JP2015502353A - インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)インフルエンザHA0アミノ酸配列を提供するステップ;
(b)HA1〜HA2の開裂部位を除去するステップ;
(c)球状頭部ドメインのアミノ酸配列、特にx+1から出発してy−1位までのアミノ酸配列を前記HA0配列から除去するステップ;
(d)へリックスAのC末端残基をへリックスCDのN末端残基に連結するアミノ酸配列中に1つ以上の突然変異を導入するステップ;および
(e)HAステムドメインポリペプチド中に1つ以上のジスルフィド架橋を導入するステップ
の一般的ステップを含むインフルエンザヘマグルチニンステムポリペプチドを提供する方法も提供する。
本発明において使用される用語の定義を以下に挙げる。
インフルエンザウイルスは、世界規模の公衆衛生に対して顕著な影響を及ぼし、毎年数百万の重病の症例、数千人の死亡、およびかなりの経済的損失を引き起こす。現在の三価インフルエンザワクチンは、ワクチン株および密接に関連する分離株に対する強力な中和抗体応答を誘発するが、ある亜型内のより分岐した株または他の亜型に及ぶことはほとんどない。さらに、適切なワクチン株の選択は多くの困難を提示し、準最適保護を頻繁にもたらす。さらに、次の流行性ウイルスの亜型の予測は、それがいつどこで生じるかを含め、現在では不可能である。
(a)インフルエンザHA0アミノ酸配列、特に、血清型H1のインフルエンザHA0アミノ酸配列を提供するステップ;
(b)好ましくは、HA1のC末端アミノ酸をアルギニン(R)またはリジン(K)以外のアミノ酸に突然変異させることにより、HA1およびHA2間の開裂部位を除去するステップ;
(c)球状頭部ドメインのアミノ酸配列をHA0配列から除去するステップ(このステップは、x位上のアミノ酸およびy位上のアミノ酸間のHA1ドメインのセグメントを欠失させ、こうして得られたHA1のN末端セグメント(HA1の1位上のアミノ酸からx位上のアミノ酸(そのアミノ酸を含む)に及ぶ)およびC末端セグメント(HA1のアミノ酸yからC末端アミノ酸に及ぶ)を場合により0〜50アミノ酸の結合配列を介して再連結させることにより行う。ある実施形態において、xは、HA1の46〜60位の任意の位置上のアミノ酸、好ましくは、52、53、55または59位上のアミノ酸であり、yは、HA1の290〜325位の任意の位置上のアミノ酸、好ましくは、291、303、318、または321位上のアミノ酸である。ここでも、使用される番号付与は、配列番号1を指す。産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列(またはシグナル配列)(例えば、配列番号1のアミノ酸1〜17に対応)は、一般に、例えば、ワクチンにおいて使用される最終ポリペプチド中には存在しないことが当業者により理解される。したがって、ある実施形態において、本発明によるポリペプチドは、リーダー配列を有さないHA1N末端セグメントを含む);
(d)好ましくは、へリックスAのC末端残基をへリックスCDのN末端残基に連結するアミノ酸配列中、好ましくは、特に、MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(配列番号17)のアミノ酸配列を含む配列番号1のアミノ酸402〜418に及ぶアミノ酸配列中に1つ以上の突然変異を導入することにより、改変HAの融合前立体構造の安定性を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させるステップ(突然変異は、好ましくは、疎水性アミノ酸残基の親水性アミノ酸残基への置換を含む);
(e)HAステムドメインポリペプチド中に1つ以上のジスルフィド架橋を導入するステップ
を含む。
−インフルエンザHA0アミノ酸配列、例えば、血清型H1、H5またはH3のインフルエンザHA0配列を提供するステップ;
−好ましくは、HA1のC末端アミノ酸をアルギニン(R)またはリジン(K)以外のアミノ酸に突然変異させることにより、HA1およびHA2間の開裂部位を除去するステップ;
−球状頭部ドメインのアミノ酸配列をHA0配列から除去するステップ(このステップは、x位上のアミノ酸およびy位上のアミノ酸間のHA1ドメインのセグメントを欠失させ、こうして得られたHA1のN末端セグメント(HA1の1位上のアミノ酸からx位上のアミノ酸(そのアミノ酸を含む)に及ぶ)およびC末端セグメント(HA1のアミノ酸yからC末端アミノ酸に及ぶ)を場合により0〜50アミノ酸の結合配列を介して再連結させることにより行う);
−好ましくは、へリックスAのC末端残基をへリックスCDのN末端残基に連結するアミノ酸配列中、好ましくは、特に、MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(配列番号17)またはH3HAについてはI(E/G)KTNEKFHQIEKEFSEVEGR421(配列番号104)のアミノ酸配列を含むH1HAのアミノ酸402〜418に及ぶアミノ酸配列中に1つ以上の突然変異を導入することにより、改変HAの融合前立体構造の安定性を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させるステップ(突然変異は、好ましくは、疎水性アミノ酸残基の親水性アミノ酸残基への置換を含む);
−HAステムドメインポリペプチド中に1つ以上のジスルフィド架橋を導入するステップ
を含む。
新規グループ1およびグループ2交差中和抗体:CR9114の同定
末梢血を正常健常ドナーから静脈穿刺によりEDTA抗凝固試料管中に回収した。scFvファージディスプレイライブラリーを、本質的に本明細書に参照により組み込まれる国際公開第2008/028946号パンフレットに記載のとおりに得た。選択は、インフルエンザA亜型H1(A/New Caledonia/20/99)、H3(A/Wisconsin/67/2005)、H4(A/Duck/HongKong/24/1976)、H5(A/Chicken/Vietnam/28/2003)、H7(A/Netherlands/219/2003)およびH9(A/HongKong/1073/99)の組換えヘマグルチニン(HA)に対して実施した。2つの連続選択ラウンドを個々の一本鎖ファージ抗体の単離前に実施した。第2の選択ラウンド後、個々の大腸菌(E.coli)コロニーを使用してモノクローナルファージ抗体を調製した。上記のスクリーニングにおいて得られた一本鎖ファージ抗体を含有する選択上清を、ELISAにおいて特異性、すなわち、異なるHA抗原への結合についてバリデートした。この目的のため、バキュロウイルス発現組換えH1(A/New Caledonia/20/99)、H3(A/Wisconsin/67/2005)、H5(A/Vietnam/1203/04)H7(A/Netherlands/219/2003)、およびB(B/Ohio/01/2005)HA(Protein Sciences,CT,USA)を、Maxisorp(商標)ELISAプレートにコートした。得られた一本鎖ファージ抗体のうち、一本鎖ファージ抗体SC09−114は、組換えインフルエンザAH1、H3、H5、H7およびインフルエンザBHAに特異的に結合することが示された。SC09−114の結合および特異性をFACS分析によりバリデートした。この目的のため、全長組換えインフルエンザA亜型H1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)およびH7(A/Netherlands/219/2003)HAを、PER.C6細胞の表面上で発現させた。SC09−114は、インフルエンザA亜型H1、H3およびH7HAに特異的に結合することが示された。scFvの重鎖および軽鎖可変領域を既に記載(国際公開第2008/028946号パンフレット)のとおりクローニングした。ヒトIgG1重鎖および軽鎖をコードする得られた発現構築物を、293T細胞との組合せで一過的に発現させ、ヒトIgG1抗体CR9114を含有する上清を得、それを標準的な精製手順を使用して産生した。CR9114の重鎖および軽鎖のCDRのアミノ酸配列を表1に挙げる。重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下に挙げる。
CR9114の交差結合反応性
CR9114を、ELISAにおいて結合特異性、すなわち、異なるHA抗原への結合についてバリデートした。この目的のため、バキュロウイルス発現組換えH1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisconsin/67/2005)、H5(A/Vietnam/1203/04、H7(A/Netherlands/219/2003)およびH9(A/HongKong/1073/99)HA(Protein Sciences,CT,USA)をMaxisorp(商標)ELISAプレートにコートした。対照として、未関連IgGのCR4098を使用した。CR114は、試験された全ての組換えHAに対する異種亜型交差結合活性を有することが示された。表2参照。
