JP2023512648A

JP2023512648A - コロナウイルスワクチン製剤

Info

Publication number: JP2023512648A
Application number: JP2022545141A
Authority: JP
Inventors: スミス，ゲイル; ジェイ．マサレ，マイケル; ティアン，ジン－フイ
Original assignee: ノババックス，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2023-03-28
Also published as: CA3165371A1; TW202142555A; WO2021154812A8; EP4097123A4; EP4097123A1; GB2610070A; AU2021214064A1; CN115720581A; WO2021154812A1; MX2022009167A; US20230070886A1; KR20220141302A; GB202212336D0; IL295142A; BR112022014830A2

Abstract

ワクチンでの使用に適しているコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質及びそれを含むナノ粒子が本明細書に開示される。ナノ粒子は、界面活性剤コアを取り囲み、及びそれに会合された病原体からの抗原を提示し、向上した安定性及び良好な免疫原性をもたらす。ワクチン及びナノ粒子を調製するための用量、製剤及び方法も開示される。

Description

関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、あらゆる目的のためにそれぞれ参照によりその全体が組み込まれる、２０２０年１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９６６，２７１号；２０２０年２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／９７６，８５８号；２０２０年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／９８３，１８０号；２０２０年７月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０４８，９４５号；２０２０年７月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０５１，７０６号；２０２０年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／０５４，１８２号；２０２０年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１２９，３９２号；及び２０２０年８月１９日に出願された米国特許出願第１６／９９７，００１号に対する優先権を主張する。

電子的に提出されるテキストファイルの説明
[0002] 本明細書と共に電子的に提出されるテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される：配列表のコンピューター可読形式のコピー（ファイル名：NOVV_088_08WO_SeqList_ST25.txt、記録日：２０２１年１月２６日、ファイルサイズ：５７７キロバイト）。

分野
[0003] 本開示は、概して、免疫応答を刺激するのに有用である、天然に存在しないコロナウイルス（ＣｏＶ）スパイク（Ｓ）ポリペプチド及びナノ粒子並びにそれを含むワクチンに関する。ナノ粒子は、任意選択により界面活性剤コアと会合され、典型的には組換えアプローチを使用して作製される抗原、例えば糖タンパク質抗原を提供する。ナノ粒子は、向上した安定性及び強化されたエピトープの提示を有する。本開示は、ナノ粒子を含む組成物、それを製造する方法及び免疫応答を刺激する方法も提供する。

発明の背景
[0004] 感染症は、世界中で依然として問題である。一部の病原体に対するワクチンの開発が進歩しているが、多くは、依然として人間の健康に対する脅威である。突発性急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）（武漢コロナウイルス及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とも呼ばれる）の発生により、中国では２０００人超が感染し、少なくとも１７人が死亡した。最近、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスは、米国、タイ、韓国、台湾及び日本に広がっている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスは、過去１７年間に何百人もの人々を死亡させた重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）及び中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と同じウイルス科に属している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、疾患ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こす。

[0005] ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのような生命を脅かす感染症の重症度を予防又は軽減するワクチンの開発が望まれている。しかしながら、病原体の非常に洗練された回避メカニズム及びワクチンの安定化が困難であることを理由として、ヒトワクチンの開発は、依然として課題である。任意選択により、ワクチンは、感染病原体をブロック又は中和する抗体を誘導する必要があり、さらに冷蔵できない環境を含む様々な環境で安定性を維持する必要がある。

発明の概要
[0006] 本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（武漢ＣｏＶ及び２０１９－ｎＣｏＶとも呼ばれる）に対する免疫応答を誘発するのに適している、天然に存在しないＣｏＶＳポリペプチドを提供する。本開示は、糖タンパク質を含むナノ粒子及び免疫応答を刺激する方法も提供する。

[0007] 本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）及び重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を含む複数のコロナウイルスに対する免疫応答を誘発するのに適したＣｏＶＳポリペプチドも提供する。

図面の簡単な説明
[0008] 特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、要求及び必要な手数料の支払いに応じて特許庁によって提供される。

[0009]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の野生型アミノ酸配列（配列番号１）の概略図を示す。フューリン切断部位ＲＲＡＲ（配列番号６）は、太字でハイライトされ、シグナルペプチドには下線が引かれている。 [0010]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓポリペプチドの一次構造を示し、この一次構造は、不活性フューリン切断部位、融合ペプチドの欠失並びにＫ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ変異を有する。ドメイン位置は、シグナルペプチドを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の野生型ＣｏＶＳポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）に対して付番されている。 [0011]不活性フューリン切断部位、アミノ酸８１９～８２８の融合ペプチドの欠失並びにＫ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ変異を有する、ＢＶ２３７８ＣｏＶＳポリペプチドの一次構造を示す。ドメイン位置は、シグナルペプチドを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の野生型ＣｏＶＳポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）に対して付番されている。 [0012]ＣｏＶＳポリペプチドＢＶ２３６４、ＢＶ２３６５、ＢＶ２３６６、ＢＶ２３６７、ＢＶ２３６８、ＢＶ２３６９、ＢＶ２３７３、ＢＶ２３７４及びＢＶ２３７５の精製を示す。データは、ＢＶ２３６５（配列番号４）及びＱＱＡＱ（配列番号７）のアミノ酸配列を有する不活性フューリン切断部位を有するＢＶ２３７３（配列番号８７）が一本鎖（Ｓ０）として発現されることを明らかにしている。対照的に、無傷のフューリン切断部位を含むＣｏＶＳポリペプチド（例えば、ＢＶ２３６４、ＢＶ２３６６及びＢＶ２３７４）は、切断産物Ｓ２の存在によって明らかなように切断されている。 [0013]ＣｏＶＳポリペプチドＢＶ２３６１、ＢＶ２３６５、ＢＶ２３６９、ＢＶ２３６５、ＢＶ２３７３及びＢＶ２３７４がヒトアンジオテンシン変換酵素２前駆体（ｈＡＣＥ２）に結合することをバイオレイヤー干渉法によって示す。 [0014]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のＢＶ２３６１が、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ受容体であるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）に結合せず、ＭＥＲＳＳタンパク質がヒトアンジオテンシン変換酵素２前駆体（ｈＡＣＥ２）に結合しないことをバイオレイヤー干渉法によって示す。 [0015]ＢＶ２３６１がｈＡＣＥ２に結合することを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって示す。 [0016]ＢＶ２３７３ＣｏＶＳポリペプチドの一次構造及びフューリン切断部位、Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐに対する改変を示す。 [0017]野生型ＣｏＶＳポリペプチド並びにＣｏＶＳポリペプチドＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３の精製を示す。 [0018]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＥＭＢＩＤ：２１３７４）のcryoEM構造上に重ねられたＢＶ２３７３ＣｏＶＳポリペプチドの低温電子顕微鏡法（cryoEM）による構造を示す。 [0019]ＣｏＶＳスパイクポリペプチドＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３がｈＡＣＥ２に結合することを示す。バイオレイヤー干渉法は、ＢＶ２３６５（図１１Ｂ）及びＢＶ２３７３（図１１Ｃ）が野生型ＣｏＶＳポリペプチド（図１１Ａ）と同様の解離速度でｈＡＣＥ２に結合することを明らかにする。 [0019]ＣｏＶＳスパイクポリペプチドＢＶ２３６５がｈＡＣＥ２に結合することを示す。バイオレイヤー干渉法は、ＢＶ２３６５が野生型ＣｏＶＳポリペプチド（図１１Ａ）と同様の解離速度でｈＡＣＥ２に結合することを明らかにする。 [0019]ＣｏＶＳスパイクポリペプチドＢＶ２３７３がｈＡＣＥ２に結合することを示す。バイオレイヤー干渉法は、ＢＶ２３７３が野生型ＣｏＶＳポリペプチド（図１１Ａ）と同様の解離速度でｈＡＣＥ２に結合することを明らかにする。 [0019]ＣｏＶＳスパイクポリペプチドＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３がｈＡＣＥ２に結合することを示す。ＥＬＩＳＡは、野生型ＣｏＶＳポリペプチド（図１１Ｄ）及びＢＶ２３６５（図１１Ｅ）が同様の親和性でｈＡＣＥ２に結合するが、ＢＶ２３７３（図１１Ｆ）がより高い親和性でｈＡＣＥ２に結合することを示す。 [0019]ＣｏＶＳスパイクポリペプチドＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３がｈＡＣＥ２に結合することを示す。ＥＬＩＳＡは、野生型ＣｏＶＳポリペプチド（図１１Ｄ）及びＢＶ２３６５（図１１Ｅ）が同様の親和性でｈＡＣＥ２に結合するが、ＢＶ２３７３（図１１Ｆ）がより高い親和性でｈＡＣＥ２に結合することを示す。 [0019]ＣｏＶＳスパイクポリペプチドＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３がｈＡＣＥ２に結合することを示す。ＥＬＩＳＡは、野生型ＣｏＶＳポリペプチド（図１１Ｄ）及びＢＶ２３６５（図１１Ｅ）が同様の親和性でｈＡＣＥ２に結合するが、ＢＶ２３７３（図１１Ｆ）がより高い親和性でｈＡＣＥ２に結合することを示す。 [0020]ＣｏＶＳポリペプチドＢＶ２３７３のｈＡＣＥ２への結合に対する、温度、２回の凍結／解凍サイクル、酸化、撹拌及び極端なｐＨなどのストレス条件の影響を示す。 [0020]ＣｏＶＳポリペプチドＢＶ２３６５のｈＡＣＥ２への結合に対する、温度、２回の凍結／解凍サイクル、酸化、撹拌及び極端なｐＨなどのストレス条件の影響を示す。 [0021]画分Ａ及び画分Ｃｉｓｃｏｍマトリックス（例えば、MATRIX-M（商標））を伴う又は伴わない、０．１μｇ～１０μｇのＢＶ２３７３の２回の投与でのマウスの免疫の１３日後、２１日後及び２８日後の抗ＣｏＶＳポリペプチドＩｇＧ力価を示す。 [0021]画分Ａ及び画分Ｃｉｓｃｏｍマトリックス（例えば、MATRIX-M（商標））を伴う又は伴わない、０．１μｇ～１０μｇのＢＶ２３７３の１回の投与でのマウスの免疫の１３日後、２１日後及び２８日後の抗ＣｏＶＳポリペプチドＩｇＧ力価を示す。 [0022]MATRIX-M（商標）を伴う又は伴わない、０．１μｇ～１０μｇのＢＶ２３７３の１回の投与又は２回の投与で免疫されたマウスにおけるｈＡＣＥ２の相互作用をブロックする抗体の誘導を示す。 [0023]MATRIX-M（商標）を伴う又は伴わない、０．１μｇ～１０μｇのＢＶ２３７３の１回の投与又は２回の投与で免疫されたマウスで検出されたウイルス中和抗体を示す。 [0024]MATRIX-M（商標）を伴う又は伴わないＢＶ２３７３の単回投与又は１４日間隔のＢＶ２３７３の２回の投与のいずれかで免疫したＡｄ／ＣＭＶ／ｈＡＣＥ２マウスの肺におけるウイルス量（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を示す。 [0025]ＢＶ２３７３による免疫後にマウスによって示された体重減少を示す。単回の０．０１μｇ、０．１μｇ、１μｇ又は１０μｇのＢＶ２３７３＋MATRIX-M（商標）による体重減少に対する免疫の効果を示す。 [0025]ＢＶ２３７３による免疫後にマウスによって示された体重減少を示す。２回のＢＶ２３７３（０．０１μｇ、０．１μｇ、１μｇ）＋MATRIX-M（商標）の投与による体重減少に対する免疫の効果を示す。 [0025]ＢＶ２３７３による免疫後にマウスによって示された体重減少を示す。MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下での２回のＢＶ２３７３（１０μｇ）の投与による体重減少に対する免疫の効果を示す。 [0026]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の４日後のマウスの肺組織病理に対するＢＶ２３７３の効果を示す。 [0026]ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染の７日後のマウスの肺組織病理に対するＢＶ２３７３の効果を示す。 [0027]MATRIX-M（商標）の存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスと比較した、アジュバントの非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるエクスビボ刺激後のＩＦＮ－γ分泌細胞の数を示す。 [0028]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＦＮ－γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0028]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＴＮＦ－α分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0028]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＬ－２分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0028]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２から選択される２つのサイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0028]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0029]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＦＮ－γ分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0029]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＴＮＦ－α分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0029]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＬ－２分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0029]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２から選択される２つのサイトカインを分泌するＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0029]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓におけるサイトカイン分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２を発現するＣＤ８^＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0030]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓において、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２から選択される１つ（単一）、２つ（二重）又は３つ（三重）のサイトカインを発現するＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋細胞の頻度を例示する。 [0031]ＣＤ４^＋Ｔ細胞からの２型サイトカイン分泌に対する、MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下でのＢＶ２３７３による免疫の効果を例示する。ＩＬ－４分泌細胞の頻度を示す。 [0031]ＣＤ４^＋Ｔ細胞からの２型サイトカイン分泌に対する、MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下でのＢＶ２３７３による免疫の効果を例示する。ＩＬ－５ＣＤ４^＋分泌細胞の頻度を示す。 [0031]ＣＤ４^＋Ｔ細胞からの２型サイトカイン分泌に対する、MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下でのＢＶ２３７３による免疫の効果を例示する。ＩＬ－４分泌ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＩＦＮ－γ分泌ＣＤ４^＋Ｔ細胞の比率を示す。 [0032]ＣＤ４^＋Ｔ濾胞ヘルパー細胞（ＴＦＨ）の存在を評価することにより、胚中心形成に対するMATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下でのＢＶ２３７３によるマウス免疫の効果を例示する。脾臓におけるＣＤ４^＋Ｔ濾胞ヘルパー細胞の頻度を示す。 [0032]ＣＤ４^＋Ｔ濾胞ヘルパー細胞（ＴＦＨ）の存在を評価することにより、胚中心形成に対するMATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下でのＢＶ２３７３によるマウス免疫の効果を例示する。ＣＤ４^＋Ｔ濾胞ヘルパー細胞の表現型（例えば、ＣＤ４^＋ＣＸＣＲ５^＋ＰＤ－１^＋）を示す。 [0033]胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞の存在を評価することにより、胚中心形成に対するMATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下でのＢＶ２３７３によるマウス免疫の効果を示す。脾臓におけるＧＣＢ細胞の頻度を示す。 [0033]胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞の存在を評価することにより、胚中心形成に対するMATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下でのＢＶ２３７３によるマウス免疫の効果を示す。ＣＤ４^＋Ｔ濾胞ヘルパー細胞の表現型（例えば、ＣＤ１９^＋ＧＬ７^＋ＣＤ－９５^＋）を明らかにする。 [0034]アヌビスヒヒにおける抗体応答に対する、MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下でのＢＶ２３７３による免疫の効果を示す。ＢＶ２３７３による免疫後のヒヒにおける抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳポリペプチドＩｇＧ力価を示す。 [0034]アヌビスヒヒにおける抗体応答に対する、MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下でのＢＶ２３７３による免疫の効果を示す。MATRIX-M（商標）の存在下における、５μｇ又は２５μｇのＢＶ２３７３での単回免疫後のヒヒにおけるｈＡＣＥ２受容体ブロッキング抗体の存在を示す。 [0034]アヌビスヒヒにおける抗体応答に対する、MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下でのＢＶ２３７３による免疫の効果を示す。ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）での単回免疫後のウイルス中和抗体力価を示す。 [0035]ＢＶ２３７３による免疫後のアヌビスヒヒにおける抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳポリペプチドＩｇＧと中和抗体力価との間の有意な相関を示す。 [0036]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したアヌビスヒヒの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるＩＦＮ－γ分泌細胞の頻度を示す。 [0037]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したアヌビスヒヒのＰＢＭＣにおけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＦＮ－γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0037]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したアヌビスヒヒのＰＢＭＣにおけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＬ－２分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0037]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したアヌビスヒヒのＰＢＭＣにおけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＴＮＦ－α分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0037]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したアヌビスヒヒのＰＢＭＣにおけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２から選択される２つのサイトカインを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0037]MATRIX-M（商標）の存在下又は非存在下においてＢＶ２３７３で免疫したアヌビスヒヒのＰＢＭＣにおけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を示す。 [0038]コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質（配列番号１０９）（ＢＶ２３８４）の概略図を示す。フューリン切断部位ＧＳＡＳ（配列番号９７）には１本の下線が引かれ、Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ変異には２本の下線が引かれている。 [0039]コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質（配列番号８６）（ＢＶ２３７３）の概略図を示す。フューリン切断部位ＱＱＡＱ（配列番号７）には１本の下線が引かれ、Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７Ｐ変異には２本の下線が引かれている。 [0040]ＣｏＶＳポリペプチドＢＶ２３７３（配列番号８７）及びＢＶ２３８４（配列番号１０９）の精製を示す。 [0041]精製後のＢＶ２３８４（配列番号１０９）純度の走査デンシトメトリープロットを示す。 [0042]精製後のＢＶ２３７３（配列番号８７）純度の走査デンシトメトリープロットを示す。 [0043]ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）の投与に応答した抗Ｓ抗体の誘導を例示する。カニクイザル（Cynomolgus macaques）に２．５μｇ、５μｇ又は２５μｇのＢＶ２３７３を２５μｇ又は５０μｇのMATRIX-M（商標）アジュバントと共に１回又は２回（０日目及び２１日目）投与した。対照には、ＢＶ２３７３もMATRIX-M（商標）も投与しなかった。２１日目及び３３日目に抗体を測定した。 [0043]ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）の投与に応答した中和抗体の誘導を例示する。カニクイザル（Cynomolgus macaques）に２．５μｇ、５μｇ又は２５μｇのＢＶ２３７３を２５μｇ又は５０μｇのMATRIX-M（商標）アジュバントと共に１回又は２回（０日目及び２１日目）投与した。対照には、ＢＶ２３７３もMATRIX-M（商標）も投与しなかった。２１日目及び３３日目に抗体を測定した。 [0044]カニクイザル（Cynomolgus macaques）における気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）で評価された、本明細書に開示されるワクチン製剤によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製の減少を示す。示されているように、カニクイザル（Cynomolgus macaques）にＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）を投与した。対象は、０日目に免疫し、２回投与群では０日目及び２１日目に免疫した。対象動物を３７日目に１×１０^４ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに曝露した。ウイルスＲＮＡ（存在する全ＲＮＡに対応する）レベルを感染性ウイルス（ｄ２ｐｉ及びｄ４ｐｉ）の曝露の２日後及び４日後に気管支洗浄（ＢＡＬ）で評価した。ほとんどの対象は、ウイルスＲＮＡを示さなかった。２日目に一部の対象で少量のＲＮＡが測定された。４日目までに、最低用量２．５μｇの２匹の対象を除いて、ＲＮＡは、測定されなかった。サブゲノムＲＮＡは、最低用量で再び、１匹の対象を除いて、２日目にも４日目にも検出されなかった。 [0044]カニクイザル（Cynomolgus macaques）における気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）で評価された、本明細書に開示されるワクチン製剤によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製の減少を示す。示されているように、カニクイザル（Cynomolgus macaques）にＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）を投与した。対象は、０日目に免疫し、２回投与群では０日目及び２１日目に免疫した。対象動物を３７日目に１×１０^４ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに曝露した。ウイルスサブゲノムＲＮＡ（複製するウイルスに対応する）レベルを感染性ウイルス（ｄ２ｐｉ及びｄ４ｐｉ）の曝露の２日後及び４日後に気管支洗浄（ＢＡＬ）で評価した。ほとんどの対象は、ウイルスＲＮＡを示さなかった。２日目に一部の対象で少量のＲＮＡが測定された。４日目までに、最低用量２．５μｇの２匹の対象を除いて、ＲＮＡは、測定されなかった。サブゲノムＲＮＡは、最低用量で再び、１匹の対象を除いて、２日目にも４日目にも検出されなかった。 [0045]カニクイザル（Cynomolgus macaques）の鼻スワブで評価された、本明細書に開示されるワクチン製剤によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製の減少を例示する。示されているように、カニクイザル（Cynomolgus macaques）にＢＶ２３７３をMATRIX-M（商標）と共に投与した。対象は、０日目に免疫し、２回投与群では０日目及び２１日目に免疫した。対象動物を３７日目に１×１０^４個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに曝露した。ウイルスＲＮＡは、感染の２日後及び４日後（ｄ２ｐｉ及びｄ４ｐｉ）に鼻スワブによって評価した。ほとんどの対象は、ウイルスＲＮＡを示さなかった。２日目及び４日目に一部の対象で少量のＲＮＡが測定された。サブゲノムＲＮＡは、２日目でも４日目でも検出されなかった。対象は、０日目に免疫し、２回投与群では０日目及び２１日目に免疫した。これらのデータは、ワクチンが鼻の総ウイルスＲＮＡを１００～１０００分の１に減少させ、ｓｇＲＮＡを検出不可能なレベルまで減少させ、及びワクチンに対する免疫応答がウイルスの複製をブロックしてウイルスの拡散を防止することが確かであることを示している。 [0045]カニクイザル（Cynomolgus macaques）の鼻スワブで評価された、本明細書に開示されるワクチン製剤によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製の減少を例示する。示されているように、カニクイザル（Cynomolgus macaques）にＢＶ２３７３をMATRIX-M（商標）と共に投与した。対象は、０日目に免疫し、２回投与群では０日目及び２１日目に免疫した。対象動物を３７日目に１×１０^４個のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに曝露した。ウイルスサブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡは、感染の２日後及び４日後（ｄ２ｐｉ及びｄ４ｐｉ）に鼻スワブによって評価した。ほとんどの対象は、ウイルスＲＮＡを示さなかった。２日目及び４日目に一部の対象で少量のＲＮＡが測定された。サブゲノムＲＮＡは、２日目でも４日目でも検出されなかった。対象は、０日目に免疫し、２回投与群では０日目及び２１日目に免疫した。これらのデータは、ワクチンが鼻の総ウイルスＲＮＡを１００～１０００分の１に減少させ、ｓｇＲＮＡを検出不可能なレベルまで減少させ、及びワクチンに対する免疫応答がウイルスの複製をブロックしてウイルスの拡散を防止することが確かであることを示している。 [0046]ＢＶ２３７３の１回投与及び２５μｇ又は５０μｇのMATRIX-M（商標）によるカニクイザル（Cynomolgus macaques）の免疫の２１日後及び３５日後の抗ＣｏＶＳポリペプチドＩｇＧ力価を示す。 [0046]ＢＶ２３７３の２回投与及び２５μｇ又は５０μｇのMATRIX-M（商標）によるカニクイザル（Cynomolgus macaques）の免疫の２１日後及び３５日後の抗ＣｏＶＳポリペプチドＩｇＧ力価を示す。 [0047]ＢＶ２３７３（５μｇ）及びMATRIX-M（商標）（２５μｇ又は５０μｇ）の１回投与によるカニクイザル（Cynomolgus macaques）の免疫の２１日後及び３５日後のカニクイザル（Cynomolgus macaques）のｈＡＣＥ２阻害力価を示す。 [0047]ＢＶ２３７３（５μｇ）及びMATRIX-M（商標）（２５μｇ又は５０μｇ）の２回投与によるカニクイザル（Cynomolgus macaques）の免疫の２１日後及び３５日後のカニクイザル（Cynomolgus macaques）のｈＡＣＥ２阻害力価を示す。 [0048]ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）の投与後のカニクイザル（Cynomolgus macaques）における抗ＣｏＶＳポリペプチドＩｇＧ力価とｈＡＣＥ２阻害力価との間の有意な相関を示す。表４の群２～６のデータを示す。 [0049]表４のＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）の２回投与による免疫又は回復期ヒト血清（群２、４及び６）による免疫の３５日後のカニクイザル（Cynomolgus macaques）の抗ＣｏＶＳポリペプチド力価及びｈＡＣＥ２阻害力価を示す。これらのデータは、ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）で免疫したカニクイザル（Cynomolgus macaques）の抗ＣｏＶＳポリペプチド力価及びｈＡＣＥ２阻害力価が、回復期血清で免疫したカニクイザル（Cynomolgus macaques）よりも優れていることを示している。 [0050]細胞変性効果（ＣＰＥ）によって決定された、ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）で免疫したカニクイザル（Cynomolgus macaques）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和力価を示す。 [0050]プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって決定された、ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）で免疫したカニクイザル（Cynomolgus macaques）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和力価を示す。 [0051]ＢＶ２３７３及び任意選択によるMATRIX-M（商標）を含むワクチンの安全性及び有効性を評価した臨床試験の投与タイミングを示す。ＡＥＳＩは、特に関心のある有害事象を示す。ＭＡＥＥは、医学的に付随する有害事象を表し、ＳＡＥは、重篤な有害事象を表す。 [0052]ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）を含むワクチンを評価した臨床試験において患者が経験した局所有害事象を示す。群Ａ～Ｅを表５に示す。データは、ワクチンが十分に許容され、安全であることを示している。 [0052]ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）を含むワクチンを評価した臨床試験において患者が経験した全身有害事象を示す。群Ａ～Ｅを表５に示す。データは、ワクチンが十分に許容され、安全であることを示している。 [0053]ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）を含むワクチンを評価した臨床試験における参加者の免疫の２１日後及び３５日後の抗ＣｏＶＳポリペプチドＩｇＧを示す。水平のバーは、それぞれ四分位範囲（ＩＲＱ）及び曲線下の中央値面積を表す。ひげの終点は、中央値±１．５×ＩＱＲよりも低い又は高い最大値及び最小値に等しい。回復期血清パネルには、Baylor College of MedicineのＰＣＲで確認されたＣＯＶＩＤ－１９参加者からの検体が含まれている（ＥＬＩＳＡのために２９検体、マイクロ中和のために３２検体（ＭＮＩＣ_＞９９））。ＣＯＶＩＤ－１９の重症度は、入院患者（集中治療室を含む）について赤いマーク、外来治療を受けた患者（救急部門で採取された試料）について青いマーク、無症状の（暴露された）患者（接触／曝露評価で採取された試料）について緑のマークで示される。 [0053]ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）を含むワクチンを評価した臨床試験における参加者の免疫の２１日後及び３５日後の中和力価を示す。水平のバーは、それぞれ四分位範囲（ＩＲＱ）及び曲線下の中央値面積を表す。ひげの終点は、中央値±１．５×ＩＱＲよりも低い又は高い最大値及び最小値に等しい。回復期血清パネルには、Baylor College of MedicineのＰＣＲで確認されたＣＯＶＩＤ－１９参加者からの検体が含まれている（ＥＬＩＳＡのために２９検体、マイクロ中和のために３２検体（ＭＮＩＣ_＞９９））。ＣＯＶＩＤ－１９の重症度は、入院患者（集中治療室を含む）について赤いマーク、外来治療を受けた患者（救急部門で採取された試料）について青いマーク、無症状の（暴露された）患者（接触／曝露評価で採取された試料）について緑のマークで示される。 [0054]回復期血清を投与された患者における抗ＣｏＶＳポリペプチドＩｇＧと中和抗体力価との間の相関を示す。回復期血清又はアジュバントＢＶ２３７３で処置された患者では、中和抗体力価と抗ＣｏＶ－ＳＩｇＧ力価との間に強い相関が観察されたが、アジュバントの非存在下においてＢＶ２３７３で処置された患者では観察されなかった。 [0054]ＢＶ２３７３の２回の２５μｇの用量を投与された患者における抗ＣｏＶＳポリペプチドＩｇＧと中和抗体力価との間の相関を示す。回復期血清又はアジュバントＢＶ２３７３で処置された患者では、中和抗体力価と抗ＣｏＶ－ＳＩｇＧ力価との間に強い相関が観察されたが、アジュバントの非存在下においてＢＶ２３７３で処置された患者では観察されなかった。 [0054]MATRIX-M（商標）と合わせたＢＶ２３７３の２回の用量（５μｇ及び２５ｕｇ）を投与された患者における抗ＣｏＶＳポリペプチドＩｇＧと中和抗体力価との間の相関を示す。回復期血清又はアジュバントＢＶ２３７３で処置された患者では、中和抗体力価と抗ＣｏＶ－ＳＩｇＧ力価との間に強い相関が観察されたが、アジュバントの非存在下においてＢＶ２３７３で処置された患者では観察されなかった。 [0055]ＢＶ２３７３で刺激した後の群Ａ（プラセボ）の参加者からのサイトカインを示したＴヘルパー１（Ｔｈ１）サイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）及びインターロイキン（ＩＬ）－２並びにＴヘルパー２（Ｔｈ２）サイトカインであるＩＬ－５及びＩＬ－１３を産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の頻度を示す。Ｔｈ１サイトカインパネルの「任意の２つ」は、２種類のＴｈ１サイトカインを同時に産生できるＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。「３つすべて」は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２を同時に産生するＣＤ４^＋Ｔ細胞を示す。Ｔｈ２パネルの「両方」は、Ｔｈ２サイトカインＩＬ－５及びＩＬ－１３を同時に産生できるＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。 [0055]ＢＶ２３７３で刺激した後の群Ｂ（２５μｇのＢＶ２３７３）の参加者からのサイトカインを示したＴヘルパー１（Ｔｈ１）サイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）及びインターロイキン（ＩＬ）－２並びにＴヘルパー２（Ｔｈ２）サイトカインであるＩＬ－５及びＩＬ－１３を産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の頻度を示す。Ｔｈ１サイトカインパネルの「任意の２つ」は、２種類のＴｈ１サイトカインを同時に産生できるＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。「３つすべて」は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２を同時に産生するＣＤ４^＋Ｔ細胞を示す。Ｔｈ２パネルの「両方」は、Ｔｈ２サイトカインＩＬ－５及びＩＬ－１３を同時に産生できるＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。 [0055]ＢＶ２３７３で刺激した後の群Ｃ（５μｇのＢＶ２３７３及び５０μｇのMATRIX-M（商標））の参加者からのサイトカインを示したＴヘルパー１（Ｔｈ１）サイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）及びインターロイキン（ＩＬ）－２並びにＴヘルパー２（Ｔｈ２）サイトカインであるＩＬ－５及びＩＬ－１３を産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の頻度を示す。Ｔｈ１サイトカインパネルの「任意の２つ」は、２種類のＴｈ１サイトカインを同時に産生できるＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。「３つすべて」は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２を同時に産生するＣＤ４^＋Ｔ細胞を示す。Ｔｈ２パネルの「両方」は、Ｔｈ２サイトカインＩＬ－５及びＩＬ－１３を同時に産生できるＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。 [0055]ＢＶ２３７３で刺激した後の群Ｄ（２５μｇのＢＶ２３７３及び５０μｇのMATRIX-M（商標））の参加者からのサイトカインを示したＴヘルパー１（Ｔｈ１）サイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）及びインターロイキン（ＩＬ）－２並びにＴヘルパー２（Ｔｈ２）サイトカインであるＩＬ－５及びＩＬ－１３を産生する抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞の頻度を示す。Ｔｈ１サイトカインパネルの「任意の２つ」は、２種類のＴｈ１サイトカインを同時に産生できるＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。「３つすべて」は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２を同時に産生するＣＤ４^＋Ｔ細胞を示す。Ｔｈ２パネルの「両方」は、Ｔｈ２サイトカインＩＬ－５及びＩＬ－１３を同時に産生できるＣＤ４^＋Ｔ細胞を意味する。 [0056]配列番号１に対して付番された、シグナルペプチドを含む野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓポリペプチドの一次構造を示す。 [0056]配列番号２に対して付番された、シグナルペプチドを含まない野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓポリペプチドの一次構造を示す。

