После отмывки окрашенных клеток Perm Wash-буфером клетки фиксировали в CytoLast буфере и хранили в темноте при 4°C до анализа на проточном цитометре. Исследование образцов проводили на проточном цитометре Navios flow cytometer (Beckman Coulter). Обработку FACS-файлов производили в пакетах программ FlowJo software. Данные по %-ному содержанию вирус-специфических Т клеток памяти получали путем вычитания пропорции клеток со спонтанной интерферонопродукцией (нестимулированные МПК) из уровней Т клеток, выявляемых при стимуляции клеток соответствующим вирусом. Статистическую обработку результатов проводили в программном обеспечении GraphPad Prizm 7.0 методом непараметрического анализа с использованием Т-критерия Вилкоксона.

На фигурах 9-17 приведены данные, иллюстрирующие уровни IFN-γ-продуцирующих цитотоксических и/или хелперных Т-клеток памяти при стимуляции мононуклеаров периферической крови COVID-реконвалесцентов вакцинными кандидатами, в сравнении со стимуляцией контрольным вакцинным штаммом - вирусным вектором. Для рекомбинантных вирусов CoVac-13, CoVac-15, CoVac-16 было показано достоверное увеличение субпопуляции CD4+ Т-клеток эффекторной памяти (CD3+CD4+CCR7-) в сравнении с вирусным вектором (Фигуры 9-11). Для рекомбинантных вирусов CoVac-17, CoVac-29, CoVac-30, CoVac-31, CoVac-32 и CoVac-30, было показано достоверное увеличение как субпопуляции Т-хэлперов (CD4+), так и субпопуляции цитотоксических (CD8+) Т-клеток эффекторной памяти в сравнении с вирусным вектором (Фигуры 12-17).

Стимуляция мононуклеарных клеток двух доноров крови, не встречавшихся ранее с SARS-CoV-2, всеми исследованными рекомбинантными вирусами не приводила к достоверному увеличению секреции IFN-γ хэлперными или цитотоксическими Т-клетками памяти, по сравнению со стимуляцией вирусным вектором ЖГВ H7N9 (Фигура 18), что подтверждает специфичность использованного метода для оценки процессинга человеческими иммунными клетками полиэпитопных кассет SARS-CoV-2, встроенных в геном вируса гриппа.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЗАО "БИОКАД"

ФГБНУ «ИЭМ»

<120> Выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа для

индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или

профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа

<160> 124

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> Природная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность гликопротеина S вируса

SARS-CoV-2

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu

1010 1015 1020

Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val

1025 1030 1035 1040

Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala

1045 1050 1055

Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu

1060 1065 1070

Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His

1075 1080 1085

Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val

1090 1095 1100

Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr

1105 1110 1115 1120

Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr

1125 1130 1135

Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

1140 1145 1150

Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp

1155 1160 1165

Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

1170 1175 1180

Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu

1185 1190 1195 1200

Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile

1205 1210 1215

Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile

1220 1225 1230

Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val

1250 1255 1260

Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

<210> 2

<211> 3819

<212> DNA

<213> Природная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая гликопротеин S вируса

SARS-CoV-2

<400> 2

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc

60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac

120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc

180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat

240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata

300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt

360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt

420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat

480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa

540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat

600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt

660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact

720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct

780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat

840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag

900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc

960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa

1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac

1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat

1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt

1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat

1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat

1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat

1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt

1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact

1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca

1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat

1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg

1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag

1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca

1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc

1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct

1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat

1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct

2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt

2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt

2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg

2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt

2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa

2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt

2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat

2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc

2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt

2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt

2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg

2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa

2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc

2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac

2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc

2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga

3000

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct

3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt

3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta

3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc

3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca

3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca

3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct

3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca

3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa

3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc

3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt

3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc

3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac

3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacaca

3819

<210> 3

<211> 419

<212> PRT

<213> Природная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность нуклеопротеина вируса

SARS-CoV-2

<400> 3

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln

145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 4

<211> 1257

<212> DNA

<213> Природная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеопротеин вируса SARS-CoV-2

<400> 4

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc

60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt

120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc

180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca

240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa

300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga

360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat

420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa

480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt

540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc

600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct

660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa

720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa

780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa

840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat

900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt

960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat

1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac

1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa

1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg

1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcc

1257

<210> 5

<211> 222

<212> PRT

<213> Природная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность мембранного белка вируса

SARS-CoV-2

<400> 5

Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu

1 5 10 15

Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile

20 25 30

Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile

35 40 45

Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys

50 55 60

Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile

65 70 75 80

Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe

85 90 95

Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe

100 105 110

Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile

115 120 125

Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile

130 135 140

Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp

145 150 155 160

Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu

165 170 175

Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly

180 185 190

Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr

195 200 205

Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln

210 215 220

<210> 6

<211> 666

<212> DNA

<213> Природная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая мембранный белок вируса