CR9114の交差中和活性
CR9114が複数のインフルエンザA株を遮断し得たか否かを決定するため、追加のインビトロウイルス中和アッセイ(VNA)を実施した。VNAは、MDCK細胞(ATCC CCL−34)について実施した。MDCK細胞をMDCK細胞培養培地(抗生物質、20mMのHepesおよび0.15%(w/v)の重炭酸ナトリウムが補給されたMEM培地(完全MEM培地)に10%(v/v)のウシ胎仔血清が補給されたもの)中で培養した。アッセイにおいて使用されたH1(A/WSN/33、A/New Caledonia/20/1999、A/Solomon Islands/IVR−145(A/Solomon Islands/3/2006の高増殖リアソータント)、A/Brisbane/59/2007、A/NYMC/X−181(A/California/07/2009の高増殖リアソータント)、H2(A/Env/MPU3156/05)、H3(A/HongKong/1/68、A/Johannesburg/33/94、A/Panama/2000/1999、A/Hiroshima/52/2005、A/Wisconsin/67/2005およびA/Brisbane/10/2007)、H4(A/WF/HK/MPA892/06)、H5(PR8−H5N1−HK97(A/HongKong/156/97およびA/PR/8/34の6:2リアソータント)およびA/Eurasian Wigeon/MPF461/07)、H6(A/Eurasian Wigeon/MPD411/07)、H7(NIBRG−60(A/Mallard/Netherlands/12/2000の6:2リアソータント)およびPR8−H7N7−NY(A/New York/107/2003(H7N7)およびA/PR/8/34の7:1リアソータント))、H8(A/Eurasian Wigeon/MPH571/08)H9(A/HongKong/1073/99およびA/Chick/HK/SSP176/09)、H10(A/Chick/Germany/N/49)およびH14(PR8−H14N5(A/mallard/Astrakhan/263/1982(H14N5)およびA/PR/8/34の6:2リアソータント))株を全て5.7×103TCID50/ml(1ml当たりの50%組織培養感染用量)の力価に希釈し、力価は、SpearmanおよびKarberの方法に従って計算した。IgG調製物(200μg/ml)を完全MEM培地中で4つ組のウェル中で段階的に2倍希釈(1:2〜1:512)した。それぞれのIgG希釈物の25μlを、ウイルス懸濁液(100TCID50/25μl)の25μlと混合し、37℃において1時間インキュベートした。次いで、懸濁液を、50μlの完全MEM培地中でコンフルエントMDCK培養物を含有する96ウェルプレート上に2つ組で移した。使用前、MDCK細胞をMDCK細胞培養培地中で1ウェル当たり3×104個の細胞において播種し、細胞がコンフルエントに達するまで増殖させ、300〜350μlのPBS、pH7.4により洗浄し、最後に50μlの完全MEM培地をそれぞれのウェルに添加した。接種した細胞を37℃において3〜4日間培養し、細胞変性効果(CPE)の発現について毎日観察した。CPEを陽性対照と比較した。
H1HAをベースとするCR6261およびCR9114の保存ステムドメインエピトープを含むステムドメインポリペプチドの設計
広域交差中和効力を有するインフルエンザウイルスヘマグルチニンに対する完全ヒトモノクローナル抗体を事前に同定した。CR6261(国際公開第2008/028946号パンフレットに記載)は、系統発生グループ1のインフルエンザAウイルスに対する広域交差中和活性を有することが示された。さらに、上記のCR9114は、系統発生グループ1および2の両方のインフルエンザAウイルスならびにインフルエンザBウイルスに結合し、中和し得ることが示されている。機能的および構造的分析は、これらの抗体が膜融合プロセスを妨げ、インフルエンザHAタンパク質のステムドメイン中で高度に保存されたエピトープに対して指向されることを明らかにした(Throsby et al.(2008);Ekiert et al.(2009)国際公開第2008/028946号パンフレット、および同時係属出願EP11173953.8号明細書)。
短いリンカーおよびhisタグを含むEGRHHHHHHH(配列番号81)、または
トロンビン開裂部位、三量体化ドメイン、およびhisタグを含むSGRSLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHH(配列番号82)により置き換えた。
Cluster2:K321C、Q405C(配列番号4)
Cluster3:F413C、E421C(配列番号5)
Cluster4:HA2 Y502S(配列番号6)。
実施例4のHAステムドメインポリペプチドの免疫原性
ステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、A/Brisbane/59/2007からの全長H1(配列番号1)、miniHA−cluster1(配列番号3)、miniHA−cluster1+2(配列番号4)およびminiHA−cluster1+4(配列番号6)をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。比較の理由のため、Steel et al.(2010)によるminiHA設計(mini−PR8;配列番号24)およびA/Puerto Rico/8/1934からの対応する全長タンパク質HAも実験に含めた。cM2をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。
第2世代のステムドメインポリペプチドの調製
実施例4に記載のステムドメインポリペプチドの平均蛍光強度は、全ての場合において、対応する全長タンパク質について観察されるものよりも低く;実際、最良の設計、miniHA−cluster1(配列番号3)は、モノクローナル抗体との結合後に全長構築物の平均強度の10%のオーダーである強度を有する。これは、細胞表面上のステムドメインポリペプチドの発現および/またはフォールディングが、全長タンパク質について観察されるものよりも低いことならびに設計をさらに改善することができることを示す。第1世代から得られた結果は第1世代構築物の改善が可能であることを示し、したがって、第2の設計ラウンドを開始した。
Mini1:欠失L60からK290 cluster11:M420I、V427I、L58T、V314T、I316T、F406S、V409T、L416S
Mini2:欠失S53からP320 cluster11:M420I、V427I、F406S、V409T、L416S
Mini3:欠失H54からI302 cluster11:M420I、V427I、V314T、I316T、F406S、V409T、L416S
Mini4:欠失G56からG317 cluster11:M420I、V427I、F406S、V409T、L416S
Mini1−cluster11(配列番号9)
Mini2−cluster11(配列番号10)
Mini3−cluster11(配列番号11)
Mini4−cluster11(配列番号12)
Mini1−cluster11+5(配列番号13)
Mini2−cluster11+5(配列番号14)
Mini3−cluster11+5(配列番号15)
Mini4−cluster11+5(配列番号16)
cluster11との組合せについてMini2>Mini1>Mini4>Mini3および
cluster11+5との組合せについてMini2>Mini1=Mini4>Mini3
第2世代HAステムドメインポリペプチドの免疫原性
実施例6のステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、A/Brisbane/59/2007からの全長H1(配列番号1)、miniHA−cluster1(配列番号3)、Mini2−cluster11(配列番号10)、Mini1−cluster11+5(配列番号13)、Mini2−cluster11+5(配列番号14)をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。cM2をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。
第3世代ステムドメインポリペプチドの調製