発明の詳細な説明
定義
[0057] 本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」は、文脈が明確に別の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「タンパク質」への言及は、１つのタンパク質又はそのようなタンパク質の混合物を指し、「方法」への言及は、当業者に公知の均等な工程及び／又は方法への言及を含むなどである。

[0058] 本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫原と組み合わせて使用すると、免疫原に対して誘発される免疫応答を増強するか又は他に変更若しくは改変する化合物を指す。免疫応答の改変には、抗体及び細胞性免疫応答のいずれか又は両方の特異性の強化又は拡大が含まれ得る。

[0059] 本明細書で使用される場合、数値の前にある「約」又は「およそ」という用語は、プラス又はマイナス１０％の範囲の値を示す。例えば、「約１００」は、９０及び１１０を包含する。

[0060] 本明細書で使用される場合、「免疫原」、「抗原」及び「エピトープ」という用語は、糖タンパク質を含むタンパク質及び免疫応答を誘発することができるペプチドなどの物質を指す。

[0061] 本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」は、抗原を含む組成物であって、この組成物の対象への投与は、抗原に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答の進行をこの対象にもたらす、組成物である。

[0062] 本明細書で使用される場合、「サブユニット」組成物、例えばワクチンは、病原体由来のすべての抗原ではなく、１つ又は複数の選択された抗原を含む。そのような組成物は、無傷のウイルス又はそのような細胞若しくは粒子の溶解物を実質的に含まず、典型的には少なくとも部分的に精製され、多くの場合、実質的に精製された病原体由来の免疫原性ポリペプチドから調製される。本明細書に開示されるサブユニット組成物中の抗原は、典型的には、多くの場合、バキュロウイルス系を使用して組換えにより調製される。

[0063] 本明細書で使用される場合、「実質的に」とは、物質が含まれる試料の大部分の割合を物質が構成するような物質（例えば、化合物、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）の単離を指す。例えば、試料において、実質的に精製された成分は、この試料の８５％、好ましくは８５％～９０％、より好ましくは少なくとも９５％～９９．５％、最も好ましくは少なくとも９９％を含む。成分が実質的に置換される場合、試料中に残存する量は、約０．５％～約１０％以下、好ましくは約０．５％～約１．０％未満である。

[0064] 本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」及び「処置すること」という用語は、有益な又は所望の結果、例えば臨床結果を得るためのアプローチを指す。本開示の目的のために、有益な又は望ましい結果は、感染若しくは疾患の開始若しくは進行を阻害若しくは抑制すること；感染若しくは疾患の発症若しくは症状を改善若しくは軽減すること；又はこれらの組み合わせを含み得る。

[0065] 本明細書で使用される場合、「予防（prevention）」は、「予防（prophylaxis）」と互換的に使用され、及び感染若しくは疾患の完全な予防又はその感染若しくは疾患の症状の発症の予防；感染若しくは疾患又はその症状の発症の遅延；或いはその後に発症した感染若しくは疾患又はその症状の重症度の低下を意味し得る。

[0066] 本明細書で使用される場合、「有効用量」又は「有効量」は、病原体感染の少なくとも１つの症状を軽減する免疫応答を誘発するのに十分な免疫原の量を指す。有効用量又は有効量は、例えば、プラーク中和、補体固定、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）又はマイクロ中和アッセイにより、例えば中和分泌及び／又は血清抗体の量を測定することによって決定することができる。

[0067] 本明細書で使用される場合、「ワクチン」という用語は、防御免疫（例えば、対象を病原体による感染から防御し、及び／又は病原体の感染によって引き起こされる疾患若しくは状態の重症度を軽減する免疫）を提供する病原体に対する免疫応答を誘発するために使用される、病原体に由来する免疫原などの免疫原性組成物を指す。防御免疫応答は、抗体の形成及び／又は細胞性応答を含み得る。文脈に応じて、「ワクチン」という用語は、防御免疫をもたらすために対象に投与される免疫原の懸濁液又は溶液を指すこともある。

[0068] 本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び他の動物を含む。典型的には、対象は、ヒトである。例えば、対象は、成人、ティーンエイジャー、子供（２歳～１４歳）、幼児（誕生～２歳）又は新生児（２ヶ月まで）であり得る。特定の態様では、対象は、生後４ヶ月又は生後６ヶ月までである。いくつかの態様では、成人は、約６５歳以上又は約６０歳以上の高齢者である。いくつかの態様では、対象は、妊婦又は妊娠を希望する女性である。他の態様では、対象は、ヒトではなく；例えばヒト以外の霊長類；例えばヒヒ、チンパンジー、ゴリラ又はマカクである。特定の態様では、対象は、イヌ又はネコなどのペットであり得る。

