RU2685185C2 - Иммуногенные композиции коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (mers-cov) и способы - Google Patents
Иммуногенные композиции коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (mers-cov) и способы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2685185C2 RU2685185C2 RU2016111934A RU2016111934A RU2685185C2 RU 2685185 C2 RU2685185 C2 RU 2685185C2 RU 2016111934 A RU2016111934 A RU 2016111934A RU 2016111934 A RU2016111934 A RU 2016111934A RU 2685185 C2 RU2685185 C2 RU 2685185C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- mers
- nanoparticles
- approximately
- cells
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 title claims abstract description 11
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 177
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 64
- 239000013638 trimer Substances 0.000 claims abstract description 42
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 39
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 39
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 29
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 claims abstract description 12
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims abstract description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims abstract description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims abstract description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 20
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 235000011126 aluminium potassium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 229940050271 potassium alum Drugs 0.000 claims description 6
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 claims description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 88
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 73
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 70
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 60
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 51
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 33
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 32
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 30
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 30
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 28
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 23
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 23
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 22
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 17
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 17
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 16
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 16
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 15
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 14
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 13
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 13
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 13
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 10
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 10
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 10
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 10
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 9
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 9
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 7
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108010039939 Cell Wall Skeleton Proteins 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 102000045598 human DPP4 Human genes 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical class OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 4
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 4
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 4
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 3
- 108010067722 Dipeptidyl Peptidase 4 Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- -1 without limitation Proteins 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 2
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 2
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 2
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OWOHLURDBZHNGG-YFKPBYRVSA-N (8ar)-hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione Chemical compound O=C1CNC(=O)[C@@H]2CCCN12 OWOHLURDBZHNGG-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKXYOQDLERSFPT-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-octadecoxyethoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO JKXYOQDLERSFPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000701412 Baculoviridae Species 0.000 description 1
- 241000112287 Bat coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 229910020516 Co—V Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241001290006 Fissurella Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700638 Raccoonpox virus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108700036684 S1 domains Proteins 0.000 description 1
- 102000044437 S1 domains Human genes 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000446399 Stipa zalesskii Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 238000011053 TCID50 method Methods 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N almurtide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CO[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@@H](NC(C)=O)C=O NWMHDZMRVUOQGL-CZEIJOLGSA-N 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001775 anti-pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000002612 cardiopulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 231100000284 endotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002346 endotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 210000005256 gram-negative cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 210000001739 intranuclear inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001738 isopycnic centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 description 1
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 229940043517 specific immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 230000008478 viral entry into host cell Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1002—Coronaviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20071—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой композицию для стимулирования иммунного ответа в отношении MERS-CoV, содержащую (i) эффективное количество наночастиц MERS-CoV, где наночастица содержит по меньшей мере один тример полипептида Spike, и (ii) адъювант на основе сапонина, где адъювант на основе сапонина состоит из Matrix M1. Изобретение относится также к способу получения высокоаффинного антитела человека в отношении MERS-CoV, включающему введение трансгенному животному иммуногенной композиции, содержащей наночастицу MERS-CoV и адъювант Matrix M1, где наночастица содержит по меньшей мере один тример полипептида Spike, при этом трансгенное животное выбрано из группы, состоящей из коровы, лошади, свиньи, овцы и козы; отбор у животного сыворотки и/или плазмы и очистку антитела от сыворотки и/или плазмы. Изобретение позволяет расширить ассортимент лекарственных средств в отношении MERS-CoV. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 14 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка заявляет преимущество на основании предварительной заявки США с регистрационным №61/880111, поданной 19 сентября 2013 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[0002] Содержание текстового файла, поданного в электронном виде с данным документом, включено в данный документ посредством ссылки во всей полноте: Копия перечня последовательностей в машиночитаемом формате (имя файла: NOVV-056/01WO_Seqlist.txt, данные записаны: 18 сентября 2014 года, размер файла 17384 мегабайт).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Коронавирусы могут вызывать заболевание у животных, например, у человека. SARS (тяжелый острый респираторный синдром) является одним из примеров такого заболевания. Не так давно появился новый коронавирус, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV), который ассоциирован с летальными исходами у людей. MERS-CoV был идентифицирован Всемирной организацией здравоохранения (WHO) как "угроза для глобального здравоохранения", и он был зарегистрирован в 21 стране Ближнего Востока и Европы. MERS-CoV представляет собой высокопатогенный респираторный вирус, который вызывает тяжелый респираторный дистресс и, возможно, почечную недостаточность у инфицированных лиц [1, 2].
[0004] Коронавирусы прикрепляются к мембране клеток посредством взаимодействия гликопротеинов Spike (S), на поверхности вириона с родственным им рецептором на клетках-хозяевах (например, дипептидилпептидаза 4 (DPP4), обнаруженная на разных клетках человека, включая клетки легких и почек). Гликопротеин S состоит из N-концевого домена S1, который содержит рецептор-связывающий домен (RBD), и домена S2, ответственного за слияние вируса с клеткой. RBD MERS-CoV состоит из корового домена, который был совместно кристаллизован с белком DPP4 человека, демонстрируя, что тот взаимодействует с лопастями 4 и 5 из DPP4 [11]. В других коронавирусах, включая SARS-CoV, антитела к RBD способны нейтрализовывать и подавлять рост вируса in vitro [12-14]. На мышиных моделях SARS-CoV индуцированные вакциной и пассивно перенесенные нейтрализующие антитела оказались эффективными в отношении подавления патогенеза в легких и гибели [15]. Вместе с тем, об антителозависимом усилении (ADE) в иммунных клетках человека сообщали для SARS CoV in vitro, хотя его клиническая значимость in vivo неизвестна.
[0005] Плазму и/или иммуноглобулин людей-реконвалесцентов эффективно использовали для профилактики и лечения многих инфекций, вызываемых вирусами [16]. Система здравоохранения Великобритании и Международный консорциум тяжелых острых респираторных и острых инфекций (International Severe Acute Respiratory & Emerging Infection Consortium (ISARIC)) определили пассивную иммунотерапию нейтрализующими антителами (включая плазму реконвалесцентов) как подход к лечению MERS-CoV, который является приоритетным в исследовании. Однако получение больших количеств противопатогенной плазмы человека и/или иммуноглобулина с антителами с высокой аффинностью и авидностью в настоящее время требует пожертвований от выздоравливающих лиц, что может ограничить широкую доступность этих полученных от человека продуктов по ряду культурных, инфраструктурных и материально-технических причин. Необходимы альтернативные средства для быстрого получения специфического человеческого поликлонального иммуноглобулина для предупреждения и лечения заболеваний, вызываемых инфекционными агентами, в том числе MERS-CoV.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[0006] В данном документе раскрыты композиции и способы для стимулирования иммунных ответов в отношении инфицирования коронавирусом (CoV), который вызывает ближневосточный респираторный синдром (MERS-CoV). Настоящее раскрытие предусматривает композиции, которые являются иммуногенными и обеспечивают защиту от инфекции, вызываемой MERS-CoV. Преимущественно композиции индуцируют выработку нейтрализующих антител к MERS-CoV и могут использоваться в качестве вакцин.
[0007] Настоящее раскрытие также предусматривает способ индуцирования устойчивого иммунитета к вирусной инфекции у животного, восприимчивого к MERS-CoV, включающий введение по меньшей мере одной эффективной дозы вакцины, содержащей наночастицу MERS-CoV. В одном варианте осуществления указанный способ включает введение животному указанной наночастицы перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
[0008] В различных аспектах наночастица содержит только один тип белка MERS-CoV. В конкретных аспектах этот единственный белок представляет собой белок Spike (S).
[0009] В одном из аспектов настоящее раскрытие предусматривает иммуногенную композицию, содержащую наночастицу MERS-CoV, где наночастица содержит по меньшей мере один тример полипептида Spike. В другом варианте осуществления наночастица содержит по меньшей мере от приблизительно пяти тримеров до приблизительно 30 тримеров полипептида шиловидного отростка. В другом варианте осуществления наночастица содержит по меньшей мере от приблизительно десяти тримеров до приблизительно 20 тримеров полипептида Spike. В одном варианте осуществления концентрация наночастицы составляет по меньшей мере от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 60 мкг/мл. В другом варианте осуществления концентрация наночастицы составляет по меньшей мере от приблизительно 30 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. В еще одном варианте осуществления полипептид Spike содержит SEQ ID NO: 2. В еще одном дополнительном варианте осуществления полипептид Spike состоит из SEQ ID NO: 2.
[0010] В еще одном аспекте настоящее раскрытие предусматривает способ получения высокоаффинного антитела, включающий введение животному иммуногенной композиции, содержащей наночастицу MERS-CoV, где наночастица содержит по меньшей мере один тример полипептида Spike, отбор у животного сыворотки и/или плазмы и очистку антитела от сыворотки и/или плазмы. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение адъюванта. В еще одном варианте осуществления адъювант выбран из группы, включающей Montanide ISA 206, Quil А, алюмокалиевые квасцы, адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда и адъюванты на основе гидроксида алюминия. В одном варианте осуществления животное представляет собой корову или лошадь. В дополнительном варианте осуществления животное, представляющее собой корову или лошадь, является транс генным животным.
[0011] В одном варианте осуществления антитело, полученное путем иммунизации животного наночастицей, имеет KD от 10-8 до 10-15. В еще одном варианте осуществления антитело имеет KD от приблизительно 10-12 до приблизительно 10-14 или от приблизительно 10-13 до приблизительно 10-14.
[0012] В еще одном аспекте настоящее раскрытие включает дополнительное введение субъекту-человеку очищенного высокоаффинного антитела, полученного с помощью способа по настоящему изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0013] На фиг. 1 изображена структура коронавируса.
[0014] На фиг. 2 изображены частицы вакцины, полученные при помощи выполнения способов, раскрытых в данном документе.
[0015] На фиг. 3 изображено связывание антитела с VLP-наночастицами MERS CoV и VLP-наночастицами SARS CoV, раскрытых в данном документе, антитела к MERS и антитела к SARS, соответственно.
[0016] На фиг. 4 проиллюстрированы электронные микрофотографии VLP-наночастиц MERS CoV и VLP-наночастиц SARS CoV, раскрытых в данном документе.
[0017] На фиг. 5 проиллюстрирован протокол иммунизации для VLP-наночастиц MERS CoV и VLP-наночастиц SARS CoV, раскрытых в данном документе, в различные периоды времени, в различных дозах и с наличием или в отсутствие адъюванта.
[0018] На фиг. 6 проиллюстрированы частицы вакцины, полученные путем выполнения способов, раскрытых в данном документе. Белки Spike MERS показаны собранными в тример из белок-белковых мицелл размером 26 нм.
[0019] На фиг. 7 проиллюстрированы результаты нейтрализации после иммунизации мышей с использованием VLP MERS CoV и VLP-наночастиц SARS CoV, раскрытых в данном документе. Адъювант Matrix М является особенно эффективным.
[0020] На фиг. 8 проиллюстрирована кодон-оптимизированная нуклеотидная последовательность Spike MERS CoV.
[0021] На фиг. 9 проиллюстрирована аминокислотная последовательность Spike MERS CoV.
[0022] На фиг. 10А-С показано продуцирование антитела, специфического к Spike MERS, и титры ELISA. На панели А показана методика вакцинации (v означает номер вакцинации; например, v1 обозначает первую вакцинацию, v2 обозначает вторую вакцинацию и т.д.). На панели В показаны титры антител к рекомбинантному белку Spike MERS-CoV в образцах сыворотки отдельных Tc-животных на протяжении периода иммунизации, измеренные с помощью ELISA. Величина титра (единиц/мл) определяется как наибольшее разведение образца сыворотки, где показатель OD450 был в 2,5 раза выше, чем для пустого. На панели С показаны титры антител к рекомбинантному белку Spike MRS-CoV в SAB-300 и SAB-301. Величина активности титра (единиц/мг) определяется как наибольшее разведение 1 мг антитела, где показатель OD450 был в 2,5 раза выше, чем для пустого.
[0023] На фиг. 11А, В показаны результаты анализа нейтрализации со снижением флуоресценции. На панели А показана сыворотка вакцинированных коров, которую испытали в отношении нейтрализации при помощи анализа FRNT50. Масса (мкг) сыворотки, необходимая для 50% подавления обнаруженного MERS-CoV, графически представлена для каждого образца. Инфекцию количественно оценивали после предварительной обработки MERS-CoV разведением сывороток. После инфицирования клетки фиксировали и метили антителом к Spike для количественного определения уровня, при котором только 50% клеток было инфицировано по сравнению с контрольными сыворотками. На панели В показаны результаты анализа FRNT50 для SAB-300 и SAB-301, которые оценивали относительно их способности подавлять инфекцию MERS-CoV в клетках Vero. Аффинно очищенное антигеном кроличье антитело к Spike использовали в качестве положительного контроля в данных анализах FRNT50. Статистические показатели: критерий Стьюдента для одной выборки с коррекцией Уэлша, симулирующей распределение Гаусса. Значимости не обнаружили. Столбики представляют 95% доверительный интервал (CI).
[0024] На фиг. 12А, В показаны анализы нейтрализации MERS-CoV. На панели А показаны SAB-300 и SAB-301, которые тестировали в отношении их способности нейтрализовывать MERS-CoV с помощью анализа TCID50, графически представленного как процент титра вируса по сравнению с очищенным hIgG в качестве отрицательного контроля. Более высокий процент означает меньшее подавление инфекции. На панели В показано антителозависимое усиление для SAB-300 и SAB-301 относительно MERS-CoV. РНК из MERS-CoV, предварительно инкубированного с SAB-300 и SAB-301, в 48 часов после инфицирования оценивали в отношении количества MERS-CoV-специфического транскрипта, и графически представили как кратность изменения по сравнению с контрольными образцами, n.s. означает не значимо.
[0025] На фиг. 13А, В показано подавление репликации MERS-CoV in vivo. SAB-300 (А) или SAB-301 (В) вводили трансдуцированным Ad5-hDPP4 мышам BALB/c (6 недель, самки) внутрибрюшинно за 12 часов до инфицирования MERS-CoV. Затем мышей инфицировали интраназально с использованием 1×105 БОЕ MERS-CoV. Титры вируса в легких измеряли в указанные моменты времени. Титры выражали как БОЕ/г ткани, n=3 мыши/группа/момент времени. *Р<0,05 по сравнению с группой без обработки; Р<0,05 по сравнению с группой с контрольным антителом.
[0026] На фиг. 14 показана кинетика связывания белка S MERS-CoV с полученным от Tc-коров человеческим IgG.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0027] Следует понимать, что формы единственного числа используются в данной заявке для удобства, однако за исключением того, где контекст или явное утверждение указывает иное, формы единственного числа предназначены для включения множественного числа. Кроме того, следует понимать, что каждая журнальная статья, патент, патентная заявка, публикация и подобные, которые упоминаются в данном документе, тем самым включены посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей. Все числовые диапазоны следует понимать с включением всех и каждой числовой точки в пределах числового диапазона, и их следует интерпретировать как перечисление всех и каждой числовой точки в индивидуальном порядке. Конечные точки всех диапазонов, направленные на один компонент или свойство, являются включающими в себя и предназначены для того, чтобы независимо комбинироваться.