ステムドメインポリペプチドの設計をさらに改善するため、第3の設計ラウンドを実行した。全長HA中で埋め込まれるが、ステムドメインポリペプチド中で埋め込まれない表面の親水性を増加させる追加の突然変異を、413位において導入し、F413G(配列番号1により番号付与)、cluster6と命名した。このクラスターを、mini−2の欠失(S53からP320)、cluster5(R324C、T436C)のジスルフィド架橋およびcluster1(すなわち、F406S、V409T、L416S;配列番号46)またはcluster11(M420I、V427I、F406S、V409T、L416S;配列番号47)のいずれかの突然変異と組み合わせた。mini−2欠失(S53からP320)とcluster1(F406S、V409T、L416S)およびcluster5(R324C、T436C)との組合せも、参照のためにこの実験に含める(配列番号48)。
CR6261およびCR9114の保存ステムドメインエピトープを含むさらなるステムドメインポリペプチドの設計
上記の手順に従って設計された本発明のポリペプチドは、安定性を増加させるためにさらに改変することができる。このような改変は、単量体および/または二量体種と比べて本発明のポリペプチドの三量体形態の形成を向上させるために導入することができる。上記のとおり、天然HAは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。このモチーフの増強により、より安定な三量体を作出することができる。
H7HAをベースとするCR6261およびCR9114の保存ステムドメインエピトープを含むステムドメインポリペプチドの設計
本発明のポリペプチドを設計する上記の手順を、H7にも適用した。この実施例において、血清型H7に基づく本発明のポリペプチドの設計を記載する。H7インフルエンザウイルスA/Mallard/Netherlands/12/2000のHA(配列番号31)を親配列として使用したが、当業者は、他のH7配列の使用も同様に可能であったことを理解する。それというのも、この配列は特にステム領域が十分保存されるためである。
H3HAをベースとするCR8020、CR8043およびCR9114の保存ステムドメインエピトープを含むステムドメインポリペプチドの設計
第1のステップにおいて、本発明のポリペプチドを表す配列を、親配列としてのH3A/Wisconsin/67/2005からのHA(配列番号89)を使用してSteelら(Steel et al 2010)による記載と類似させて構築した。HAの頭部をアミノ酸D69からアミノ酸K292のHA1の一部の欠失により除去する。
Cluster1:I67T、I98T、I316Q、F408T、H409S、V418S
Cluster2:A320C、E406C
Cluster3 K326C、D435A、S438C
Cluster4 L397K、I401T
Cluster5 N405DまたはN405EまたはN405A
Cluster6 F415C、Q423C
Cluster7 G495E
Cluster8 F347C、S385C、N461C、L463C
H3 Mini−HA cluster1(配列番号91)
H3 Mini−HA cluster1+2(配列番号92)
H3 Mini−HA cluster1+3(配列番号93)
H3 Mini−HA cluster1+4(配列番号94)
H3 Mini−HA cluster1+5N405A(配列番号95)
H3 Mini−HA cluster1+5N405D(配列番号96)
H3 Mini−HA cluster1+5N405E(配列番号97)
H3 Mini−HA cluster1+6(配列番号98)
H3 Mini−HA cluster1+7(配列番号99)
H3 Mini−HA cluster1+2+3+4+5+6+7−N405E(配列番号100)
H3 Mini−HA cluster1+2+3+4+5+6+7−N405A(配列番号101)H3 Mini−HA cluster1+2+3+4+5+6+7−N405D(配列番号102)
H3 Mini−HA cluster1+8(配列番号103)
H3HAをベースとするCR8020、CR8043およびCR9114の保存ステムドメインエピトープを含むさらなるステムドメインポリペプチドの設計
この実施例において、血清型H3に基づく本発明のさらなるポリペプチドの設計を記載する。H3インフルエンザウイルスA/Wisconsin/67/2005(配列番号89)およびA/HongKong/1/1968(配列番号121)のHAを親配列として使用した。
Cluster9 F408S、I411T、F415S
Cluster10 V418G
Cluster11 I401R
Cluster12 K326C、S438C
Cluster13 T334C、I393C
Cluster14 C321G
GCN4 421から441位におけるRMKQIEDKIEEIESKQKKIEN
または421から435位におけるRMKQIEDKIEEIESK
tri 421から441位におけるIEAIEKKIEAIEKKIEAIEKK
または421から435位におけるIEAIEKKIEAIEKKI
配列番号105:H3−mini2
配列番号106:H3−mini2−cl9+10
配列番号107:H3−mini2−cl9+11
配列番号108:H3−mini2−cl9+10+11
配列番号109:H3−mini2−cl9+10+11−tri(421〜441位におけるtri配列)
配列番号110:H3−mini2−cl9+10+11−GCN4(421〜441位におけるGCN4配列)
配列番号111:H3−mini2−cl9+10+11+12
配列番号112:H3−mini2−cl9+10+12
配列番号113:H3−mini2−cl9+10+11+12−GCN4(421〜435位における短いGCN4配列)
配列番号114:H3−mini2−cl9+10+11+12−tri(421〜435位における短いtri配列)
配列番号115:H3−mini2−cl9+13
配列番号116:H3−mini2−cl9+10+11+13
配列番号117:H3−mini2−cl9+10+11+13−GCN4(421〜441位におけるGCN4配列)
配列番号118:H3−mini2−cl9+10+11+13−tri(421〜441位におけるtri配列)
配列番号119:H3−mini3−cl9+10+11+12+14
配列番号120:H3−mini4−cl9+10+11+12+14
配列番号121:H3 Full length A/HongKong/1/1968
配列番号122:HK68H3m2−cl9
配列番号123:HK68H3m2−cl9+10
配列番号124:HK68H3m2−cl9+10+11
配列番号125:HK68H3m2−cl9+10+12
配列番号126:HK68H3m2−cl9+10+11+12
配列番号127:HK68H3m2−cl9+10+11+13
配列番号128:HK68H3m2−cl9+10+11+12−tri(421〜435位における短いtri配列)
配列番号129:HK68H3m2−cl9+10+11+13−tri(421〜441位におけるtri配列)
配列番号130:HK68H3m2−cl9+10+11+12−GCN4(421〜435位における短いGCN4配列)
配列番号131:HK68H3m2−cl9+10+11+13−GCN4(421〜441位におけるGCN4配列)。
保存ステムドメインエピトープを含む可溶性ステムドメインポリペプチドの設計、発現および部分精製
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、得られるポリペプチドが細胞中での発現時に細胞表面上に提示されるようにHAの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、HA2の523、524、525、526、527、528、529または530位(配列番号1による番号付与)(の相当物)からC末端の細胞質配列および膜貫通配列は、細胞中での発現が、例えば、ワクチンにおいて使用することができる分泌(可溶性)ポリペプチドをもたらすように除去した。可溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列(「foldon」としても公知)、すなわち、AYVRKDGEWVLL(配列番号143)を場合によりリンカー(例えば、GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)を介して連結させて導入することによりさらに安定化させることができる。リンカーは、当業者に周知のプロトコルに従って精製後に処理するための開裂部位を場合により含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、短いリンカー、例えば、EGRを介して連結されたタグ配列、例えば、ヒスチジンタグ(6または7つの連続ヒスチジン)を付加することができる。一部の実施形態において、リンカーおよびヒスチジンタグは、foldon配列を存在させることなく付加する。