[0069] 本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、米国連邦政府又は州政府の規制機関によって承認されていること又は米国薬局方、欧州薬局方若しくは哺乳動物、より具体的にはヒトでの使用について一般的に認められている他の薬局方にリストされていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘発するためのワクチン及び／又は抗原組成物として有用であり得る。

[0070] 本明細書で使用される場合、「約」という用語は、示された数値のプラス又はマイナス１０％を意味する。

[0071] 本明細書で使用される場合、「ＮＶＸ－ＣｏＶ２３７３」という用語は、ＢＶ２３７３スパイク糖タンパク質（配列番号８７）並びに画分Ａ及び画分Ｃのｉｓｃｏｍマトリックス（例えば、MATRIX-M（商標））を含むワクチン組成物を指す。

[0072] 本明細書で使用される場合、ＣｏＶＳポリペプチドを指すときの「改変」という用語は、ＣｏＶＳポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸の変異、欠失又は付加を指す。ＣｏＶＳポリペプチド内の改変の位置は、配列番号１（シグナルペプチドを含むＣｏＶＳポリペプチド）又は配列番号２（シグナルペプチドを欠く成熟ＣｏＶＳポリペプチド）へのポリペプチドの配列のアラインメントに基づいて決定することができる。

コロナウイルス（ＣｏＶ）スパイク（Ｓ）タンパク質を含むワクチン組成物
[0073] 本開示は、天然に存在しないコロナウイルス（ＣｏＶ）スパイク（Ｓ）ポリペプチド、ＣｏＶＳポリペプチドを含むナノ粒子並びに天然に存在しないＣｏＶＳポリペプチド又はＣｏＶＳポリペプチドを含むナノ粒子のいずれかを含む免疫原性組成物及びワクチン組成物を提供する。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチド、ナノ粒子、免疫原性組成物及びワクチン組成物を使用して免疫応答を刺激する方法が本明細書に示される。

[0074] ナノ粒子及びワクチン組成物を製造する方法も本明細書に示される。有利には、この方法は、昆虫細胞におけるタンパク質の組換え発現に関連するタンパク質などの他のタンパク質による汚染を実質的に含まないナノ粒子を提供する。実施形態では、発現は、バキュロウイルス／Ｓｆ９系で起こる。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原
[0075] 本開示のワクチン組成物は、天然に存在しないＣｏＶＳポリペプチドを含む。ＣｏＶＳポリペプチドは、限定されるものではないが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むコロナウイルス、例えばＳＡＲＳＣｏＶ－２、ＭＥＲＳＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶに由来し得る。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体に由来する。実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＶＵＩ２０２０１２／０１、Ｂ．１．１．７、５０１Ｙ．Ｖ２、Ｃａｌ．２０Ｃ又はＰ．１である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶＳタンパク質とは対照的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質は、Ｓ１／Ｓ２切断部位において、多塩基性ＲＲＡＲフューリン様切断モチーフとなる４つのアミノ酸が挿入されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質は、不活性前駆体（Ｓ０）として合成され、この前駆体は、フューリン切断部位でタンパク質分解的に切断されてＳ１及びＳ２サブユニットになり、これらのサブユニットは、非共有結合のまま融合前三量体を形成する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質のＳ２ドメインには、融合ペプチド（ＦＰ）、２つのヘプタッドリピート（ＨＲ１及びＨＲ２）、膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び細胞質尾部（ＣＴ）が含まれる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質のＳ１ドメインは、４つの異なるドメイン：Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及び受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含むＣ末端ドメイン並びに２つのサブドメインＳＤ１及びＳＤ２に折り畳まれる。融合前のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質三量体は、Ｓタンパク質受容体の結合及び切断時、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへの構造的再編成を受ける。

[0076] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、翻訳後のグリコシル化による糖タンパク質である。糖タンパク質は、シグナルペプチド、Ｓ１サブユニット、Ｓ２サブユニット、ＮＴＤ、ＲＢＤ、２つのサブドメイン（図４６Ａ及び図４６ＢではＳＤ１／２と表示され、本明細書では「ＳＤ１／２」と呼ばれるＳＤ１及びＳＤ２）、無傷又は改変された融合ペプチド、ＨＲ１ドメイン、ＨＲ２ドメイン、ＴＭ及びＣＤの１つ又は複数を含む。実施形態では、各ドメインのアミノ酸が図２及び図４６Ａ（配列番号１に従って示される）、図４６Ｂ（配列番号２に従って示される）並びに図３（配列番号１に対応して示される）に示されている。実施形態では、各ドメインは、配列番号１又は配列番号２にある各ドメインの配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有し得る。各ドメインは、配列番号１又は配列番号２に示される各ドメインと比較して、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約２０個又は最大約３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。各ドメインは、配列番号１又は配列番号２に示される各ドメインと比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸又は約２５～３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。図２及び図３は、成熟ペプチドに存在しない１３個のアミノ酸のＮ末端シグナルペプチドを例示することに留意されたい。ＣｏＶＳポリペプチドを使用して、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドに対する免疫応答を刺激することができる。

[0077] 実施形態では、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）が改変されて、天然に存在しないＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドが得られる（図１）。実施形態では、ＣｏＶスパイク（Ｓ）糖タンパク質は、Ｓ１サブユニット及びＳ２サブユニットを含み、このＳ１サブユニットは、ＮＴＤ、ＲＢＤ、ＳＤ１／２及び不活性フューリン切断部位（アミノ酸６６９～６７２）を含み、このＳ２サブユニットは、アミノ酸９７３及び９７４の変異を含み；
このＮＴＤ（アミノ酸１～３１８）は、任意選択により、
（ａ）ＮＴＤからの１つ又は複数のアミノ酸の欠失であって、任意選択により、この１つ又は複数の改変は、アミノ酸５６、５７、１３１、１３２、２２９、２３０、２３１及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、アミノ酸の欠失；及び
（ｂ）アミノ酸６７、２２９、２０２、１３９、５、２３３、７、１３、１２５、１７７又はこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異
からなる群から選択される１つ又は複数の改変を含み；
ＲＢＤは、任意選択により、アミノ酸４８８、４０４、４７１、４３９、４２６、４４０及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異を含み；
ＳＤ１／２は、任意選択により、６０１、５５７、６６８、６４２及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異を含み；及び
Ｓ２サブユニットは、任意選択により、
（ａ）６７６～７０２、７０２～７１１、７７５～７９３からの１つ又は複数のアミノ酸の欠失；
（ｂ）融合ペプチド（アミノ酸８０６～８１５）からの１つ又は複数のアミノ酸の欠失；
（ｃ）９７３、９７４、７０３、１１０５、６８８、９６９及び１０１４からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異；及び
（ｄ）膜貫通及び細胞質ドメイン（ＴＭＣＴ）（アミノ酸１２０１～１２６０）からの１つ又は複数のアミノ酸の欠失
からなる群から選択される１つ又は複数の改変を含み、
ＣｏＶＳ糖タンパク質のアミノ酸は、配列番号２に対して付番されている。図３は、ＢＶ２３７８と呼ばれるＣｏＶＳポリペプチドを示し、このＣｏＶＳポリペプチドは、不活性フューリン切断部位、欠失した融合ペプチド（例えば、アミノ酸８１９～８２８の欠失）、Ｋ９８６Ｐ及びＶ９８７変異を有し、これらのアミノ酸は、配列番号１に対して付番されている。成熟ＢＶ２３７８ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１～１３であるシグナルペプチドの１つ又は複数のアミノ酸を欠いている。実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、融合前のコンフォメーションで存在する。実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、柔軟なＨＲ２ドメインを含む。特に明記しない限り、ドメインの柔軟性は、遷移電子顕微鏡（ＴＥＭ）及び２Ｄクラス平均化によって決定される。電子密度の減少は、柔軟なドメインに対応する。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－Ｓ１サブユニットに対する改変
[0078] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１２１のアミノ酸配列を有するＳ１サブユニットに対する１つ又は複数の改変を含む。

[0079] Ｓ１サブユニットのアミノ酸配列（配列番号１２１）を以下に示す。

[0080] 配列番号１２１の下線を引いた領域は、改変され得るＳ１サブユニット内のアミノ酸を表す。

[0081] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＳ１サブユニットに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有するＳ１サブユニットを含む。Ｓ１サブユニットは、配列番号１又は配列番号２のＳ１サブユニットのアミノ酸配列と比較して、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個又は最大約３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。Ｓ１サブユニットは、配列番号１又は配列番号２のＳ１サブユニットと比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸又は約２５～３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。

[0082] 実施形態では、Ｓ１サブユニットは、表１Ａに示される改変の任意の組み合わせを含み得る。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－Ｓ１サブユニットに対する改変－ＮＴＤ
[0083] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＮＴＤに対する１つ又は複数の改変を含む。実施形態では、ＮＴＤは、配列番号１のアミノ酸１４～３０５又は配列番号２のアミノ酸１～２９２に対応する配列番号１１８のアミノ酸配列を有する。

[0084] ＮＴＤのアミノ酸配列（配列番号１１８）を以下に示す。

[0085] 配列番号１１８の下線を引いた領域は、改変され得るＮＴＤ内のアミノ酸を表す。

[0086] 実施形態では、ＮＴＤは、配列番号１のアミノ酸１４～３３１又は配列番号２のアミノ酸１～３１８に対応する配列番号４５のアミノ酸配列を有する。ＮＴＤのアミノ酸配列（配列番号４５）を以下に示す。
[0087]

[0088] 実施形態では、ＮＴＤ及びＲＢＤは、最大約１個のアミノ酸、最大約５個のアミノ酸、最大約１０個のアミノ又は最大約２０個のアミノ酸が重複する。

[0089] 実施形態では、本明細書で提供されるＮＴＤは、Ｃ末端において、最大５個、最大１０個、最大１５個、最大２０個、最大２５個又は最大３０個のアミノ酸が伸長され得る。

[0090] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＮＴＤに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有するＮＴＤを含む。ＮＴＤは、配列番号１又は配列番号２のＮＴＤのアミノ酸配列と比較して、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個又は最大約３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。ＮＴＤは、配列番号１又は配列番号２のＮＴＤと比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸又は約２５～３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。

[0091] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）（配列番号２のアミノ酸１～２９２に対応する）からの１つ又は複数のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＮＴＤの最大約１０個、最大約２０個、最大約３０個、最大約４０個、最大約５０個、最大約６０個、最大約７０個、最大約８０個、最大約９０個、最大約１００個、最大約１１０個、最大約１２０個、最大約１３０個、最大約１４０個、最大約１５０個、最大約１６０個、最大約１７０個、最大約１８０個、最大約１９０個、最大約２００個、最大約２１０個、最大約２２０個、最大約２３０個、最大約２４０個、最大約２５０個、最大約２６０個、最大約２７０個、最大約２８０個、最大約２９０個又は最大約２９２個のアミノ酸の欠失を含む。

[0092] いくつかの実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＮＴＤ（配列番号２のアミノ酸１～３１８に対応する）からの１つ又は複数のアミノ酸の欠失を含む。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号２のＮＴＤのアミノ酸１～３１８の欠失を含む。実施形態では、ＮＴＤの欠失は、ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドのタンパク質発現を促進する。実施形態では、ＮＴＤの欠失を有するＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号４６、４８、４９、５１、５２及び５４によって表されるアミノ酸配列を有する。実施形態では、ＮＴＤの欠失を有するＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号４７、配列番号５０及び配列番号５３からなる群から選択される単離された核酸配列によってコードされる。

[0093] 実施形態では、ＮＴＤは、表１Ｂに示される改変の任意の組み合わせを含み得る。改変は、参照のための成熟Ｓポリペプチド配列である配列番号２に関して示されている。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－Ｓ１サブユニットに対する改変－ＲＢＤ
[0094] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＲＢＤに対する１つ又は複数の改変を含む。

[0095] 実施形態では、ＲＢＤは、配列番号１のアミノ酸３３１～５２７又は配列番号２のアミノ酸３１８～５１４に対応する配列番号１２６のアミノ酸配列を有する。

[0096] ＲＢＤのアミノ酸配列（配列番号１２６）を以下に示す。

[0097] 配列番号１２６の下線を引いた領域は、改変され得るＲＢＤサブユニット内のアミノ酸を表す。

[0098] 実施形態では、ＲＢＤは、配列番号１のアミノ酸３３５～５３０又は配列番号２のアミノ酸３２２～５１７に対応する配列番号１１６のアミノ酸配列を有する。

[0099] ＲＢＤのアミノ酸配列（配列番号１１６）を以下に示す。

[0100] 配列番号１１６の下線を引いた領域は、改変され得るＲＢＤサブユニット内のアミノ酸を表す。

[0101] 実施形態では、本明細書で提供されるＲＢＤは、Ｎ末端又はＣ末端において、最大１個のアミノ酸、最大５個のアミノ酸、最大１０個のアミノ酸、最大１５個のアミノ酸、最大２０個のアミノ酸、最大２５個のアミノ酸又は最大３０個のアミノ酸によって伸長され得る。

[0102] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＲＢＤに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有するＲＢＤを含む。ＲＢＤは、配列番号１又は配列番号２のＲＢＤのアミノ酸配列と比較して、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個又は最大約３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。ＲＢＤは、配列番号１又は配列番号２のＲＢＤと比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸又は約２５～３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。

[0103] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個又は少なくとも２０個の変異をＲＢＤに有する。実施形態では、ＲＢＤは、表１Ｃに示される改変の任意の組み合わせを含み得る。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－ＳＤ１／２に対する改変
[0104] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸５４２～６８１又は配列番号２のアミノ酸５２９～６６８に対応する配列番号１２２のアミノ酸配列を有するＳＤ１／２に対する１つ又は複数の改変を含む。

[0105] ＳＤ１／２のアミノ酸配列（配列番号１２２）を以下に示す。

[0106] 配列番号１２２の下線を引いた領域は、改変され得るＳＤ１／２内のアミノ酸を表す。

[0107] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＳＤ１／２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有するＳＤ１／２を含む。ＳＤ１／２は、配列番号１又は配列番号２のＳＤ１／２のアミノ酸配列と比較して、最大約１個、最大約２、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個又は最大約３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。ＳＤ１／２は、配列番号１又は配列番号２のＳＤ１／２と比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸又は約２５～３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。

[0108] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個又は少なくとも２０個の変異をＳＤ１／２に有する。実施形態では、ＳＤ１／２は、表１Ｄに示される改変の任意の組み合わせを含み得る。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－フューリン切断部位に対する改変
[0109] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、１つ又は複数の変異によって不活性化される、配列番号１のアミノ酸６８２～６８５又は配列番号２のアミノ酸６６９～６７２に対応するフューリン部位（ＲＲＡＲ）を含む。フューリン切断部位の不活性化は、フューリンがＣｏＶＳポリペプチドを切断することを防止する。実施形態では、不活性化フューリン切断部位を含む本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、単鎖として発現される。

[0110] 実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアミノ酸の１つ又は複数が任意の天然アミノ酸に変異している。実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。アミノ酸の非限定的な例には、アラニン、アルギニン、グリシン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンが含まれる。

[0111] 実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアミノ酸の１つ又は複数がグルタミンに変異している。実施形態では、１個、２個、３個又は４個のアミノ酸がグルタミンに変異され得る。実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアルギニンの１つがグルタミンに変異している。実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアルギニンの２つがグルタミンに変異している。実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアルギニンの３つがグルタミンに変異している。

[0112] 実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアミノ酸の１つ又は複数がアラニンに変異している。実施形態では、１個、２個、３個又は４個のアミノ酸がアラニンに変異され得る。実施形態では、天然フューリン切断部位を含むアルギニンの１つがアラニンに変異している。実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアルギニンの２つがアラニンに変異している。実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアルギニンの３つがアラニンに変異している。

[0113] 実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアミノ酸の１つ又は複数がグリシンに変異している。実施形態では、１個、２個、３個又は４個のアミノ酸がグリシンに変異され得る。実施形態では、天然フューリン切断部位のアルギニンの１つがグリシンに変異している。実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアルギニンの２つがグリシンに変異している。実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアルギニンの３つがグリシンに変異している。

[0114] 実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアミノ酸の１つ又は複数がアスパラギンに変異している。例えば、１個、２個、３個又は４個のアミノ酸がアスパラギンに変異され得る。実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアルギニンの１つがアスパラギンに変異している。実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアルギニンの２つがアスパラギンに変異している。実施形態では、天然フューリン切断部位を構成するアルギニンの３つがアスパラギンに変異している。

[0115] ＣｏＶＳポリペプチド内に含まれる不活性化フューリン部位のアミノ酸配列の非限定的な例が表１Ｅに示される。

[0116] 実施形態では、活性フューリン切断部位（配列番号６）の代わりに、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、不活性化フューリン切断部位を含む。実施形態では、不活性化フューリン切断部位のアミノ酸配列は、配列番号７～３４又は配列番号９７のいずれか１つによって表される。実施形態では、不活性化フューリン切断部位のアミノ酸配列は、ＱＱＡＱ（配列番号７）である。実施形態では、不活性化フューリン切断部位のアミノ酸配列は、ＧＳＡＳ（配列番号９７）である。実施形態では、不活性化フューリン切断部位のアミノ酸配列は、ＧＳＧＡ（配列番号１１１）である。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－Ｓ２サブユニットに対する改変
[0117] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸６８６～１２７３又は配列番号２のアミノ酸６７３～１２６０に対応する配列番号１２０のアミノ酸配列を有するＳ２サブユニットに対する１つ又は複数の改変を含む。