[0028] "Приблизительно" включает в себя все значения, имеющие фактически такой же эффект или обеспечивающие фактически такой же результат, как и заданное значение. Таким образом, диапазон, охваченный выражением "приблизительно", будет варьировать в зависимости от контекста, в котором используется выражение, например, от параметра, с которым связано заданное значение. Таким образом, в зависимости от контекста "приблизительно" может означать, например, ±15%, ±10%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1% или ± менее 1%. Важно отметить, что все перечисления заданного значения, которым предшествует выражение "приблизительно", предназначены также для перечисления только одного заданного значения.
[0029] Используемый в данном документе термин "бакуловирус", известный также как baculoviridae, относится к семейству оболочечных ДНК-содержащих вирусов членистоногих, представителей которого можно использовать в качестве векторов экспрессии для продуцирования рекомбинантных белков при встраивании в культуры клеток. Вирион содержит один или несколько палочковидных нуклеокапсидов, содержащих молекулу кольцевой сверхспиральной двухцепочечной ДНК (молекулярная масса 54×106-154×106). Используемый в качестве вектора вирус обычно представляет собой вирус ядерного полиэдроза (NVP) Autographa californica. Экспрессия введенных генов контролируется сильным промотором, который обычно регулирует экспрессию полиэдрического белкового компонента в крупных ядерных включениях, в которые заключены вирусы в инфицированных клетках.
[0030] Используемое в данном документе выражение "полученный из" относится к происхождению или источнику и может включать природные, рекомбинантные, неочищенные или очищенные молекулы.
[0031] Используемый в данном документе термин "макромолекулярная структура белка" относится к конструкции или организации одного или нескольких белков.
[0032] Используемое в данном документе выражение "вакцина" относится к препарату из мертвых или ослабленных патогенов, или из полученных антигенных детерминант, который применяют для индуцирования формирования антител или иммунитета в отношении к патогену. Вакцину вводят для обеспечения иммунитета к заболеванию, например, MERS, который вызван вирусами MERS CoV, или SARS, который вызван вирусами SARS CoV. Настоящее раскрытие предусматривает вакцинные композиции, которые являются иммуногенными и обеспечивают защиту. Кроме того, термин "вакцина" также относится к суспензии или раствору иммуногена (например, VLP-наночастица) который вводят позвоночному для получения защитного иммунитета, т.е., иммунитета, который снижает тяжесть заболевания, связанного с инфекцией.
[0033] Используемое в данном документе выражение "устойчивый иммунитет" относится к иммунному ответу, при котором при введении позвоночному наночастиц происходит индукция иммунной системы указанного позвоночного, приводящая к предупреждению инфекции, облегчению тяжести инфекции или уменьшению у указанного позвоночного по меньшей мере одного симптома, связанного с вирусной инфекцией.
[0034] Используемый в данном документе термин "адъювант" относится к соединению, которое при использовании в комбинации со специфичным иммуногеном (например, VLP-наночастица) в составе усиливает, или иным образом изменяет, или модифицирует получаемый в результате иммунный ответ. Модификация иммунного ответа включает повышение эффективности или расширение спектра специфичности каждого из гуморального или клеточного иммунного ответа или обоих. Модификация иммунного ответа также может означать снижение или подавление определенных антиген-специфичных иммунных ответов.
[0035] Используемый в данном документе термин "иммуностимулятор" относится к соединению, которое повышает иммунный ответ посредством собственных химических мессенджеров организма (цитокинов). Эти молекулы включают в себя разные цитокины, лимфокины и хемокины с иммуностимулирующей, иммунопотенцирующей и провоспалительной активностью, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); факторы роста (например, гранулоцитарный-макрофагальный (GM)-колониестимулирующий фактор (CSF)) и другие иммуностимулирующие молекулы, такие как макрофагальный воспалительный фактор, лиганд Flt3, В7.1; В7.2 и т.д. Молекулы иммуностимуляторов можно вводить в том же составе, что и VLP-наночастицы, или можно вводить отдельно. Для получения иммуностимулирующего эффекта можно вводить либо белок, либо вектор экспрессии, кодирующий белок.
[0036] Используемая в данном документе "эффективная доза" в целом относится к такому количеству наночастицы, которое достаточно для индуцирования иммунитета, для предупреждения и/или облегчения тяжести вирусной инфекции, или для уменьшения по меньшей мере одного симптома инфекции, и/или для усиления эффективности другой дозы наночастицы. Эффективная доза может относиться к количеству наночастицы, достаточному для задержки или сведения к минимуму проявления инфекции. Эффективная доза может также относиться к количеству наночастицы, которое обеспечивает терапевтическое преимущество в лечении или контроле инфекции. Кроме того, эффективная доза представляет собой количество в отношении наночастиц отдельно, или в комбинации с другими видами терапии, которое обеспечивает терапевтическое преимущество в лечении или контроле вирусной инфекции. Эффективная доза также может представлять собой количество, достаточное для повышения у субъекта (например, у человека) собственного иммунного ответа на последующее воздействие вируса. Уровни иммунитета можно контролировать, например, путем измерения количеств нейтрализующих секреторных и/или сывороточных антител, например, с помощью анализа нейтрализации бляшкообразования, реакции связывания комплемента, твердофазного иммуноферментного анализа или реакции микронейтрализации. В случае вакцины "эффективная доза" представляет собой дозу, которая предупреждает заболевание или снижает тяжесть симптомов.
[0037] Используемое в данном документе выражение "фактически защитный гуморальный иммунный ответ" относится к иммунному ответу, опосредованному антителами, на вирус, проявляющийся у позвоночного (например, человека), который предупреждает инфекцию, или облегчает ее тяжесть, или уменьшает по меньшей мере один из ее симптомов. Наночастицы могут стимулировать выработку антител, которые, например, представляют собой нейтрализующие антитела, которые блокируют проникновение вирусов в клетки, блокируют репликацию указанного вируса путем связывания с вирусом и/или защищают клетки-хозяева от инфекции и разрушения.
[0038] Используемое в данном документе выражение "фактически защитный клеточный ответ" относится к иммунному ответу, опосредованному Т-лимфоцитами и/или другими лейкоцитами, на вирус, проявляющийся у позвоночного (например, человека), который предупреждает или облегчает тяжесть инфекции, или уменьшает по меньшей мере один из ее симптомов. Один из важных аспектов клеточного иммунитета включает антиген-специфический ответ цитолитических Т-клеток ("CTL"). CTL обладают специфичностью в отношении пептидных антигенов, которые представлены в ассоциации с белками, кодируемыми главным комплексом гистосовместимости (МНС) и экспрессируемыми на поверхности клеток. CTL помогают индуцировать и стимулировать разрушение внутриклеточных микробов или лизис клеток, инфицированных такими микробами. Другой аспект клеточного иммунитета включает антиген-специфический ответ хелперных Т-клеток. Хелперные Т-клетки действуют с тем, чтобы оказать помошь в стимулировании функции и сфокусировать активность неспецифических эффекторных клеток против клеток, выставляющих пептидные антигены в ассоциации с молекулами МНС на своей поверхности. "Клеточный иммунный ответ" также относится к продукции цитокинов, хемокинов и других подобных молекул, продуцируемых активированными Т-клетками и/или другими лейкоцитами, в том числе тех, которые получены из CD4+ и CD8+ Т-клеток.
[0039] Используемое в данном документе выражение "устойчивый иммунитет на популяционной основе" относится к иммунитету в результате введения наночастиц индивидуумам в популяции. Результатом иммунитета у указанного индивидуума в указанной популяции является предупреждение, облегчение тяжести инфекции или уменьшение по меньшей мере одного из симптомов, связанных с вирусной инфекцией у указанного индивидуума, и предупреждение распространения указанного вируса среди индивидуумов в популяции. Термин популяция определен как группа индивидуумов (например, детей школьного возраста, пожилых, здоровых индивидуумов и т.д.) и может включать географическую область (например, конкретные города, школы, районы проживания, место работы, страну, штат и т.д.).
[0040] Используемый в данном документе термин "антигенный состав" или "антигенная композиция" относится к препарату, который при введении позвоночному, особенно млекопитающему, будет индуцировать иммунный ответ.
[0041] Используемый в данном документе термин "позвоночное", или "субъект", или "пациент" относится к любому представителю подтипа позвоночных, в том числе без ограничения к людям и другим приматам, в том числе приматам, за исключением человека, таким как шимпанзе и другие высшие приматы и виды обезьян. Сельскохозяйственные животные, такие как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашние млекопитающие, такие как собаки и кошки; лабораторные животные, в том числе грызуны, такие как мыши, крысы и морские свинки; птицы, в том числе домашние, дикие и охотничье-промысловые птицы, такие как куры, индейки и другие куриные, утки, гуси и т.п., также представляют собой неограничивающие примеры. Термины "млекопитающие" и "животные" включены в это определение. Предусматривается, что охватываются как взрослые, так и новорожденные особи.
VLP-наночастицы
[0042] Одной из целей при разработке вакцин является получение вакцин, которые стимулируют иммунную систему против патогена, но сами по себе не являются инфекционными. Это уводит от применения цельных вирионов в вакцинах в сторону более минималистичных композиций. Однако эти минималистичные композиций обладают собственными лимитирующими факторами, и, в частности, часто демонстрируют пониженную иммуногенность, требующую применения адъювантов и систем, которые усиливают иммунный ответ. Наночастицы, содержащие нативные вирусные белки, предлагают средства иммунизации, которые используют естественную способность вирусов проникать в клетку и стимулировать иммунный ответ.
[0043] Наночастицы, как раскрыто в данном документе, представляют собой особый тип вирусоподобной частицы (VLP). Наночастицы содержат вирусные белки, но не содержат какого-либо вирусного генетического материала и, таким образом, сами по себе не являются инфекционными. Наночастицы образуются путем самосборки полученных рекомбинантным путем вирусных белков и стимулируют особенно полезные иммунные ответы. Не вдаваясь в теорию, полагают, что размер, повторяющаяся структура и корпускулярная природа способствуют мощным иммунным ответам. Следует отметить, что мощный иммунный ответ может быть получен даже при отсутствии адъюванта.
Структура наночастиц
[0044] Наночастицы содержат вирусные белки, такие как белки вирусного капсида или оболочки, организованные в полимерной форме. Как правило, полимер представляет собой по меньшей мере тример вирусных белков. В других аспектах полимер может содержать более трех мономеров вирусных белков. Например, полимер может содержать 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мономерных единиц (названный 4-мерный, 5-мерный, 6-мерный и так далее). В конкретных аспектах полимеры могут быть собраны в структуры более высокого порядка. Так, например, наночастицы могут содержать по меньшей мере приблизительно 3 полимера, по меньшей мере приблизительно 5 полимеров, по меньшей мере приблизительно 10 полимеров, по меньшей мере приблизительно 15 полимеров, по меньшей мере приблизительно 20 полимеров или по меньшей мере приблизительно 30 полимеров. В конкретных аспектах наночастица содержит от приблизительно 5 до приблизительно 15 полимеров, от приблизительно 5 до приблизительно 20 полимеров или от приблизительно 5 до приблизительно 30 полимеров. В других аспектах наночастица содержит от приблизительно 5 до приблизительно 200 полимеров, от приблизительно 10 до приблизительно 200 полимеров или от приблизительно 10 до приблизительно 50 полимеров. Таким образом, в конкретных примерах наночастицы могут содержать от приблизительно 5 до приблизительно 20 тримеров.
[0045] Как правило, более сложные структуры более высокого порядка могут быть получены за счет увеличения концентрации белка. В одном из примеров более низкие концентрации белка дают наночастицы, содержащие приблизительно 5 полимеров, в то время как более высокие концентрации белка (например, 30-50 мкг/мл) дают наночастицы, содержащие от приблизительно 10 до приблизительно 20 полимеров. В одном неограничивающем примере концентрация наночастиц составляет по меньшей мере приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 20 мкг/мл, приблизительно 30 мкг/мл, приблизительно 40 мкг/мл, приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 60 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 200 мкг/мл или приблизительно 500 мкг/мл. В частности, концентрация наночастиц может составлять от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 1 мг/мл, или от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 500 мкг/мл, или от приблизительно 30 мкг/мл до приблизительно 100 мкг/мл, или от приблизительно 30 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл.
Наночастицы белков
[0046] Наночастицы, раскрытые в данном документе, могут содержать любой белок MERS-CoV, в том числе без ограничения, белок Spike (S), белок мембраны (М), белок нуклеокапсида (N) и белок оболочки (Е), или их комбинацию. Белки могут быть получены или извлечены из любого штамма, клады или вида MERS-CoV. Наночастицы могут содержать один или более белков из одного или более изолятов, штаммов, клад и/или видов MERS-CoV. В одном варианте осуществления белки получают или извлекают из штамма Jordan-N3/2012 (GenBank KC776174.1) MERS-CoV. В другом варианте осуществления белки получают или извлекают из штамма Munich_2013 MERS-CoV. В другом варианте осуществления белки получают или извлекают из штамма Al-Hasa_1_2013 MERS-CoV. Белки, содержащие наночастицы, также могут быть получены или извлечены из разных других источников, в том числе без ограничения из штамма Hafr-Al-batin_1_2013, штамма Bisha_1_2012, штамма Qatar_3_2013, штамма Camel_Egypt_2013, вирусов MERS-CoV клады А, вирусов MERS-CoV клады В, близкородственных штаммов HKU4 и HKU5 коронавируса летучих мышей и/или других близкородственных коронавирусов. Белки MERS-CoV можно также получить синтетическим или рекомбинантным путем in vitro. В одном варианте осуществления белки получают рекомбинантным путем в клетках насекомых, таких как клетки Sf9.
[0047] В одном варианте осуществления полимер может содержать один или более разных типов белков из MERS-CoV. В еще одном варианте осуществления полимер содержит единственный тип белка из MERS-CoV. В предпочтительном варианте осуществления полимер содержит только белок Spike. В еще одном варианте осуществления белок в полимере состоит из белка Spike. В еще одном варианте осуществления наночастица не содержит белки мембраны или нуклеокапсида. В еще одном дополнительном варианте осуществления наночастица не содержит каких-либо последовательностей вирусных нуклеиновых кислот.
[0048] В одном варианте осуществления наночастица содержит белок Spike или его фрагмент. В еще одном дополнительном варианте осуществления наночастица содержит тример из белков Spike или его фрагментов. В еще одном варианте осуществления наночастица содержит по меньшей мере один полимер белка Spike, кодируемого SEQ ID NO: 1. В еще одном варианте осуществления наночастица содержит по меньшей мере один полимер белка Spike, содержащего SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления наночастица содержит по меньшей мере один полимер белка Spike, состоящего из SEQ ID NO: 2. В еще одном варианте осуществления наночастица содержит по меньшей мере один полимер рецептор-связывающего домена (RBD) белка Spike.