モノクローナル抗体CR9114、CR6261およびFI6v3の保存ステムドメインエピトープを含む可溶性ステムドメインポリペプチドの発現および部分精製
本発明のポリペプチドの高度に純粋な調製物を得るため、HEK293F細胞に、s−H1−mini2−cluster1+5+6−GCN4(配列番号145)をコードする遺伝子を含有する発現ベクターpcDNA2004を形質移入させた。産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列(またはシグナル配列)(配列番号145のアミノ酸1〜17に対応)は、分泌最終ポリペプチド中に存在しないことが当業者により理解される。この目的のため、HEK293F細胞(Invitrogen)を300gにおいて5分間スピンダウンさせ、SF1000を介して300mLの予備加温Freestyle(商標)培地中で再懸濁することにより1.0*106vc/mLを播種した。この培養物をmultitronインキュベーター中で37℃、10%のCO2、110rpmにおいて1時間インキュベートした。1時間後、プラスミドDNAを9.9mLのOptimem培地中で300mLの培養容量中1.0μg/mLの濃度にピペッティングした。並行して、440μLの293fectin(登録商標)を9.9mLのOptimem培地中でピペッティングし、室温において5分間インキュベートした。5分後、プラスミドDNA/Optimem混合物を293fectin(登録商標)/Optimem混合物に添加し、室温において20分間インキュベートした。インキュベーション後、プラスミドDNA/293fectin(登録商標)混合物を細胞懸濁液に滴加した。形質移入培養物をmultitronインキュベーター中で37℃、10%のCO2および110rpmにおいてインキュベートした。7日目、細胞を培養培地から遠心分離(3000gにおいて30分間)により分離した一方、本発明の可溶性ポリペプチドを含有する上清をさらなる処理のために0.2μmボトルトップフィルター上で濾過した。
インフルエンザBHAをベースとするCR9114の保存ステムドメインエピトープを含むステムドメインポリペプチドの設計
本発明のポリペプチドを設計する上記の手順をインフルエンザBにも適用した。この実施例において、公知の系統、すなわち、B/Florida/4/2006(B/Yamagata系統)およびB/Malaysia/2506/2004(B/Victoria系統)の両方のウイルス株から採取されるHA配列に基づく本発明のポリペプチドを記載する。当業者は、他のインフルエンザBHA配列の使用も可能であることを理解する。それというのも、この配列は、特にステム領域が十分保存されるためである。したがって、下記による他のインフルエンザBHA配列に由来するポリペプチドも本発明により包含される。
第3世代HAステムドメインポリペプチドの免疫原性
ステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、マウスをA/Brisbane/59/2007からの全長H1(配列番号1)、Mini3−cluster11(配列番号11)、Mini2−cluster11+5(配列番号14)、mini2−cluster1+5(配列番号48)、mini2−cluster1+5+6(配列番号46)、mini2−cluster1+5+6−GCN4(配列番号45)およびmini2−cluster1+5+6−nl(配列番号152)をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。cM2をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。
第3世代HAステムドメインポリペプチドmini2−cluster1+5+6−GCN4の免疫原性
本発明のステムドメインポリペプチドの免疫原性をさらに評価するため、mini2−cluster1+5+6−GCN4(配列番号45)コードする発現ベクターによりマウスを1回免疫化し(プライム)、精製タンパク質s−H1−mini2−cluster1+5+6−GCN4(配列番号145)により3週間間隔において2回ブーストした。比較の理由のため、別個の群を、mini2−cluster1+5+6−GCN4(配列番号45)およびA/Brisbane/59/2007からの全長H1(配列番号1)をコードする発現ベクターによる3週間間隔の免疫化において3回免疫化した。cM2をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。
CR6261およびCR9114の保存ステムドメインエピトープを含むさらなるステムドメインポリペプチドの設計
上記の手順に従って設計された本発明のポリペプチドは、安定性を増加させるためにさらに改変することができる。このような改変は、単量体および/または二量体種と比べて本発明のポリペプチドの三量体形態の形成を向上させるために導入することができる。上記のとおり、天然HAは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する。したがって、頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、トランケート分子中の単量体間の相互作用の強化は三量体形態の安定性を増加させる。ステムドメインにおいて、三量体化は、三量体の形成により媒介される。ステムドメイン中のコイルドコイルモチーフの増強により、より安定な三量体形態を達成することができる。
一般に当業者に公知の方法を使用して上記のタンパク質配列(配列番号44〜46;配列番号49〜53および配列番号152〜157をコードする遺伝子を合成し、発現ベクターpcDNA2004中にクローニングした。比較の理由のため、全長配列(配列番号1)およびcM2をコードする発現ベクターを実験に含めた。
第3世代HAステムドメインポリペプチドの免疫原性
ステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、A/Brisbane/59/2007からの全長H1(配列番号1)、Mini3−cluster11(配列番号11)、Mini2−cluster11+5(配列番号14)、mini2−cluster1+5+6(配列番号46)、mini2−cluster1+5+6−GCN4(配列番号45)、mini2−cluster1+5+6−nl(配列番号152)、mini2−cluster1+5+6−nl2(配列番号153)、mini2−cluster1+5+6−nl2s−GCN4(配列番号154)、mini2−cluster1+5+6−GCN4t2(配列番号51)、mini2−cluster1+5+6−GCN4t3(配列番号52)、mini2−cluster1+5+6+12(配列番号156)およびmini2−cluster1+5+6+12+13(配列番号157)をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。cM2をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。
CR6261およびCR9114の保存ステムドメインエピトープを含むステムドメインポリペプチドを設計する一般的方法
上記の結果に基づき、本発明のポリペプチドをインフルエンザウイルスHA0配列から、特に血清型H1のインフルエンザHA0配列から作出する一般的方法を定義する。この方法は、以下のステップを含む:
1.HA1〜HA2の開裂部位の除去。この除去は、P1位におけるR(わずかな場合においてK)のQへの突然変異により達成することができる(例えば、開裂部位(配列番号1中の343位)の命名法の説明については、Sun et al,2010参照。Qへの突然変異が好ましいが、S、T、N、DまたはEも代替例である。
2.配列番号1からのアミノ酸53〜320、または他のインフルエンザウイルスからのHA中の相当位置を欠失させることによる頭部ドメインの除去。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ClustalまたはMuscleなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。配列の残留部分を直接的に、またはフレキシブルリンカーを導入することにより結合させることができる。リンカー配列は、1〜50アミノ酸長であり得る。限定された長さ(10アミノ酸以下)のフレキシブルリンカー、例えば、GGG、GGGG、GSA、GSAG、GSAGSA、GSAGSAGまたは類似物が好ましい。欠失の長さは、例えば、欠失を54、55、56、57もしくは58位(の相当物)において開始することにより、または欠失の長さを増加させるため、47、48、49、50、51、もしくは52位において切断することにより変えることもできる。同様に、欠失させるべき最後のアミノ酸は、315、316、317、318もしくは319位(の相当物)におけるもの、または欠失の長さを増加させるため、321、322、323、324、もしくは325位(の相当物)におけるものであり得る。欠失の長さの変化は、リンカー配列の長さを合致させることにより部分的に補うことができることを理解することは重要であり、すなわち、より大きい欠失はより長いリンカーと合致させることができ、逆もまた同様である。これらのポリペプチドも本発明により包含される。