[0118] Ｓ２サブユニットのアミノ酸配列（配列番号１２０）を以下に示す。

[0119] 配列番号１２０の下線を引いた領域は、改変され得るＳ２サブユニット内のアミノ酸を表す。

[0120] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＳ２サブユニットに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有するＳ２サブユニットを含む。Ｓ２サブユニットは、配列番号１又は配列番号２のＳ２サブユニットのアミノ酸配列と比較して、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個又は最大約３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。Ｓ２サブユニットは、配列番号１又は配列番号２のＳ２サブユニットと比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸又は約２５～３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。

[0121] 実施形態では、Ｓ２サブユニットは、表１Ｆに示される改変の任意の組み合わせを含み得る。

[0122] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸６７６～６８５内の１つ又は複数の欠失に対応する欠失を含む。実施形態では、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸６７６～６８５の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のアミノ酸が欠失している。実施形態では、アミノ酸６７６～６８５内のアミノ酸の欠失は、連続的であり、例えばアミノ酸６７６及び６７７が欠失しているか、又はアミノ酸６８０及び６８１が欠失している。実施形態では、アミノ酸６７６～６８５内のアミノ酸の欠失は、非連続的であり、例えばアミノ酸６７６及び６８０が欠失しているか、又はアミノ酸６７７及び６８２が欠失している。実施形態では、アミノ酸６７６～６８５内の１つ又は複数の欠失に対応する欠失を含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号６２及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

[0123] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸７０２～７１１内の１つ又は複数の欠失に対応する欠失を含む。実施形態では、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸７０２～７１１の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のアミノ酸が欠失している。実施形態では、アミノ酸７０２～７１１内のアミノ酸の１つ又は複数の欠失は、連続的であり、例えばアミノ酸７０２及び７０３が欠失しているか、又はアミノ酸７０８及び７０９が欠失している。実施形態では、アミノ酸７０２～７１１内のアミノ酸の欠失は、非連続的であり、例えばアミノ酸７０２及び７０４が欠失しているか、又はアミノ酸７０７及び７１０が欠失している。実施形態では、アミノ酸７０２～７１１内の１つ又は複数の欠失に対応する欠失を含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号６４及び配列番号６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

[0124] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶＳポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸７７５～７９３内の１つ又は複数の欠失に対応する欠失を含む。実施形態では、天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸７７５～７９３の最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約６個、最大約７個、最大約８個、最大約９個、最大約１０個、最大約１１個、最大約１２個、最大約１３個、最大約１４個、最大約１５個、最大約１６個、最大約１７個、最大約１８個又は最大約１９個のアミノ酸が欠失している。実施形態では、アミノ酸７７５～７９３内のアミノ酸の１つ又は複数の欠失は、連続的であり、例えばアミノ酸７７６及び７７７が欠失しているか、又はアミノ酸７８０及び７８１が欠失している。実施形態では、アミノ酸７７５～７９３内のアミノ酸の欠失は、非連続的であり、例えばアミノ酸７７５及び７９０が欠失しているか、又はアミノ酸７７７及び７８１が欠失している。

[0125] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸８０６～８１５に対応する融合ペプチド（配列番号１０４）の欠失を含む。実施形態では、ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）の融合ペプチドの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のアミノ酸が欠失している。実施形態では、融合ペプチド内のアミノ酸の欠失は、連続的であり、例えばアミノ酸８０６及び８０７が欠失しているか、又はアミノ酸８０９及び８１０が欠失している。実施形態では、融合ペプチド内のアミノ酸の欠失は、非連続的であり、例えばアミノ酸８０６及び８０８が欠失しているか、又はアミノ酸８１０及び８１３が欠失している。実施形態では、融合ペプチドの１つ又は複数のアミノ酸に対応する欠失を含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号６６、７７及び１０５～１０８から選択されるアミノ酸配列を有する。

[0126] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のＬｙｓ－９７３に変異を含む。実施形態では、Ｌｙｓ－９７３は、任意の天然アミノ酸に変異している。実施形態では、Ｌｙｓ－９７３は、プロリンに変異している。実施形態では、Ｌｙｓ－９７３は、グリシンに変異している。実施形態では、アミノ酸９７３に変異を含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号８４～８９、１０５～１０６及び１０９～１１０からなる群から選択される。

[0127] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のＶａｌ－９７４に変異を含む。実施形態では、Ｖａｌ－９７４は、任意の天然アミノ酸に変異している。実施形態では、Ｖａｌ－９７４は、プロリンに変異している。実施形態では、Ｖａｌ－９７４は、グリシンに変異している。実施形態では、アミノ酸９７４に変異を含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号８４～８９、１０５～１０６及び１０９～１１０からなる群から選択される。

[0128] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のＬｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４に変異を含む。実施形態では、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４は、任意の天然アミノ酸に変異している。実施形態では、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４は、プロリンに変異している。実施形態では、アミノ酸９７３及び９７４に変異を含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号８４～８９、１０５～１０６及び１０９～１１０から選択される。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－Ｓ２サブユニットに対する改変－ＨＲ１ドメイン
[0129] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸９１２～９８４又は配列番号２のアミノ酸８８９～９７１に対応する配列番号１１９のアミノ酸配列を有するＨＲ１ドメインに対する１つ又は複数の改変を含む。

[0130] ＨＲ１ドメインのアミノ酸配列（配列番号１１９）を以下に示す。

[0131] 配列番号１１９の下線を引いた領域は、改変され得るＨＲ１ドメイン内のアミノ酸を表す。

[0132] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＨＲ１ドメインに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有するＨＲ１ドメインを含む。ＨＲ１ドメインは、配列番号１又は配列番号２のＨＲ１ドメインのアミノ酸配列と比較して、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個又は最大約３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。ＨＲ１ドメインは、配列番号１又は配列番号２のＨＲ１ドメインと比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸又は約２５～３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。

[0133] 実施形態では、ＨＲ１ドメインは、表１Ｇに示される改変の任意の組み合わせを含み得る。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－Ｓ２サブユニットに対する改変－ＨＲ２ドメイン
[0134] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１１６３～１２１３又は配列番号２のアミノ酸１１５０～１２００に対応する配列番号１２５のアミノ酸配列を有するＨＲ２ドメインに対する１つ又は複数の改変を含む。

[0135] ＨＲ２ドメインのアミノ酸配列（配列番号１２５）を以下に示す。
ＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰ

[0136] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＨＲ２ドメインに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有するＨＲ２ドメインを含む。ＨＲ２ドメインは、配列番号１又は配列番号２のＨＲ２ドメインのアミノ酸配列と比較して、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個又は最大約３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。ＨＲ２ドメインは、配列番号１又は配列番号２のＨＲ２ドメインと比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸又は約２５～３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－ＴＭドメインに対する改変
[0137] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１２１４～１２３７又は配列番号２のアミノ酸１２０１～１２２４に対応する配列番号１２３のアミノ酸配列を有するＴＭドメインに対する１つ又は複数の改変を含む。

[0138] ＴＭドメインのアミノ酸配列（配列番号１２３）を以下に示す。
ＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭ

[0139] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＴＭドメインに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有するＴＭドメインを含む。ＴＭドメインは、配列番号１又は配列番号２のＴＭドメインのアミノ酸配列と比較して、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個又は最大約３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。ＴＭドメインは、配列番号１又は配列番号２のＴＭドメインと比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸又は約２５～３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。

[0140] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、全ＴＭドメインを欠いている。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＴＭドメインを含む。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－ＣＴに対する改変
[0141] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１２３８～１２７３又は配列番号２のアミノ酸１２２５～１２６０に対応する配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＣＴに対する１つ又は複数の改変を含む。

[0142] ＣＴのアミノ酸配列（配列番号１２４）を以下に示す。
ＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ

[0143] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１又は配列番号２のＣＴに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有するＣＴを含む。ＣＴは、配列番号１又は配列番号２のＣＴのアミノ酸配列と比較して、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個又は最大約３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。ＣＴは、配列番号１又は配列番号２のＣＴと比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸又は約２５～３０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。

[0144] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、ＣＴを欠いている。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＣＴを含む。

[0145] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＴＭ及びＣＴを含む。実施形態では、ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドは、膜貫通及び細胞質尾部（ＴＭＣＴ）（アミノ酸１２０１～１２６０に対応する）からの１つ又は複数のアミノ酸の欠失を含む。ＴＭＣＴのアミノ酸配列は、配列番号３９によって表される。実施形態では、ＴＭＣＴの１つ又は複数の残基の欠失を有するＣｏＶＳポリペプチドは、増強されたタンパク質発現を有する。実施形態では、ＴＭＣＴからの１つ又は複数の欠失を有するＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドは、配列番号４０、４１、４２、５２、５４、５９、６１、８８及び８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。実施形態では、ＴＭ－ＣＤからの１つ又は複数の欠失を有するＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号３９、４３、５３及び６０からなる群から選択される単離された核酸配列によってコードされる。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原－非限定的な変異の組み合わせ
[0146] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸５６及び５７の欠失を含む。

[0147] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸１３１及び１３２の欠失を含む。

[0148] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸５６及び１３１の欠失を含む。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸５７及び１３１の欠失を含む。

[0149] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸５６、５７及び１３１の欠失を含む。

[0150] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸５６及び１３２の欠失を含む。

[0151] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸５７及び１３２の欠失を含む。

[0152] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸５６、５７及び１３２の欠失を含む。

[0153] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸５６、５７、１３１及び１３２の欠失を含む。

[0154] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＣｏＶＳポリペプチドの融合前コンフォメーションを安定化させる変異を含む。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、融合前コンフォメーションを安定化させるプロリン又はグリシン置換を含む。この戦略は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる以下の文献に記載されているように、融合前に安定化されたＭＥＲＳ－ＣｏＶＳタンパク質を開発するために利用されている：Proc Natl Acad Sci USA. 2017 Aug 29; 114 (35): E7348-E7357；Sci Rep. 2018 Oct 24; 8 (1):15701；米国特許出願公開第２０２０／００６１１８５号；及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８３７０号。

[0155] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４での変異並びに不活性化フューリン切断部位を含む。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を含む。Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４における変異並びに不活性化フューリン切断部位を含む例示的なＣｏＶＳポリペプチドを図８に示す。実施形態では、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びに不活性化フューリン切断部位を含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号８６又は８７のアミノ酸配列及び配列番号９６の核酸配列を有する。

[0156] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４における変異、不活性化フューリン切断部位及び融合ペプチドの１つ又は複数のアミノ酸の欠失を含む。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異、ＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位及び融合ペプチドの１つ又は複数のアミノ酸の欠失を含む。実施形態では、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異、不活性化フューリン切断部位並びに融合ペプチドの１つ又は複数のアミノ酸の欠失を含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１０５又は配列番号１０６のアミノ酸配列を有する。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）と比較して、Ｌｅｕ－５のフェニルアラニンへの変異、Ｔｈｒ－７のアスパラギンへの変異、Ｐｒｏ－１３のセリンへの変異、Ａｓｐ－１２５のチロシンへの変異、Ａｒｇ－１７７のセリンへの変異、Ｌｙｓ－４０４のスレオニンへの変異、Ｇｌｕ－４７１のリジンへの変異、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ｈｉｓ－６４２のチロシンへの変異、Ｔｈｒ－１０１４のイソロイシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異及びＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を含む。

[0157] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）と比較して、Ｔｒｐ－１３９のシステインへの変異、Ｌｅｕ－４３９のアルギニンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を含む。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号１）と比較して、Ｔｒｐ－１５２のシステインへの変異、Ｌｅｕ－４５２のアルギニンへの変異、Ｓｅｒ－１３のイソロイシンへの変異、Ｌｙｓ－９８６及びＶａｌ－９８７のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を含む。

[0158] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）と比較して、Ｌｙｓ－４０４のスレオニン又はアスパラギンへの変異、Ｇｌｕ－４７１のリジンへの変異、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ｌｅｕ－５のフェニルアラニンへの変異、Ａｓｐ－６７のアラニンへの変異、Ａｓｐ－２０２のグリシンへの変異、アミノ酸２２９～２３１の１つ又は複数の欠失、Ａｒｇ－２３３のイソロイシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を含む。

[0159] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）と比較して、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を含む。実施形態では、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を有するＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。

[0160] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）と比較して、Ａｓｐ－６０１のグリシンへの変異、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を含む。実施形態では、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を有するＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。

[0161] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）と比較して、アミノ酸５６、５７及び１３１の欠失、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ａｌａ－５５７のアスパラギン酸への変異、Ａｓｐ－６０１のグリシンへの変異、Ｐｒｏ－６６８のヒスチジンへの変異、Ｔｈｒ－７０３のイソロイシンへの変異、Ｓｅｒ－９６９のアラニンへの変異、Ａｓｐ－１１０５のヒスチジンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を含む。実施形態では、アミノ酸５６、５７及び１３１の欠失、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ａｌａ－５５７のアスパラギン酸への変異、Ａｓｐ－６０１のグリシンへの変異、Ｐｒｏ－６６８のヒスチジンへの変異、Ｔｈｒ－７０３のイソロイシンへの変異、Ｓｅｒ－９６９のアラニンへの変異、Ａｓｐ－１１０５のヒスチジンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異及びＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を有するＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。

[0162] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）と比較して、アミノ酸５６、５７及び１３２の欠失、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ａｌａ－５５７のアスパラギン酸への変異、Ａｓｐ－６０１のグリシンへの変異、Ｐｒｏ－６６８のヒスチジンへの変異、Ｔｈｒ－７０３のイソロイシンへの変異、Ｓｅｒ－９６９のアラニンへの変異、Ａｓｐ－１１０５のヒスチジンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を含む。実施形態では、アミノ酸５６、５７及び１３２の欠失、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ａｌａ－５５７のアスパラギン酸への変異、Ａｓｐ－６０１のグリシンへの変異、Ｐｒｏ－６６８のヒスチジンへの変異、Ｔｈｒ－７０３のイソロイシンへの変異、Ｓｅｒ－９６９のアラニンへの変異、Ａｓｐ－１１０５のヒスチジンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を有するＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。

[0163] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号２）と比較して、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ａｓｐ－６７のアラニンへの変異、Ｌｅｕ－２２９のヒスチジンへの変異、Ａｓｐ－２０２のグリシンへの変異、Ｌｙｓ－４０４のアスパラギンへの変異、Ｇｌｕ－４７１のリジンへの変異、Ａｌａ－６８８のバリンへの変異、Ａｓｐ－６０１のグリシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を含む。実施形態では、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ａｓｐ－６７のアラニンへの変異、Ｌｅｕ－２２９のヒスチジンへの変異、Ａｓｐ－２０２のグリシンへの変異、Ｌｙｓ－４０４のアスパラギンへの変異、Ｇｌｕ－４７１のリジンへの変異、Ａｌａ－６８８のバリンへの変異、Ａｓｐ－６０１のグリシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにＱＱＡＱ（配列番号７）又はＧＳＡＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する不活性化フューリン切断部位を有するＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。

[0164] 実施形態では、ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドは、ポリペプチドリンカーを含む。実施形態では、ポリペプチドリンカーは、グリシン及びセリンを含む。実施形態では、リンカーは、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約１００％のグリシンを有する。

[0165] 実施形態では、ポリペプチドリンカーは、（ＳＧＧＧ）_ｎ（配列番号９１）の反復を有し、式中、ｎは、１～５０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）である。実施形態では、ポリペプチドリンカーは、配列番号９０に対応するアミノ酸配列を有する。

[0166] 実施形態では、ポリペプチドリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号９３）の反復を有し、式中、ｎは、１～５０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）である。

[0167] 実施形態では、ポリペプチドリンカーは、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号９２）の反復を有し、式中、ｎは、１～５０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０）である。

[0168] いくつかの態様では、ポリペプチドリンカーは、ポリ－（Ｇｌｙ）ｎリンカーであり、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１６、１７、１８、１９又は２０である。他の実施形態では、リンカーは、ジペプチド、トリペプチド及びクアドリペプチドからなる群から選択される。実施形態では、リンカーは、アラニン－セリン（ＡＳ）、ロイシン－グルタミン酸（ＬＥ）及びセリン－アルギニン（ＳＲ）からなる群から選択されるジペプチドである。

[0169] 実施形態では、ポリペプチドリンカーは、天然に存在するＣｏＶＳポリペプチド又は本明細書に開示されるＣｏＶＳポリペプチドの１～１００個の連続するアミノ酸を含む。実施形態では、ポリペプチドリンカーは、配列番号９４に対応するアミノ酸配列を有する。

[0170] 実施形態では、ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドは、フォルドン（foldon）を含む。実施形態では、ＴＭＣＴは、フォルドンに置き換えられる。実施形態では、フォルドンは、ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドの三量体化を引き起こす。実施形態では、フォルドンは、当技術分野で公知のアミノ酸配列である。実施形態では、フォルドンは、配列番号６８のアミノ酸配列を有する。実施形態では、フォルドンは、Ｔ４フィブリチン三量体化モチーフである。実施形態では、Ｔ４フィブリチン三量体化ドメインは、配列番号１０３のアミノ酸配列を有する。実施形態では、フォルドンは、アミノ酸配列において、ポリペプチドリンカーによってＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドから分離されている。ポリペプチドリンカーの非限定的な例は、本開示全体を通して見られる。

[0171] 実施形態では、本開示は、コロナウイルスＳタンパク質の断片及びナノ粒子を含むＣｏＶＳポリペプチド並びにそれを含むワクチンを提供する。実施形態では、コロナウイルスＳタンパク質の断片は、１０～１５００アミノ酸長（例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１０５０、約１１００、約１１５０、約１２００、約１２５０、約１３００、約１３５０、約１４００、約１４５０又は約１５００アミノ酸長）である。実施形態では、コロナウイルスＳタンパク質の断片は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、サブドメイン１、サブドメイン２、上部ヘリックス、融合ペプチド、結合領域、７残基反復１、中央ヘリックス、７残基反復２、ＮＴＤ及びＴＭＣＴからなる群から選択される。

[0172] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＲＢＤ及びサブドメイン１を含む。実施形態では、ＲＢＤ及びサブドメイン１を含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸３１９～５９１である。