[0049] Наночастицы можно получить, как описано в данной области (например, как описано в патенте США №20100239617, опубликованном 23 сентября 2010 года и включенном в данный документ для всех целей). Общие руководства, описывающие молекулярно-биологические методики, которые применимы к настоящему раскрытию, такие как клонирование, мутации, культура клеток и им подобные, включают в себя Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 ("Sambrook") и Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel"). В этих руководствах описаны мутагенез, применение векторов, промоторов и многие другие актуальные темы, связанные с клонированием и мутацией белков. Так, настоящее раскрытие также охватывает применение известных способов белковой инженерии и технологии рекомбинантной ДНК для улучшения или изменения характеристик белков, экспрессированных на или в наночастицах. Они включают без ограничений сайт-направленный, случайный точковый мутагенез, гомологичную рекомбинацию (ДНК-шаффлинг), мутагенез с применением матриц, содержащих урацил, сайт-специфический мутагенез с применением олигонуклеотидов, мутагенез с использованием фосфоротиоат-модифицированной ДНК, мутагенез с применением дуплексов ДНК, содержащих разрывы, и т.п. Дополнительные подходящие способы включают репарацию точковых несовпадений, мутагенез с применением штаммов-хозяев, дефицитных по репарации, рестрикцию-отбор и рестрикцию-очистку, делеционный мутагенез, мутагенез путем синтеза полного гена, репарацию двухцепочечного разрыва и т.п. Мутагенез, например, вовлекающий гибридные конструкции, также включен в настоящее раскрытие. В одном варианте осуществления мутагенез можно направлять с помощью известной информации о молекулах, встречающихся в природе, или измененных или мутированных молекулах, встречающихся в природе, например, о последовательности, сравнении последовательностей, физических свойствах, кристаллической структуре и т.п.
Белки Spike MERS
[0050] Подходящие белки Spike или их фрагменты получают или извлекают из изолятов, штаммов, клад и/или последовательностей MERS-CoV. В качестве альтернативы, их можно получить рекомбинантным или синтетическим путем. Например, подходящая аминокислотная последовательность MERS-CoV раскрыта в Genbank с номером доступа AGN70962 (фиг. 9 (SEQ ID NO: 2)). В одном варианте осуществления белок Spike или его фрагмент получен из штамма Al-Hasa MERS-CoV.
[0051] Настоящее раскрытие предусматривает варианты белков MERS-CoV. Варианты могут содержать изменения в аминокислотных последовательностях составляющих белков. Выражение "вариант" относительно полипептида относится к аминокислотной последовательности, которую изменили по одной или более аминокислотам относительно референтной последовательности. Вариант может иметь "консервативные" замены, где замещенная аминокислота имеет подобные структурные или химические свойства, например, замещение лейцина изолейцином. В качестве альтернативы, вариант может иметь "неконсервативные" замены, например, замещение глицина триптофаном. Аналогичные незначительные вариации также могут включать делеции или вставки аминокислот, или и первые, и вторые. Руководство по определению, какие аминокислотные остатки можно замещать, вставлять или удалять без устранения биологической или иммунологической активности, можно найти в компьютерных программах, хорошо известных из уровня техники, например, программного обеспечения DNASTAR.
[0052] Естественные варианты могут возникать вследствие антигенного дрейфа. Антигенные дрейфы представляют собой небольшие изменения в вирусных белках, которые происходят непрерывно с течением времени. Таким образом, у человека, зараженного конкретным штаммом вируса MERS-CoV, образуются антитела к такому вирусу, хотя при появлении более новых штаммов вируса антитела к более старым штаммам уже не распознают более новый вирус, и может происходить повторное заражение. Природные белки MERS-CoV и варианты RBD можно использовать для получения наночастиц, как описано в данном документе.
[0053] В некоторых вариантах осуществления осуществляют мутации, в которые входят изменения, приводящие к молчащим заменам, добавлениям или делениям, но не изменяют свойства или активности кодируемого белка или структуры белков. Варианты нуклеотидов можно получать в силу разных соображений, например, для оптимизации кодонов для изменения экспрессии у определенного хозяина (замена кодонов в человеческой мРНК на кодоны, предпочтительные для клеток насекомых, таких как клетки Sf9). См. публикацию заявки на патент США 2005/0118191, включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. В конкретном аспекте предпочтительный белок кодируется кодон-оптимизированной нуклеотидной последовательностью, такой как показанная на фигуре 8 (SEQ ID NO: 1). Нуклеиновая кислота и полипептиды могут быть по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны последовательностям, показанным на фигурах 8 и 9 (SEQ ID NO: 1 и 2).
[0054] Кроме того, последовательность нуклеотидов можно секвенировать, чтобы убедиться в том, что были клонированы правильные кодирующие участки, и они не содержат какие-либо нежелательные мутации. Нуклеотиды можно субклонировать в вектор экспрессии (например, бакуловирус) для экспрессии в любой клетке. Выше приведен только один пример того, как вирусные белки можно клонировать. Специалист в данной области понимает, что дополнительные способы доступны и являются возможными.
[0055] Настоящее раскрытие также предусматривает конструкции и способы, которые будут повышать эффективность получения наночастиц. Например, удаление сайтов расщепления из белков с целью повышения экспрессии белка. Другие способы включают в себя добавление лидерных последовательностей для более эффективной транспортировки. Например, гетерологичную сигнальную последовательность можно гибридизировать с белком MERS. В одном варианте осуществления сигнальную последовательность можно получить из гена клетки насекомого. В другом варианте осуществления сигнальный пептид представляет собой сигнальную последовательность хитиназы, которая эффективно работает в бакуловирусных системах экспрессии. В другом варианте осуществления обмен лидерными последовательностями между белками может обеспечить лучший транспорт белка.
[0056] Можно использовать подходящие векторы, кодирующие белки MERS-CoV или их фрагменты. Вектор может представлять собой, например, фаг, плазмиду, вирусный или ретровирусный вектор. В одном варианте осуществления вектор представляет собой рекомбинантный бакуловирусный вектор. Конструкции и/или векторы, которые кодируют гены, должны быть функционально сцеплены с подходящим промотором, например, промотор гена полиэдрина AcMNPV (или другого бакуловируса), промотор фага лямбда PL, промотор lac из Е. coli, промоторы phoA и tac, ранний и поздний промоторы SV40 и промоторы ретровирусных LTR являются неограничивающими примерами. Другие подходящие промоторы будут известны специалисту в данной области в зависимости от требуемых клетки-хозяина и/или скорости экспрессии. Конструкции для экспрессии будут дополнительно содержать сайты для инициации транскрипции, терминации транскрипции и, в транскрибированном участке, участок связывания рибосомы для трансляции. Кодирующая часть транскриптов, экспрессируемых с помощью конструкций, будет предпочтительно включать кодон инициации трансляции в начале и терминирующий кодон, соответственно расположенный на конце транслируемого полипептида.
[0057] Векторы экспрессии будут предпочтительно включать в себя по меньшей мере один селектируемый маркер. Такие маркеры включают дигидрофолатредуктазу, G418 или ген устойчивости к неомицину для эукариотической клеточной культуры и гены устойчивости к тетрациклину, канамицину или ампициллину для культивирования в E. coli и других бактериях. Среди векторов предпочтительными являются вирусные векторы, такие как бакуловирус, поксвирус (например, вирус коровьей оспы, вирус оспы птиц, вирус оспы канареек, вирус оспы кур, вирус оспы енотов, вирус оспы свиней и т.д.), аденовирус (например, аденовирус собак), герпесвирус и ретровирус. Бактериальные векторы также можно использовать. Примеры бактериальных векторов включают pQE70, pQE60 и pQE-9, векторы pBluescript, векторы Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5. Среди предпочтительных эукариотических векторов pFastBac1 pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 и pSG, pSVK3, pBPV, pMSG и pSVL. Другие подходящие векторы будут очевидными для специалиста в данной области.
[0058] Векторы, например, векторы, содержащие полинуклеотиды MERS-CoV, можно трансфицировать в клетки-хозяева в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. Например, введение нуклеиновых кислот в эукариотические клетки можно осуществлять посредством совместной преципитации с фосфатом кальция, электропорации, микроинъекции, липофекции и трансфекции с использованием полиаминных реагентов для трансфекции. В одном варианте осуществления указанный вектор представляет собой рекомбинантный бакуловирус.
[0059] Рекомбинантные векторы, такие как раскрытые выше, можно использовать для трансфекции, инфицирования или трансформации, и можно экспрессировать белки в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках. Среди эукариотических клеток-хозяев можно использовать клетки-хозяева дрожжей, насекомых, птиц, растений, С. elegans (или нематоды) и млекопитающих. Неограничивающими примерами клеток насекомых являются клетки Spodoptera frugiperda (Sf), например, Sf9, Sf21, клетки Trichoplusia ni, например, клетки High Five, и клетки Drosophila S2. Примерами грибных (в том числе дрожжевых) клеток-хозяев являются S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K. lactis), виды Candida, в том числе С. albicans и С. glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pichia pastoris и Yarrowia lipolytica. Примерами клеток млекопитающих являются клетки COS, клетки почки детенышей хомяка, мышиные L-клетки, клетки LNCaP, клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки почки эмбриона человека (НЕК) и клетки африканской зеленой мартышки, клетки CV1, клетки HeLa, клетки MDCK, клетки Vero и Нер-2. Также можно использовать ооциты Xenopus laevis или другие клетки, происходящие от амфибий. Прокариотические клетки-хозяева включают бактериальные клетки, например, Е. coli, В. subtilis и микобактерии.
[0060] Способы выращивания клеток, разработанных для получения наночастиц, включают без ограничения техники периодических, периодических с подпиткой, непрерывных и перфузионных клеточных культур. Клеточная культура означает рост и размножение клеток в биореакторе (камере сбраживания), где клетки размножаются и экспрессируют белок (например, рекомбинантные белки) для очистки и выделения. Типично, культивирование клеток проводят в стерильных условиях с контролируемыми температурой и атмосферой в биореакторе. Биореактор представляет собой камеру, используемую для культивирования клеток, в которой условия окружающей среды, такие как температуру, атмосферу, перемешивание и/или pH, можно контролировать. В одном варианте осуществления указанный биореактор представляет собой камеру из нержавеющей стали. В другом варианте осуществления указанный биореактор представляет собой предварительно простерилизованный пластиковый пакет (например, Cellbag®, Wave Biotech, Бриджуотер, Нью-Джерси). В другом варианте осуществления указанные предварительно стерилизованные пластиковые пакеты представляют собой пакеты объемом от приблизительно 50 л до 1000 л.
[0061] Затем наночастицы можно выделять при помощи, которые сохраняют их целостность, например, путем центрифугирования в градиенте, например, хлорида цезия, сахарозы и иодиксанола, а также стандартных методик очистки, включая, например, ионообменную и гель-фильтрационную хроматографию.
[0062] Следующее представляет собой пример того, как наночастицы можно получить, выделить и очистить. Как правило, наночастицы получают из рекомбинантных клеточных линий, разработанных для создания наночастиц, где указанные клетки выращивают в клеточной культуре.
[0063] Например, получение наночастиц может начинаться с посева клеток Sf9 (неинфицированных) во встряхиваемые колбы, предоставления клеткам возможности развиваться и увеличиваться, поскольку клетки растут и размножаются (например, со 125-мл колбы до 50 л пакета фирмы Wave Biotech). Среду, используемую для выращивания клетки, составляют для обеспечения соответствующей клеточной линии (предпочтительно бессывороточная среда, например среда для клеток насекомых ExCell-420, JRH). Затем указанные клетки инфицируют рекомбинантным бакуловирусом при наиболее эффективной множественности заражения (например, от приблизительно 1 до приблизительно 3 бляшкообразующих единиц на клетку). После того, как произошло инфицирование, белки экспрессируются из генома вируса, самостоятельно собираются в VLP-наночастицы и секретируются из клетки в течение от приблизительно 24 до 72 часов после инфицирования. Как правило, инфицирование наиболее эффективно, когда клетки пребывают в средней лог-фазе роста (4-8×106 клеток/мл) и являются жизнеспособными по меньшей мере на приблизительно 90%.
[0064] В качестве альтернативы, наночастицы можно получать, например, путем инфицирования клеток-хозяев (например, клеток Sf9) рекомбинантным бакуловирусом, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие белок MERS-CoV или представляющие интерес белки. Инфицированные клетки инкубируют и собирают. Белок MERS-CoV (например, белок Spike) экстрагируют из клеточной мембраны с помощью детергента. Затем белкам дают возможность естественным образом собраться с формированием структур (например, тримеров), которые затем очищают. Удаление детергента в ходе очистки позволяет белкам формировать структуры более высокого порядка, такие как наночастицы, содержащие множественные структуры (например, белок-белковые мицеллярные наночастицы, содержащие белковые тримеры). Как правило, на количество структур в наночастицах оказывает влияние концентрация белка, с более высокими концентрациями белка получают наночастицы, содержащие большее количество структур (например, тримеров).
[0065] Наночастицы можно собирать через примерно 48-96 часов после инфицирования, когда уровни VLP-наночастиц в среде клеточной культуры находятся вблизи максимума, но до обширного клеточного лизиса. Плотность и жизнеспособность клеток Sf9 во время сбора может составлять от приблизительно 0,5×106 клеток/мл до приблизительно 1,5×106 клеток/мл с жизнеспособностью по меньшей мере 20%, как показано в анализе с исключением красителя. Потом среду удаляют и очищают от примесей. Чтобы избежать нежелательной агрегации, в среду можно добавить NaCl в концентрации от приблизительно 0,4 до приблизительно 1,0 М, предпочтительно до приблизительно 0,5 М. Удаление клеток и клеточного дебриса из среды клеточной культуры, содержащей наночастицы, можно осуществлять с помощью тангенциальной поточной фильтрации (TFF) через предварительно простерилизованный половолоконный 0,5 или 1,00 мкм фильтровальный картридж одноразового применения или аналогичное устройство.
[0066] Затем наночастицы в очищенной культуральной среде можно концентрировать путем ультрафильтрации с использованием одноразового, предварительно стерилизованного половолоконного картриджа с отсечением по молекулярной массе 500000. Концентрированные наночастицы можно подвергнуть диафильтрации против 10 объемов фосфатно-солевого буфера (PBS), pH 7,0-8,0, содержащего 0,5 М NaCl, для удаления остаточных компонентов среды.
[0067] Концентрированные диафильтрованные наночастицы можно дополнительно очистить на ступенчатом с 20% до 60% градиенте сахарозы в буфере PBS при pH 7,2 с 0,5 М NaCl путем центрифугирования при 6500 g в течение 18 часов при температуре от приблизительно 4°C до приблизительно 10°C. Обычно VLP-наночастицы образуют характерную видимую полосу в области от приблизительно 30% до приблизительно 40% сахарозы или на границе раздела (в 20% и 60% ступенчатом градиенте), которую можно собрать из градиента и сохранить. Этот продукт можно развести, чтобы он содержал 200 мМ NaCl в препарате для следующей стадии процесса очистки. Этот продукт содержит VLP-наночастицы и может содержать интактные бакуловирусные частицы.
[0068] Дополнительной очистки наночастиц можно достичь путем анионной обменной хроматографии или изопикнического центрифугирования с использованием 44% сахарозной подушки. При анионообменной хроматографии образец из градиента сахарозы (см. выше) загружают в колонку, содержащую среду с анионом (например, Matrix Fractogel EMD ТМАЕ) и элюируют градиентом соли (от приблизительно 0,2 М до приблизительно 1,0 М NaCl), что может отделять наночастицу от других загрязнителей (например, бакуловируса и ДНК/РНК). В способе с сахарозной подушкой образец, содержащий наночастицы, добавляют к 44% сахарозной подушке и центрифугируют в течение приблизительно 18 часов при 30000 g. Наночастицы формируют полосу выше 44% сахарозы, тогда как бакуловирус выпадает в осадок на дне и другие загрязняющие белки остаются в слое с 0% сахарозы в верхней части. Собирают верхний слой или полосу наночастиц.