3.H1A/Brisbane/59/2007(配列番号1)中の残基402〜418(の相当物)により形成されるループ(AへリックスおよびCDへリックス間)の溶解度を増加させて改変HAの融合前立体構造の安定性を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させること。このループは、以下の表6において確認することができるとおり、H1配列中で高度に保存される。これは、例えば、前記ループ中のアミノ酸I、L、FまたはV残基を親水性相当物により置き換えることにより達成することができる。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、ClustalまたはMuscleなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。グリシンへの突然変異は、融合後立体構造を脱安定化させる。それというのも、このアミノ酸の高いフレキシビリティがこのHA配列の一部により形成され得る融合後へリックスの安定性の減少をもたらすためである。血清型H1のインフルエンザHAの残基402〜418のループを記載するコンセンサス配列は、(配列番号17)MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)である。本発明のポリペプチドにおいて、406、409、413位および/または416位におけるアミノ酸(または配列アラインメントから決定されたそれらの相当物)は、極性(S、T、N、Q)、荷電(R、H、K、D、E)またはフレキシブル(G)アミノ酸である。L416のSまたはTのいずれかへの突然変異もコンセンサスN−グリコシル化部位(コンセンサス配列は、NX(S/T)である)を導入することに留意すべきである。この位置におけるアスパラギンのグリコシル化は、この領域の溶解度をさらに増加させる。これらの部位における突然変異の組合せも可能であり、例えば、配列番号10および配列番号14中のF406S、V409T、L416Sである。一部の場合、コンセンサスアミノ酸を回復させるための突然変異が好ましく、例えば、VもしくはMが404位(Tへ)、Vが408位(Aへ)もしくは410位(Gへ)またはIが414位(Nへ)における場合であり;これらの特定のアミノ酸を有する配列の発生率は極めて低い。本発明のポリペプチドを特性決定する上記の突然変異の概要を表6に挙げる。
4.ジスルフィド架橋を本発明のポリペプチド中に、好ましくは、H1A/Brisbane/59/2007中の324および436位(の相当物)のアミノ酸間に導入すること;配列番号13〜16。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Clustal、Muscleなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方(他方が既にシステインである場合)、しかし通常、空間的に近い2つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。
1.開裂部位を除去すること:突然変異R344Q(番号付与は、配列番号56を指す。
2.残基K53からP321を欠失させ、GGGGリンカーをD52およびK322(番号付与は、配列番号56を指す)間に導入すること
3.Aへリックス〜CDへリックスのループ(配列番号56中の残基403〜419)中でセリン残基を407、417位において(F407S、L417S;番号付与は、配列番号2を指す)、トレオニンを410位において(V410T;番号付与は、配列番号56を指す)およびグリシン残基を414位において(F414G;番号付与は、配列番号2を指す)導入すること
4.ジスルフィド架橋を、残基リジン325およびトレオニン437をシステインに突然変異させることにより導入すること(K325C、T437C;番号付与は、配列番号56を指す)
5.追加の安定化エレメントを、419KRIENLNKKVDDGFLD434(番号付与は、配列番号56を指す)を配列RMKQIEDKIEEIESKQにより置き換えることにより導入した。
1.開裂部位を除去すること:突然変異R343Q(番号付与は、配列番号78を指す)
2.残基K53からP320を欠失させ、GGGGリンカーをD52およびK321(番号付与は、配列番号78を指す)間に導入すること
3.Aへリックス〜CDへリックスのループ(配列番号78中の残基402〜418)中でセリン残基を406、416位において(F406S、L416S;番号付与は、配列番号78を指す)トレオニンを409位において(V409T;番号付与は、配列番号78を指す)およびグリシン残基を413位において(F413G;番号付与は、配列番号78を指す)導入すること
4.ジスルフィド架橋を、残基アルギニン324およびトレオニン436をシステインに突然変異させることにより導入すること(R324C、T436C;番号付与は、配列番号78を指す)
5.追加の安定化エレメントを、418KRMENLNNKVDDGFLD433(番号付与は、配列番号78を指す)を配列RMKQIEDKIEEIESKQにより置き換えることにより導入した。
1.開裂部位を除去すること:突然変異R344Q(番号付与は、配列番号64を指す)
2.残基S53からP321を欠失させ、GGGGリンカーをD52およびK322(番号付与は、配列番号64を指す)間に導入すること
3.Aへリックス〜CDへリックスのループ(配列番号64中の残基403〜419)中でセリン残基を407、417位において(F407S、L417S;番号付与は、配列番号64を指す)、トレオニンを410位において(V410T;番号付与は、配列番号64を指す)およびグリシン残基を414位において(F414G;番号付与は、配列番号64を指す)導入すること
4.ジスルフィド架橋を、残基アルギニン325およびトレオニン437をシステインに突然変異させることにより導入すること(R325C、T437C;番号付与は、配列番号64を指す)
5.追加の安定化エレメントを、419RRMENLNKKVDDGFLD434(番号付与は、配列番号64を指す)を配列RMKQIEDKIEEIESKQにより置き換えることにより導入した。
1.開裂部位の除去。H5FLHAA/Vietnam/1203/2004(配列番号158)は、多塩基開裂部位(341RRRKKR346)を含有するため、単一部位突然変異は、タンパク質開裂を防止するため十分でない。代わりに341RRRKK345を欠失させ、R346Q突然変異を導入する。
2.残基K52からP319を欠失させ、GGGGリンカーをK51およびK320(番号付与は、配列番号158を指す)間に導入すること
3.Aへリックス〜CDへリックスのループ(配列番号158中の残基405〜421)中でセリン残基を409、419位において(F409S、L419S;番号付与は、配列番号158を指す)、トレオニンを412位において(V412T;番号付与は、配列番号158を指す)およびグリシン残基を416位において(F416G;番号付与は、配列番号158を指す)導入すること
4.ジスルフィド架橋を、残基リジン323およびトレオニン439をシステインに突然変異させることにより導入すること(K323C、T439C;番号付与は、配列番号158を指す)
5.追加の安定化エレメントを、421RRIENLNKKMEDGFLDV437(番号付与は、配列番号158を指す)を配列RMKQIEDKIEEIESKQIにより置き換えることにより導入した。
本発明のポリペプチドによるマウスにおける致死インフルエンザチャレンジに対する保護
本発明のポリペプチドがマウスを他の場合に致死性のインフルエンザウイルスへの曝露時の死亡から保護する免疫応答を誘導し得るか否かを決定するため、インフルエンザチャレンジ実験を実施した。配列番号78、161、45および6、ならびに開裂部位を除去するための追加のR343Q突然変異を含有するA/Brisbane/59/2007からの全長HA(配列番号1)をコードする発現ベクターによりマウスを筋肉内で免疫化した。cM2をコードする発現ベクターを陰性対照として含めた。免疫化は、50μgの発現構築物+50μgのアジュバント(pUMCV1−GM−CSF)を使用して以下の試験プロトコルに従って実施した。
1日目 採血。
0日目 ワクチンの投与(筋肉内)。
21日目 ワクチンの投与(筋肉内)。