[0173] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、コロナウイルスＳタンパク質の断片を含み、このコロナウイルスＳタンパク質の断片は、ＲＢＤである。ＲＢＤの非限定的な例には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤ（アミノ酸配列＝配列番号６９）、ＳＡＲＳのＲＢＤ（アミノ酸配列＝配列番号７０）及びＭＥＲＳのＲＢＤ（アミノ酸配列＝配列番号７１）が含まれる。

[0174] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ポリペプチドリンカーによって連結された２つ以上のＲＢＤを含む。実施形態では、ポリペプチドリンカーは、配列番号９０又は配列番号９４のアミノ酸配列を有する。

[0175] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個のＲＢＤを含む。

[0176] いくつかの実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ポリペプチドリンカーによって連結された２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤを含む。実施形態では、２つ以上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤを含む抗原は、配列番号７２～７５の１つに対応するアミノ酸配列を有する。

[0177] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ及びＳＡＲＳＲＢＤを含む。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ及びＳＡＲＳＲＢＤを含み、各ＲＢＤは、ポリペプチドリンカーによって分離されている。実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ及びＳＡＲＳＲＢＤを含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号７６～７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

[0178] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ及びＭＥＲＳＲＢＤを含む。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ及びＭＥＲＳＲＢＤを含み、各ＲＢＤは、ポリペプチドリンカーによって分離されている。

[0179] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＳＡＲＳＲＢＤ及びＭＥＲＳＲＢＤを含む。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＳＡＲＳＲＢＤ及びＭＥＲＳＲＢＤを含み、各ＲＢＤは、ポリペプチドリンカーによって分離されている。

[0180] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ、ＳＡＲＳＲＢＤ及びＭＥＲＳＲＢＤを含む。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ、ＳＡＲＳＲＢＤ及びＭＥＲＳＲＢＤを含み、各ＲＢＤは、ポリペプチドリンカーによって分離されている。実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤ、ＳＡＲＳＲＢＤ及びＭＥＲＳＲＢＤを含むＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号８０～８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

[0181] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドと共に発現される。実施形態では、Ｎ末端シグナルペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列（ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳ）を有する。実施形態では、Ｎ末端シグナルペプチドは、配列番号１１７のアミノ酸配列（ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＩ）を有する。実施形態では、シグナルペプチドは、ＣｏＶＳタンパク質の発現を可能にする任意のシグナルペプチドで置換され得る。実施形態では、ＣｏＶＳタンパク質シグナルペプチドのアミノ酸の１つ又は複数が欠失又は変異し得る。開始メチオニン残基は、発現を開始するために維持される。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号３５、配列番号３７、配列番号９５、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号９６及び配列番号６０からなる群から選択される核酸配列によってコードされる。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドのＮ末端シグナルペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）シグナルポリペプチド（配列番号５）と比較して、Ｓｅｒ－１３に変異を含む。実施形態では、Ｓｅｒ－１３は、任意の天然アミノ酸に変異している。実施形態では、Ｓｅｒ－１３は、アラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、スレオニン又はバリンに変異している。実施形態では、Ｓｅｒ－１３は、イソロイシンに変異している。

[0182] 宿主細胞におけるＣｏＶＳタンパク質の発現に続いて、Ｎ末端シグナルペプチドが切断されて成熟ＣｏＶタンパク質配列（配列番号２、４、３８、４１、４４、４８、５１、５４、５８、６１、６３、６５、６７、７３、７５、７８、７９、８２、８３、８５、８７、８９、１０６及び１１０）が得られる。実施形態では、シグナルペプチドは、宿主細胞プロテアーゼによって切断される。態様では、完全長タンパク質を宿主細胞から単離し、続いてシグナルペプチドを切断することができる。

[0183] 発現及び精製中の、配列番号１、３、３６、４０、４２、４６、４９、５２、５６、５９、６２、６４、６６、７２、７４、７６、７７、８０、８１、８４、８６、８７、１０５、１０７、８８及び１０９に対応するアミノ酸配列を有するＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断後、配列番号２、４、３８、４１、４４、４８、５１、５４、５８、６１、６３、６５、６７、７３、７５、７８、７９、８２、８３、８５、１０６、１０８、８９及び１１０又は１１２～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドが得られ、この成熟ポリペプチドは、ＣｏＶＳナノ粒子ワクチン又はＣｏＶＳナノ粒子を生成するために使用される。

[0184] 有利には、開示されるＣｏＶＳポリペプチドは、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）タンパク質と比較して、タンパク質発現及び安定性が増強され得る。

[0185] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、天然コロナウイルスＳタンパク質（配列番号２）からのさらなる改変を含む。実施形態では、本明細書に記載のコロナウイルスＳタンパク質は、天然コロナウイルスＳタンパク質に対して少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を示す。当業者は、既知の技術を使用して、天然タンパク質又は本明細書に記載の任意のＣｏＶＳポリペプチドに対する組換えコロナウイルスＳタンパク質の同一性パーセントを計算することになる。例えば、パーセンテージ同一性は、オンラインで入手できるツールCLUSTALW2又はBasic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）を使用して計算することができる。CLUSTALW2ペアワイズアラインメントには、以下のデフォルトパラメータを使用することができる：Protein Weight Matrix＝Gonnet；Gap Open＝10；Gap Extension＝0.1。

[0186] 実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号８７のアミノ酸配列を有するＣｏＶＳポリペプチドと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％同一である。ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号８７のアミノ酸配列を有するＣｏＶＳポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、最大約１個、最大約２個、最大約３個、最大約４個、最大約５個、最大約１０個、最大約１５個、最大約２０個、最大約２５個、最大約３０個、最大約３５個、最大約４０個、最大約４５個又は最大約５０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。ＣｏＶＳポリペプチドは、配列番号８７のアミノ酸配列を有するＣｏＶＳポリペプチドと比較して、約１～約５個のアミノ酸、約３～約１０個のアミノ酸、約５～１０個のアミノ酸、約８～１２個のアミノ酸、約１０～１５個のアミノ酸、約１２～１７個のアミノ酸、約１５～２０個のアミノ酸、約１８～２３個のアミノ酸、約２０～２５個のアミノ酸、約２２～約２７個のアミノ酸、約２５～３０個のアミノ酸、約３０～３５個のアミノ酸、約３５～４０個のアミノ酸、約４０～４５個のアミノ酸又は約４５～５０個のアミノ酸の欠失、挿入又は変異を有し得る。実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、コロナウイルスＳタンパク質（配列番号８７）と比較して、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個又は約２５個の置換を含む。

[0187] 実施形態では、コロナウイルスＳポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端又はＮ末端及びＣ末端の両方で伸長される。いくつかの態様では、伸長は、精製又は検出などの機能に有用なタグである。いくつかの態様では、タグは、エピトープを含む。例えば、タグは、ポリグルタミン酸タグ、FLAGタグ、ＨＡタグ、ポリＨｉｓタグ（約５～１０個のヒスチジンを有する）（配列番号１０１）、ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１００）、８Ｘ－Ｈｉｓタグ（８個のヒスチジンを有する）（配列番号１０２）、Ｍｙｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、マルトース結合タンパク質タグ、チオレドキシンタグ又はＦｃタグであり得る。他の態様では、伸長は、発現を促進するためにタンパク質に融合されたＮ末端シグナルペプチドであり得る。このようなシグナルペプチドは、多くの場合、細胞内での発現中に切断されるが、一部のナノ粒子には、無傷のシグナルペプチドを含む抗原が含まれ得る。従って、ナノ粒子が抗原を含む場合、抗原は、伸長を含み得るため、ナノ粒子に組み込まれると、融合タンパク質であり得る。配列に対する同一性を計算する目的では、伸長は含まれない。実施形態では、タグは、プロテアーゼ切断部位である。プロテアーゼ切断部位の非限定的な例には、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断部位、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、エンドペプチダーゼ、カスパーゼ－１、カスパーゼ－２、カスパーゼ－３、カスパーゼ－４、カスパーゼ－５、カスパーゼ－６、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８、カスパーゼ－９、カスパーゼ－１０、エンテロキナーゼ、Ｘａ因子、グランザイムＢ、ＴＥＶプロテアーゼ及びトロンビンが含まれる。実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断部位である。実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。

[0188] 実施形態では、ＣｏＶＳ糖タンパク質は、融合タンパク質を含む。実施形態では、ＣｏＶＳ糖タンパク質は、Ｎ末端融合タンパク質を含む。実施形態では、ＣｏｖＳ糖タンパク質は、Ｃ末端融合タンパク質を含む。実施形態では、融合タンパク質は、タンパク質の発現、精製又は検出に有用なタグを包含する。実施形態では、タグは、ポリＨｉｓタグ（約５～１０個のヒスチジンを有する）、Ｍｙｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、マルトース結合タンパク質タグ、チオレドキシンタグ、Strepタグ、Twin-Strepタグ又はＦｃタグである。実施形態では、タグは、Ｆｃタグである。実施形態では、Ｆｃタグは、単量体、二量体又は三量体である。実施形態では、タグは、ヘキサヒスチジンタグ、例えば６つのヒスチジンを含むポリＨｉｓタグ（配列番号１００）である。実施形態では、タグは、配列番号９９のアミノ酸配列を有するTwin-Strepタグである。

[0189] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、別のコロナウイルスタンパク質を含む融合タンパク質である。実施形態では、他のコロナウイルスタンパク質は、同じコロナウイルスに由来する。実施形態では、他のコロナウイルスタンパク質は、異なるコロナウイルスに由来する。

[0190] いくつかの態様では、ＣｏＶＳタンパク質は、切断され得る。例えば、Ｎ末端は、約１０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸又は約２００個のアミノ酸によって切断され得る。Ｃ末端は、Ｎ末端の代わりに切断するか、又はＮ末端に加えて切断することができる。例えば、Ｃ末端は、約１０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸又は約２００個のアミノ酸によって切断され得る。切断を有するタンパク質に対する同一性を計算する目的では、タンパク質の残りの部分について同一性を測定する。

ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドを含むナノ粒子
[0191] 実施形態では、成熟ＣｏＶＳポリペプチド抗原を使用して、コロナウイルスＳナノ粒子を含むワクチンを作製する。実施形態では、本開示のナノ粒子は、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドを含む。実施形態では、本開示のナノ粒子は、界面活性剤コアに会合したＣｏＶＳポリペプチドを含む。界面活性剤の存在により、抗原をまとめて提示するコアを形成することによってナノ粒子の形成が促進される。実施形態では、ナノ粒子は、頭部領域が外側に突出し、疎水性領域及びＰＳ８０界面活性剤が糖タンパク質に囲まれた中心コアを形成する、マルチオリゴマー糖タンパク質－界面活性剤（例えば、ＰＳ８０）ナノ粒子に組み込まれたＣｏＶＳポリペプチドを含み得る。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、界面活性剤コアへのタンパク質の会合を促進する膜貫通ドメインを本質的に含むか又は含むように適合される。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、頭部ドメインを含む。図１０は、本開示のＣｏＶＳポリペプチドの例示的な構造を示す。主に、ＣｏＶＳポリペプチド三量体の膜貫通ドメインは、界面活性剤に会合しているが；ポリペプチドの他の部分も相互作用し得る。有利には、ナノ粒子は、環境ストレスに対する耐性が改善されるため、界面活性剤の周りにタンパク質の複数のコピーがまとめられることにより、安定性が向上し、及び／又は免疫系への提示が改善される。

[0192] 実施形態では、界面活性剤コアは、非イオン性界面活性剤コアである。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、非イオン性界面活性剤コアと会合している。実施形態では、界面活性剤は、aト－２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート－４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート－６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート－６５（ＰＳ６５）及びポリソルベート－８０（ＰＳ８０）からなる群から選択される。

[0193] 実施形態では、界面活性剤は、ＰＳ８０である。

[0194] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、三量体を形成する。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コアを取り囲む複数のポリペプチド三量体から構成される。実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも約１個の三量体又はそれを超えるものを含む。実施形態では、ナノ粒子は、スパイクタンパク質の少なくとも約５～約３０個の三量体を含む。実施形態では、各ナノ粒子は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は１５個、２０個、２５個又は３０個（これらの間のすべての値及び範囲を含む）の三量体を含み得る。本明細書に開示される組成物は、異なる数の三量体を有するナノ粒子を含み得る。例えば、組成物は、三量体の数が２～９個の範囲であるナノ粒子を含み得；実施形態では、組成物中のナノ粒子は、２～６個の三量体を含み得る。実施形態では、組成物は、１ナノ粒子当たり２～６個の三量体又は１ナノ粒子当たり２～９個の三量体を有するナノ粒子の異種集団を含む。実施形態では、組成物は、ナノ粒子の実質的に均一な集団を含み得る。例えば、集団は、５個の三量体を有する約９５％のナノ粒子を含み得る。

[0195] 本明細書に開示されるナノ粒子は、粒径が様々である。実施形態では、本明細書に開示されるナノ粒子は、Ｚ－ａｖｅサイズが約２０ｎｍ～約６０ｎｍ、約２０ｎｍ～約５０ｎｍ、約２０ｎｍ～約４５ｎｍ、約２０ｎｍ～約３５ｎｍ、約２０ｎｍ～約３０ｎｍ、約２５ｎｍ～約３５ｎｍ又は約２５ｎｍ～約４５ｎｍの範囲である。特に明記しない限り、粒径（Ｚ－ａｖｅ）は、Zetasizer NanoZS（Malvern, UK）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される。

[0196] 実施形態では、本明細書に開示されるＣｏＶＳポリペプチドを含むナノ粒子は、野生型ＣｏＶＳポリペプチドを含むナノ粒子と比較して粒径が小さい。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、粒径が少なくとも約４０％小さい、例えば粒径が少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％又は少なくとも約８５％小さい。

[0197] 本明細書に開示されるＣｏＶＳポリペプチドを含むナノ粒子は、野生型ＣｏＶＳポリペプチドを含むナノ粒子よりもサイズ、形状及び質量が均一である。不均一性の尺度である多分散性指数（ＰＤＩ）は、特に明記しない限り、Malvern Setasizerを使用する動的光散乱によって測定される。実施形態では、本明細書で測定される粒子は、約０．２～約０．４５、例えば約０．２、約０．２５、約０．２９、約０．３、約０．３５、約０．４０又は約０．４５のＰＤＩを有する。実施形態では、本明細書で測定されるナノ粒子は、野生型ＣｏＶＳポリペプチドを含むナノ粒子のＰＤＩよりも少なくとも約２５％小さいＰＤＩ、例えば少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％又は少なくとも約６０％小さいＰＤＩを有する。

[0198] ＣｏＶＳポリペプチド及びそれを含むナノ粒子は、野生型ＣｏＶＳポリペプチド又はそのナノ粒子と比較して熱安定性が改善されている。ＣｏＶＳポリペプチドの熱安定性は、特に明記しない限り、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して測定される。転移エンタルピー（ΔＨｃａｌ）は、ＣｏＶＳポリペプチドを展開するために必要なエネルギーである。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、野生型ＣｏＶＳポリペプチドと比較して増加したΔＨｃａｌを有する。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドのΔＨｃａｌは、野生型ＣｏＶＳポリペプチドのΔＨｃａｌよりも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍又は約１０倍大きい。

[0199] 本明細書に開示されるワクチン組成物は、いくつかのナノ粒子タイプを含み得る。いくつかの態様では、ナノ粒子タイプは、二量体又は単量体であり得る異方性ロッドの形態である。他の態様では、ナノ粒子タイプは、球状オリゴマーである。さらに他の態様では、ナノ粒子は、最初の２つのタイプの中間の沈降特性を有する中間ナノ粒子として説明することができる。ナノ粒子タイプの形成は、製造プロセス中に界面活性剤及びタンパク質の濃度を制御することによって調節することができる。沈降係数を測定することによってナノ粒子タイプを決定することができる。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原を含むナノ粒子の製造
[0200] 本開示のナノ粒子は、天然に存在しない生成物であり、その成分は、自然界では一緒に存在しない。一般に、本明細書に開示される方法は、界面活性剤交換アプローチを使用し、このアプローチでは、第１の界面活性剤を使用してタンパク質を単離し、次いでその第１の界面活性剤を第２の界面活性剤と交換してナノ粒子を形成する。

[0201] ナノ粒子に含まれる抗原は、典型的には、宿主細胞における組換え発現によって産生される。標準的な組換え技術を使用することができる。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、バキュロウイルス系を使用して昆虫宿主細胞で発現される。実施形態では、バキュロウイルスは、カテプシンＬノックアウトバキュロウイルス、キチナーゼノックアウトバキュロウイルスである。任意選択により、バキュロウイルスは、カテプシン－Ｌ及びキチナーゼの両方についてダブルノックアウトのバキュロウイルスである。高レベルの発現は、昆虫細胞発現系で達成され得る。昆虫細胞の非限定的な例は、ツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda））（Ｓｆ）細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、イラクサギヌワバ（トリコプルシア・ニ（Trichoplusiani））細胞、例えばハイファイブ（High Five）細胞及びショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２細胞である。実施形態では、本明細書に記載のＣｏＶＳポリペプチドは、任意の適切な宿主細胞で産生される。実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞である。

[0202] 典型的なトランスフェクション及び細胞増殖法を使用して、細胞を培養することができる。ベクター、例えば融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当技術分野で周知の方法に従って宿主細胞にトランスフェクトすることができる。例えば、核酸の真核細胞への導入は、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション及びポリアミントランスフェクション試薬を使用するトランスフェクションによって達成することができる。一実施形態では、ベクターは、組換えバキュロウイルスである。

[0203] 宿主細胞を増殖させる方法には、限定されるものではないが、バッチ培養技術、流加培養技術、連続及び灌流細胞培養技術が含まれる。細胞培養とは、精製及び分離のための、細胞が増殖してタンパク質（例えば、組換えタンパク質）を発現するバイオリアクター（発酵チャンバー）内での細胞の成長及び増殖を意味する。典型的には、細胞培養は、滅菌され、制御された温度及び大気条件下においてバイオリアクター内で行われる。バイオリアクターは、細胞培養に使用されるチャンバーであり、温度、雰囲気、撹拌及び／又はｐＨなどの環境条件を監視することができる。一実施形態では、バイオリアクターは、ステンレス鋼チャンバーである。別の実施形態では、バイオリアクターは、滅菌済みのプラスチックバッグ（例えば、Cellbag（登録商標）, Wave Biotech, Bridgewater, N.J.）である。他の実施形態では、滅菌済みプラスチックバッグは、約５０Ｌ～３５００Ｌのバッグである。