[0069] При необходимости интактный бакуловирус можно инактивировать. Инактивацию можно осуществлять химическими способами, например, с помощью формалина или β-пропиолактона (BPL). Удаление и/или инактивацию интактного бакуловируса также в значительной степени можно осуществлять с использованием селективного осаждения и хроматографических способов, известных из уровня техники, как поясняется примером выше. Способы инактивации включают инкубирование образца, содержащего наночастицы, в 0,2% BPL в течение 3 часов при температуре от приблизительно 25°C до приблизительно 27°C. Бакуловирус также можно инактивировать путем инкубирования образца, содержащего наночастицы, в 0,05% BPL при 4°C в течение 3 дней, затем при 37°C в течение одного часа.
[0070] После стадии инактивации/удаления продукт, содержащий наночастицы, можно провести через еще одну стадию диафильтрации для удаления любого реагента стадии инактивации и/или любой остаточной сахарозы и поместить наночастицы в требуемый буфер (например, PBS). Раствор, содержащий наночастицы, можно стерилизовать способами, известными в данной области (например, стерилизацией посредством фильтрации), и хранить в холодильнике или в морозильной камере.
[0071] Вышеописанные методики можно использовать на практике в различных масштабах. Например, Т-колбы, встряхиваемые колбы, роллерные бутыли, вплоть до биореакторов промышленных размеров. Биореакторы могут включать в себя либо бак из нержавеющей стали, либо предварительно простерилизованный пластиковый пакет (например, систему, продаваемую Wave Biotech, Бриджуотер, Нью-Джерси). Специалист в данной области будет знать, что является наиболее целесообразным для его целей.
Фармацевтические или вакцинные составы и введение
[0072] Фармацевтические композиции, применяемые в данного документе, содержат фармацевтически приемлемый носитель, в том числе любой подходящий разбавитель или наполнитель, который включает любое фармацевтическое средство, которое само по себе не индуцирует формирование иммунного ответа, причиняющего вред позвоночному, получающему композицию, и которое можно вводить без чрезмерной токсичности вместе с наночастицей. Используемое в данном документе выражение "фармацевтически приемлемый" означает, что он является одобренным регулирующим органом федерального правительства или правительства штата, или перечислен в Фармакопее США, Европейской фармакопее или в других общепризнанных фармакопеях для применения у позвоночных, и, более конкретно, у людей.
[0073] В целом, наночастицы вводят в эффективном количестве (как определено выше), достаточном для стимуляции иммунного ответа против одного или более штаммов вируса MERS CoV. Эти композиции можно использовать в качестве вакцины и/или антигенных композиций для индуцирования протективного иммунного ответа у позвоночного. Композиции могут содержать наночастицы, имеющие различные типы полимеров. Например, композиции могут содержать в основном тримеры с оставшейся частью, включающей различные полимеры. В одном из вариантов осуществления наночастицы, вводимые в эффективном количестве для стимуляции иммунного ответа против одного или более штаммов вируса MERS-CoV, содержат по меньшей мере приблизительно 5-100 тримеров, по меньшей мере приблизительно 10-90 тримеров, по меньшей мере приблизительно 20-50 тримеров, по меньшей мере приблизительно 10-30 тримеров или по меньшей мере приблизительно 10-20 тримеров белков MERS-CoV. В дополнительном варианте осуществления композиции вводимые наночастицы содержат по меньшей мере приблизительно 5-100 тримеров, по меньшей мере приблизительно 10-90 тримеров, по меньшей мере приблизительно 20-50 тримеров, по меньшей мере приблизительно 10-30 тримеров или по меньшей мере приблизительно 10-20 тримеров белка Spike или его фрагмента (такого как RBD).
[0074] В одном неограничивающем варианте осуществления концентрация наночастиц составляет по меньшей мере приблизительно 10 мкг/мл, приблизительно 20 мкг/мл, приблизительно 30 мкг/мл, приблизительно 40 мкг/мл, приблизительно 50 мкг/мл, приблизительно 60 мкг/мл, приблизительно 100 мкг/мл, приблизительно 200 мкг/мл или приблизительно 500 мкг/мл. В частности, концентрация наночастиц составляет от приблизительно 10 мкг/мл до приблизительно 1 мг/мл, или от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 500 мкг/мл, или от приблизительно 30 мкг/мл до приблизительно 100 мкг/мл, или от приблизительно 30 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл.
[0075] В других примерах композиции могут содержать наночастицы более высокого порядка, такие как от 5-мерные - 6-мерные. В конкретных аспектах композиции содержат по меньшей мере 70% 5-мерных - 6-мерных, по меньшей мере 80% 5-мерных - 6-мерных или по меньшей мере 90% 5-мерных - 6-мерных. В других аспектах композиция содержит по меньшей мере 70% 5-мерных - 6-мерных, по меньшей мере 80% 5-мерных - 6-мерных или по меньшей мере 90% 5-мерных - 6-мерных.
[0076] В одном варианте осуществления фармацевтические составы, раскрытые в данном документе, содержат наночастицы, содержащие белок MERS-CoV, часто белок Spike, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
[0077] В других вариантах осуществления композиции могут содержать наночастицы, содержащие белки MERS-CoV или варианты, такие как вариант RBD, из разных штаммов MERS. Такие композиции можно вводить для обеспечения иммунитета к нескольким различным штаммам. В одном из аспектов композиция может содержать наночастицы для обеспечения иммунного ответа против первого штамма, второго штамма, третьего штамма. В другом аспекте наночастицы могут обеспечить иммунный ответ против четырех, пяти или шести штаммов. В еще одном варианте осуществления фармацевтические составы содержат очищенное высокоаффинное антитело, произведенное в организме животного, которому ввели наночастицы.
[0078] Фармацевтически приемлемые носители включают без ограничений физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, стерильный изотонический водный буфер и их комбинации. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и других наполнителей представлено в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J. последнее издание). Состав должен удовлетворять требованиям способа введения. В предпочтительном варианте осуществления состав, являющийся подходящим для введения человеку, предпочтительно является стерильным, не содержащим частиц и/или апирогенным.
[0079] Композиция, при необходимости, также может содержать небольшие количества увлажняющих или эмульгирующих средств, или забуферивающих pH средств. Композиция может представлять собой твердую форму, такую как лиофилизированный порошок, подходящий для восстановления, жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетку, пилюлю, капсулу, состав с замедленным высвобождением или порошок. Состав для перорального введения может включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натриевая соль сахарина, целлюлоза, карбонат магния и т.д. со степенью чистоты для фармацевтической промышленности.
[0080] Настоящее раскрытие также предусматривает фармацевтический комплект или набор, содержащий один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами иммуногенных вакцинных составов. В предпочтительном варианте осуществления набор содержит два контейнера, один, содержащий наночастицы, и другой, содержащий адъювант. К таким контейнерам (контейнерами) может прилагаться информация в форме, предусмотренной правительственным учреждением, регулирующим производство, применение или продажу лекарственных препаратов или биологических продуктов, при этом в информации отражается одобрение учреждения относительно производства, применения или продажи для введения людям.
[0081] Составы могут быть упакованы в герметично укупоренном контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества композиции. В одном варианте осуществления композицию поставляют в виде жидкости, в другом варианте осуществления в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично укупоренном контейнере, при этом она может быть восстановлена, например, водой или физиологическим раствором до соответствующей концентрации для введения субъекту. Предпочтительно, композицию поставляют в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично укупоренном контейнере в дозированной форме, предпочтительно, приблизительно 1 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 100 мкг, приблизительно 125 мкг, приблизительно 150 мкг или приблизительно 200 мкг. В качестве альтернативы, дозированная форма композиции составляет менее приблизительно 1 мкг (например, приблизительно 0,08 мкг, приблизительно 0,04 мкг, приблизительно 0,2 мкг, приблизительно 0,4 мкг, приблизительно 0,8 мкг, приблизительно 0,5 мкг или менее, приблизительно 0,25 мкг или менее или приблизительно 0,1 мкг или менее), или более приблизительно 125 мкг (например, приблизительно 150 мкг или более, приблизительно 250 мкг или более или приблизительно 500 мкг или более). Эти дозы можно измерить как общее количество наночастиц, или в виде мкг белка MERS-CoV (например, белка Spike или его фрагмента). Композицию с наночастицами следует вводить в течение приблизительно 12 часов, предпочтительно в течение приблизительно 6 часов, в течение приблизительно 5 часов, в течение приблизительно 3 часов или в течение приблизительно 1 часа после восстановления из лиофилизированного порошка.
[0082] В альтернативном варианте осуществления композиция с наночастицами поставляется в жидкой форме в герметично укупоренном контейнере с указанием количества и концентрации композиции с наночастицами. Предпочтительно, композиция с наночастицами в жидкой форме поставляется в герметично укупоренном контейнере в концентрации по меньшей мере приблизительно 50 мкг/мл, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл, по меньшей мере приблизительно 200 мкг/мл, по меньшей мере 500 мкг/мл или по меньшей мере 1 мг/мл.
[0083] Наночастицы можно вводить животному, чтобы вызвать иммунный ответ против MERS-CoV. В одном варианте осуществления животное восприимчиво к инфекции MERS-CoV. В одном варианте осуществления животное представляет собой человека. Предпочтительно, введение наночастиц вызывает устойчивый иммунитет против по меньшей мере одного штамма, изолята, клады и/или вида MERS-CoV. В одном варианте осуществления введение наночастиц вызывает устойчивый иммунитет против по меньшей мере 2 или более штаммов, изолятов, клад и/или видов MERS-CoV. В еще одном варианте осуществления введение наночастиц вызывает устойчивый иммунитет против другого коронавируса. Как правило, дозу можно подбирать в пределах этого диапазона на основе, например, возраста, физического состояния, массы тела, пола, питания, времени введения и других клинических факторов.
[0084] Кроме того, в данном документе раскрыты способы составления вакцины или антигенной композиции, которая индуцирует у субъекта устойчивый иммунитет к вирусной инфекции или по меньшей мере к одному из ее симптомов, включающие добавление к указанному составу эффективной дозы наночастиц.
[0085] Хотя предпочтительной является стимуляция устойчивого иммунитета однократной дозой, для достижения требуемого эффекта можно вводить дополнительные дозы с помощью такого же или отличающегося пути введения. Например, у новорожденных и младенцев для для достижения достаточных уровней иммунитета могут потребоваться множественные введения. Введение можно продолжать с определенными интервалами на протяжении всего детского возраста при необходимости поддержания достаточных уровней защиты против инфекции. Подобным образом, для взрослых, которые являются особенно восприимчивыми к повторным или тяжелым инфекциям, таких как, например, медицинские работники, работники детских садов, члены семей с маленькими детьми, пожилые люди и индивидуумы с нарушенной сердечно-легочной функцией, могут потребоваться множественные иммунизации для установления и/или поддержания защитных иммунных ответов. Уровни индуцированного иммунитета можно отслеживать, например, путем измерения количеств нейтрализующих секреторных и сывороточных антител, и при необходимости корригируют дозировки или повторяют вакцинации для вызова или поддержания требуемых уровней защиты.
[0086] Таким образом, в одном варианте осуществления способ индуцирования у субъекта устойчивого иммунитета против вирусной инфекции или по меньшей мере одного из ее симптомов включает введение по меньшей мере одной эффективной дозы наночастиц, где наночастица содержит по меньшей мере один тример, содержащий белок Spike MERS CoV или его фрагмент. В других аспектах наночастица содержит по меньшей мере один тример, состоящий фактически из белка Spike MERS CoV или его фрагмента. В действительности, белок Spike может являться единственным белком в тримере и/или наночастице.
[0087] Способы введения композиции, содержащей наночастицы (вакцины и/или антигенных составов), включают без ограничений парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и чресслизистое (например, интраназальным и пероральным или пульмональным путем, или с помощью суппозиториев). В конкретном варианте осуществления композиции по настоящему раскрытию вводят внутримышечно, внутривенно, подкожно, трансдермально или внутрикожно. Композиции можно вводить с помощью любого удобного пути, например путем инфузии или болюсного введения, путем абсорбции через эпителиальные или слизисто-кожные выстилки (например, слизистую рта, толстой кишки, конъюнктивы, носоглотки, ротоглотки, влагалища, уретры, мочевого пузыря или кишечника и т.д.), и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. В некоторых вариантах осуществления интраназальный или другие чресслизистые пути введения композиции, содержащей наночастицы, могут индуцировать гуморальный или другой иммунный ответ, который в значительной степени выше, чем при других путях введения. В другом варианте осуществления интраназальный или другие чресслизистые пути введения композиции, содержащей наночастицы, может индуцировать гуморальный или другой иммунный ответ, который будет индуцировать перекрестную защиту против других штаммов вируса. Введение может быть системным или местным. Состав профилактической вакцины вводят системно, например, путем подкожной или внутримышечной инъекции с использованием иглы и шприца или безыгольного инъекционного устройства. В качестве альтернативы, вакцинный состав вводят интраназально, либо по каплям, в виде крупнодисперсного аэрозоля (более приблизительно 10 микрон), либо распыляют в верхних дыхательных путях. Хотя любой из вышеуказанных путей доставки приводит в результате к иммунному ответу, интраназальное введение предоставляет дополнительное преимущество в том, что вызывает мукозный иммунитет в месте проникновения вируса.
[0088] В еще одном варианте осуществления вакцину и/или антигенный состав вводят таким образом, чтобы целенаправленно воздействовать на слизистые ткани для вызова иммунного ответа в месте иммунизации. Например, на слизистые ткани, такие как лимфоидная ткань, ассоциированная с кишечником (GALT), можно целенаправленно воздействать для иммунизации путем перорального введения композиций, которые содержат адъюванты с определенными свойствами целенаправленного воздействия на слизистые. Также можно проводить целенаправленное воздействие на дополнительные слизистые ткани, такие как лимфоидная ткань носоглотки (NALT) и лимфоидная ткань бронхов (BALT).
[0089] Вакцины и/или антигенные составы также можно вводить на основе схемы дозирования, например, первичное введение вакцинной композиции с последующими бустерными введениями. В определенных вариантах осуществления вторую дозу композиции вводят в любое место в пределах от двух недель до одного года, предпочтительно от приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5 до приблизительно 6 месяцев после первичного введения. Кроме того, после второй дозы можно вводить третью дозу, и ее вводят от приблизительно трех месяцев до приблизительно двух лет, или даже более, предпочтительно через от приблизительно 4, приблизительно 5 или приблизительно 6 месяцев или приблизительно 7 месяцев до приблизительно одного года после первичного введения. Если после второй дозы в сыворотке и/или моче, или выделениях слизистых не выявлены уровни специфичных иммуноглобулинов, или они низкие, то введение третьей дозы является необязательным. В предпочтительном варианте осуществления вторую дозу вводят через приблизительно один месяц после первого введения, а третью дозу вводят через приблизительно шесть месяцев после первого введения. В другом варианте осуществления вторую дозу вводят через приблизительно шесть месяцев после первого введения.