28日目 採血。
42日目 ワクチンの投与(筋肉内)。
47日目 採血。
48日目 体重、体温、臨床スコアおよび致死率の計測。
49日目 致死用量のインフルエンザウイルス感染によるチャレンジ(経鼻)。
49日目 残留接種材料をウイルスの逆力価測定(back titration)に利用する。
49〜70日目 体重、体温、臨床スコアおよび致死率の毎日の計測。
臨床スコア≧3を有する動物を1日2回モニタリングする。
臨床スコア≧4または体温’’32℃を有する動物を、どの動物が最初に該当しようとも、試験から直ちに除去する。
70日目 全てのマウスの安楽死。
群1〜6:PR8(A/Puerto Rico8/34、H1N1)によるチャレンジ
群1:配列番号78
群2:配列番号161
群3:配列番号1R343Q
群4:配列番号45
群5:配列番号6
群6:空のベクター
1群当たり10匹のマウス。合計60匹のマウス。BALB/c。
ウイルス株および源:
インフルエンザウイルス株PR8(A/Puerto Rico8/34、H1N1)は、Virapur(San Diego)から供給された。原液1×10e8 pfu/ml バッチ#E2004B。
貯蔵条件:−75℃±10℃。フリーザー:−86℃UCTフリーザー。Thermo Form.Fisher Scientific。
マウス、BALB/c(特定病原体不在;SPF)、雌、試験0日目に6〜8週齢約17〜19グラム。Charles River Laboratoriesから供給され、「耳識別」により識別する。全ての動物を馴化させ、実験の開始前11日間維持した。
接種材料再構成の方法
上記列記の適切なDNA配合物を調製し、アリコート化し、−20℃において貯蔵した。1つの構築物当たり1つのアリコートを注射直前に室温に解凍し、注射器中に抜き取り、注射した。それぞれのアリコートの残部は、それぞれの免疫化ラウンドの全ての注射の完了後に廃棄した。
マウスを、体重1kg当たり9.75mgのXylasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com);カタログ番号:763.02)および48.75mgのKetasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com);カタログ番号:668.51)を用いて腹腔内注射により麻酔した。G29針を有する0.5mlの注射器を使用して50μlのDNA溶液をそれぞれの後足の大腿四頭筋中に筋肉内(i.m.)注射し、1匹のマウス当たり100μlの注射合計容量を生じさせた。それぞれのアリコートの残部は、それぞれの免疫化ラウンドの全ての注射の完了後に廃棄した。
接種材料再構成の方法
ウイルス材料を−75℃±10℃において貯蔵し、投与前に解凍した。解凍したら、材料を低温PBS(4℃)中で、A/PR/8/34チャレンジについて5LD50/50μlに対応させて希釈した。希釈ウイルスをマウスへの投与まで氷上で保持した。
動物を、1kgの体重当たり9.75mgのXylasolおよび48.75mgのKetasolを用いて腹腔内注射により麻酔し、それぞれの動物は50μlのウイルス溶液を鼻腔内により受けた。未使用材料は逆力価測定のために実験室に戻した。
上記の試験プロトコルに規定された日数において、血液試料を採取した(中間採血:眼窩後カニューレ挿入を介する100〜150μl、心臓穿刺を介する最終採血:約300〜500μl)。血清を、この血液から14000gにおける5分間の遠心分離により単離し、輸送までドライアイス上で−20℃において貯蔵した。
ウイルスチャレンジ後の臨床徴候を、スコアリング系(健常マウスについて1点;不快感の徴候、例として、わずかな立毛、歩容のわずかな変化および歩行の増加を示すマウスについて2点;強い立毛、腹部収縮、歩容変化、不活動期間、呼吸速度の増加および時々の水泡音(弾発音/有響ノイズ)の徴候を示すマウスについて3点;前述の群の特徴の増大を有するが、活動をほとんど示さず、瀕死になるマウスについて4点;死亡マウスについて5点)によりスコアリングした。動物を、それらが3のスコアを受ける限り1日2回調査した。スコアリングは単一調査者により実施し、部分的に2つのスコアにより表わされる症状を有するマウスはスコア+/−0.5であった。
全ての動物を、48日目から開始して毎日秤量した(確認番号2216)。動物を、死亡の場合において試験終了前、すなわち、試験からの除去時においても秤量した。体重をグラム(g)で記録した。
投与されるウイルスの用量は、動物の接種が完了した後に残留する接種材料からの8つのレプリケート試料を力価測定することにより決定した。ウイルス逆力価測定のため、「Current Protocols in Immunology,Animal Models of Infectious Disease 19.11.7」に概略されたプロトコルに従ってTCID50計測を利用した。
試験を、技術的困難なしで、定義された試験プロトコルと一致させて実施した。インフルエンザウイルス株PR8(A/Puerto Rico8/34,H1N1)の接種材料の逆力価測定は、以下のTCID50:PR8(A/Puerto Rico8/34、H1N1):3.2×104TCID50/mlをもたらした。
代表的なH1N1HA配列のパネルの選択およびそれらの配列をベースとする本発明のポリペプチドの設計
実施例20に記載の設計方法の広い適用可能性を示すため、この方法を、H1N1ウイルスにおいて見出される天然配列変異の大部分をカバーする選択HA0配列のパネルに適用した。この実施例における公知のヒトH1N1HA配列のプールからの代表的なHA配列のパネルの選択は、最大の代表性を有する最少数の株を選択する目的を有する。この目的を達成するため、インフルエンザウイルス配列データベース中に存在するヒトH1N1インフルエンザウイルスのHA配列間の全ての差を定量し、これらの差の構造を調査し、均一な下位群を同定した。このような群のそれぞれから、パネルに寄与する最も代表的な配列を選択した。
本発明のポリペプチドs−H1−mini2−cluster1+5+6−GCN4(配列番号145)の特性決定
本発明の精製ポリペプチドs−H1−mini2−cluster1+5+6−GCN4(配列番号145)を、実施例13に記載のとおりに得た。CR6261およびCR9114の立体構造的エピトープの存在を確認するため、これらの抗体と精製タンパク質との結合をバイオレイヤー干渉法(Octet Red384,Forte Bio)により試験した。この目的のため、ビオチン化CR6261、CR9114およびCR8020をストレプトアビジンコートセンサ上で固定化し、センサを最初に本発明の精製ポリペプチド(250nM)の溶液に曝露させて会合速度を計測し、次いで洗浄溶液に曝露させて解離速度を計測した。比較の理由のため、実験を全長タンパク質(配列番号149)を用いてその三量体および単量体形態の両方で繰り返した。結果を図27に示す。
本発明のポリペプチドによるマウスにおける致死インフルエンザチャレンジに対する保護
本発明のポリペプチドがマウスを他の場合に致死性のインフルエンザウイルスへの曝露時に死亡から保護する免疫応答を誘導し得るか否かを決定するため、インフルエンザチャレンジ実験を実施した。H3全長A/HongKong/1/1968(配列番号121)、HK68H3m2−cl9+10+11(配列番号124)およびHK68H3m2−cl9+10+11+12−GCN4配列番号130をコードする発現ベクターによりマウスを筋肉内で免疫化した。免疫化を、50μgの発現構築物+50μgのアジュバント(pUMCV1−GM−CSF)を以下の試験プロトコルに従って使用して実施した。
1日目 採血。
0日目 ワクチンの投与(筋肉内)。
21日目 ワクチンの投与(筋肉内)。
28日目 採血。
42日目 ワクチンの投与(筋肉内)。
47日目 採血。
48日目 体重、体温、臨床スコアおよび致死率の計測。
49日目 致死用量のインフルエンザウイルス感染によるチャレンジ(経鼻)。
49日目 残留接種材料をウイルスの逆力価測定に利用する。
49〜70日目 体重、体温、臨床スコアおよび致死率の毎日の計測。
臨床スコア≧3を有する動物を1日2回モニタリングする。
臨床スコア≧4または体温’’32℃を有する動物を、どの動物が最初に該当しようとも、試験から直ちに除去する。
70日目 全てのマウスの安楽死。
群7〜10:HK68(A/HongKong/1/68、H3N2)によるチャレンジ
群7:配列番号121
群8:配列番号130
群9:配列番号124
群10:空のベクター
1群当たり10匹のマウス。合計40匹のマウス。BALB/c。
ウイルス株および源
インフルエンザウイルス株HK68(A/HongKong/1/68)を、Prof J.Katz(Center for Disease Control and Prevention,Atlanta,GA,USA)により提供し、次いでVirapur(San Diego)により増殖させた。ウイルスをマウス肺中で複数回継代してマウスにおける病原性を向上させた。このウイルスについての好適な参照は、Frace et al.,Vaccine 1999;17:2237である。原液3×10e8 pfu/ml。バッチ#F1109A。