ＣｏＶスパイク（Ｓ）タンパク質抗原を含むナノ粒子の抽出及び精製
[0204] 宿主細胞の増殖後、界面活性剤及び精製プロトコルを使用して宿主細胞からタンパク質を回収することができる。宿主細胞を４８～９６時間増殖させたら、細胞を培地から単離し、界面活性剤を含む溶液を加えて細胞膜を可溶化し、タンパク質を界面活性剤抽出物に放出させる。Triton X-100及びTERGITOL（登録商標）ノニルフェノールエトキシレート（ＮＰ－９としても知られる）は、それぞれ抽出に適した界面活性剤である。界面活性剤は、約０．１％～約１．０％の最終濃度まで添加することができる。例えば、濃度は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．５％、約０．７％、約０．８％又は約１．０％であり得る。濃度範囲は、約０．１％～約０．３％であり得る。態様では、濃度は、約０．５％である。

［[0205］] 他の態様では、異なる第１の界面活性剤を使用して、タンパク質を宿主細胞から単離することができる。例えば、第１の界面活性剤は、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、ノノキシノール－９、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、BRIJ（登録商標）ポリエチレングリコールドデシルエーテル３５、BRIJ（登録商標）ポリエチレングリコール（３）セチルエーテル５６、BRIJ（登録商標）アルコールエトキシレート７２、BRIJ（登録商標）ポリオキシル２ステアリルエーテル７６、BRIJ（登録商標）ポリエチレングリコールモノオレリルエーテル９２Ｖ、BRIJ（登録商標）ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル９７、BRIJ（登録商標）ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル５８Ｐ、CREMOPHOR（登録商標）ELマクロゴルグリセロールリシノレート、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ－デカノイル－Ｎ－メチルグルカミン、ｎ－デシルα－Ｄ－グルコピラノシド、デシルβ－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ドデカノイル－Ｎ－メチルグルカミド、ｎドデシルα－Ｄ－マルトシド、ｎ－ドデシルβ－Ｄ－マルトシド、ｎ－ドデシルβ－Ｄ－マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ｎ－ヘキサデシルβ－Ｄ－マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、Igepal CA-630、Igepal CA-630、メチル－６－０－（Ｎ－ヘプチルカルバモイル）－α－Ｄ－グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチルグルカミン、Ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル－β－Ｄグルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルＷ－１、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１００ステアレート、ポリオキシエチレン２０イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル、ポリオキシエチレン４０ステアレート、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシエチレン８ステアレート、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、ポリオキシエチレン２５プロピレングリコールステアレート、キラヤ樹皮由来サポニン、SPAN（登録商標）２０ソルビタンラウレート、SPAN（登録商標）４０ソルビタンモノパルミテート、SPAN（登録商標）６０ソルビタンステアレート、SPAN（登録商標）６５ソルビタントリステアレート、SPAN（登録商標）８０ソルビタンモノオレエート、SPAN（登録商標）８５ソルビタントリオレエート、TERGITOL（登録商標）第２級アルコールエトキシレート１５－Ｓ－１２型、TERGITOL（登録商標）第２級アルコールエトキシレート１５－Ｓ－３０型、TERGITOL（登録商標）第２級アルコールエトキシレート１５－Ｓ－５型、TERGITOL（登録商標）第２級アルコールエトキシレート１５－Ｓ－７型、TERGITOL（登録商標）第２級アルコールエトキシレート１５－Ｓ－９型、TERGITOL（登録商標）ノニルフェノールエトキシレートＮＰ－１０型、TERGITOL（登録商標）ノニルフェノールエトキシレートＮＰ－４型、TERGITOL（登録商標）ノニルフェノールエトキシレートＮＰ－４０型、TERGITOL（登録商標）ノニルフェノールエトキシレートＮＰ－７型、TERGITOL（登録商標）ノニルフェノールエトキシレートＮＰ－９型、TERGITOL（登録商標）分岐第２級アルコールエトキシレートＴＭＮ－１０型、TERGITOL（登録商標）分岐第２級アルコールエトキシレートＴＭＮ－６型、TRITON（商標）X-100ポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル又はこれらの組み合わせであり得る。

[0206] 次いで、ナノ粒子を、遠心分離を使用して細胞破片から単離することができる。実施形態では、塩化セシウム、スクロース及びイオジキサノールを使用するなどの勾配遠心分離を使用することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを含む標準的な精製技術などの他の技術を代替として又は追加で使用することができる。

[0207] 例えば、第１のカラムは、FRACTOGEL（登録商標）ＥＭＤメタクリレートベースのポリマービーズＴＭＡＥ（EMD Millipore）などのイオン交換クロマトグラフィー樹脂であり得、第２のカラムは、レンチル（レンズマメ（Lens culinaris））レクチン親和性樹脂であり得、及び第３のカラムは、FRACTOGEL（登録商標）ＥＭＤメタクリレートベースのポリマービーズＳＯ３（EMD Millipore）樹脂などの陽イオン交換カラムであり得る。他の態様では、陽イオン交換カラムは、ＭＭＣカラム又はNuvia C Primeカラム（Bio-Rad Laboratories, Inc）であり得る。好ましくは、本明細書に開示される方法は、界面活性剤抽出カラム；例えば疎水性相互作用カラムを使用しない。そのようなカラムは、多くの場合、精製中に界面活性剤を除去するために使用されるが、本明細書に開示される方法に悪影響を与え得る。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原を含むナノ粒子の界面活性剤交換
[0208] ナノ粒子を形成するために、宿主細胞からタンパク質を抽出するために使用される第１の界面活性剤は、ナノ粒子構造に到達するように第２の界面活性剤で実質的に置き換えられる。ＮＰ－９は、好ましい抽出界面活性剤である。典型的には、ナノ粒子は、ＨＰＬＣで測定すると検出可能なＮＰ－９を含まない。第２の界面活性剤は、典型的には、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０、ＰＳ６５及びＰＳ８０からなる群から選択される。好ましくは、第２の界面活性剤は、ＰＳ８０である。

[0209] 特定の態様では、界面活性剤交換を、アフィニティークロマトグラフィーを使用して行って、これらの炭水化物部分を介して糖タンパク質を結合させる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーは、マメ科レクチンカラムを使用することができる。マメ科レクチンは、元々植物で同定されたタンパク質であり、炭水化物残基と特異的及び可逆的に相互作用することが分かっている。例えば、Sharon and Lis,“Legume lectins--a large family of homologous proteins,”FASEB J. 1990 Nov;4(14):3198-208；Liener,“The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine,”Elsevier, 2012を参照されたい。適切なレクチンには、コンカナバリンＡ（con A）、エンドウレクチン、イガマメレクチン（sainfoin lect）及びレンチルレクチンが含まれる。レンチルレクチンは、その結合特性により界面活性剤交換に好ましいカラムである。レクチンカラムは、市販されており；例えば、Capto Lentil Lectinは、GE Healthcareから入手可能である。いくつかの態様では、レンチルレクチンカラムは、組換えレクチンを使用することができる。分子レベルでは、炭水化物部分がレンチルレクチンに結合し、タンパク質のアミノ酸を遊離させて界面活性剤の周りに合体させ、抗原の複数のコピーを有するナノ粒子、例えば界面活性剤に固定された二量体、三量体又は四量体であり得る糖タンパク質オリゴマーを提供する界面活性剤コアの形成をもたらすと考えられている。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、三量体を形成する。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチド三量体は、界面活性剤に固定される。実施形態では、各ＣｏＶＳポリペプチドナノ粒子は、非イオン性コアに会合した少なくとも１つの三量体を含む。

[0210] 界面活性剤は、界面活性剤交換中にナノ粒子を形成するためにタンパク質と共にインキュベートされると、初期の精製工程中に最大約０．１％（ｗ／ｖ）存在する可能性があり、この量は、最適な安定性を有する最終ナノ粒子を達成するために低減される。例えば、非イオン性界面活性剤（例えば、ＰＳ８０）は、約０．００５％（ｖ／ｖ）～約０．１％（ｖ／ｖ）、例えば約０．００５％（ｖ／ｖ）、約０．００６％（ｖ／ｖ）、約０．００７％（ｖ／ｖ）、約０．００８％（ｖ／ｖ）、約０．００９％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．０１５％（ｖ／ｖ）、約０．０２％（ｖ／ｖ）、約０．０２５％（ｖ／ｖ）、約０．０３％（ｖ／ｖ）、約０．０３５％（ｖ／ｖ）、約０．０４％（ｖ／ｖ）、約０．０４５％（ｖ／ｖ）、約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．０５５％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）、約０．０６５％（ｖ／ｖ）、約０．０７％（ｖ／ｖ）、約０．０７５％（ｖ／ｖ）、約０．０８％（ｖ／ｖ）、約０．０８５％（ｖ／ｖ）、約０．０９％（ｖ／ｖ）、約０．０９５％（ｖ／ｖ）又は約０．１％（ｖ／ｖ）のＰＳ８０であり得る。実施形態では、ナノ粒子は、約０．０３％～約０．０５％のＰＳ８０を含む。実施形態では、ナノ粒子は、約０．０１％（ｖ／ｖ）のＰＳ８０を含む。

[0211] 実施形態では、精製されたＣｏＶＳポリペプチドは、透析される。実施形態では、透析は、精製後に行われる。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドは、リン酸ナトリウム、ＮａＣｌ及びＰＳ８０を含む溶液中で透析される。実施形態では、リン酸ナトリウムを含む透析溶液は、約５ｍＭ～約１００ｍＭのリン酸ナトリウム、例えば約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ又は約１００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。実施形態では、リン酸ナトリウムを含む溶液のｐＨは、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４又は約７．５である。実施形態では、塩化ナトリウムを含む透析溶液は、約５０ｍＭ～約５００ｍＭのＮａＣｌ、例えば約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２１０ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２３０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２６０ｍＭ、約２７０ｍＭ、約２８０ｍＭ、約２９０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３１０ｍＭ、約３２０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約３４０ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３６０ｍＭ、約３７０ｍＭ、約３８０ｍＭ、約３９０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４１０ｍＭ、約４２０ｍＭ、約４３０ｍＭ、約４４０ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４６０ｍＭ、約４７０ｍＭ、約４８０ｍＭ、約４９０ｍＭ又は約５００ｍＭのＮａＣｌを含む。実施形態では、ＰＳ８０を含む透析溶液は、約０．００５％（ｖ／ｖ）、約０．００６％（ｖ／ｖ）、約０．００７％（ｖ／ｖ）、約０．００８％（ｖ／ｖ）、約０．００９％（ｖ／ｖ）、約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．０１５％（ｖ／ｖ）、約０．０２％（ｖ／ｖ）、約０．０２５％（ｖ／ｖ）、約０．０３％（ｖ／ｖ）、約０．０３５％（ｖ／ｖ）、約０．０４％（ｖ／ｖ）、約０．０４５％（ｖ／ｖ）、約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．０５５％（ｖ／ｖ）、約０．０６％（ｖ／ｖ）、約０．０６５％（ｖ／ｖ）、約０．０７％（ｖ／ｖ）、約０．０７５％（ｖ／ｖ）、約０．０８％（ｖ／ｖ）、約０．０８５％（ｖ／ｖ）、約０．０９％（ｖ／ｖ）、約０．０９５％（ｖ／ｖ）又は約０．１％（ｖ／ｖ）のＰＳ８０を含む。実施形態では、透析溶液は、約２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、約３００ｍＭのＮａＣｌ及び約０．０１％（ｖ／ｖ）のＰＳ８０を含む。

[0212] 界面活性剤交換は、上記のように精製され、精製され、貯蔵のために凍結され、次いで界面活性剤交換のために解凍されたタンパク質で行うことができる。

[0213] 本明細書に開示される組成物の安定性は、様々な方法で測定することができる。１つのアプローチでは、過酷な保管条件を模倣することによってナノ粒子にストレスを与えるように設計された様々な処理後、抗原タンパク質の完全性を決定するためにペプチドマップを作成することができる。従って、安定性の尺度は、対照試料と比較した、ストレスを受けた試料中の抗原ペプチドの相対的存在量である。例えば、ＣｏＶＳポリペプチドを含むナノ粒子の安定性は、ナノ粒子を様々なｐＨ、プロテアーゼ、塩、限定されるものではないが、過酸化水素を含む酸化剤、様々な温度に曝露し、凍結／解凍サイクルに供し、及び撹拌することによって評価することができる。図１２Ａ及び図１２Ｂは、ＢＶ２３７３（配列番号８７）及びＢＶ２３６５（配列番号４）が様々なストレス条件下でｈＡＣＥ２への結合を維持することを示す。界面活性剤コアに固定された糖タンパク質の位置は、望ましくない相互作用を減らすことによって安定性を高めると考えられている。例えば、プロテアーゼベースの分解に対する保護の改善は、本明細書に開示されるモル比で糖タンパク質をコアに固定して、立体障害がプロテアーゼのアクセスをブロックする遮蔽効果によって達成することができる。安定性も、無傷のタンパク質をモニタリングすることによって測定することができる。図３３及び図３４は、配列番号１０９及び８７それぞれのアミノ酸配列を有するＣｏＶポリペプチドを含むナノ粒子を比較する。図３４は、配列番号８７のアミノ酸配列を有するＣｏＶポリペプチドが精製中に特に良好な安定性を示すことを示している。図３４のポリペプチドは、ＱＱＡＱのアミノ酸配列（配列番号７）を有するフューリン切断部位を含む。

ＣｏＶＳポリペプチド抗原を含むワクチン組成物
[0214] 本開示は、例えば、ナノ粒子中における、ＣｏＶＳポリペプチドを含むワクチン組成物を提供する。いくつかの態様では、ワクチン組成物は、同じ種のウイルスに由来する２つ以上のウイルス株に由来する抗原を含むナノ粒子を含み得る。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物の成分の１つ又は複数で満たされた１つ又は複数の容器を含む医薬品パック又はキットを提供する。

[0215] 本明細書に開示される組成物は、予防的又は治療的のいずれか、典型的には予防的に使用することができる。従って、本開示は、感染を処置又は予防する方法を含む。この方法は、治療量又は予防量の本開示の免疫原性組成物を対象に投与することを含む。好ましくは、医薬組成物は、防御効果を提供するワクチン組成物である。他の態様では、防御効果には、曝露された集団の割合での感染に関連する症状の改善が含まれ得る。例えば、組成物は、未処置の対象と比較して、熱疲労、筋肉痛、頭痛、喉の痛み、嘔吐、下痢、発疹、腎臓及び肝機能障害の症状、内出血及び外出血から選択される１つ又は複数のウイルス病の症状を予防又は軽減することができる。

[0216] ナノ粒子は、様々な賦形剤及び緩衝剤などの存在下でワクチンとして投与するために製剤化することができる。例えば、ワクチン組成物は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム及び／又はヒスチジンを含み得る。リン酸ナトリウムは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ又は約２５ｍＭで存在し得；特定の例では、約２２ｍＭのリン酸ナトリウムが存在する。ヒスチジンは、約０．１％（ｗ／ｖ）、約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．７％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）又は約２．５％（ｗ／ｖ）存在し得る。塩化ナトリウムは、存在する場合、約１５０ｍＭであり得る。特定の組成物では、塩化ナトリウムは、例えば、約２００ｍＭ～約５００ｍＭのより高い濃度で存在し得る。実施形態では、塩化ナトリウムは、限定されるものではないが、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ又は約５００ｍＭを含む高濃度で存在する。

[0217] 実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子は、特定のｐＨレベルで改善された安定性を有する。実施形態では、ナノ粒子は、わずかに酸性のｐＨレベルで安定である。例えば、ナノ粒子は、わずかに酸性のｐＨ、例えばｐＨ５．８～ｐＨ７．０で安定である。実施形態では、ナノ粒子及びナノ粒子を含む組成物は、約ｐＨ５．９～約ｐＨ６．８、約ｐＨ６．０～約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．１～約ｐＨ６．４、約ｐＨ６．１～約ｐＨ６．３又は約ｐＨ６．２を含む約ｐＨ５．８～約ｐＨ７．０の範囲のｐＨで安定であり得る。実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子及び組成物は、約ｐＨ７．０～約ｐＨ７．４を含む中性ｐＨで安定である。実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子及び組成物は、わずかにアルカリ性のｐＨ、例えば約ｐＨ７．０～約ｐＨ８．５、約ｐＨ７．０～約ｐＨ８．０又は約ｐＨ７．０～約ｐＨ７．５（これらの間のすべての値及び範囲を含む）で安定である。

アジュバント
[0218] 特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、免疫応答を増強するために１つ又は複数のアジュバントと組み合わせることができる。他の実施形態では、組成物は、アジュバントなしで調製されるため、アジュバントを含まない組成物として投与することができる。有利には、本明細書に開示されるアジュバントを含まない組成物は、単回投与として投与される場合、防御免疫応答を提供し得る。強力な免疫応答を誘発するミョウバンを含まない組成物は、約６０歳以上の成人に特に有用である。

アルミニウムベースのアジュバント
[0219] 実施形態では、アジュバントは、ミョウバン（例えば、ＡｌＰＯ_４又はＡｌ（ＯＨ）_３）であり得る。典型的には、ナノ粒子は、ミョウバンに実質的に結合している。例えば、ナノ粒子は、ミョウバンに少なくとも８０％結合、少なくとも８５％結合、少なくとも９０％結合又は少なくとも９５％結合し得る。多くの場合、ナノ粒子は、組成物中でミョウバンに９２％～９７％結合している。投与量当たり存在するミョウバンの量は、典型的には、約４００μｇ～約１２５０μｇの範囲である。例えば、ミョウバンは、投与量当たり約３００μｇ～約９００μｇ、約４００μｇ～約８００μｇ、約５００μｇ～約７００μｇ、約４００μｇ～約６００μｇ又は約４００μｇ～約５００μｇの量で存在し得る。典型的には、ミョウバンは、１２０μｇのタンパク質ナノ粒子の投与量に約４００μｇ存在する。