[0090] В другом варианте осуществления наночастицу можно вводить как часть комбинированной терапии. Например, наночастицы можно составлять с другими иммуногенными композициями и/или противовирусными препаратами.
[0091] Дозировку фармацевтического состава может легко определить специалист в данной области, например, вначале определив дозы, эффективные для вызова профилактического или терапевтического иммунного ответа, например, путем измерения сывороточного титра иммуноглобулинов, специфичных в отношении вируса, или путем измерения коэффициента подавления антител в образцах сыворотки или образцах мочи, или секретах слизистых. Указанные дозировки можно определить по исследованиям на животных.
[0092] Кроме того, специалист в данной области может проводить клинические исследования на людях для определения предпочтительной эффективной дозы для людей. Такие клинические исследования являются принятыми и хорошо известными в данной области. Точная доза, подлежащая применению, также будет зависеть от пути введения. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых доза-ответ, полученных в in vitro тестовых системах или тестовых системах с животными.
[0093] Также, как хорошо известно из уровня техники, иммуногенность конкретной композиции можно повысить путем использования неспецифических стимуляторов иммунного ответа, известных как адъюванты. Адъюванты использовали в экспериментальных условиях для стимуляции общего повышения иммунитета против неизвестных антигенов (например, патент США №4877611). В протоколах иммунизации адъюванты для стимуляции ответов применялись в течение многих лет, и в таком качества адъюванты хорошо известны специалисту в данной области. Ряд адъювантов воздействет на путь, при котором происходит презентирование антигенов. Например, иммунный ответ повышается, когда белковые антигены осаждают с помощью алюмокалиевых квасцов. Эмульгирование антигенов также продлевает продолжительность презентирования антигена. Адъюванты могут быть включены. Подходящие адъюванты включают описанные в Vogel et al., "А Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)", включенную в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
[0094] Другие иллюстративные адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (неспецифический стимулятор иммунного ответа, содержащий убитые Mycobacterium tuberculosis), неполные адъюванты Фрейнда и адъювант на основе гидроксид алюминия. Другие адъюванты включают GMCSP, BCG, гидроксид алюминия, соединения MDP, такие как thur-MDP и nor-MDP, CGP (МТР-РЕ), липид A, Montanide ISA 206 и монофосфориллипид A (MPL). Также предусмотрена система RIBI, которая содержит три компонента, выделенные из бактерий, MPL, трегалозы димиколат (TDM) и скелет клеточной стенки (CWS) в 2% эмульсии сквалена/Tween 80. Также можно применять MF-59, Novasomes®, антигены для МНС.
[0095] В одном из вариантов осуществления адъювант представляет собой олиголамеллярную липидную везикулу, содержащую от приблизительно двух до десяти бислоев, расположенных в форме фактически сферических оболочек, разделенных водными слоями, окружающими крупную аморфную центральную полость без липидных бислоев. Олиголамеллярные липидные везикулы могут проявлять действие в отношении стимуляции иммунного ответа посредством нескольких путей: в качестве неспецифических стимуляторов, в качестве носителей для антигена, в качестве носителей дополнительных адъювантов и их комбинаций. Олиголамеллярные липидные везикулы проявляют свое действие в качестве неспецифических иммуностимуляторов, например, если вакцину получают путем перемешивания антигена с предварительно сформированными везикулами таким образом, что антиген остается снаружи везикул. При инкапсуляции антигена в пределах центральной полости везикулы, везикула действует как иммуностимулятор, так и как носитель антигена. В другом варианте осуществления везикулы в основном получают из нефосфолипидных везикул. В других вариантах осуществления везикулы представляют собой Novasome®. Novasome® представляют собой олигослойные нефосфолипидные везикулы в диапазоне от приблизительно 100 нм до приблизительно 500 нм. Они содержат Brij 72, холестерин, олеиновую кислоту и сквален. Было показано, что Novasomes являются эффективным адъювантом для антигенов (см. патенты США №№5629021, 6387373 и 4911928, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей).
[0096] В одном аспекте адъювантный эффект достигается путем применения использования такого средства, как алюмокалиевые квасцы, применяемого в от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1% растворе в фосфатно-солевом буферном растворе. В качестве альтернативы, наночастицы можно получить в виде смеси с синтетическими полимерами Сахаров (Carbopol®), используемых в виде приблизительно 0,25% раствора. Некоторые адъюванты, например, некоторые органические молекулы, полученные из бактерий, действуют на хозяина, а не на антиген. Примером может служить мурамилдипептид (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин [MDP]), являющийся бактериальным пептидогликаном. В других вариантах осуществления также могут быть использованы гемоцианины и гемоэритрины. Использование гемоцианина из моллюсков семейства фиссурелловые (KLH) является предпочтительным в определенных вариантах осуществления, хотя можно использовать гемоцианины и гемоэритрины других моллюсков и членистоногих.
[0097] Разные полисахаридные адъюванты также можно использовать. Например, было описано применение различных пневмококковых полисахаридных адъювантов при гуморальном ответе у мышей (Yin et al., 1989). Дозы, которые вызывают оптимальные ответы, или которые по другим причинам не вызывают подавление, следует использовать как указано (Yin et al., 1989). Полиаминовые модификации полисахаридов являются особенно предпочтительными, такие как хитин и хитозан, в том числе деацетилированный хитин. В другом варианте осуществления липофильное дисахарид-трипептидное производное мурамилдипептида, которое описано для использования в искусственных липосомах, образованных фосфатидилхолином и фосфатидилглицеролом.
[0098] Другие подходящие адъюванты включают амфипатические и поверхностно-активные вещества, например, сапонин и производные, такие как QS21 (Cambridge Biotech). Адъюванты на основе сапонина включают содержащие Matrix А и Matrix С по отдельности и в комбинации. Иллюстративные подходящие адъюванты на основе сапонинов описаны в опубликованных заявках на патент США 20120107353 и 20110081378, которые включены в данный документ посредством ссылки для всех целей.
[0099] Также можно использовать неионогенные поверхностно-активные вещества из блок-сополимеров (Rabinovich et al., 1994). Олигонуклеотиды являются еще одной применимой группой адъювантов (Yamamoto et al., 1988). Quil А и lentinen представляют собой другие адъюванты, которые можно использовать в определенных вариантах осуществления.
[00100] Еще одну группу адъювантов составляют обезвреженные эндотоксины, такие как очищенный обезвреженный эндотоксин из патента США №4866034. Эти очищенные нейтрализованные эндотоксины эффективны в получении у позвоночных ответов на адъюванты. Естественно обезвреженные эндотоксины можно комбинировать с другими адъювантами для получения композиции из нескольких адъювантов. Например, конкретно предусматривается комбинация нейтрализованных эндотоксинов с трегалозы димиколатом, что описано в патенте США №4435386. Также предусматриваются как комбинации нейтрализованных эндотоксинов с трегалозы димиколатом и эндотоксическими гликолипидами (патент США №4505899), так и комбинация нейтрализованных эндотоксинов со скелетом клеточной стенки (CWS) или CWS и трегалозы димиколата, что описано в патентах США №№4436727, 4436728 и 4505900. Комбинации только CWS и трегалозы димиколата без нейтрилизованных эндотоксинов также предусматриваются как полезные, что описано в патенте США №4520019.
[00101] Специалистам в данной области известны различные типы адъювантов, которые можно конъюгировать с вакцинами, в том числе алкиллизофосфолипиды (ALP); BCG и биотин (включая биотинилированные производные) среди прочих. Конкретными адъювантами, особенно предпочтительными для использования, являются тейхоевые кислоты из грамотрицательных клеток. К ним относятся липотейхоевые кислоты (LTA), рибитолтейхоевые кислоты (RTA) и глицеролтейхоевая кислота (GTA). Активные формы их синтетических аналогов также можно использовать. (Takada et al., 1995).
[00102] Разные адъюванты, даже те, которые обычно не используют в организме человека, можно, тем не менее, использовать у других позвоночных, где, например, желательна выработка антитела или в дальнейшем получение активированных Т-клеток. Токсичность или другие побочные эффекты, которые могут возникнуть из-за адъюванта или клеток, что например, может происходить при использовании необлученных опухолевых клеток, в таких обстоятельствах не имеет какого-либо значения.
[00103] Еще один способ индуцирования иммунного ответа можно осуществлять путем составления наночастиц с "иммуностимуляторами". Такие иммуностимуляторы представляют собой собственные химические посредники организма (цитокины) для усиления ответа иммунной системы. Иммуностимуляторы включают без ограничения различные цитокины, лимфокины и хемокины с иммуностимулирующей, иммунопотенцирующей и провоспалительной активностью, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); факторы роста (например, гранулоцитарно-макрофагальный (GМ)-колониестимулирующий фактор (CSF)); и другие иммуностимулирующие молекулы, такие как макрофагальный воспалительный фактор, лиганд Flt3, В7.1; В7.2 и т.д. Иммуностимулирующие молекулы можно вводить в том же составе, что и наночастицы, или можно вводить отдельно. Для получения иммуностимулирующего эффекта можно вводить либо белок, либо вектор экспрессии, кодирующий белок.
[00104] Алюмокалиевые квасцы могут присутствовать в диапазоне с нижним пределом приблизительно 0,2 мкг, приблизительно 0,4 мкг, приблизительно 0,6 мкг приблизительно 0,8 мкг, приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 3 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 6 мкг, приблизительно 7 мкг, приблизительно 9 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 35 мкг, 40 мкг, приблизительно 45 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 60 мкг, приблизительно 70 мкг, приблизительно 80 мкг, приблизительно 90 мкг, приблизительно 100 мкг, приблизительно 110 мкг, приблизительно 120 мкг, приблизительно 130 мкг, приблизительно 140 мкг или приблизительно 150 мкг. Алюмокалиевые квасцы могут присутствовать в диапазоне с верхним пределом приблизительною мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 35 мкг, 40 мкг, приблизительно 45 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 60 мкг, приблизительно 70 мкг, приблизительно 80 мкг, приблизительно 90 мкг, приблизительно 100 мкг, приблизительно 110 мкг, приблизительно 120 мкг, приблизительно 130 мкг, приблизительно 140 мкг, приблизительно 150 мкг или приблизительно 200 мкг. В конкретных аспектах диапазон алюмокалиевых квасцов составляет от приблизительно 80 мкг до приблизительно 120 мкг или от приблизительно 100 мкг до приблизительно 120 мкг.
[00105] Адъювант на основе сапонина может присутствовать в диапазоне с нижним пределом приблизительно 0,2 мкг, приблизительно 0,4 мкг, приблизительно 0,6 мкг, приблизительно 0,8 мкг, приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 3 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 6 мкг, приблизительно 7 мкг, приблизительно 9 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 25 мкг или приблизительно 30 мкг. Адъювант на основе сапонина может присутствовать в диапазоне с верхним пределом приблизительно 10 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 35 мкг, 40 мкг, приблизительно 45 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 60 мкг, приблизительно 70 мкг, приблизительно 80 мкг, приблизительно 90 мкг, приблизительно 100 мкг, приблизительно 110 мкг, приблизительно 120 мкг, приблизительно 130 мкг, приблизительно 140 мкг, приблизительно 150 мкг или приблизительно 200 мкг. В конкретных аспектах диапазон адъюванта на основе сапонина составляет от приблизительно 5 мкг до приблизительно 20 мкг или от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мкг.
[00106] Эти дозы являются особенно подходящими для мышей и их можно скорректировать для применения у человека, исходя из типичного веса мыши 20 г в сравнении с весом человека приблизительно 60 кг.
Способ стимуляции иммунного ответа против MERS CoV
[00107] Наночастицы являются пригодными для получения иммуногенных композиций для стимуляции иммунного ответа, который обеспечивает иммунитет или устойчивый иммунитет к вирусам MERS CoV. Как мукозальный, так и клеточный иммунитет могут вносить вклад в иммунитет к инфекции и заболеванию. Антитела, секретируемые местно в верхних дыхательных путях, представляют собой главный фактор устойчивости к естественным инфекциям. Секреторный иммуноглобулин A (sIgA) вовлечен в защиту верхних дыхательных путей, а сывороточный IgG в защиту нижних дыхательных путей. Иммунный ответ, индуцированный инфекцией, защищает от повторного заражения тем же вирусом или антигенно подобным штаммом вируса. Антитела, продуцированные в хозяине после иммунизации наночастицами, раскрытыми в данном документе, можно также вводить другим, тем самым обеспечивая пассивное введение субъекту.
[00108] Настоящее раскрытие обеспечивает способ получения высокоаффинных антител к MERS-CoV. Высокоаффинные антитела, полученные при иммунизации с наночастицами, раскрытыми в данном документе, получают путем введения животному иммуногенной композиции, содержащей наночастицу MERS-CoV, отбора у животного сыворотки и/или плазмы и очистки антитела от сыворотки и/или плазмы. В одном варианте осуществления животное представляет собой человека. В одном варианте осуществления животное представляет собой корову или лошадь. В другом варианте осуществления корова или лошадь является трансгенной. В еще одном варианте осуществления трансгенная корова или лошадь продуцирует человеческие антитела. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение адъюванта или иммуностимулирующего соединения. В еще одном варианте осуществления очищенное высокоаффинное антитело вводят субъекту-человеку. В одном варианте осуществления субъект-человек подвержен риску инфекции MERS-CoV.
[00109] Наночастицы могут индуцировать устойчивый иммунитет у позвоночного (например, человека) при введении указанному позвоночному. Устойчивый иммунитет является результатом иммунного ответа против наночастиц, который защищает или облегчает тяжесть инфекции, или по меньшей мере уменьшает симптом вирусной инфекции у указанного позвоночного. В ряде случаев, если указанное позвоночное заражается, указанная инфекция будет бессимптомной. Ответ может представлять собой неполный защитный ответ. В этом случае, если указанное позвоночное инфицировано вирусом MERS CoV, позвоночное будет испытывать уменьшенные симптомы или симптомы более короткой продолжительности по сравнению с неиммунизированным позвоночным.
[00110] В одном варианте осуществления настоящее раскрытие обеспечивает способы индуцирования у субъекта устойчивого иммунитета к вирусной инфекции или по меньшей мере к одному ее симптому, включающие введение по меньшей мере одной эффективной дозы наночастицы. В одном варианте осуществления указанное индуцирование устойчивого иммунитета уменьшает продолжительность симптомов MERS. В еще одном варианте осуществления способ индуцирования у субъекта устойчивого иммунитета к вирусной инфекции или по меньшей мере к одному из ее симптомов включает введение по меньшей мере одной эффективной дозы наночастицы. В еще одном варианте осуществления указанный субъект является млекопитающим. В еще одном варианте осуществления указанное млекопитающее является человеком. В еще одном варианте осуществления указанная наночастица составлена с адъювантом или иммуностимулятором.