貯蔵条件:−75℃±10℃。フリーザー:−86℃UCTフリーザー。Thermo Form.Fisher Scientific。
マウス、BALB/c(特定病原体不在;SPF)、雌、試験0日目に6〜8週齢約17〜19グラム。Charles River Laboratoriesから供給され、「耳識別」により識別する。全ての動物を馴化させ、実験の開始前11日間維持した。
接種材料再構成の方法
上記列記の適切なDNA配合物を調製し、アリコート化し、−20℃において貯蔵した。1つの構築物当たり1つのアリコートを注射直前に室温に解凍し、注射器中に抜き取り、注射した。それぞれのアリコートの残部は、それぞれの免疫化ラウンドの全ての注射の完了後に廃棄した。
マウスを、体重1kg当たり9.75mgのXylasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com);カタログ番号:763.02)および48.75mgのKetasol(Graeub E Dr.AG(www.graeub.com);カタログ番号:668.51)を用いて腹腔内注射により麻酔した。G29針を有する0.5mlの注射器を使用して50μlのDNA溶液をそれぞれの後足の大腿四頭筋中に筋肉内(i.m.)注射し、1匹のマウス当たり100μlの注射合計容量を生じさせた。それぞれのアリコートの残部は、それぞれの免疫化ラウンドの全ての注射の完了後に廃棄した。
接種材料再構成の方法
ウイルス材料を−75℃±10℃において貯蔵し、投与前に解凍した。解凍したら、材料を低温PBS(4℃)中で、A/HK/1/68チャレンジについて10LD50/50μlに対応させて希釈した。希釈ウイルスをマウスへの投与まで氷上で保持した。
動物を、1kgの体重当たり9.75mgのXylasolおよび48.75mgのKetasolを用いて腹腔内注射により麻酔し、それぞれの動物は50μlのウイルス溶液を鼻腔内により受けた。未使用材料は逆力価測定のために実験室に戻した。
上記の試験プロトコルに規定された日数において、血液試料を採取した(中間採血:眼窩後カニューレ挿入を介する100〜150μl、心臓穿刺を介する最終採血:約300〜500μl)。血清を、この血液から14000gにおける5分間の遠心分離により単離し、輸送までドライアイス上で−20℃において貯蔵した。
ウイルスチャレンジ後の臨床徴候を、スコアリング系(健常マウスについて1点;不快感の徴候、例として、わずかな立毛、歩容のわずかな変化および歩行の増加を示すマウスについて2点;強い立毛、腹部収縮、歩容変化、不活動期間、呼吸速度の増加および時々の水泡音(弾発音/有響ノイズ)の徴候を示すマウスについて3点;前述の群の特徴の増大を有するが、活動をほとんど示さず、瀕死になるマウスについて4点;死亡マウスについて5点)によりスコアリングした。動物を、それらが3のスコアを受ける限り1日2回調査した。スコアリングは単一調査者により実施し、部分的に2つのスコアにより表わされる症状を有するマウスはスコア+/−0.5であった。
全ての動物を、48日目から開始して毎日秤量した(確認番号2216)。動物を、死亡の場合において試験終了前、すなわち、試験からの除去時においても秤量した。体重をグラム(g)で記録した。
投与されるウイルスの用量は、動物の接種が完了した後に残留する接種材料からの8つのレプリケート試料を力価測定することにより決定した。ウイルス逆力価測定のため、「Current Protocols in Immunology,Animal Models of Infectious Disease 19.11.7」に概略されたプロトコルに従ってTCID50計測を利用した。
試験を、技術的困難なしで、定義された試験プロトコルと一致させて実施した。インフルエンザウイルス株HK68(A/HongKong/1/68、H3N2)の接種材料の逆力価測定は、以下のTCID50:HK68(A/HongKong/1/68):1×103TCID50/mlをもたらした。
H3HAをベースとするステムドメインポリペプチドの設計および特性決定
実施例12に記載のステムドメインポリペプチドをさらに改善するため、構築物の追加の組を設計した。53および334位(T53C、G334C;cluster16)ならびに39および51位(G39C−E51C;cluster17)(番号付与は、配列番号121を指す)における安定化ジスルフィド架橋の形成を可能とするシステイン突然変異の2つの追加の組を設計した。さらに420〜421位の間、すなわち、長いCDへリックス(図1参照)のN末端側において挿入すべき2つの配列を設計した。挿入配列を、それらが三量体分子中の個々の単量体間の単量体間ジスルフィド架橋の形成を容易にするように設計した。2つの異なる配列、すなわち、NATGGCCGG(Cluster18)およびGSGKCCGG(Cluster19)を設計した。cluster18の配列は、ステムドメインポリペプチド中にグリコシル化部位(すなわち、NAT)を導入する配列も含む。一部の場合、グリコシル化部位は、417〜419位においてもNATへの突然変異により導入する。A/HongKong/1/1968からの全長HAの配列を出発点として使用して、上記の改変をS62〜P322欠失と組み合わせて以下のステムドメインポリペプチドを得た:
配列番号174:H3HKmini2a−linker+cl9+10+11+12+GCN4T−CG7−1
配列番号175:HK68H3mini2a−linker+cl9_+10+12+18+GCN4T
配列番号176:HK68H3mini2a−linker+cl9_+10+12+16+CG7−GCN4T
配列番号177:HK68H3mini2a−linker+cl9_+10+12+19+GCN4T
配列番号178:HK68H3mini2a−linker+cl9_+10+12+17+CG7−GCN4T
配列番号179:H3HK68mini2a−linker2+cl9_+10+12+GCN4T
H3HAをベースとするHAステムドメインポリペプチドの免疫原性
ステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、A/Wisconsin/67/2005(配列番号89)からの全長H3、配列番号105:H3−mini2、配列番号108:H3−mini2−cl9+10+11、配列番号112:H3−mini2−cl9+10+12、配列番号111:H3−mini2−cl9+10+11+12、配列番号114:H3−mini2−cl9+10+11+12−tri、配列番号113:H3−mini2−cl9+10+11+12−GCN4、配列番号119:H3−mini3−cl9+10+11+12+14、配列番号120:H3−mini4−cl9+10+11+12+14をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。cM2をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。
A/HongKong/1/1968のH3HAをベースとするHAステムドメインポリペプチドの免疫原性
ステムドメインポリペプチドの免疫原性を評価するため、A/HongKong/1/1968からの全長H3(配列番号121)、配列番号124:HK68H3m2−cl9+10+11、配列番号125:HK68H3m2−cl9+10+12、配列番号126:HK68H3m2−cl9+10+11+12、配列番号128:HK68H3m2−cl9+10+11+12−tri、配列番号130:HK68H3m2−cl9+10+11+12−GCN4をコードする発現ベクターによりマウスを免疫化した。cM2をコードする発現ベクターも陰性対照として含めた。
グループ1およびグループ2インフルエンザウイルスを中和する抗体を誘発し得るH1HAをベースとする別のステムドメインポリペプチドの設計