SARS-CoV-2

<400> 6

atggcagatt ccaacggtac tattaccgtt gaagagctta aaaagctcct tgaacaatgg

60

aacctagtaa taggtttcct attccttaca tggatttgtc ttctacaatt tgcctatgcc

120

aacaggaata ggtttttgta tataattaag ttaattttcc tctggctgtt atggccagta

180

actttagctt gttttgtgct tgctgctgtt tacagaataa attggatcac cggtggaatt

240

gctatcgcaa tggcttgtct tgtaggcttg atgtggctca gctacttcat tgcttctttc

300

agactgtttg cgcgtacgcg ttccatgtgg tcattcaatc cagaaactaa cattcttctc

360

aacgtgccac tccatggcac tattctgacc agaccgcttc tagaaagtga actcgtaatc

420

ggagctgtga tccttcgtgg acatcttcgt attgctggac accatctagg acgctgtgac

480

atcaaggacc tgcctaaaga aatcactgtt gctacatcac gaacgctttc ttattacaaa

540

ttgggagctt cgcagcgtgt agcaggtgac tcaggttttg ctgcatacag tcgctacagg

600

attggcaact ataaattaaa cacagaccat tccagtagca gtgacaatat tgctttgctt

660

gtacag

666

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента из гликопротеина S

вируса SARS-CoV-2

<400> 7

Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 8

Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val

1 5

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 9

Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 10

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 11

Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 12

Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu

1 5

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 13

Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

1 5 10

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 14

Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu

1 5

<210> 15

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента из нуклеопротеина

вируса SARS-CoV-2

<400> 15

Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 16

Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu

1 5 10

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 17

Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 18

Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu

1 5

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 19

Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro

1 5 10

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 20

Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val

1 5

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

вируса SARS-CoV-2

<400> 21

Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala

1 5

<210> 22

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента из мембранного

белка

вируса SARS-CoV-2

<400> 22

Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala

1 5 10 15

Ala Val Tyr Arg Ile

20

<210> 23

<211> 113

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 1

<400> 23

Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu

1 5 10 15

Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg

20 25 30

Ile Asn Trp Val Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg

35 40 45

Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala

50 55 60

Lys Asn Leu Asn Glu Ser Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala

65 70 75 80

Ile Val Met Val Thr Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu

85 90 95

His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro

100 105 110

Ala

<210> 24

<211> 92

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 2

<400> 24

Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn

1 5 10 15

Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile

20 25 30

Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala

35 40 45

Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala

50 55 60

Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val

65 70 75 80

Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly Ala

85 90

<210> 25

<211> 92

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 3

<400> 25

Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met

1 5 10 15

Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr

20 25 30

His Gly Ala Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys

35 40 45

Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu

50 55 60

Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly

65 70 75 80

Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys

85 90

<210> 26

<211> 115

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 4

<400> 26

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

1 5 10 15

Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys

20 25 30

Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile

35 40 45

Val Met Val Thr Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr

50 55 60

Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr

65 70 75 80

Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu

85 90 95

Ser Lys Met Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr

100 105 110

Val Pro Ala

115

<210> 27

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 5

<400> 27

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

1 5 10 15

Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys

20 25 30

Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile

35 40 45

Val Met Val Thr Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp

50 55 60

Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Ala Pro His Gly Val Val

65 70 75 80

Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Lys Leu Ile Phe

85 90 95

Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala

100 105 110

Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly

115 120

<210> 28

<211> 96

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 6

<400> 28

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

1 5 10 15

Ser Leu Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro

20 25 30

Ala Gln Glu Lys Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr

35 40 45

Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr

50 55 60

Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu

65 70 75 80

Ser Lys Met Ser Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr

85 90 95

<210> 29

<211> 96

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 7

<400> 29

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

1 5 10 15

Ser Leu Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro

20 25 30

Ala Gln Glu Lys Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu

35 40 45

Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile

50 55 60

Val Met Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala

65 70 75 80

Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly

85 90 95

<210> 30

<211> 101

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 8

<400> 30

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

1 5 10 15

Ser Leu Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro

20 25 30

Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala

35 40 45

Ile Val Met Val Thr Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg

50 55 60

Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp

65 70 75 80

Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn

85 90 95

Trp Ile Thr Gly Gly

100

<210> 31

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 9

<400> 31

Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu

1 5 10 15

Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile

20 25 30

Asn Trp Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn

35 40 45

Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile

50 55 60

Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala

65 70 75 80

Ile Val Met Val Thr Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

85 90 95

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Ala Pro His Gly Val

100 105 110

Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala

115 120

<210> 32

<211> 122

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 10

<400> 32

Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg

1 5 10 15

Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr

20 25 30

Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu

35 40 45

Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala

50 55 60

Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Lys

65 70 75 80

Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val

85 90 95

Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

100 105 110

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

115 120

<210> 33

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 11

<400> 33

Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg

1 5 10 15

Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Arg Ser Gly Ala Arg

20 25 30

Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp

35 40 45

Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Gly Tyr Gln Pro

50 55 60

Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr

65 70 75 80

Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile

85 90 95

Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala

100 105 110

Glu Gly Ser Arg Gly Gly

115

<210> 34

<211> 116

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 12

<400> 34

Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg

1 5 10 15

Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Asp Lys Asp Pro Asn Phe

20 25 30

Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Gly Lys Leu

35 40 45

Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys

50 55 60

Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile

65 70 75 80

Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu

85 90 95

Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu

100 105 110

Ile Arg Ala Ala

115

<210> 35

<211> 104

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 13

<400> 35

Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys

1 5 10 15

His Ile Asp Ala Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln

20 25 30

Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Thr Glu

35 40 45

Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala

50 55 60

Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro

65 70 75 80

Lys Gly Phe Tyr Ala Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser

85 90 95

Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

100

<210> 36

<211> 114

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 14

<400> 36

Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys

1 5 10 15

His Ile Asp Ala Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg

20 25 30

Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu

35 40 45

Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

50 55 60

Val Leu Ser Phe Glu Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His

65 70 75 80

Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu

85 90 95

Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg

100 105 110

Gly Gly

<210> 37

<211> 117

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 15

<400> 37

Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys

1 5 10 15

His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Asp Gly Lys Met Lys Asp

20 25 30

Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Lys

35 40 45

Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val

50 55 60

Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp

65 70 75 80

Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg

85 90 95

Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln

100 105 110

Leu Ile Arg Ala Ala

115

<210> 38

<211> 147

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 16

<400> 38

Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg

1 5 10 15

Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Arg Gln Gly Thr Asp

20 25 30

Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala

35 40 45

Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr

50 55 60

Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn

65 70 75 80

Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys

85 90 95

Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu

100 105 110

Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile

115 120 125

Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile

130 135 140

Arg Ala Ala

145

<210> 39

<211> 161

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 17

<400> 39

Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg

1 5 10 15

Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr

20 25 30

Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu

35 40 45

Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala

50 55 60

Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Ala

65 70 75 80

Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser

85 90 95

Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu

100 105 110

Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr

115 120 125

Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Gly Tyr

130 135 140

Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro

145 150 155 160

Ala

<210> 40

<211> 174

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 18

<400> 40

Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg

1 5 10 15

Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Arg Gln Gly Thr Asp

20 25 30

Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala

35 40 45

Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr

50 55 60

Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn

65 70 75 80

Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys

85 90 95

Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln

100 105 110

Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe

115 120 125

Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys

130 135 140

Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln

145 150 155 160

Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala

165 170

<210> 41

<211> 135

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 1 и саморасщепляемого

пептида

<400> 41

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile Lys

20 25 30

Leu Val Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val

35 40 45

Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Val Gly Glu Thr Ala Leu Ala

50 55 60

Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Glu Ile Asp

65 70 75 80

Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Trp Leu Gly Phe

85 90 95

Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Pro Gln Ala Ala Pro

100 105 110

His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ser Gln Glu Arg

115 120 125

Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala

130 135

<210> 42

<211> 114

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 2 и саморасщепляемого

пептида

<400> 42

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

20 25 30

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly

35 40 45

Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe

50 55 60

Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Pro

65 70 75 80

Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser

85 90 95

Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His

100 105 110

Gly Ala

<210> 43

<211> 114

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 3 и саморасщепляемого

пептида

<400> 43

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala

20 25 30

Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser

35 40 45

Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly Ala Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg

50 55 60

Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln

65 70 75 80

Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp

85 90 95

Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu

100 105 110

Leu Cys

<210> 44

<211> 137

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 4 и саморасщепляемого

пептида

<400> 44

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val

20 25 30

Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys

35 40 45

Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile

50 55 60

Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Lys Leu Ile Phe Leu Trp

65 70 75 80

Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr

85 90 95

Arg Ile Asn Trp Ile Thr Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp

100 105 110

Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Ala Pro His Gly Val Val

115 120 125

Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala

130 135

<210> 45

<211> 144

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 5 и саморасщепляемого

пептида

<400> 45

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val

20 25 30

Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys

35 40 45

Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile

50 55 60

Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Gly Gly Asp Ala Ala Leu

65 70 75 80

Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser

85 90 95

Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln

100 105 110

Glu Lys Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala

115 120 125

Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly

130 135 140

<210> 46

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 6 и саморасщепляемого

пептида

<400> 46

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val

20 25 30

Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu

35 40 45

His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Lys Leu Ile Phe Leu Trp

50 55 60

Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr

65 70 75 80

Arg Ile Asn Trp Ile Thr Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp

85 90 95

Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Phe Ile Ala Gly Leu Ile

100 105 110

Ala Ile Val Met Val Thr

115

<210> 47

<211> 118

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 7 и саморасщепляемого

пептида

<400> 47

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val

20 25 30

Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu

35 40 45

His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asp Ala Ala Leu Ala Leu

50 55 60

Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Phe Ile

65 70 75 80

Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu

85 90 95

Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile

100 105 110

Asn Trp Ile Thr Gly Gly

115

<210> 48

<211> 123

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 8 и саморасщепляемого

пептида

<400> 48

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val

20 25 30

Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu

35 40 45

His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Phe

50 55 60

Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Asp Ala Ala Leu Ala

65 70 75 80

Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Lys Leu Ile

85 90 95

Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala

100 105 110

Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly

115 120

<210> 49

<211> 144

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 9 и

саморасщепляемого пептида

<400> 49

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Leu

20 25 30

Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu

35 40 45

Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

50 55 60

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly

65 70 75 80

Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe

85 90 95

Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Gly Gly Asp Ala Ala

100 105 110

Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met

115 120 125

Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala

130 135 140

<210> 50

<211> 144

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 10 и

саморасщепляемого пептида

<400> 50

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met

20 25 30

Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro

35 40 45

Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val

50 55 60

Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg

65 70 75 80

Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr

85 90 95

Thr Leu Pro Lys Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln

100 105 110

Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Gln

115 120 125

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

130 135 140

<210> 51

<211> 140

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 11 и

саморасщепляемого пептида

<400> 51

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met

20 25 30

Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro

35 40 45

Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro

50 55 60

Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu

65 70 75 80

Asp Leu Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Thr

85 90 95

Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro

100 105 110

Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu

115 120 125

Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly

130 135 140

<210> 52

<211> 138

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 12 и

Саморасщепляемого пептида

<400> 52

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met

20 25 30

Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro

35 40 45

Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His

50 55 60

Ile Asp Ala Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala

65 70 75 80

Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser

85 90 95

Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu

100 105 110

Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr

115 120 125

Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala

130 135

<210> 53

<211> 126

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 13 и

саморасщепляемого пептида

<400> 53

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln

20 25 30

Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Gly Lys Leu Gln Asp Val

35 40 45

Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser

50 55 60

Ser Asn Phe Gly Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile

65 70 75 80

Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro

85 90 95

Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Gly Tyr Gln Pro Tyr

100 105 110

Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

115 120 125

<210> 54

<211> 136

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 14 и

Саморасщепляемого пептида

<400> 54

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln

20 25 30

Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Asn Gly Glu Arg Ser Gly

35 40 45

Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala

50 55 60

Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Gly Tyr

65 70 75 80

Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Thr Glu Gly Ala Leu