[00111] В вариантах осуществления доза каждого антигена, присутствующая в композиции, может составлять приблизительно 0,2 мкг, приблизительно 0,4 мкг, приблизительно 0,6 мкг, приблизительно 0,8 мкг, приблизительно 1 мкг, приблизительно 2 мкг, приблизительно 3 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 5 мкг, приблизительно 6 мкг, приблизительно 7 мкг, приблизительно 9 мкг, приблизительно 10 мкг, приблизительно 15 мкг, приблизительно 20 мкг, приблизительно 25 мкг, приблизительно 30 мкг, приблизительно 35 мкг, 40 мкг, приблизительно 45 мкг, приблизительно 50 мкг, приблизительно 60 мкг, приблизительно 70 мкг, приблизительно 80 мкг, приблизительно 90 мкг, приблизительно 100 мкг, приблизительно 110 мкг, приблизительно 120 мкг, приблизительно 130 мкг, приблизительно 140 мкг или приблизительно 150 мкг. Например, количество можно измерять в соответствии с содержанием белка Spike MERS. Например, 1 мкг наночастицы составляет приблизительно 1 мкг Spike MERS.
Антитела, получаемые при иммунизации наночастицами
[00112] Наночастицы, раскрытые в данном документе, индуцируют у хозяина продуцирование высокоаффинных антител к MERS-CoV. Эти высокоаффинные антитела к MERS-CoV демонстрируют более высокую аффинность, чем антитела к MERS-Co-V, полученные традиционными способами (например, с фаговым дисплеем; см. Zhang et al. 2014)).
[00113] Термин "аффинность" относится к силе взаимодействия между эпитопом и антигенсвязывающим сайтом антитела. Аффинность можно определить, например, с помощью уравнения:
[00114] Где KA=константа аффинности; [Ab] = молярная концентрация незанятых сайтов связывания на антителе; [Ag] = молярная концентрация незанятых сайтов связывания на антигене и [Ab-Ag] = молярная концентрация комплекса антиген-антитело. KA описывает, сколько комплексов антиген-антитело существует в момент достижения равновесия. Время, необходимое для этого, зависит от скорости диффузии и одинаково для каждого антитела. Однако высокоаффинные антитела будут связывать большее количество антигена за более короткий период времени, чем низкоаффинные антитела. KA (константа аффинности) полученных антител может варьировать и находиться в диапазоне от приблизительно 105 моль-1 до приблизительно 1012 моль-1 или более. На KA могут влиять такие факторы, как pH, температура и буферная композиция.
[00115] Полученные антитела могут быть поликлональными антителами или моноклональными антителами. Аффинность моноклональных антител можно измерить точно, поскольку они являются однородными и селективными относительно одного эпитопа. Поликлональные антитела являются неоднородными и будут содержать смесь антител различной аффинности, распознающих несколько эпитопов - поэтому можно определить только среднюю аффинность.
[00116] Аффинность антител можно измерить с помощью любых средств, обычно используемых в данной области, включая без ограничения применение биосенсоров, таких как поверхностный плазмонный резонанс (например, Biacore). Единицы резонанса пропорциональны степени связывания растворимого лиганда с иммобилизированным рецептором (или растворимого антитела с иммобилизированным антигеном). Определение количества связывания при равновесии с различными известными концентрациями рецептора (антитела) и лиганда (белкового антигена) позволяет рассчитать константы равновесия (KA, KD) и скорости диссоциации и ассоциации (koff, kon).
[00117] Например, KD (равновесная константа диссоциации) представляет собой соотношение koff/kon антитела и его антигена. KD и аффинность имеют обратную зависимость. Более низкое значение KD (более низкая концентрация антитела), более высокая аффинность антитела. Большинство антител имеют значения KD в низком от микромолярного (10-6) до наномолярного (10-7 до 10-9) диапазона. Высокоаффинные антитела, как правило, рассматриваются как находящиеся в низком наномолярном диапазоне (10-9) с в значительной степени высокоаффинными антителами, находящимися в пикомолярном (10-12) диапазоне или ниже (например, диапазон от 10-13 до 10-14). В одном из вариантов осуществления антитела, полученные при иммунизации наночастицами, раскрытыми в данном документе, имеют KD в диапазоне от приблизительно 10-6 до приблизительно 10-15, от приблизительно 10-7 до приблизительною 10-15, от приблизительно 10-8 до приблизительно 10-15 и от приблизительно 10-9 до приблизительно 10-15, от приблизительно 10-10 до приблизительно 10-15, от приблизительно 10-11 до приблизительно 10-15, от приблизительно 10-12 до приблизительно 10-15, от приблизительно 10-13 до приблизительно 10-14, от приблизительно 10-13 до приблизительно 10-15 и от приблизительно 10-14 до приблизительно 10-15. В предпочтительном варианте осуществления антитела, полученные при иммунизации наночастицами, раскрытыми в данном документе, имеют KD в диапазоне от приблизительно 10-10 до приблизительно 10-14.
[00118] Антитела, полученные при иммунизации наночастицами, раскрытыми в данном документе, имеют низкую степень диссоциации (Koff), что указывает на их тесную связь с антигеном. В одном из вариантов осуществления антитела, полученные при иммунизации наночастицами, раскрытыми в данном документе, имеют Koff в диапазоне от приблизительно 10-3 М-1 до приблизительно 10-13 М-1, от приблизительно 10-5 М-1 до приблизительно 10-13 М-1, от приблизительно 10-6 М-1 до приблизительно 10-13 М-1, от приблизительно 10-7 М-1 до приблизительно 10-13 М-1, от приблизительно 10-8 М-1 до приблизительно 10-13 М-1, от приблизительно 10-9 М-1 до приблизительно 10-13 М-1, от приблизительно 10-10 М-1 до приблизительно 10-13 М-1, от приблизительно 10-11 М-1 до приблизительно 10-13 М-1 или от приблизительно 10-12 М-1 до приблизительно 10-13 М-1. В еще одном варианте осуществления антитела, полученные при иммунизации наночастицами, раскрытыми в данном документе, имеют Koff в диапазоне от приблизительно 10-4 М-1 до приблизительно 10-10 М-1, от приблизительно 10-4 М-1 до приблизительно 10-9 М-1 или от приблизительно 10-4 М-1 до приблизительно 10-8 М-1.
[00119] Антитела, полученные при иммунизации наночастицами, раскрытыми в данном документе, имеют высокую степень ассоциации (Kon), что указывает на их плотное связывание с антигеном. В одном из вариантов осуществления антитела, полученные при иммунизации наночастицами, раскрытыми в данном документе, имеют Kon в диапазоне от приблизительно 103 М до приблизительно 108 М, от приблизительно 104 М до приблизительно 107 М, от приблизительно 104 М до приблизительно 106 М, от приблизительно 104 М до приблизительно 105 М, от приблизительно 105 М до приблизительно 107 М или от приблизительно 105 М до приблизительно 106 М.
[00120] Антитела, полученные при иммунизации наночастицами, раскрытыми в данном документе, нейтрализуют вирус MERS-CoV. Антитела могут быть нейтрализующими антителами широкого спектра и нейтрализоввать один или более штаммов вируса MERS-CoV, клад или коронавирусов, или антитела могут нейтрализовать только один штамм вируса MERS-CoV. Нейтрализующую способность антител можно измерить с помощью любых средств, обычно используемых в данной области, включая без ограничения тест нейтрализации по снижению флуоресценции (FRNT50), клеточные анализы in vitro, в которых измеряют количество вирионов, высвободившихся из иммунизированных клеток, и анализы in vivo, в которых оценивают инфекцию у иммунизированного животного.
[00121] Настоящее раскрытие дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не должны толковаться как ограничивающие. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных заявок на патент, процитированных на протяжении настоящей заявки, а также фигуры включены посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.
Пример 1.
Получение наночастиц Spike MERS CoV
[00122] Наночастицы получали при помощи сверхэкспрессии белка Spike MERS CoV (фигуры 8 и 9) в бакуловирусе в клетках Sf9. После очистки белок Spike, входящий в состав VLP-наночастиц, извлекали преимущественно в форме тримера (фигуры 4 и 6).
Пример 2.
Индукция иммунного ответа при помощи наночастиц Spike MERS CoV
[00123] VLP вводили мышам, как показано на фигуре 5. В конце 45-дневного периода у мышей отбирали кровь для оценки иммунного ответа. На фигуре 7 проиллюстрированы титры нейтрализующих антител у мышей, которым вводили VLP-наночастицы Spike SARS CoV или VLP-наночастицы Spike MERS CoV. Наиболее высокий ответ получали при использовании адъюванта Matrix M1.
Пример 3.
Высокоактивный человеческий иммуноглобулин к MERS-CoV, полученный из трансхромосомных коров, ингибирует MERS-CoV In Vivo
[00124] Для того, чтобы продемонстрировать способность антител hIgG к MERS CoV и иммуноглобулина, полученного из Tc-коров после вакцинации, нейтрализовать MERS CoV in vitro и in vivo, вводили три экспериментальные вакцины против MERS CoV трем отдельным группам Tc-коров для индукции высоких титров нейтрализующих антител к MERS CoV. Первая протестированная вакцина представляла собой вакцину на основе цельного убитого вириона (WKV) MERS-CoV штамма Jordan (клады А), вторая представляла собой вакцину на основе наночастиц Spike (SN) MERS-CoV Al-Hasa (клады В), а третья представляла собой вакцину на основе пДНК, кодирующей белок Spike MERS-CoV Al-Hasa. В анализе in vitro было обнаружено, что вакцина на основе пДНК характеризуется слабой иммуногенностью, и ее в дальнейшем не оценивали (данные не представлены). Однако сыворотка реконвалесцентов и высокоочищенный иммуноглобулин hIgG от вакцинированных как с использованием WKV (названный SAB-300), так и с использованием SN (названный SAB-301) Tc-коров, были способны к перекрестной нейтрализации вируса in vitro, не вызывали антитело-зависимое проникновение вируса MERS-CoV в человеческие В-клетки Raji и быстро устраняли вирусную инфекцию (штамм Erasmus) в мышиной модели MERS-CoV с трансдукцией Ad5-hDPP4.
СПОСОБЫ И МАТЕРИАЛЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ НА ЖИВОТНЫХ
Клонирование трансхромосомных (Тс) коров и получение антител
[00125] Tc-коров получали, как описано в Matsushita et al. PLoS One, 2014. 9(3): p. e90383, Sano et al. PLoS One, 2013. 8(10): p. e78119 и Kuroiwa, et al., Nat Biotechnol, 2009. 27(2): p. 173-81. Вкратце, Tc-коровы, использованные в данном исследовании, являются гомозиготными по тройному нокауту в генах эндогенных иммуноглобулинов коров (IGHM-/- IGHML1-/- IGL-/-) и несут человеческую искусственную хромосому (НАС), состоящую из фрагмента хромосомы 14 человека, который содержит полный локус тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и фрагмента хромосомы 2 человека, который содержит полный локус легкой каппа-цепи иммуноглобулина человека.
Получение цельного инактивированного вириона
[00126] Цельные инактивированные вирионы MERS-CoV получали для вакцинации путем отбора среды из клеток Vero CCL-81, инфицированных штаммом Jordan-N3/2012 (GenBank KC776174.1). MERS-CoV, в количестве 4×108 БОЕ, облучали кобальтовым источником до достижения дозы 6 Мрад. Проводили испытание безопасности материала после инактивации. Каких-либо специфических сигнальных последовательностей MERS-CoV в облученном материале пассажей не обнаружили.
Получение наночастиц Spike MERS-CoV
[00127] Получали очищенные наночастицы белка Spike MERS-CoV штамма Al-Hasa, как описано в Coleman et al. 2014. Вкратце, клетки Sf9 при 2-3×106 клеток/мл инфицировали специфическим рекомбинантным бакуловирусом. Инфицированные клетки Sf9 инкубировали при непрерывном перемешивании при температуре 27±2°C и собирали в 68-72 часа после инфицирования путем центрифугирования при 4000 g в течение 15 минут. Белки Spike экстрагировали из клеточных мембран с помощью неионогенного детергента, и нерастворимый материал удаляли путем центрифугирования при 10000 g в течение 30 минут. Агрегаты белка Spike очищали с использованием комбинации анионообменной, аффинной и эксклюзионной хроматографии. Во время очистки большую часть детергентов удаляли, позволяя тримерам белка Spike сформировать белок-белковые мицеллярные наночастицы более высокого порядка. Очищенные наночастицы Spike профильтровывали через 0,2 мкм и хранили при -80°C.
Вакцинация Tc-коров
[00128] Как показано на фигуре 10А, трех Tc-коров в группе 1 (#2244; #2252 и #2254) иммунизировали цельным убитым вирусом (WKV) MERS-CoV при 1-2×108 PPF/доза, составленным с адъювантом Montanide ISA 25 (Seppic) в виде эмульсии типа "масло в воде" с добавлением извлеченного из сапонина иммуностимулятора Quil A (Accurate Chemicals). Двух Tc-коров в группе 2 (#2178 и #2183) иммунизировали наночастицей рекомбинантного белка (SN) MERS-CoV при 2 мг/доза, составленной с адъювантом Montanide ISA 206 в виде эмульсии типа "вода в масле в воде" с добавлением Quil А. Tc-коров в обеих группах иммунизировали 5 раз с интервалами от трех до четырех недель.
Провокационные испытания in vivo с MERS-CoV у мышей, трансдуцированных аденовирусом/hDPP4
[00129] Трансдуцированных hDPP4 мышей BALB/c инфицировали MERS-CoV, штамм Erasmus. Вкратце, BALB/c внутрибрюшинно вводили 100 или 500 мкг отрицательного контроля или тестируемого иммуноглобулина, собранного у коров (SAB-300 или SAB-301). Через двенадцать часов мышей инфицировали интраназально MERS-CoV (1×105 БОЕ) в общем объеме 50 мкл. Для получения титров вируса легкие отбирали и помещали в PBS и гомогенизировали с помощью ручного гомогенизатора. Вирус титровали на клетках Vero 81. Титры вируса выражали как БОЕ/г ткани для MERS-CoV.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка антиген-специфического hIgG, полученного от Tc-животных
[00130] Анализы ELISA, специфичные относительно белка Spike MERS-CoV, проводили для оценки специфического к антигену ответа hIgG у Tc-коров после иммунизации с использованием WKV или SN (фигура 10В), и SAB-300, и SAB-301 (фигура 10С). Результаты ELISA продемонстрировали надежный специфичный ответ hIgG на Spike MERS-CoV при второй вакцинации (V2) и сохраняющиеся высокие титры до последней иммунизации (V5) как для сыворотки, так и для SAB-300 и SAB-301 (фигура 10). Эти данные указывают, что hIgG-антитела с высоким титром, целенаправленно воздействующие на белки MERS-CoV, получены у Tc-коров, иммунизированных с использованием WKV или SN, и что оба иммуноглобулина сохраняют активность после очистки.
Нейтрализация MERS-CoV in vitro с использованием сывороток, SAB-300 и SAB-301
Реакция нейтрализации со снижением флуоресценции - 50% снижение (FRNT50)
[00131] Два анализа нейтрализации проводили для выявления потенциала нейтрализации у SAB-300 и SAB-301 in vitro. Исследовали способность сыворотки от вакцинированных коров, SAB-300 и SAB-301 ингибировать инфекцию MERS-CoV in vitro с использованием реакции нейтрализации со снижением флуоресценции (FRNT50) и анализа нейтрализации вирусной инфекции. Анализ FRNT с использованием флуоресценции характеризует инфекцию, а анализ нейтрализации вирусной инфекции характеризует жизнеспособность клеток.