実施例4および6は、広域中和CR6261抗体のエピトープを安定的に曝露させるH1配列をベースとするポリペプチドを開示する。CR6261がもっぱら系統発生グループ1からのインフルエンザウイルスを中和するという事実を考慮すると、このエピトープに対して設計されたポリペプチドは、系統発生グループ2インフルエンザウイルスに対する強力な反応を誘発し得ない。このような広域交差中和抗体を誘導する本発明によるポリペプチドを設計する別の手法は、エピトープ中の重要なアミノ酸の構造および生化学的特徴に関してH3HA配列により密接に類似するH1HA配列バリアントを使用することである。グループ特異的抗体および分子(CR6261、F10およびHB36)ならびに結晶化panインフルエンザ抗体FI6(Corti et al,2011)の構造間の比較に基づき、本発明者らは、グループ1−グループ2T49N(HA2)突然変異を立体衝突の導入なしでFI6によってのみ提供することができることを見出した。HA2の49位におけるアスパラギンは、NCBIインフルエンザデータベース:A/swine/Hubei/S1/2009(ACY06623)およびA/swine/Haseluenne/IDT2617/2003(ABV60697)の2つのグループ1ウイルス中に存在する。したがって、一実施形態において、実施例4、6および9に開示される本発明の基礎を構成するH1配列は、それらのN49含有HA配列のものである。あるいは、実施例4、6および9に記載の本発明による配列は、TをNアミノ酸に変化させるためのHA2中の49位における追加の突然変異を有する。表7は、本発明のポリペプチドのための出発配列として使用することができる例示的H1HA配列の配列アラインメントを示す。
膜貫通配列を欠く本発明の追加のポリペプチドの設計
天然形態のインフルエンザHAは、細胞またはウイルス膜上で三量体として存在する。ある実施形態において、分泌(可溶性)ポリペプチドが細胞中での発現後に生成されるように細胞内および膜貫通配列を除去する。HAの分泌エクトドメインを発現させ、精製する方法は記載されている(例えば、Dopheide et al 2009;Ekiert et al 2009,2011;Stevens et al 2004,2006;Wilson et al 1981参照)。当業者は、これらの方法を本発明のステムドメインポリペプチドに直接適用して分泌(可溶性)ポリペプチドの発現を達成することもできることを理解する。したがって、これらのポリペプチドも本発明に包含される。例えば、グループ1インフルエンザウイルスのHA配列に由来する本発明のポリペプチドの場合、本発明の可溶性ポリペプチドは、残基514(の相当物)からC末端(番号付与は、配列番号1を指す)のポリペプチド配列の欠失により作出することができる。あるいは、追加の残基を本発明のポリペプチド中に、例えば、残基515、516、517、518、519、520、521または522から配列を欠失させることにより含めることができる。場合によりhisタグ配列(HHHHHHまたはHHHHHHH)を精製目的のため、場合によりリンカーを介して連結させて付加することができる。場合により、リンカーは、精製後にhisタグを除去するためのタンパク質分解開裂部位を含有し得る。可溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、例えば、foldon配列を導入することによりさらに安定化させることができる。上記のとおり得られたポリペプチドも本発明に包含される。
Claims (21)
- (a)HA1C末端ステムセグメントに0〜50アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているHA1N末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンHA1ドメイン、および(b)インフルエンザヘマグルチニンHA2ドメインを含むインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、前記ヘマグルチニンステムドメインポリペプチドはHA1およびHA2間の連結部におけるプロテアーゼ開裂に耐性であり、HA2のAへリックスおよびへリックスCDを連結するアミノ酸配列中の1つ以上のアミノ酸が野生型インフルエンザHA2ドメインと比較して突然変異しており、前記HA1およびHA2ドメインは、H1、H5およびH3からなる群から選択されるインフルエンザAウイルス亜型に由来するインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド。
- 全長HA1ドメインを含まない、請求項1に記載のポリペプチド。
- グリコシル化されている、請求項1または2に記載のポリペプチド。
- (a)HA1のアミノ酸y〜末端を含むHA1C末端ステムセグメントに0〜50アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているHA1のアミノ酸1〜xを含むHA1N末端セグメント、および(b)インフルエンザヘマグルチニンHA2ドメインを含む、請求項1、2または3に記載のポリペプチド。
- H1亜型のHAを含むインフルエンザAウイルスからのインフルエンザヘマグルチニンをベースとするインフルエンザヘマグルチニンHA1および/またはHA2ドメインを含み、x=46〜60の任意のアミノ酸であり、y=290〜325の任意のアミノ酸である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 表7のインフルエンザAウイルスからなる群から選択されるH1亜型のHAを含むインフルエンザAウイルスからのインフルエンザヘマグルチニンをベースとするインフルエンザヘマグルチニンHA1および/またはHA2ドメインを含む、請求項5に記載のポリペプチド。
- H3亜型のHAを含むインフルエンザAウイルスからのインフルエンザヘマグルチニンをベースとするインフルエンザヘマグルチニンHA1および/またはHA2ドメインを含み、x=56〜69の任意のアミノ酸であり、y=292〜325の任意のアミノ酸である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記HA1C末端ステムセグメントの前記C末端アミノ酸残基は、アルギニン(R)またはリジン(K)以外の任意のアミノ酸、好ましくは、グルタミン(Q)である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 前記HA1ドメインおよび/または前記HA2ドメイン中の1つ以上のさらなる突然変異を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 1つ以上のジスルフィド架橋を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- シグナル配列を含まない、請求項1〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- HA1のアミノ酸y〜末端を含むHA1C末端ステムセグメントに0〜50アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているHA1のアミノ酸p〜xを含むHA1N末端セグメント、および(b)インフルエンザヘマグルチニンHA2ドメインを含み、p=成熟HAの最初のアミノ酸である、請求項11に記載のポリペプチド。
- HAの細胞内および膜貫通配列を含まない、請求項1〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- H1HA2のアミノ酸残基520、521、522、523、524、525、526、527、528、529または530からC末端アミノ酸に及ぶインフルエンザH1HA2ドメインのC末端部分を含まない、請求項13に記載のポリペプチド。
- 抗体CR6261および/またはCR9114に選択的に結合し、抗体CR8057に結合しない、請求項1〜14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- 抗体CR8020、CR843および/またはCR9114に選択的に結合し、抗体CR8057に結合しない、請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
- (a)インフルエンザHA0アミノ酸配列を提供するステップ;
(b)HA1〜HA2の開裂部位を除去するステップ;
(c)球状頭部ドメインのアミノ酸配列を前記HA0配列から除去するステップ;
(d)へリックスAのC末端残基をへリックスCDのN末端残基に連結するアミノ酸配列中に1つ以上の突然変異を導入するステップ;および
(e)HAステムドメインポリペプチド中に1つ以上のジスルフィド結合を導入するステップ
を含むインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する方法。 - 請求項17に記載の方法により得られるインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載のポリペプチド、および/または請求項19に記載の核酸分子を含む免疫原性組成物。
- 医薬品として使用され、特にワクチンとして使用される、請求項1〜16のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項19に記載の核酸、および/または請求項20に記載の免疫原性組成物。
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