85 90 95

Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala

100 105 110

Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe

115 120 125

Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly

130 135

<210> 55

<211> 139

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 15 и

саморасщепляемого

пептида

<400> 55

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln

20 25 30

Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro

35 40 45

Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu

50 55 60

Gly Thr Gly Pro Glu Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln

65 70 75 80

Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile

85 90 95

Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala

100 105 110

Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln

115 120 125

Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala

130 135

<210> 56

<211> 169

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 16 и

саморасщепляемого пептида

<400> 56

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met

20 25 30

Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro

35 40 45

Glu Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe

50 55 60

Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu

65 70 75 80

Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu

85 90 95

Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys

100 105 110

His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Ser

115 120 125

Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val

130 135 140

Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr

145 150 155 160

Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala

165

<210> 57

<211> 183

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 17 и

саморасщепляемого пептида

<400> 57

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met

20 25 30

Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro

35 40 45

Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val

50 55 60

Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg

65 70 75 80

Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr

85 90 95

Thr Leu Pro Lys Gly Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser

100 105 110

Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu

115 120 125

Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg

130 135 140

Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala

145 150 155 160

Glu Ile Arg Ala Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe

165 170 175

Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

180

<210> 58

<211> 196

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность кассеты 18 и

саморасщепляемого пептида

<400> 58

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met

20 25 30

Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro

35 40 45

Glu Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe

50 55 60

Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu

65 70 75 80

Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu

85 90 95

Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys

100 105 110

His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Leu

115 120 125

Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys

130 135 140

Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile

145 150 155 160

Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu

165 170 175

Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu

180 185 190

Ile Arg Ala Ala

195

<210> 59

<211> 339

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 1

<400> 59

aatcggaaca ggtttttgta cataataaag cttgttttcc tctggctctt gtggccagta

60

acacttgctt gttttgtgct tgctgctgtc tacagaatta attgggtggg tgaaactgcc

120

ctcgcgctat tgctgctaga cagattgaac cagcttgaga gcaaagaaat tgaccgcctc

180

aatgaggtcg ctaaaaattt aaatgaatca tggctcggct tcattgctgg actaattgcc

240

atcgtcatgg ttacaccaca agcagccccg catggtgttg tcttcctaca tgtcacgtat

300

gtgccatccc aggagaggaa cttcaccaca gcgccagca

339

<210> 60

<211> 276

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 2

<400> 60

attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt

60

gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc

120

ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg tccgcaaatt

180

gcacaatttg ctccaagtgc ctctgcattc tttggaatgt cacgcattgg catggaagtc

240

acaccttcgg gaacatggct gacttatcat ggagcc

276

<210> 61

<211> 276

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 3

<400> 61

ccgcaaattg cacaatttgc tccaagtgcc tctgcattct ttggaatgtc acgcattggc

60

atggaagtca caccttcggg aacatggctg acttatcatg gagccattca aaaagaaatt

120

gaccgcctca atgaggtcgc taaaaattta aatgaatcac tcattgacct tcaagaattg

180

ggaaaatatg agcaatatat taaatggcct tggtatgttt ggctcggctt cattgctgga

240

ctaattgcca tcgtcatggt tacaatcttg ctttgt

276

<210> 62

<211> 345

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 4

<400> 62

caaaaagaaa ttgaccgcct caatgaggtt gccaagaatt taaatgaatc tctcatcgat

60

ctccaagaac ttggaaagta tgagcagtat ataaaatggc catggtacat ttggctaggt

120

tttatagctg gcttgattgc catagtaatg gtgacaaagt taattttcct ctggctgtta

180

tggccagtaa ctttagcttg ttttgtgctt gctgctgttt acagaataaa ttggatcacc

240

gatgctgctc ttgctttgct gctgcttgac agattgaacc agcttgagag caaaatgtca

300

gcacctcatg gtgtagtctt cttgcatgtg acttatgtcc ctgca

345

<210> 63

<211> 366

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 5

<400> 63

caaaaagaaa ttgaccgcct caatgaggtt gccaagaatt taaatgaatc tctcatcgat

60

ctccaagaac ttggaaagta tgagcagtat ataaaatggc catggtacat ttggctaggt

120

tttatagctg gcttgattgc catagtaatg gtgacaggcg gtgatgctgc tcttgctttg

180

ctgctgcttg acagattgaa ccagcttgag agcaaaatgt cagcacctca tggtgtagtc

240

ttcttgcatg tgacttatgt ccctgcacaa gaaaagaagt taattttcct ctggctgtta

300

tggccagtaa ctttagcttg ttttgtgctt gctgctgttt acagaataaa ttggatcacc

360

ggtgga

366

<210> 64

<211> 288

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 6

<400> 64

caaaaagaaa ttgaccgcct caatgaggtt gccaagaatt taaatgaatc tctcgcacct

60

catggtgtag tcttcttgca tgtgacttat gtccctgcac aagaaaagaa gttaattttc

120

ctctggctgt tatggccagt aactttagct tgttttgtgc ttgctgctgt ttacagaata

180

aattggatca ccgatgctgc tcttgctttg ctgctgcttg acagattgaa ccagcttgag

240

agcaaaatgt cttttatagc tggcttgatt gccatagtaa tggtgaca

288

<210> 65

<211> 288

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 7

<400> 65

caaaaagaaa ttgaccgcct caatgaggtt gccaagaatt taaatgaatc tctcgcacct

60

catggtgtag tcttcttgca tgtgacttat gtccctgcac aagaaaagga tgctgctctt

120

gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtcttt tatagctggc

180

ttgattgcca tagtaatgaa gttaattttc ctctggctgt tatggccagt aactttagct

240

tgttttgtgc ttgctgctgt ttacagaata aattggatca ccggtgga

288

<210> 66

<211> 303

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 8

<400> 66

caaaaagaaa ttgaccgcct caatgaggtt gccaagaatt taaatgaatc tctcgcacct

60

catggtgtag tcttcttgca tgtgacttat gtccctgcac aagaaaagaa cttcacaact

120

gcttttatag ctggcttgat tgccatagta atggtgacag atgctgctct tgctttgctg

180

ctgcttgaca gattgaacca gcttgagagc aaaaagttaa ttttcctctg gctgttatgg

240

ccagtaactt tagcttgttt tgtgcttgct gctgtttaca gaataaattg gatcaccggt

300

gga

303

<210> 67

<211> 366

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 9

<400> 67