[00132] Анализ FRNT50 проводили с сыворотками от вакцинированных коров (фигура 11А), и SAB-300, и SAB-301 (фигура 11В). Обнаружили, что корова #2244 в V2 продуцировала нейтрализующее антитело с высоким титром, как и в V2 от коров #2178 и #2183. По сравнению с равным количеством положительного контрольного кроличьего антитела к Spike, которое аффинно очищено антигеном, сыворотки крови Тс коров в V2 являются в значительной степени более нейтрализующими. Эти данные согласуются с результатами антиген-специфичного ELISA на фигуре 10В. Затем SAB-300, очищенный hIgG от коровы #2244 в V2, и SAB-301, очищенный hIgG из V2 от #2178 и #2183, тестировали на в отношении нейтрализации в таком же анализе FRNT50. Полученные данные показывают, что SAB-300 и SAB-301 генерируют аналогичные высокие уровни титров нейтрализующих антител (фигура 11С). По сравнению с равными количествами положительного контрольного аффинно очищенного антигеном кроличьего антитела к Spike оба очищенных препарата hIgG были высоко эффективными в отношении нейтрализации MERS-CoV, демонстрируя, что как SAB-300, так и SAB-301 были способны ингибировать инфекцию MERS-CoV in vitro.
[00133] Кроме того, SAB-300 и SAB-301 вызывали выраженную нейтрализацию MERS-CoV, выращенного в клетках Vero Е6, тогда как неспецифическая контрольная сыворотка не оказывала существенного влияния на инфекцию MERS-CoV клеток Vero Е6 (фигура 12А). Уровни инфекционного MERS-CoV, выделенного из клеток, инфицированных MERS-CoV, предварительно обработанного SAB-300, были ниже предела обнаружения анализа (158 TCID50/мл; фигура 12А), указывая на то, что SAB-300 является очень сильным нейтрализующим антителом. Уровни инфекционного MERS-CoV, выделенного из клеток, инфицированных MERS-CoV, предварительно обработанного SAB-301, были ниже предела обнаружения анализа (158 TCID50/мл; фигура 12А) при всех разведения, кроме 1:8000 и 1:16000, что свидетельствует о том, что сывороточное SAB-301 является высокоактивным нейтрализующим антителом, но не в такой степени ингибирующим, как SAB-300.
SAB-300 и SAB-301 не вызывают антителозависимогоусиления MERS-CoV
[00134] Для демонстрации того, что вирусы MERS-CoV, связанные с антителами, не создают возможность проникновения вириона в клетки, которые обычно не инфицируются, клетки Raji, иммортализированную линию В-клеток человека, которую, как правило, не инфицирует MERS-CoV, тестировали, чтобы выяснить, может ли присутствие антител к MERS приводить к транскрипции вирусной РНК и высвобождению живого вируса. Клетки Raji инфицировали MERS-CoV, предварительно инкубированным с SAB-300 и SAB-301 (фигура 12 В). ОТ-ПЦР для вирусной мРНК и анализы по TCID50 проводили на средах через 48 часов после инфицирования для исследования инфекции. Анализ TCID50 не выявил MERS-CoV, высвободившегося из клеток Raji, указывая, что они не были инфицированы MERS-CoV. И наоборот, в данном анализе было обнаружено, что обработанные аналогичным образом клетки Vero Е6, которые как правило инфицируются MERS-CoV, продуцируют высокие уровни вируса через 48 часов после инфицирования (данные не показаны). Для того, чтобы определить, обнаруживалась ли РНК MERS-CoV в клетках Raji, инфицированных MERS-CoV, после предварительной инкубации с SAB-300 и SAB-301, РНК экстрагировали из инфицированных клеток и анализировали с помощью ПЦР Taqman в режиме реального времени с праймерами, специфичными к вновь транскрибированной РНК MERS-CoV (лидерный праймер) (фигура 12В). Не выявили какого-либо значимого уровня вновь транскрибированной вирусной РНК MERS-CoV (набор лидерных праймеров) в клетках Raji, инфицированных только MERS-CoV, обработанных неспецифическим hIgG отрицательного контроля, выделенным из плазмы до вакцинации, или в клетках, инфицированных MERS-CoV, предварительно обработанных SAB-300 или SAB-301. Эти данные свидетельствуют о том, что антителозависимое усиление инфекции MERS-CoV, вызванное SAB-300 или SAB-301, отсутствует.
Ингибирование репликации MERS-CoV in vivo
[00135] Тестировали эффективность SAB-300 и SAB-301 на мышиной модели MERS-CoV. Мыши являются непермиссивными по отношению к MERS-CoV; однако при трансдукции с аденовирусом, экспрессирующим рецептор MERS-CoV, дипептидилпептидазу 4 человека (hDPP4), они становятся пермиссивными и в них происходит репликация вируса (Zhao, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2014. 111(13): p. 4970-5). Для тестирования противовирусной активности Tc-антител мышей BALB/c (6-8 недель) трансдуцировали интраназально с использованием 2,5×108 БОЕ Ad5-hDPP4 в 75 мкл PBS. Через 5 дней после трансдукции мышей обрабатывали путем внутрибрюшинного введения одной дозы 100 или 500 мкг контрольного hIgG, SAB-300 или SAB-301. Двенадцать часов спустя мышей инфицировали интраназально с использованием MERS-CoV (1×105 БОЕ) в общем объеме 50 мкл. Никаких дополнительных введений антитела не проводили на протяжении 5-дневного течения инфекции. На 1-й, 3-й и 5-й дни после инфицирования мышей умерщвляли и анализировали их легкие. Для получения титров вируса легкие гомогенизировали в PBS с помощью ручного гомогенизатора, осветляли путем центрифугирования и титровали на клетках Vero (фигура 13). Титры ~1×106 БОЕ/мг ткани легкого обнаруживали в легких группы без обработки и группы, получающей человеческий IgG отрицательного контроля, в 1-й и 3-й дни после инфицирования с падением титров до 1×105 на 5-й день после инфицирования. У мышей с введением 100 мкг или 500 мкг SAB-300 обнаруживали ~50-кратное или 500-кратное снижение, соответственно, титров вируса на 1-й день после инфицирования по сравнению с группой контрольного введения hIgG (фигура 13А). К 3-му дню после инфицирования снижение титра вируса для группы 100 мкг было ~5000-кратным, тогда как титры у мышей, получивших 500 мкг, были ниже уровня обнаружения. На 5-й день после инфицирования титры вируса в обеих обработанных группах были ниже уровня обнаружения (фигура 13А). Аналогичное снижение титра вируса установили для антитела SAB-301 за исключением того, что легочные титры были несколько выше в 1-й день после инфицирования по сравнению с мышами, обработанными SAB-300 (фигура 13В). К 5-му дню после инфицирования все мыши, обработанные SAB-301, имели титры вируса ниже уровня обнаружения (фигура 13В). Эти данные демонстрируют, что как SAB-300, так и SAB-301 были способны защитить мышей от инфекции MERS-CoV с помощью однократной профилактической инъекции.
Пример 4.
Анализ BIACORE антител у животных, иммунизированных наночастицами белка Spike (S) MERS-CoV
[00136] Авидность двух антител от двух Tc-коров (#2178 и 2183), иммунизированных вакциной на основе наночастиц S MERS-CoV, после серии иммунизаций, как показано на фигуре 10А и в примере 3, тестировали с использованием анализа аффинности к S (Biacore™). Тестировали авидность антител в сыворотке данных животных после 3-й вакцинации (v3), 4-й вакцинации (v4) и 5-й вакцинации (v5). Вкратце, посредством белка A/G, связанного через аминогруппу с чипом СМ5, сывороточный IgG от Tc-коров захватывался в проточной кювете. Антиген белка Spike MERS в концентрации 0, 20 и 40 нМ вводили в проточную кювету в течение 180 секунд с последующей диссоциацией в течение 600 секунд. Использовали модель сглаживания 1:1. Скорости ассоциации и диссоциации измеряли в зависимости от времени и наносили на сенсограмму, и рассчитывали константу диссоциации по скоростям ассоциации и диссоциации. Результаты показаны на фигуре 14 и в таблице 1.
[00137] В таблице 2 показана аффинность моноклональных антител (mAb) к S1, полученных с помощью фагового дисплея, как раскрыто в Ying et al. J. Virol. (2014). Сравнение данных этих двух таблиц демонстрирует, что заявленная KD и скорости Koff антитела для mAb к MERS-CoV, полученных с помощью фагового дисплея, на несколько порядков меньше, чем у поликлональных ответов к S, индуцированных у Tc-коровы.
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[00138] Специалисты в данной области определят или будут способны установить с использованием всего лишь рутинных экспериментов множество эквивалентов специфических вариантов осуществления, описанных в данном документе. Такие эквиваленты охватываются формулой изобретения, представленной в данном документе.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
[00139] Данная заявка включает посредством ссылки все публикации или ссылки, раскрытые в данном документе, для всех целей во всей их полноте.
[00140] Данная заявка включает посредством ссылки для всех целей во всей полноте следующе документы: заявка на патент США с регистрационным №12/306965, поданная 27 июня 2007 года, заявка на патент США с регистрационным №61/015440, поданная 20 декабря 2007 года, заявка на патент США с регистрационным №11/582540, поданная 18 октября 2006 года, заявка на патент США с регистрационным №12/633995, поданная 18 октября 2006 года, заявки на патент США с регистрационным №60/727513, поданная 18 октября 2005 года; 60/780847, поданная 10 марта 2006 года; 60/800006, поданная 15 мая 2006 года; 60/831196, поданная 17 июля 2006 года; 60/832116, поданная 21 июля 2006 года, и 60/845495, поданная 19 сентября 2006 года, и 10/617569, поданная 11 июля 2003 года.
Ссылочные материалы
1. Berglund P., Fleeton M.N., Smerdou С. and Liljestrom, P. (1999). Immunization with recombinant Semliki Forest virus induces protection against influenza challenge in mice. Vaccine 17, 497-507.
2. Cox J.C. and Coulter A.R. (1997). Adjuvants--a classification and review of their modes of action. Vaccine 15, 248-256.
3. Crawford J., Wilkinson В., Vosnesensky A., Smith G., Garcia M., Stone H. and Perdue M. L. (1999). Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes. Vaccine 17, 2265-2274.
4. Crowther R.A., Kiselev N.A., Bottcher В., Berriman J.A., Borisova G.P., Ose V., Pumpens P. (1994). Three-dimensional structure of hepatitis В virus core particles determined by electron cryomicroscopy. Cell 17, 943-50.
5. Gomez-Puertas P., Mena I., Castillo M., Vivo A., Perez-Pastrana E. and Portela, A. (1999). Efficient formation of influenza virus-like particles: dependence on the expression levels of viral proteins. J. Gen. Virol. 80, 1635-1645.
6. Johansson В.E. (1999). Immunization with influenza A virus hemagglutinin and neuraminidase produced in recombinant baculovirus results in a balanced and broadened immune response superior to conventional vaccine. Vaccine 17, 2073-2080.
7. Lakey D.L., Treanor J.J., Betts B.F., Smith G.E., Thompson J., Sannella E., Reed G., Wilkinson В.E. and Wright P.E. (1996) Recombinant baculovirus influenza A hemagglutinin vaccines are well tolerated and immunogenic in healthy adults. J. Infect. Dis. 174, 838-841.
8. Latham T. and Galarza J.M. (2001). Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. J. Virol. 75, 6154-6165.
9. Mena I., Vivo A., Perez E. and Portela A. (1996). Rescue of a synthetic chloramphenicol acetyltransferase RNA into influenza-like particles obtained from recombinant plasmids. J. Virol. 70, 5016-5024.
10. Murphy B.R. and Webster R.G. (1996). Orthomyxoviruses. В "Virology" (D.M.K.B.N. Fields, P.M. Howley, Eds.) Vol. 1, pp. 1397-1445. Lippincott-Raven, Philadelphia.
11. Neumann G, Watanabe T. and Kawaoka Y. (2000). Plasmid-driven formation of influenza virus-like particles. J. Virol. 74, 547-551.
12. Olsen C.W., McGregor M.W., Dybdahl-Sissoko N., Schram B.R, Nelson K. M., Lunn D. P., Macklin M.D. and Swain W.F. (1997). Immunogenicity and efficacy of baculovirus-expressed and DNA-based equine influenza virus hemagglutinin vaccines in mice. Vaccine 15, 1149-1156.
13. Peiris J.S., Guan Y., Markwell D., Ghose P., Webster R.G. and Shortridge K.F. (2001). Cocirculation of avian H9N2 and contemporary "human" H3N2 influenza A viruses in pigs in southwestern China: potential for genetic reassortment? J. Virol. 75, 9679-9686.
14. Pumpens P. and Grens E. (2003). Artificial genes for chimeric virus-like particles. B: "Artificial DNA" (Khudyakov Y.E. и Fields H.A., Eds) pp. 249-327. CRC Press, New York.
15. Pushko P., Parker M., Ludwig G.V., Davis N.L., Johnston R.E. and Smith J.F. (1997). Replicon-helper systems from attenuated Venezuelan equine encephalitis virus: expression of heterologous genes in vitro and immunization against heterologous pathogens in vivo. Virology 239, 389-401.
16. Slepushkin V.A., Katz J.M., Black R.A., Gamble W.C, Rota P.A. and Cox N.J. (1995). Protection of mice against influenza A virus challenged by vaccination with baculovirus-expressed M2 protein. Vaccine 13, 1399-1402.
17. Treanor J.J., Betts R.F., Smith G.E., Anderson E.L., Hackett C.S., Wilkinson В.E., Belshe R.B. and Powers D.C. (1996). Evaluation of a recombinant hemagglutinin expressed in insect cells as an influenza vaccine in young and elderly adults. J. Infect. Dis. 173, 1467-1470.
18. Tsuji M., et al. (1998). Recombinant Sindbis viruses expressing a cytotoxic T-lymphocyte epitope of a malaria parasite or of influenza virus elicit protection against the corresponding pathogen in mice. J. Virol. 72, 6907-6910.
19. Ulmer, J.В., et al. (1993). Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science 259, 1745-1749.
20. Ulmer, J.В., et al. (1998). Protective CD4+ and CD8+ T cells against influenza virus induced by vaccination with nucleoprotein DNA. J. Virol. 72, 5648-5653.
21. Watanabe Т., Watanabe S., Neumann G. и Kawaoka Y. (2002) Immunogenicity and protective efficacy of replication-incompetent influenza virus-like particles. J. Virol. 76, 767-773.
22. Zhou, X., et al. (1995). Generation of cytotoxic and humoral immune responses by non-replicative recombinant Semliki Forest virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3009-3013.
23. Zabel et al. (2014). Viral Particles Drive Rapid Differentiation of Memory В Cells into Secondary Plasma Cells Producing Increased Levels of Antibodies. J. Immunol. 192: 5499-5508.
24. Zhang et al. (2000). HPV6b virus like particles are potent immunogens without adjuvant in man. Vaccine. 18: 1051-8.
Claims (24)
1. Композиция для стимулирования иммунного ответа в отношении MERS-CoV, содержащая (i) эффективное количество наночастиц MERS-CoV, где наночастица содержит по меньшей мере один тример полипептида Spike, и (ii) адъювант на основе сапонина, где адъювант на основе сапонина состоит из Matrix M1.