サポニンアジュバント
[0220] サポニンを含むアジュバントも、本明細書に開示される免疫原と組み合わせることができる。サポニンは、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）の木の樹皮に由来するグリコシドである。典型的には、サポニンは、多段階の精製プロセスを使用して調製され、複数の画分が得られる。本明細書で使用される場合、「キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）由来のサポニン画分」という用語は、キラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）の半精製された若しくは定義されたサポニン画分又はその実質的に純粋な画分を表すために一般的に使用される。

サポニン画分
[0221] いくつかのアプローチは、サポニン画分を生成するのに適している。画分Ａ、Ｂ及びＣは、米国特許第６，３５２，６９７号に記載されており、以下のように調製することができる。粗水性キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）抽出物であるＱｕｉｌＡからの親油性画分をクロマトグラフィーによって分離し、水中の７０％アセトニトリルで溶出して親油性画分を回収する。次いで、この親油性画分を、酸性水中で２５％～６０％アセトニトリルの勾配を使用して溶出するセミ分取ＨＰＬＣによって分離する。本明細書で「画分Ａ」又は「ＱＨ－Ａ」と呼ばれる画分は、約３９％アセトニトリルで溶出される画分であるか、又はその画分に対応する。本明細書で「画分Ｂ」又は「ＱＨ－Ｂ」と呼ばれる画分は、約４７％アセトニトリルで溶出される画分であるか、又はその画分に対応する。本明細書で「画分Ｃ」又は「ＱＨ－Ｃ」と呼ばれる画分は、約４９％アセトニトリルで溶出される画分であるか、又はその画分に対応する。画分の精製に関する追加の情報は、米国特許第５，０５７，５４０号に見られる。本明細書に記載のように調製すると、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）の画分Ａ、Ｂ及びＣは、定義可能な特性を有する化学的に密接に関連する分子の群又はファミリーをそれぞれ表す。画分Ａ、Ｂ及びＣが得られるクロマトグラフィー条件は、溶出プロファイル及び生物学的活性に関するバッチ間の再現性が非常に一貫するような条件である。

[0222] 他のサポニン画分も記載されている。画分Ｂ３、Ｂ４及びＢ４ｂは、欧州特許第０４３６６２０号に記載されている。画分ＱＡ１～ＱＡ２２は、欧州特許第０３６３２２７９Ｂ２号、Q-VAC（Nor-Feed, AS Denmark）、Quillaja saponaria Molina Spikoside（lsconova AB, Ultunaallen 2B, 756 51 Uppsala, Sweden）に記載されている。欧州特許第０３６３２２７９Ｂ２号の画分ＱＡ－１、ＱＡ－２、ＱＡ－３、ＱＡ－４、ＱＡ－５、ＱＡ－６、ＱＡ－７、ＱＡ－８、ＱＡ－９、ＱＡ－１０、ＱＡ－１１、ＱＡ－１２、ＱＡ－１３、ＱＡ－１４、ＱＡ－１５、ＱＡ－１６、ＱＡ－１７、ＱＡ－１８、ＱＡ－１９、ＱＡ－２０、ＱＡ－２１及びＱＡ－２２、特にＱＡ－７、ＱＡ－１７、ＱＡ－１８及びＱＡ－２１を使用することができる。これらは、欧州特許第０３６３２２７９Ｂ２号、特に６ページ並びに８ページ及び９ページの実施例１に記載されているように得られる。

[0223] 本明細書に記載され、アジュバントを形成するために使用されるサポニン画分は、多くの場合、実質的に純粋な画分であり；即ち、画分は、他の物質の汚染が実質的に存在しない。特定の態様では、実質的に純粋なサポニン画分は、他のサポニン又は他のアジュバント物質などの他の化合物を最大４０重量％、最大３０重量％、最大２５重量％、最大２０重量％、最大１５重量％、最大１０％、最大７重量％、最大５重量％、最大２重量％、最大１重量％、最大０．５重量％又は最大０．１重量％含み得る。

ＩＳＣＯＭの構造
[0224] サポニン画分は、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）と呼ばれるケージ様粒子の形態で投与することができる。ＩＳＣＯＭは、欧州特許第０１０９９４２Ｂ１号、同第０２４２３８０Ｂ１号、同第０１８０５４６Ｂ１号に記載のように調製することができる。特定の実施形態では、欧州特許第９６００６４７－３号（ＰＣＴ／スウェーデン特許第９７／００２８９号）に記載のように、トランスポート抗原及び／又はパッセンジャー抗原を使用することができる。

マトリックスアジュバント
[0225] 実施形態では、ＩＳＣＯＭは、ＩＳＣＯＭマトリックス複合体である。ＩＳＣＯＭマトリックス複合体は、少なくとも１つのサポニン画分及び脂質を含む。脂質は、少なくともコレステロールなどのステロールである。特定の態様では、ＩＳＣＯＭマトリックス複合体は、リン脂質も含む。ＩＳＣＯＭマトリックス複合体は、必ずしもグリコシドではない１つ又は複数の他の免疫調節（アジュバント活性）物質も含み得、参照によりその全体が本明細書に援用される欧州特許第０４３６６２０Ｂ１号に記載されているように生成され得る。

[0226] 他の態様では、ＩＳＣＯＭは、ＩＳＣＯＭ複合体である。ＩＳＣＯＭ複合体は、少なくとも１つのサポニン、少なくとも１つの脂質及び少なくとも１種類の抗原又はエピトープを含む。ＩＳＣＯＭ複合体は、抗原の一部が粒子に組み込まれるように界面活性剤処理によって会合した抗原を含む。対照的に、ＩＳＣＯＭマトリックスは、抗原との混合物として処方され、ＩＳＣＯＭマトリックス粒子と抗原との間の会合は、静電相互作用及び／又は疎水性相互作用によって媒介される。

[0227] 一実施形態によると、ＩＳＣＯＭマトリックス複合体若しくはＩＳＣＯＭ複合体に組み込まれるサポニン画分又はＩＳＣＯＭ若しくはＩＳＣＯＭマトリックス複合体に同様に組み込まれるか又はこれらと混合される少なくとも１つの追加のアジュバントは、キラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）、キラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）の半精製調製物、キラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）の精製調製物の画分Ａ、画分Ｂ若しくは画分Ｃ又は任意の精製サブ画分、例えばＱＡ１～２１から選択される。

[0228] 特定の態様では、各ＩＳＣＯＭ粒子は、少なくとも２つのサポニン画分を含み得る。異なるサポニン画分の重量％の任意の組み合わせを使用することができる。任意の２つの画分の重量％の任意の組み合わせを使用することができる。例えば、粒子は、任意の重量％の画分Ａ及び任意の重量％の別のサポニン画分、例えばそれぞれ粗サポニン画分又は画分Ｃを含み得る。従って、特定の態様では、各ＩＳＣＯＭマトリックス粒子又は各ＩＳＣＯＭ複合体粒子は、０．１～９９．９重量％、５～９５重量％、１０～９０重量％、１５～８５重量％、２０～８０重量％、２５～７５重量％、３０～７０重量％、３５～６５重量％、４０～６０重量％、４５～５５重量％、４０～６０重量％又は５０重量％の１つのサポニン画分、例えば画分Ａ及び別の画分、例えば任意の粗画分又は任意の他の画分、例えば画分Ｃのそれぞれの場合における１００％までの残りを含み得る。重量は、サポニン画分の総重量として計算される。ＩＳＣＯＭマトリックス複合体及びＩＳＣＯＭ複合体アジュバントの例は、参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１３／０１２９７７０号に開示されている。

[0229] 特定の実施形態では、ＩＳＣＯＭマトリックス又はＩＳＣＯＭ複合体は、５～９９重量％の１つの画分、例えば画分Ａ及び１００重量％までの残り、例えば粗サポニン画分又は画分Ｃを含む。重量は、サポニン画分の総重量として計算される。

[0230] 別の実施形態では、ＩＳＣＯＭマトリックス又はＩＳＣＯＭ複合体は、４０～９９重量％の１つの画分、例えば画分Ａ及び１～６０重量％の別の画分、例えば粗サポニン画分又は画分Ｃを含む。重量は、サポニン画分の総重量として計算される。

[0231] さらに別の実施形態では、ＩＳＣＯＭマトリックス又はＩＳＣＯＭ複合体は、７０～９５重量％の１つの画分、例えば画分Ａ及び３０～５重量％の別の画分、例えば粗サポニン画分又は画分Ｃを含む。重量は、サポニン画分の総重量として計算される。他の実施形態では、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）由来のサポニン画分は、ＱＡ１～２１のいずれか１つから選択される。

[0232] サポニン画分の混合物を含む粒子に加えて、ＩＳＣＯＭマトリックス粒子及びＩＳＣＯＭ複合体粒子は、それぞれ１つのみのサポニン画分を使用して形成され得る。本明細書に開示される組成物は、各粒子が１つのみのサポニン画分を含む複数の粒子を含み得る。即ち、特定の組成物は、１つ若しくは複数の異なるタイプのＩＳＣＯＭマトリックス複合体粒子及び／又は１つ若しくは複数の異なるタイプのＩＳＣＯＭ複合体粒子を含み得、個々の粒子は、それぞれキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）由来の１つのサポニン画分を含み、１つの複合体中のサポニン画分は、他の複合体粒子中のサポニン画分と異なる。

[0233] 特定の態様では、１つのタイプのサポニン画分又は粗サポニン画分を１つのＩＳＣＯＭマトリックス複合体又は粒子に組み込むことができ、別のタイプの実質的に純粋なサポニン画分又は粗サポニン画分を別のＩＳＣＯＭマトリックス複合体又は粒子に組み込むことができる。組成物又はワクチンは、少なくとも２つのタイプの複合体又は粒子を含むことができ、各タイプは、物理的に異なる粒子に組み込まれた１つのタイプのサポニンを有する。

[0234] 本組成物では、１つのサポニン画分キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）及び別のサポニン画分キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja saponaria Molina）が異なるＩＳＣＯＭマトリックス複合体粒子及び／又はＩＳＣＯＭ複合体粒子に別々に組み込まれている、ＩＳＣＯＭマトリックス複合体粒子及び／又はＩＳＣＯＭ複合体粒子の混合物を使用することができる。

[0235] それぞれ１つのサポニン画分を有するＩＳＣＯＭマトリックス又はＩＳＣＯＭ複合体粒子は、任意の組み合わせの重量％で組成物中に存在し得る。特定の態様では、組成物は、０．１～９９．９重量％、５～９５重量％、１０～９０重量％、１５～８５重量％、２０～８０重量％、２５～７５重量％、３０～７０重量％、３５～６５重量％、４０～６０重量％、４５～５５重量％、４０～６０重量％又は５０重量％の第１のサポニン画分を含むＩＳＣＯＭマトリックス又は複合体を含み得、残りの部分は、異なるサポニン画分を含むＩＳＣＯＭマトリックス又は複合体によって構成されている。いくつかの態様では、残りの部分は、各マトリックス又は複合体粒子が１つのみのサポニン画分を含む、１つ又は複数のＩＳＣＯＭマトリックス又は複合体である。他の態様では、ＩＳＣＯＭマトリックス又は複合体粒子は、２つ以上のサポニン画分を含み得る。

[0236] 特定の組成物では、第１のＩＳＣＯＭマトリックス又はＩＳＣＯＭ複合体粒子中のサポニン画分のみが画分Ａであり、第２のＩＳＣＯＭマトリックス又はＩＳＣＯＭ複合体粒子中のサポニン画分のみが画分Ｃである。

[0237] 好ましい組成物は、画分Ａを含む第１のＩＳＣＯＭマトリックス及び画分Ｃを含む第２のＩＳＣＯＭマトリックスを含み、画分ＡＩＳＣＯＭマトリックスは、全サポニンアジュバントの重量当たり約７０％を構成し、画分ＣＩＳＣＯＭマトリックスは、全サポニンアジュバントの重量当たり約３０％を構成する。別の好ましい組成物では、画分ＡＩＳＣＯＭマトリックスは、全サポニンアジュバントの重量当たり約８５％を構成し、画分ＣＩＳＣＯＭマトリックスは、全サポニンアジュバントの重量当たり約１５％を構成する。従って、特定の組成物では、画分ＡＩＳＣＯＭマトリックスは、組成物中のサポニンアジュバントの総重量の約７０％～約８５％の範囲で存在し、画分ＣＩＳＣＯＭマトリックスは、組成物中のサポニンアジュバントの総重量の約１５％～約３０％の範囲で存在する。実施形態では、画分ＡＩＳＣＯＭマトリックスは、アジュバント中の画分ＡＩＳＣＯＭマトリックス及び画分ＣＩＳＣＯＭの重量の合計の５０～９６重量％を構成し、画分ＣＩＳＣＯＭマトリックスは残りを構成する。本明細書でMATRIX-M（商標）と呼ばれる特に好ましい組成物では、画分ＡＩＳＣＯＭマトリックスは、組成物中のサポニンアジュバントの総重量の約８５％で存在し、画分ＣＩＳＣＯＭマトリックスは、組成物中のサポニンアジュバントの総重量の約１５％で存在する。MATRIX-M（商標）は、Matrix-M1と互換的に呼ぶことができる。

[0238] 例示的なＱＳ－７及びＱＳ－２１画分、これらの製造及びこれらの使用は、参照により本明細書に援用される米国特許第５，０５７，５４０号；同第６，２３１，８５９号；同第６，３５２，６９７号；同第６，５２４，５８４号；同第６，８４６，４８９号；同第７，７７６，３４３号；及び同第８，１７３，１４１号に記載されている。

[0239] いくつかの組成物では、他のアジュバントを追加又は代替として使用することができる。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用されるVogel et al.,“A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2nd Edition)”に記載されている任意のアジュバントを含めることは、本開示の範囲内で想定される。他のアジュバントには、完全フロイントアジュバント（死んだ結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含む免疫応答の非特異的刺激物質）、フロイント不完全アジュバント及び水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。他のアジュバントには、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、ＭＤＰ化合物、例えばｔｈｕｒ－ＭＤＰ及びｎｏｒ－ＭＤＰ、ＣＧＰ（ＭＴＰ－ＰＥ）、脂質Ａ及びモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ＭＦ－５９、ＲＩＢＩ（細菌から抽出される３成分を含む）、ＭＰＬ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）（２％スクアレン／TWEEN（登録商標）ポリソルベート８０エマルジョン中）が含まれる。実施形態では、アジュバントは、パウシラメラ脂質小胞（paucilamellar lipid vesicle）；例えばNOVASOMES（登録商標）であり得る。NOVASOMES（登録商標）は、約１００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲のパウシラメラ脂質小胞（paucilamellar lipid vesicle）である。NOVASOMES（登録商標）には、BRIJ（登録商標）アルコールエトキシレート７２、コレステロール、オレイン酸及びスクアレンが含まれる。NOVASOMES（登録商標）は、有効なアジュバントであることが示されている（米国特許第５，６２９，０２１号、同第６，３８７，３７３号及び同第４，９１１，９２８号を参照されたい）。

投与及び用量
[0240] 実施形態では、本開示は、１つ又は複数のコロナウイルスに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。実施形態では、免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、ＭＥＲＳ及びＳＡＲＳの１つ又は複数に対するものである。この方法は、免疫学的に有効な量の、ナノ粒子を含むか、又は組換えＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。有利には、本明細書に開示されるタンパク質は、特に有用な抗コロナウイルス応答の１つ又は複数を誘発する。

[0241] 実施形態では、ナノ粒子又はＣｏＶＳポリペプチドは、アジュバントと共に投与される。他の態様では、ナノ粒子又はＣｏＶＳポリペプチドは、アジュバントなしで投与される。いくつかの態様では、アジュバントは、非共有相互作用などによってナノ粒子に結合され得る。他の態様では、アジュバントは、ナノ粒子と同時投与されるが、アジュバントとナノ粒子とは、実質的に相互作用しない。

[0242] 実施形態では、ナノ粒子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染、ＳＡＲＳ感染又はＭＥＲＳ感染の１つ又は複数の予防及び／又は処置のために使用され得る。従って、本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、ＭＥＲＳ及びＳＡＲＳの１つ又は複数に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。この方法は、免疫学的に有効な量の、ナノ粒子又はＣｏＶＳポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含む。有利には、本明細書に開示されるタンパク質は、特に有用な抗コロナウイルス応答を誘発する。

[0243] 本明細書に開示される組成物は、全身経路、若しくは粘膜経路、若しくは経皮経路を介して又は特定の組織に直接投与され得る。本明細書で使用される場合、「全身投与」という用語は、非経口投与経路を含む。特に、非経口投与には、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内又は胸骨内注射、静脈内又は腎臓透析注入技術が含まれる。典型的には、全身非経口投与は、筋肉内注射である。本明細書で使用される場合、「粘膜投与」という用語は、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、気管内、腸内及び眼内投与が含まれる。好ましくは、投与は、筋肉内である。

[0244] 組成物は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールで投与することができる。複数回投与は、一次免疫スケジュール又は追加免疫スケジュールで使用することができる。複数回投与スケジュールでは、様々な用量が同じ又は異なる経路、例えば非経口初回及び粘膜追加、粘膜初回及び非経口追加などによって投与され得る。いくつかの態様では、後続追加用量は、前の投与の約２週間後、約３週間後、約４週間後、約５週間後又は約６週間後に投与される。実施形態では、後続追加投与は、前の投与の３週間後に投与される。実施形態では、初回用量は、０日目に投与され、及び追加用量は、２１日目に投与される。実施形態では、初回用量は、０日目に投与され、及び追加用量は、２８日目に投与される。