aggaataggt ttttgtatat aattaagtta attttcctct ggctgttatg gccagtaact

60

ttagcttgtt ttgtgcttgc tgctgtttac agaataaatt ggaaagaaat tgaccgcctc

120

aatgaggttg ccaagaattt aaatgaatct ctcatcgatc tccaagaact tggaaagtat

180

gagcagtata taaaatggcc atggtacatt tggctaggtt ttatagctgg cttgattgcc

240

atagtaatgg tgacaggcgg tgatgctgct cttgctttgc tgctgcttga cagattgaac

300

cagcttgaga gcaaaatgtc agcacctcat ggtgtagtct tcttgcatgt gacttatgtc

360

cctgca

366

<210> 68

<211> 366

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 10

<400> 68

agacgaattc gtggtggtga cggtaaaatg aaagatctca gtccaagatg gtatttctac

60

tacctaggaa ctgggccaga agctggactt ccctatggtg ctaacaaaga cggcatcata

120

tgggttgcaa ctgagggagc cttgaataca ccaaaagatc acattggcac ccgcaatcct

180

gctaacaatg ctgcaatcgt gctacaactt cctcaaggaa caacattgcc aaaaggcaaa

240

cttcaagatg tggtcaacca aaatgcacaa gctttaaaca cgcttgttaa acaacttagc

300

tccaattttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca

360

ccagca

366

<210> 69

<211> 354

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 11

<400> 69

agacgaattc gtggtggtga cggtaaaatg aaagatctca gtccaagatg gtatttctac

60

tacctaggaa ctgggccaga acgcagtggg gcgcgatcaa aacaacgtcg gccccaaggt

120

ttacccaata atactgcgtc ttggttcacc gctctcactc aacatggcaa ggaagacctt

180

ggttaccaac catacagagt agtagtactt tcttttgaaa ctgagggagc cttgaataca

240

ccaaaagatc acattggcac ccgcaatcct gctaacaatg ctgcaatcgt gctacaactt

300

cctcaaggaa caacattgcc aaaaggcttc tacgcagaag ggagcagagg cggc

354

<210> 70

<211> 348

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 12

<400> 70

agacgaattc gtggtggtga cggtaaaatg aaagatctca gtccaagatg gtatttctac

60

tacctaggaa ctgggccagg aaaacttcaa gatgtggtca accaaaatgc acaagcttta

120

aacacgcttg ttaaacaact tagctccaat tttggtgcaa tttcaagtgt tttaaatgat

180

atcctttcac gtcttgacaa agttgaggct gaagtgcaaa ttgataggtt gatcacaggc

240

agacttcaaa gtttgcagac atatgtgact caacaattaa ttagagctgc agacaaagat

300

ccaaatttca aagatcaagt cattttgctg aataagcata ttgacgca

348

<210> 71

<211> 312

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 13

<400> 71

gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca tattgacgca

60

ggaaaacttc aagatgtggt caaccaaaat gcacaagctt taaacacgct tgttaaacaa

120

cttagctcca attttggtac tgagggagcc ttgaatacac caaaagatca cattggcacc

180

cgcaatcctg ctaacaatgc tgcaatcgtg ctacaacttc ctcaaggaac aacattgcca

240

aaaggcttct acgcaggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta

300

catgcaccag ca

312

<210> 72

<211> 342

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 14

<400> 72

gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca tattgacgca

60

aatggagaac gcagtggggc gcgatcaaaa caacgtcggc cccaaggttt acccaataat

120

actgcgtctt ggttcaccgc tctcactcaa catggcaagg aagaccttgg ttaccaacca

180

tacagagtag tagtactttc ttttgaaact gagggagcct tgaatacacc aaaagatcac

240

attggcaccc gcaatcctgc taacaatgct gcaatcgtgc tacaacttcc tcaaggaaca

300

acattgccaa aaggcttcta cgcagaaggg agcagaggcg gc

342

<210> 73

<211> 351

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 15

<400> 73

gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca tattgacgca

60

tacaaaacat tcccaccaga cggtaaaatg aaagatctca gtccaagatg gtatttctac

120

tacctaggaa ctgggccaga aaaacttcaa gatgtggtca accaaaatgc acaagcttta

180

aacacgcttg ttaaacaact tagctccaat tttggtgcaa tttcaagtgt tttaaatgat

240

atcctttcac gtcttgacaa agttgaggct gaagtgcaaa ttgataggtt gatcacaggc

300

agacttcaaa gtttgcagac atatgtgact caacaattaa ttagagctgc a

351

<210> 74

<211> 441

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 16

<400> 74

agacgaattc gtggtggtga cggtaaaatg aaagatctca gtccaagatg gtatttctac

60

tacctaggaa ctgggccaga aagacaagga actgattaca aacattggcc gcaaattgca

120

caatttgccc ccagcgcttc agcgttcttc ggaatgtcgc gcattggcat ggaagtcaca

180

ccttcgggaa cgtggttgac ctacacaggt gccatcaaat tggatgacaa agatccaaat

240

ttcaaagatc aagtcatttt gctgaataag catattgacg catacaaaac attcccacca

300

acagagccta aaaagagtgt tttaaatgat atcctttcac gtcttgacaa agttgaggct

360

gaagtgcaaa ttgataggtt gatcacaggc agacttcaaa gtttgcagac atatgtgact

420

caacaattaa ttagagctgc a

441

<210> 75

<211> 483

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 17

<400> 75

agacgaattc gtggtggtga cggtaaaatg aaagatctca gtccaagatg gtatttctac

60

tacctaggaa ctgggccaga agctggactt ccctatggtg ctaacaaaga cggcatcata

120

tgggttgcaa ctgagggagc cttgaataca ccaaaagatc acattggcac ccgcaatcct

180

gctaacaatg ctgcaatcgt gctacaactt cctcaaggaa caacattgcc aaaaggcgct

240

ttaaacacgc ttgttaaaca acttagctcc aattttggtg caatttcaag tgttttaaat

300

gatatccttt cacgtcttga caaagttgag gctgaagtgc aaattgatag gttgatcaca

360

ggcagacttc aaagtttgca gacatatgtg actcaacaat taattagagc tgcagaaatc

420

agagctggtt accaaccata cagagtagta gtactttctt ttgaacttct acatgcacca

480

gca

483

<210> 76

<211> 522

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 18

<400> 76

agacgaattc gtggtggtga cggtaaaatg aaagatctca gtccaagatg gtatttctac

60

tacctaggaa ctgggccaga aagacaagga actgattaca aacattggcc gcaaattgca

120

caatttgccc ccagcgcttc agcgttcttc ggaatgtcgc gcattggcat ggaagtcaca

180

ccttcgggaa cgtggttgac ctacacaggt gccatcaaat tggatgacaa agatccaaat

240

ttcaaagatc aagtcatttt gctgaataag catattgacg catacaaaac attcccacca

300

acagagccta aaaaacttca agatgtggtc aaccaaaatg cacaagcttt aaacacgctt

360

gttaaacaac ttagctccaa ttttggtgca atttcaagtg ttttaaatga tatcctttca

420

cgtcttgaca aagttgaggc tgaagtgcaa attgataggt tgatcacagg cagacttcaa

480

agtttgcaga catatgtgac tcaacaatta attagagctg ca

522

<210> 77

<211> 405

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 1 и саморасщепляемый

пептид

<400> 77

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctaatc ggaacaggtt tttgtacata ataaagcttg ttttcctctg gctcttgtgg

120

ccagtaacac ttgcttgttt tgtgcttgct gctgtctaca gaattaattg ggtgggtgaa

180

actgccctcg cgctattgct gctagacaga ttgaaccagc ttgagagcaa agaaattgac

240

cgcctcaatg aggtcgctaa aaatttaaat gaatcatggc tcggcttcat tgctggacta

300

attgccatcg tcatggttac accacaagca gccccgcatg gtgttgtctt cctacatgtc

360

acgtatgtgc catcccagga gaggaacttc accacagcgc cagca

405

<210> 78

<211> 342

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 2 и саморасщепляемый

пептид

<400> 78

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctattc aaaaagaaat tgaccgcctc aatgaggtcg ctaaaaattt aaatgaatca

120

ctcattgacc ttcaagaatt gggaaaatat gagcaatata ttaaatggcc ttggtatgtt

180

tggctcggct tcattgctgg actaattgcc atcgtcatgg ttacaatctt gctttgtccg

240

caaattgcac aatttgctcc aagtgcctct gcattctttg gaatgtcacg cattggcatg

300

gaagtcacac cttcgggaac atggctgact tatcatggag cc

342

<210> 79

<211> 342

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 3 и саморасщепляемый

пептид

<400> 79

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctccgc aaattgcaca atttgctcca agtgcctctg cattctttgg aatgtcacgc

120

attggcatgg aagtcacacc ttcgggaaca tggctgactt atcatggagc cattcaaaaa

180

gaaattgacc gcctcaatga ggtcgctaaa aatttaaatg aatcactcat tgaccttcaa

240

gaattgggaa aatatgagca atatattaaa tggccttggt atgtttggct cggcttcatt

300

gctggactaa ttgccatcgt catggttaca atcttgcttt gt

342

<210> 80

<211> 411

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 4 и саморасщепляемый

пептид

<400> 80

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctcaaa aagaaattga ccgcctcaat gaggttgcca agaatttaaa tgaatctctc