2. Композиция по п. 1, где наночастица содержит по меньшей мере от приблизительно пяти тримеров до приблизительно 30 тримеров полипептида Spike.
3. Композиция по п. 2, где наночастица содержит по меньшей мере от приблизительно десяти тримеров до приблизительно 20 тримеров полипептида Spike.
4. Композиция по п. 1, где концентрация наночастицы составляет по меньшей мере от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 60 мкг/мл.
5. Композиция по п. 4, где концентрация наночастицы составляет по меньшей мере от приблизительно 30 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл.
6. Композиция по любому из пп. 1-3, где полипептид Spike содержит SEQ ID NO: 2.
7. Композиция по любому из пп. 1-3, где полипептид Spike состоит из SEQ ID NO: 2.
8. Способ получения высокоаффинного антитела человека в отношении MERS-CoV, включающий:
(а) введение трансгенному животному иммуногенной композиции, содержащей наночастицу MERS-CoV и адъювант Matrix M1, где наночастица содержит по меньшей мере один тример полипептида Spike, при этом трансгенное животное выбрано из группы, состоящей из коровы, лошади, свиньи, овцы и козы;
(b) отбор у животного сыворотки и/или плазмы и
(c) очистку антитела от сыворотки и/или плазмы.
9. Способ по п. 8, где наночастица содержит по меньшей мере от приблизительно пяти тримеров до приблизительно 30 тримеров полипептида Spike.
10. Способ по п. 9, где наночастица содержит по меньшей мере от приблизительно десяти тримеров до приблизительно 20 тримеров полипептида Spike.
11. Способ по п. 8, где концентрация наночастицы составляет по меньшей мере от приблизительно 20 мкг/мл до приблизительно 60 мкг/мл.
12. Способ по п. 11, где концентрация наночастицы составляет по меньшей мере от приблизительно 30 мкг/мл до приблизительно 50 мкг/мл.
13. Способ по любому из пп. 8-10, где полипептид Spike содержит SEQ ID NO: 2.
14. Способ по любому из пп. 8-10, где полипептид Spike состоит из SEQ ID NO: 2.
15. Способ по п. 8, дополнительно включающий введение адъюванта.
16. Способ по п. 15, где адъювант выбран из группы, включающей Montanide ISA 206, Quil А, алюмокалиевые квасцы, адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, адъювант на основе сапонина и адъюванты на основе гидроксида алюминия.
17. Способ по п. 8, где животное представляет собой корову или лошадь.
18. Способ по п. 17, где животное, представляющее собой корову или лошадь, является трансгенным животным.
19. Способ по п. 8, где антитело имеет KD от 10-8 до 10-15.
20. Способ по п. 19, где антитело имеет KD от 10-12 до 10-14.
21. Способ по п. 8, дополнительно включающий введение субъекту-человеку очищенного высокоаффинного антитела.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361880111P | 2013-09-19 | 2013-09-19 | |
US61/880,111 | 2013-09-19 | ||
PCT/US2014/056517 WO2015042373A1 (en) | 2013-09-19 | 2014-09-19 | Immunogenic middle east respiratory syndrome coronavirus (mers-cov) compositions and methods |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016111934A RU2016111934A (ru) | 2017-10-05 |
RU2016111934A3 RU2016111934A3 (ru) | 2018-03-22 |
RU2685185C2 true RU2685185C2 (ru) | 2019-04-16 |
Family
ID=51660661
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016111934A RU2685185C2 (ru) | 2013-09-19 | 2014-09-19 | Иммуногенные композиции коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (mers-cov) и способы |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10751410B2 (ru) |
EP (1) | EP3046579A1 (ru) |
JP (1) | JP6643239B2 (ru) |
KR (1) | KR102399854B1 (ru) |
CN (1) | CN105555306B (ru) |
BR (1) | BR112016006122B1 (ru) |
CA (1) | CA2922258C (ru) |
HK (1) | HK1225631A1 (ru) |
IL (1) | IL244298B (ru) |
MX (1) | MX2016003419A (ru) |
RU (1) | RU2685185C2 (ru) |
SA (1) | SA516370772B1 (ru) |
SG (2) | SG11201601423SA (ru) |
WO (1) | WO2015042373A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2813150C2 (ru) * | 2021-07-16 | 2024-02-06 | Акционерное общество "БИОКАД" | Выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014045254A2 (en) * | 2012-09-23 | 2014-03-27 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Human betacoronavirus lineage c and identification of n-terminal dipeptidyl peptidase as its virus receptor |
WO2014134439A1 (en) | 2013-03-01 | 2014-09-04 | New York Blood Center, Inc. | Immunogenic composition for mers coronavirus infection |
CN112057613A (zh) | 2013-11-29 | 2020-12-11 | 宾夕法尼亚大学理事会 | MERS-CoV疫苗 |
US11103575B2 (en) | 2014-02-28 | 2021-08-31 | The New York Blood Center, Inc. | Immunogenic composition for MERS coronavirus infection |
JP2017006008A (ja) * | 2015-06-17 | 2017-01-12 | オーストリッチファーマ株式会社 | Mers用抗体および抗血清 |
AU2016315478B2 (en) | 2015-09-03 | 2023-07-13 | Novavax, Inc. | Vaccine compositions having improved stability and immunogenicity |
CN106119213A (zh) * | 2016-06-20 | 2016-11-16 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 以流感病毒M1为骨架的MERS‑CoV嵌合型VLPs疫苗 |
EP3541419B1 (en) * | 2016-11-18 | 2022-01-05 | New York Blood Center, Inc. | Immunogenic composition for mers coronavirus infection |
KR20180058206A (ko) * | 2016-11-23 | 2018-05-31 | 에스케이케미칼 주식회사 | 중동호흡기증후군 코로나바이러스 s 단백질 면역원 조성물 및 이의 제작 방법 |
KR102167727B1 (ko) * | 2017-06-21 | 2020-10-20 | 경희대학교 산학협력단 | 드로소필라 멜라노개스터 s2를 이용한 메르스 항원 단백질 생산방법 |
KR101895228B1 (ko) * | 2017-08-23 | 2018-10-30 | 대한민국 | 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 스파이크 단백질에 대한 단일클론항체 및 이의 용도 |
JP7417532B2 (ja) | 2018-03-19 | 2024-01-18 | ノババックス,インコーポレイテッド | 多価インフルエンザナノ粒子ワクチン |
US10953089B1 (en) | 2020-01-27 | 2021-03-23 | Novavax, Inc. | Coronavirus vaccine formulations |
JP2023512648A (ja) * | 2020-01-27 | 2023-03-28 | ノババックス,インコーポレイテッド | コロナウイルスワクチン製剤 |
US11202753B1 (en) | 2020-03-06 | 2021-12-21 | Aquavit Pharmaceuticals, Inc. | Systems and methods for generating immune responses in subjects using microchannel delivery devices |
CN111484560A (zh) * | 2020-03-24 | 2020-08-04 | 深圳市华启生物科技有限公司 | 冠状病毒模型及其应用 |
CN111450047A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-07-28 | 天津大学 | 一种mers病毒免疫凝胶制剂的合成方法 |
US20230203101A1 (en) * | 2020-04-22 | 2023-06-29 | POSTECH Research and Business Development Foundation | Coronavirus Disease 2019(COVID -19) Recombinant Spike Protein Forming Trimer, Method for Mass Producing Recombinant Spike Protein in Plants, and Method for Preparing Vaccine Composition on Basis Thereof |
US11129890B1 (en) * | 2020-05-19 | 2021-09-28 | Vigene Biosciences, Inc. | Non-integrating HIV-1 comprising mutant RT/IN proteins and the SARS-CoV-2 spike protein |
CN113943373B (zh) * | 2020-10-27 | 2022-09-06 | 中国科学院微生物研究所 | 一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用 |
WO2022115503A1 (en) * | 2020-11-25 | 2022-06-02 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Treatment and prevention of coronavirus infection |
CN113861278B (zh) * | 2021-06-18 | 2022-08-05 | 国药中生生物技术研究院有限公司 | 一种产生广谱交叉中和活性的重组新型冠状病毒rbd三聚体蛋白疫苗、其制备方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009081285A2 (en) * | 2007-12-17 | 2009-07-02 | Medical Research Council Technology | Hepatitis c virus antibodies |
RU2403063C1 (ru) * | 2009-08-28 | 2010-11-10 | Автономная некоммерческая организация "Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных" (АНО "НИИ ДПБ") | Вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US1544007A (en) | 1921-08-11 | 1925-06-30 | Hughes Arthur Sheridan | Toilet partition |
US4520019A (en) | 1982-04-29 | 1985-05-28 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Stable composition and preparation thereof |
US4436727A (en) | 1982-05-26 | 1984-03-13 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Refined detoxified endotoxin product |
US4505900A (en) | 1982-05-26 | 1985-03-19 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Refined detoxified endotoxin product |
US4435386A (en) | 1982-05-26 | 1984-03-06 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Refined detoxified endotoxin product |
US4436728A (en) | 1982-05-26 | 1984-03-13 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Refined detoxified endotoxin product |
US4866034A (en) | 1982-05-26 | 1989-09-12 | Ribi Immunochem Research Inc. | Refined detoxified endotoxin |
US4505899A (en) | 1982-05-26 | 1985-03-19 | Ribi Immunochem Research, Inc. | Refined detoxified endotoxin product |
US4877611A (en) | 1986-04-15 | 1989-10-31 | Ribi Immunochem Research Inc. | Vaccine containing tumor antigens and adjuvants |
US4911928A (en) | 1987-03-13 | 1990-03-27 | Micro-Pak, Inc. | Paucilamellar lipid vesicles |
US6387373B1 (en) | 1993-01-15 | 2002-05-14 | Novavax, Inc. | Vaccines containing paucilsmellar lipid vesicles as immunological adjuvants |
US5629021A (en) | 1995-01-31 | 1997-05-13 | Novavax, Inc. | Micellar nanoparticles |
AU2003219760A1 (en) | 2002-02-14 | 2003-09-04 | Novavax, Inc. | Optimization of gene sequences of virus-like particles for expression in insect cells |
US7375202B2 (en) * | 2003-03-24 | 2008-05-20 | The University Of Hong Kong | Human virus causing severe acute respiratory syndrome (SARS) and uses thereof |
SE0300795D0 (sv) | 2003-03-24 | 2003-03-24 | Isconova Ab | Composition comprising iscom particles and live micro-organisms |
CN1237184C (zh) * | 2003-06-03 | 2006-01-18 | 中国科学院上海药物研究所 | 抗SARS-CoV药物作用靶标、药物筛选方法及抗SARS药物 |
DK3067064T3 (da) | 2008-12-09 | 2020-06-08 | Novavax Inc | Modificerede rsv-f-proteiner og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
CN102470168A (zh) | 2009-07-10 | 2012-05-23 | 伊斯克诺瓦公司 | 新组合物 |
-
2014
- 2014-09-19 KR KR1020167007733A patent/KR102399854B1/ko active IP Right Grant
- 2014-09-19 EP EP14780994.1A patent/EP3046579A1/en active Pending
- 2014-09-19 CN CN201480051512.9A patent/CN105555306B/zh active Active
- 2014-09-19 JP JP2016544012A patent/JP6643239B2/ja active Active
- 2014-09-19 MX MX2016003419A patent/MX2016003419A/es unknown
- 2014-09-19 SG SG11201601423SA patent/SG11201601423SA/en unknown
- 2014-09-19 RU RU2016111934A patent/RU2685185C2/ru active
- 2014-09-19 CA CA2922258A patent/CA2922258C/en active Active
- 2014-09-19 WO PCT/US2014/056517 patent/WO2015042373A1/en active Application Filing
- 2014-09-19 BR BR112016006122-5A patent/BR112016006122B1/pt active IP Right Grant
- 2014-09-19 SG SG10201802194WA patent/SG10201802194WA/en unknown
- 2014-09-19 US US15/023,629 patent/US10751410B2/en active Active
-
2016
- 2016-02-25 IL IL244298A patent/IL244298B/en active IP Right Grant
- 2016-03-17 SA SA516370772A patent/SA516370772B1/ar unknown
- 2016-12-08 HK HK16113985A patent/HK1225631A1/zh unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009081285A2 (en) * | 2007-12-17 | 2009-07-02 | Medical Research Council Technology | Hepatitis c virus antibodies |
RU2403063C1 (ru) * | 2009-08-28 | 2010-11-10 | Автономная некоммерческая организация "Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных" (АНО "НИИ ДПБ") | Вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
YE V LIU ET AL: "Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV", VACCINE, ELSEVIER LTD, GB, vol. 29, no. 38, pages 6606-6613, 29.06.2011. "Novavax creates MERS-CoV vaccine candidate", 7 June 2013 (2013-06-07), Найдено в Интернет по адресу: URL:http://vaccinenewsdaily.com/vaccine_development/325407-novavax-creates-mers-cov-vaccine-candidate/. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2813150C2 (ru) * | 2021-07-16 | 2024-02-06 | Акционерное общество "БИОКАД" | Выделенный рекомбинантный вирус на основе вируса гриппа для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа и/или профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SA516370772B1 (ar) | 2023-01-08 |
US10751410B2 (en) | 2020-08-25 |
KR20160055164A (ko) | 2016-05-17 |
SG10201802194WA (en) | 2018-05-30 |
CA2922258C (en) | 2022-11-29 |
BR112016006122B1 (pt) | 2023-11-14 |
JP6643239B2 (ja) | 2020-02-12 |
IL244298B (en) | 2021-06-30 |
HK1225631A1 (zh) | 2017-09-15 |
CA2922258A1 (en) | 2015-03-26 |
IL244298A0 (en) | 2016-04-21 |
BR112016006122A2 (pt) | 2017-09-26 |
US20160206729A1 (en) | 2016-07-21 |
EP3046579A1 (en) | 2016-07-27 |
KR102399854B1 (ko) | 2022-05-19 |
WO2015042373A1 (en) | 2015-03-26 |
RU2016111934A (ru) | 2017-10-05 |
MX2016003419A (es) | 2016-10-10 |
CN105555306B (zh) | 2019-12-03 |
CN105555306A (zh) | 2016-05-04 |
SG11201601423SA (en) | 2016-04-28 |
JP2016536346A (ja) | 2016-11-24 |
RU2016111934A3 (ru) | 2018-03-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2685185C2 (ru) | Иммуногенные композиции коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (mers-cov) и способы | |
US10548968B2 (en) | Functional influenza virus-like particles (VLPS) | |
US10729760B2 (en) | Functional influenza virus like particles (VLPs) | |
KR101801213B1 (ko) | 변형 rsv f 단백질 및 이들의 사용 방법 | |
CN103865892B (zh) | 功能性流感病毒样颗粒(vlp) | |
MX2014003777A (es) | Vacuna de nanoparticulas de proteinas f del rsv recombinantes para el virus respiratorio sincitial. | |
KR20140021530A (ko) | 변형 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 및 이의 용도 | |
US20220193224A1 (en) | Rsv-based virus-like particles and methods of production and use thereof | |
WO2010148386A1 (en) | Swine-origin influenza a (h1n1) virus-like particles and methods of use thereof | |
RU2575800C2 (ru) | Вирусоподобные частицы (vlp) из гликопротеина вируса бешенства |