120

atcgatctcc aagaacttgg aaagtatgag cagtatataa aatggccatg gtacatttgg

180

ctaggtttta tagctggctt gattgccata gtaatggtga caaagttaat tttcctctgg

240

ctgttatggc cagtaacttt agcttgtttt gtgcttgctg ctgtttacag aataaattgg

300

atcaccgatg ctgctcttgc tttgctgctg cttgacagat tgaaccagct tgagagcaaa

360

atgtcagcac ctcatggtgt agtcttcttg catgtgactt atgtccctgc a

411

<210> 81

<211> 432

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 5 и саморасщепляемый

пептид

<400> 81

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctcaaa aagaaattga ccgcctcaat gaggttgcca agaatttaaa tgaatctctc

120

atcgatctcc aagaacttgg aaagtatgag cagtatataa aatggccatg gtacatttgg

180

ctaggtttta tagctggctt gattgccata gtaatggtga caggcggtga tgctgctctt

240

gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtcagc acctcatggt

300

gtagtcttct tgcatgtgac ttatgtccct gcacaagaaa agaagttaat tttcctctgg

360

ctgttatggc cagtaacttt agcttgtttt gtgcttgctg ctgtttacag aataaattgg

420

atcaccggtg ga

432

<210> 82

<211> 354

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 6 и саморасщепляемый

пептид

<400> 82

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctcaaa aagaaattga ccgcctcaat gaggttgcca agaatttaaa tgaatctctc

120

gcacctcatg gtgtagtctt cttgcatgtg acttatgtcc ctgcacaaga aaagaagtta

180

attttcctct ggctgttatg gccagtaact ttagcttgtt ttgtgcttgc tgctgtttac

240

agaataaatt ggatcaccga tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag

300

cttgagagca aaatgtcttt tatagctggc ttgattgcca tagtaatggt gaca

354

<210> 83

<211> 354

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 7 и саморасщепляемый

пептид

<400> 83

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctcaaa aagaaattga ccgcctcaat gaggttgcca agaatttaaa tgaatctctc

120

gcacctcatg gtgtagtctt cttgcatgtg acttatgtcc ctgcacaaga aaaggatgct

180

gctcttgctt tgctgctgct tgacagattg aaccagcttg agagcaaaat gtcttttata

240

gctggcttga ttgccatagt aatgaagtta attttcctct ggctgttatg gccagtaact

300

ttagcttgtt ttgtgcttgc tgctgtttac agaataaatt ggatcaccgg tgga

354

<210> 84

<211> 369

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 8 и саморасщепляемый

пептид

<400> 84

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctcaaa aagaaattga ccgcctcaat gaggttgcca agaatttaaa tgaatctctc

120

gcacctcatg gtgtagtctt cttgcatgtg acttatgtcc ctgcacaaga aaagaacttc

180

acaactgctt ttatagctgg cttgattgcc atagtaatgg tgacagatgc tgctcttgct

240

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa agttaatttt cctctggctg

300

ttatggccag taactttagc ttgttttgtg cttgctgctg tttacagaat aaattggatc

360

accggtgga

369

<210> 85

<211> 432

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 9 и саморасщепляемый

пептид

<400> 85

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctagga ataggttttt gtatataatt aagttaattt tcctctggct gttatggcca

120

gtaactttag cttgttttgt gcttgctgct gtttacagaa taaattggaa agaaattgac

180

cgcctcaatg aggttgccaa gaatttaaat gaatctctca tcgatctcca agaacttgga

240

aagtatgagc agtatataaa atggccatgg tacatttggc taggttttat agctggcttg

300

attgccatag taatggtgac aggcggtgat gctgctcttg ctttgctgct gcttgacaga

360

ttgaaccagc ttgagagcaa aatgtcagca cctcatggtg tagtcttctt gcatgtgact

420

tatgtccctg ca

432

<210> 86

<211> 432

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 10 и саморасщепляемый

пептид

<400> 86

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctagac gaattcgtgg tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat

120

ttctactacc taggaactgg gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc

180

atcatatggg ttgcaactga gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc

240

aatcctgcta acaatgctgc aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa

300

ggcaaacttc aagatgtggt caaccaaaat gcacaagctt taaacacgct tgttaaacaa

360

cttagctcca attttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta

420

catgcaccag ca

432

<210> 87

<211> 420

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 11 и саморасщепляемый

пептид

<400> 87

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctagac gaattcgtgg tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat

120

ttctactacc taggaactgg gccagaacgc agtggggcgc gatcaaaaca acgtcggccc

180

caaggtttac ccaataatac tgcgtcttgg ttcaccgctc tcactcaaca tggcaaggaa

240

gaccttggtt accaaccata cagagtagta gtactttctt ttgaaactga gggagccttg

300

aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc aatcgtgcta

360

caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag cagaggcggc

420

<210> 88

<211> 414

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 12 и саморасщепляемый

пептид

<400> 88

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctagac gaattcgtgg tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat

120

ttctactacc taggaactgg gccaggaaaa cttcaagatg tggtcaacca aaatgcacaa

180

gctttaaaca cgcttgttaa acaacttagc tccaattttg gtgcaatttc aagtgtttta

240

aatgatatcc tttcacgtct tgacaaagtt gaggctgaag tgcaaattga taggttgatc

300

acaggcagac ttcaaagttt gcagacatat gtgactcaac aattaattag agctgcagac

360

aaagatccaa atttcaaaga tcaagtcatt ttgctgaata agcatattga cgca

414

<210> 89

<211> 378

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 13 и саморасщепляемый

пептид

<400> 89

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctgatg acaaagatcc aaatttcaaa gatcaagtca ttttgctgaa taagcatatt

120

gacgcaggaa aacttcaaga tgtggtcaac caaaatgcac aagctttaaa cacgcttgtt

180

aaacaactta gctccaattt tggtactgag ggagccttga atacaccaaa agatcacatt

240

ggcacccgca atcctgctaa caatgctgca atcgtgctac aacttcctca aggaacaaca

300

ttgccaaaag gcttctacgc aggttaccaa ccatacagag tagtagtact ttcttttgaa

360

cttctacatg caccagca

378

<210> 90

<211> 408

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 14 и саморасщепляемый

пептид

<400> 90

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctgatg acaaagatcc aaatttcaaa gatcaagtca ttttgctgaa taagcatatt

120

gacgcaaatg gagaacgcag tggggcgcga tcaaaacaac gtcggcccca aggtttaccc

180

aataatactg cgtcttggtt caccgctctc actcaacatg gcaaggaaga ccttggttac

240

caaccataca gagtagtagt actttctttt gaaactgagg gagccttgaa tacaccaaaa

300

gatcacattg gcacccgcaa tcctgctaac aatgctgcaa tcgtgctaca acttcctcaa

360

ggaacaacat tgccaaaagg cttctacgca gaagggagca gaggcggc

408

<210> 91

<211> 417

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 15 и саморасщепляемый

пептид

<400> 91

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctgatg acaaagatcc aaatttcaaa gatcaagtca ttttgctgaa taagcatatt

120

gacgcataca aaacattccc accagacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat

180

ttctactacc taggaactgg gccagaaaaa cttcaagatg tggtcaacca aaatgcacaa

240

gctttaaaca cgcttgttaa acaacttagc tccaattttg gtgcaatttc aagtgtttta

300

aatgatatcc tttcacgtct tgacaaagtt gaggctgaag tgcaaattga taggttgatc

360

acaggcagac ttcaaagttt gcagacatat gtgactcaac aattaattag agctgca

417

<210> 92

<211> 507

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 16 и саморасщепляемый

пептид

<400> 92

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctagac gaattcgtgg tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat

120

ttctactacc taggaactgg gccagaaaga caaggaactg attacaaaca ttggccgcaa

180

attgcacaat ttgcccccag cgcttcagcg ttcttcggaa tgtcgcgcat tggcatggaa

240

gtcacacctt cgggaacgtg gttgacctac acaggtgcca tcaaattgga tgacaaagat

300

ccaaatttca aagatcaagt cattttgctg aataagcata ttgacgcata caaaacattc

360

ccaccaacag agcctaaaaa gagtgtttta aatgatatcc tttcacgtct tgacaaagtt

420

gaggctgaag tgcaaattga taggttgatc acaggcagac ttcaaagttt gcagacatat

480

gtgactcaac aattaattag agctgca

507

<210> 93

<211> 549

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 17 и саморасщепляемый

пептид

<400> 93

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctagac gaattcgtgg tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat

120

ttctactacc taggaactgg gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc

180

atcatatggg ttgcaactga gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc

240

aatcctgcta acaatgctgc aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa

300

ggcgctttaa acacgcttgt taaacaactt agctccaatt ttggtgcaat ttcaagtgtt

360

ttaaatgata tcctttcacg tcttgacaaa gttgaggctg aagtgcaaat tgataggttg

420

atcacaggca gacttcaaag tttgcagaca tatgtgactc aacaattaat tagagctgca

480

gaaatcagag ctggttacca accatacaga gtagtagtac tttcttttga acttctacat

540

gcaccagca

549

<210> 94

<211> 588

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Нуклеиновая кислота, кодирующая кассету 18 и саморасщепляемый

пептид

<400> 94

ggaagtggag ccaccaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct

60

ggacctagac gaattcgtgg tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat

120

ttctactacc taggaactgg gccagaaaga caaggaactg attacaaaca ttggccgcaa

180

attgcacaat ttgcccccag cgcttcagcg ttcttcggaa tgtcgcgcat tggcatggaa

240

gtcacacctt cgggaacgtg gttgacctac acaggtgcca tcaaattgga tgacaaagat

300

ccaaatttca aagatcaagt cattttgctg aataagcata ttgacgcata caaaacattc

360

ccaccaacag agcctaaaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac

420

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc

480

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga

540

cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgca

588

<210> 95

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (1180-1197 а.о.)

гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) из области

heptad repeat 2, принимающей участие в проникновении вируса в

заражаемую клетку

<400> 95

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

1 5 10 15

Ser Leu

<210> 96

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (1164-1178 а.о.)

заражаемую клетку

<400> 96

Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser

1 5 10 15

<210> 97

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (1199-1213 а.о.)

гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1)

<400> 97

Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr

1 5 10 15

<210> 98

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (1220-1231 а.о.)

гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1)

<400> 98

Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr

1 5 10

<210> 99

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (1220-1229 а.о.)

гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1)

<400> 99

Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met

1 5 10

<210> 100

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (1035-1062 а.о.)

гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1)

<400> 100

Pro Gln Ala Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1 5 10 15

Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala

20 25

<210> 101

<211> 23

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (1056-1078 а.о.)

гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1)

<400> 101

Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln

1 5 10 15

Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala

20

<210> 102

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (1056-1073 а.о.)

гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1)

<400> 102

Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln

1 5 10 15

Glu Lys

<210> 103

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (1055-1073 а.о.)

гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1)

<400> 103

Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala

1 5 10 15

Gln Glu Lys

<210> 104

<211> 16

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (1055-1070 а.о.)

гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1)

<400> 104

Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala

1 5 10 15

<210> 105

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (504-522 а.о.)

рецептор-связывающего домена (RBD)

<400> 105

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

1 5 10 15

Ala Pro Ala

<210> 106

<211> 13

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (504-516 а.о.)

рецептор-связывающего домена (RBD)

<400> 106

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu

1 5 10

<210> 107

<211> 26

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (946-971 а.о.)

гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1), частично из

области heptad repeat 1

<400> 107

Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr

1 5 10 15

Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly

20 25

<210> 108

<211> 24

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (947-970 а.о.)

heptad repeat 1

<400> 108

Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu

1 5 10 15

Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe

20

<210> 109

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (216-234 а.о.)

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-1, частично совпадающей с

таковой у нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 109

Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu

1 5 10 15

Glu Ser Lys

<210> 110

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (214-234 а.о.)

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 110

Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln

1 5 10 15

Leu Glu Ser Lys Met

20

<210> 111

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (216-235 а.о.)

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 111

Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu

1 5 10 15

Ser Lys Met Ser

20

<210> 112

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 112

Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu

1 5 10 15

Ser Lys Met

<210> 113

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (216-233 а.о.)

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 113

Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu

1 5 10 15

Ser Lys

<210> 114

<211> 27

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (92-118 а.о.)

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 114

Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg

1 5 10 15

Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu

20 25

<210> 115

<211> 26

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (92-117 а.о.)

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 115

Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg

1 5 10 15

Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro

20 25

<210> 116

<211> 21

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (98-119 а.о.)

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 116

Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu

1 5 10 15

Gly Thr Gly Pro Glu

20

<210> 117

<211> 35

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (303-337 а.о.)

<400> 117

Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met

1 5 10 15

Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr

20 25 30

His Gly Ala

35

<210> 118

<211> 26

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (340-365 а.о.)

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 118

Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys

1 5 10 15

His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro

20 25

<210> 119

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (341-359 а.о.)

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 119

Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His

1 5 10 15

Ile Asp Ala

<210> 120

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (340-359 а.о.)

нуклеопротеина N вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 3)

<400> 120

Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys

1 5 10 15

His Ile Asp Ala

20

<210> 121

<211> 36

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (40-75 а.о.)

мембранного белка M вируса SARS-CoV-1, частично совпадающей с

таковой у мембранного белка M вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 5)

<400> 121

Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Leu Val Phe Leu Trp Leu

1 5 10 15

Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg

20 25 30

Ile Asn Trp Val

35

<210> 122

<211> 34

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (42-75 а.о.)

мембранного белка M вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 5)

<400> 122

Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu

1 5 10 15

Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile

20 25 30

Asn Trp

<210> 123

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (50-79 а.о.)

мембранного белка M вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 5)

<400> 123

Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe

1 5 10 15

Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly

20 25 30

<210> 124

<211> 28

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность фрагмента (50-77 а.о.)

мембранного белка M вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 5)

<400> 124

Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys Phe

1 5 10 15

Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr

20 25

<---

Claims

1. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный полипептид для увеличения титра антител к вирусу гриппа, который включает эпитопные фрагменты белков коронавируса, которые выбирают из группы:

i) а) фрагменты из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которые представляют собой SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9; и

b) фрагмент из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, который представляет собой SEQ ID NO: 15; и

c) фрагмент из мембранного белка коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, который представляет собой SEQ ID NO: 22; или

ii) а) фрагменты из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которые представляют собой SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8; и

b) фрагмент из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, который представляет собой SEQ ID NO: 20; или

iii) а) фрагмент из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которые представляют собой SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11; и

b) фрагменты из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, которые представляют собой SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18; или

iv) а) фрагмент из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, который представляет собой SEQ ID NO: 10; и

v) а) фрагменты из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которые представляют собой SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; и

b) фрагменты из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, которые представляют собой SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 21; или

vi) а) фрагменты из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которые представляют собой SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11;и

b) фрагменты из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, которые представляют собой SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 21; или

vii) а) фрагмент из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, который представляют собой SEQ ID NO: 10; и

viii) а) фрагменты из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которые представляют собой SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; и

b) фрагменты из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, которые представляют собой SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21; или

ix) а) фрагменты из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которые представляют собой SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; и

x) а) фрагмент из гликопротеина S коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, которые представляют собой SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; и

b) фрагменты из нуклеопротеина коронавируса с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, которые представляют собой SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21.

2. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где кодируемый рекомбинантный полипептид содержит аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31.

3. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где кодируемый полипептид содержит аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25.

4. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где кодируемый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.

5. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где кодируемый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33.

6. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где кодируемый полипептид содержит аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 37.

7. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где кодируемый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.

8. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где кодируемый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

9. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где кодируемый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.

10. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где кодируемый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39.

11. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где кодируемый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.

12. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, которая включает нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 59-76.

13. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 1, где коронавирус представляет собой бета-коронавирус.

14. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 13, где бета-коронавирус представляет собой вирус SARS-CoV-2.

15. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный полипептид для увеличения титра антител к вирусу гриппа, включающий фрагменты из белков коронавируса и содержащий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 23-40.

16. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 15, которая включает нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы, которая включает нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 59-76, которые, соответственно, кодируют аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 23-40.

17. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 15, где коронавирус представляет собой бета-коронавирус.

18. Выделенная нуклеиновая кислота по п. 17, где бета-коронавирус представляет собой вирус SARS-CoV-2.

19. Выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и коронавирусом, который включает нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-18.

20. Выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по п. 19, где выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа получают из аттенуированного вируса гриппа.

21. Выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по п. 19, где выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа получают из вируса гриппа типа H2N2.

22. Выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по п. 19, где выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа получают из вируса А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) или его производных.

23. Выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по п. 19, где нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-18 находится в гене нейраминидазы (NA) или гене NS вируса гриппа.

24. Фармацевтическая композиция для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и коронавирусом, включающая рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по любому из пп. 19-23 в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

25. Вакцина для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и коронавирусом, включающая рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа по любому из пп. 19-23 в эффективном количестве.

26. Вакцина по п. 25 для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и заболеваний, вызванных коронавирусом.

27. Вакцина по любому из пп. 25-26, где коронавирус представляет собой бета-коронавирус.

28. Вакцина по любому из пп. 25-26, где коронавирус выбирают из группы, которая включает коронавирус человека ОС43, коронавирус человека НКШ, MERS-CoV, SARS-CoV или SARS-CoV-2.

29. Вакцина по любому из пп. 25-26, где специфический иммунитет к коронавирусу представляет собой специфический Т-клеточный иммунитет.

30. Применение рекомбинантного вируса на основе вируса гриппа по любому из пп. 19-23, фармацевтической композиции по п. 24 или вакцины по п. 25 для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и коронавирусом.

31. Применение по п. 30 для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и заболеваний, вызванных коронавирусом.

32. Применение по любому из пп. 30-31, где специфический иммунитет к коронавирусу представляет собой специфический Т-клеточный иммунитет.

33. Применение по любому из пп. 30-31, где коронавирус представляет собой бета-коронавирус.

34. Применение по любому из пп. 30-31, где коронавирус выбирают из группы, которая включает коронавирус человека ОС43, коронавирус человека HKU1, MERS-CoV, SARS-CoV или SARS-CoV-2.

35. Способ индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и коронавирусу и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа и коронавирусом, включающий введение в организм млекопитающих рекомбинантного вируса на основе вируса гриппа по любому из пп. 19-23, фармацевтической композиции по п. 24 или вакцины по п. 25, в эффективном количестве.

36. Способ по п. 35, где коронавирус представляет собой бета-коронавирус.

37. Способ по п. 35, где коронавирус выбирают из группы, которая включает коронавирус человека ОС43, коронавирус человека HKU1, MERS-CoV, SARS-CoV или SARS-CoV-2.

38. Способ по п. 35, где специфический иммунитет к коронавирусу представляет собой специфический Т-клеточный иммунитет.