[0245] 実施形態では、μｇ単位で測定される用量は、溶質を含む用量の総重量、又はＣｏＶＳポリペプチドナノ粒子の重量、又はＣｏＶＳポリペプチドの重量であり得る。用量は、Ａ２８０又はＥＬＩＳＡのいずれかのタンパク質濃度アッセイを使用して測定される。

[0246] 小児への投与を含む抗原の用量は、約５μｇ～約２５μｇ、約１μｇ～約３００μｇ、約９０μｇ～約２７０μｇ、約１００μｇ～約１６０μｇ、約１１０μｇ～約１５０μｇ、約１２０μｇ～約１４０μｇ又は約１４０μｇ～約１６０μｇの範囲であり得る。実施形態では、用量は、約１２０μｇであり、ミョウバンと共に投与される。いくつかの態様では、小児用量は、約１μｇ～約９０μｇの範囲であり得る。実施形態では、ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドの用量は、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、約１２μｇ、約１３μｇ、約１４μｇ、約１５μｇ、約１６μｇ、約１７μｇ、約１８μｇ、約１９μｇ、約２０μｇ、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５μｇ、約２６μｇ、約２７μｇ、約２８μｇ、約２９μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００μｇ、約１１０μｇ、約１２０μｇ、約１３０μｇ、約１４０μｇ、約１５０μｇ、約１６０μｇ、約１７０μｇ、約１８０μｇ、約１９０μｇ、約２００μｇ、約２１０μｇ、約２２０μｇ、約２３０μｇ、約２４０μｇ、約２５０μｇ、約２６０μｇ、約２７０μｇ、約２８０μｇ、約２９０μｇ又は約３００μｇ（これらの間のすべての値及び範囲を含む）である。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドの用量は、５μｇである。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドの用量は、２５μｇである。

[0247] 特定の集団は、アジュバントの有無にかかわらず投与することができる。特定の態様では、組成物は、添加されるアジュバントを含まなくてもよい。このような場合、用量を約１０％増加させ得る。

[0248] 実施形態では、天然に存在しないＣｏＶＳポリペプチドと共に投与されるアジュバントの用量は、約１μｇ～約１００μｇ、例えば約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１１μｇ、約１２μｇ、約１３μｇ、約１４μｇ、約１５μｇ、約１６μｇ、約１７μｇ、約１８μｇ、約１９μｇ、約２０μｇ、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５μｇ、約２６μｇ、約２７μｇ、約２８μｇ、約２９μｇ、約３０μｇ、約３１μｇ、約３２μｇ、約３３μｇ、約３４μｇ、約３５μｇ、約３６μｇ、約３７μｇ、約３８μｇ、約３９μｇ、約４０μｇ、約４１μｇ、約４２μｇ、約４３μｇ、約４４μｇ、約４５μｇ、約４６μｇ、約４７μｇ、約４８μｇ、約４９μｇ、約５０μｇ、約５１μｇ、約５２μｇ、約５３μｇ、約５４μｇ、約５５μｇ、約５６μｇ、約５７μｇ、約５８μｇ、約５９μｇ、約６０μｇ、約６１μｇ、約６２μｇ、約６３μｇ、約６４μｇ、約６５μｇ、約６６μｇ、約６７μｇ、約６８μｇ、約６９μｇ、約７０μｇ、約７１μｇ、約７２μｇ、約７３μｇ、約７４μｇ、約７５μｇ、約７６μｇ、約７７μｇ、約７８μｇ、約７９μｇ、約８０μｇ、約８１μｇ、約８２μｇ、約８３μｇ、約８４μｇ、約８５μｇ、約８６μｇ、約８７μｇ、約８８μｇ、約８９μｇ、約９０μｇ、約９１μｇ、約９２μｇ、約９３μｇ、約９４μｇ、約９５μｇ、約９６μｇ、約９７μｇ、約９８μｇ、約９９μｇ又は約１００μｇのアジュバントである。実施形態では、アジュバントの用量は、約５０μｇである。実施形態では、アジュバントは、サポニンアジュバント、例えばMATRIX-M（商標）である。

[0249] 実施形態では、用量は、約０．１ｍＬ～約１．５ｍＬ、例えば約０．１ｍＬ、約０．２ｍＬ、約０．２５ｍＬ、約０．３ｍＬ、約０．４ｍＬ、約０．５ｍＬ、約０．６ｍＬ、約０．７ｍＬ、約０．８ｍＬ、約０．９ｍＬ、約１．０ｍＬ、約１．１ｍＬ、約１．２ｍＬ、約１．３ｍＬ、約１．４ｍＬ又は約１．５ｍＬの量で投与される。実施形態では、用量は、０．２５ｍＬの量で投与される。実施形態では、用量は、０．５ｍＬの量で投与される。実施形態では、用量は、０．６ｍＬの量で投与される。

[0250] ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対するワクチンの特定の実施形態では、用量は、約１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約１７５μｇ／ｍＬ～約３２５μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ～約２８０μｇ／ｍＬ又は約２４０μｇ／ｍＬ～約２６０μｇ／ｍＬの濃度のＣｏＶＳポリペプチドを含み得る。

[0251] 別の実施形態では、本開示は、有効用量のナノ粒子又はＣｏＶＳポリペプチドを組成物に添加することを含む、哺乳動物の感染又はその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘発するワクチン組成物を製剤化する方法を提供する。開示されるＣｏＶＳポリペプチド及びナノ粒子は、感染病原体に対する免疫又は実質的な免疫を付与する免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。従って、一実施形態では、本開示は、ナノ粒子及び／又はＣｏＶＳポリペプチドの少なくとも１つの有効用量を投与することを含む、対象における感染症又はその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘発する方法を提供する。

[0252] 実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチド又はそれを含むナノ粒子は、追加の免疫原性組成物と組み合わせて投与される。実施形態では、追加の免疫原性組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を誘発する。実施形態では、追加の免疫原性組成物は、開示されるＣｏＶＳポリペプチド又はそれを含むナノ粒子の約１分以内、約５分以内、約１０分以内、約２０分以内、約３０分以内、約４０分以内、約５０分以内、約１時間以内、約２時間以内、約３時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約６時間以内、約７時間以内、約８時間以内、約９時間以内、約１０時間以内、約１１時間以内、約１２時間以内、約１３時間以内、約１４時間以内、約１５時間以内、約１６時間以内、約１７時間以内、約１８時間以内、約１９時間以内、約２０時間以内、約２１時間以内、約２２時間以内、約２３時間以内、約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内、約１０日以内、約１１日以内、約１２日以内、約１３日以内、約１４日以内、約１５日以内、約１６日以内、約１７日以内、約１８日以内、約１９日以内、約２０日以内、約２１日以内、約２２日以内、約２３日以内、約２４日以内、約２５日以内、約２６日以内、約２７日以内、約２８日以内、約２９日以内、約３０日以内又は約３１日以内に投与される。実施形態では、追加の組成物は、ＣｏＶＳポリペプチド又はそれを含むナノ粒子を含む組成物の初回用量と共に投与される。実施形態では、追加の組成物は、ＣｏＶＳポリペプチド又はそれを含むナノ粒子を含む組成物の追加用量と共に投与される。

[0253] 実施形態では、追加の免疫原性組成物は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク糖タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク糖タンパク質をコードするウイルスベクター又は不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む。

[0254] 実施形態では、追加の免疫原性組成物は、ＣｏＶＳポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１の９８６位及び９８７位におけるプロリン置換を含むＣｏＶＳポリペプチドをコードする。実施形態では、ｍＲＮＡは、無傷のフューリン切断部位を含むＣｏＶＳポリペプチドをコードする。実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１の９８６位及び９８７位におけるプロリン置換及び無傷のフューリン切断部位を含むＣｏＶＳポリペプチドをコードする。実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１の９８６位及び９８７位におけるプロリン置換及び不活性フューリン切断部位を含むＣｏＶＳポリペプチドをコードする。実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号８７のアミノ酸配列を有するＣｏＶＳポリペプチドをコードする。ＣｏＶＳポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子内に封入されている。ＣｏＶＳポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む免疫原性組成物の例は、参照によりその全体が本明細書に援用されるJackson et al. N. Eng. J. Med. 2020. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2- preliminary reportに記載されている。実施形態では、ＣｏＶＳポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む組成物は、２５μｇ、１００μｇ又は２５０μｇの用量で投与される。

[0255] 実施形態では、追加の免疫原性組成物は、ＣｏＶＳポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターを含む。実施形態では、ＡＡＶベクターは、野生型ＣｏＶＳポリペプチドをコードする。実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号１の９８６位及び９８７位におけるプロリン置換及び無傷のフューリン切断部位を含むＣｏＶＳポリペプチドをコードする。実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号１の９８６位及び９８７位におけるプロリン置換及び不活性フューリン切断部位を含むＣｏＶＳポリペプチドをコードする。実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号８７のアミノ酸配列を有するＣｏＶＳポリペプチドをコードする。以下の刊行物は、それぞれが参照によりその全体が本明細書に援用される、ＣｏＶＳポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターを含む免疫原性組成物を記載している：van Doremalen N. et al. A single dose of ChAdOx1 MERS provides protective immunity in rhesus macaques. Science Advances, 2020；van Doremalen N. et al. ChAdOx1 nCoV-19 vaccination prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques. bioRxiv, (2020)。

[0256] 実施形態では、追加の免疫原性組成物は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。実施形態では、追加の免疫原性組成物は、プラスミドＤＮＡを含む。実施形態では、プラスミドＤＮＡは、ＣｏＶＳポリペプチドをコードする。実施形態では、ＤＮＡは、配列番号１の９８６位及び９８７位におけるプロリン置換及び無傷のフューリン切断部位を含むＣｏＶＳポリペプチドをコードする。実施形態では、ＤＮＡは、配列番号１の９８６位及び９８７位におけるプロリン置換及び不活性フューリン切断部位を含むＣｏＶＳポリペプチドをコードする。実施形態では、ＤＮＡは、配列番号８７のアミノ酸配列を有するＣｏＶＳポリペプチドをコードする。

[0257] 実施形態では、追加の免疫原性組成物には、不活性化ウイルスワクチンが含まれる。

[0258] 実施形態では、ＣｏＶＳタンパク質又はＣｏＶＳタンパク質を含むナノ粒子は、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つ又は複数に対する免疫又は実質的な免疫を付与する免疫応答を刺激する免疫原性組成物を調製するのに有用である。粘膜免疫及び細胞性免疫の両方は、感染症及び疾患に対する免疫に寄与し得る。上気道で局所的に分泌される抗体は、自然感染に対する耐性の主な要因である。分泌型免疫グロブリンＡ（ｓＩｇＡ）は、上気道の保護に関与し、血清ＩｇＧは下気道の保護に関与している。感染によって誘発される免疫応答は、同じウイルス又は抗原的に類似したウイルス株による再感染から保護する。本明細書に開示されるナノ粒子での免疫後に宿主で産生される抗体は、他にも投与することができるため、対象に受動的投与を提供する。

[0259] 実施形態では、ＣｏＶＳタンパク質又はＣｏＶＳタンパク質を含むナノ粒子は、
（ａ）ＮＴＤの１つ又は複数のアミノ酸の欠失であって、この１つ又は複数のアミノ酸は、アミノ酸５６、５７、１３１、１３２、２２９、２３０、２３１又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、欠失；及び
（ｂ）ＮＴＤの１つ又は複数のアミノ酸の変異であって、この１つ又は複数の変異は、アミノ酸６７、２２９、２０２、１３９、５、２３３、７、１３、１２５、１７７又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、変異；
（ｃ）ＲＢＤの１つ又は複数のアミノ酸の変異であって、この１つ又は複数の変異は、アミノ酸４８８、４０４、４７１、４３９、４２６、４４０及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、変異；
（ｄ）ＳＤ１／２の１つ又は複数のアミノ酸への変異であって、この１つ又は複数のアミノ酸は、６０１、５５７、６６８、６４２及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、変異；
（ｅ）不活性フューリン切断部位（アミノ酸６６９～６７２の１つ又は複数の変異に対応する）；
（ｆ）Ｓ２サブユニットの１つ又は複数のアミノ酸の欠失であって、このアミノ酸は、６７６～７０２、７０２～７１１、７７５～７９３、８０６～８１５；及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、欠失；
（ｇ）Ｓ２サブユニットの１つ又は複数のアミノ酸の変異であって、このアミノ酸は、９７３、９７４、７０３、１１０５、６８８、９６９及び１０１４；及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、変異；
（ｈ）ＴＭＣＴ（アミノ酸１２０１～１２６０）からの１つ又は複数のアミノ酸の欠失であって、ＣｏＶＳ糖タンパク質のアミノ酸は、配列番号２に対して付番されている、欠失
から選択される１つ又は複数の改変を有するＳタンパク質を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する交差中和抗体を誘導する。

[0260] 実施形態では、ＣｏＶＳタンパク質又はＣｏＶＳタンパク質を含むナノ粒子は、アミノ酸５６の欠失、アミノ酸５７の欠失、アミノ酸１３１、Ｎ４８８Ｙ、Ａ５５７Ｄ、Ｄ６０１Ｇ、Ｐ６６８Ｈ、Ｔ７０３Ｉ、Ｓ９６９Ａ、Ｄ１１０５Ｈ、Ｎ４２６Ｋ及びＹ４４０Ｆの欠失から選択される１つ又は複数の改変を有するＳタンパク質を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する交差中和抗体を誘導し、これらのアミノ酸は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣｏＶＳポリペプチドに対して付番されている。

[0261] 実施形態では、本開示は、高親和性抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及び抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス抗体の１つ又は複数を産生する方法を提供する。本明細書に開示されるナノ粒子を用いた免疫によって産生される高親和性抗体は、ＳＣｏＶポリペプチド又はＳＣｏＶポリペプチドを含むナノ粒子を含む免疫原性組成物を動物に投与すること、動物から血清及び／又は血漿を採取すること並びに血清及び／又は血漿からの抗体を精製することによって作製される。一実施形態では、動物は、ヒトである。実施形態では、動物は、ニワトリ、マウス、モルモット、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒト、ウマ、ヒツジ又はウシである。一実施形態では、動物は、ウシ又はウマである。別の実施形態では、ウシ又はウマ動物は、トランスジェニックである。さらに別の実施形態では、トランスジェニックウシ又はウマ動物は、ヒト抗体を産生する。実施形態では、動物は、モノクローナル抗体を産生する。実施形態では、動物は、ポリクローナル抗体を産生する。一実施形態では、方法は、アジュバント又は免疫刺激化合物の投与をさらに含む。さらなる実施形態では、精製された高親和性抗体は、ヒト対象に投与される。一実施形態では、ヒト対象は、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つ又は複数に感染するリスクがある。

[0262] 実施形態では、ＣｏＶＳタンパク質又はナノ粒子は、インフルエンザ糖タンパク質又はインフルエンザ糖タンパク質を含むナノ粒子と同時投与される。適切な糖タンパク質及びナノ粒子は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１８／０１３３３０８号及び同第２０１９／０３１４４８７号に記載されている。実施形態では、ＣｏＶＳタンパク質又はナノ粒子は、（ａ）Ｂ型インフルエンザ株由来の組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）糖タンパク質を含む界面活性剤コアナノ粒子；及び（ｂ）Ａ型インフルエンザ株由来の組換えインフルエンザＨＡ糖タンパク質及びＩＳＣＯＭマトリックスアジュバントを含むヘマグルチニンサポニンマトリックスナノ粒子（ＨａＳＭａＮ）と同時投与される。実施形態では、ＣｏＶＳタンパク質又はナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コア及びインフルエンザＨＡ糖タンパク質を含むナノ粒子と同時投与され、このインフルエンザＨＡ糖タンパク質は、非イオン性界面活性剤コアから外側に突出する頭部領域及び非イオン性界面活性剤コアに関連する膜貫通ドメインを含み、インフルエンザＨＡ糖タンパク質は、ＨＡ０糖タンパク質であり、インフルエンザＨＡ糖タンパク質のアミノ酸配列は、天然インフルエンザＨＡタンパク質のアミノ酸配列に対して１００％の同一性を有する。実施形態では、インフルエンザ糖タンパク質又はナノ粒子は、ＣｏＶＳタンパク質又はナノ粒子と共製剤化される。

[0263] 本開示で引用されたすべての特許、特許出願、参考文献及び雑誌記事は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

実施例
実施例１
コロナウイルススパイク（Ｓ）ポリペプチドナノ粒子の発現及び精製
[0264] 天然コロナウイルススパイク（Ｓ）ポリペプチド（配列番号１及び配列番号２）並びに配列番号３、４、３８、４１、４４、４８、５１、５４、５８、６１、６３、６５、６７、７３、７５、７８、７９、８２、８３、８５、８７、１０６、１０８及び８９に対応するアミノ酸配列を有するＣｏＶスパイクポリペプチドをバキュロウイルス発現系で発現させ、コロナウイルススパイク（Ｓ）ポリペプチドを発現する組換えプラークを採取し、確認した。いずれの場合にも、シグナルペプチドは、配列番号５である。図４及び図９は、ＣｏＶスパイクポリペプチドＢＶ２３６４、ＢＶ２３６５、ＢＶ２３６６、ＢＶ２３６７、ＢＶ２３６８、ＢＶ２３６９、ＢＶ２３７３、ＢＶ２３７４及びＢＶ２３７５の成功した精製を示す。表２は、前述のＣｏＶスパイクポリペプチドの配列特性を示す。

[0265] 野生型ＢＶ２３６１タンパク質（配列番号２）は、ヒトアンジオテンシン変換酵素２前駆体（ｈＡＣＥ２）に結合する。ＣｏＶＳポリペプチドの結合を評価するために、バイオレイヤー干渉法及びＥＬＩＳＡを行った。

バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）：
[0266] ＢＬＩ実験は、Octet QK384システム（Pall Forte Bio, Fremont, CA）を使用して行った。Ｈｉｓタグ付きヒトＡＣＥ２（２μｇｍＬ－１）をニッケル荷電Ｎｉ－ＮＴＡバイオセンサーチップに固定した。ベースライン後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質を含む試料を２倍連続希釈し、６００秒間会合させた後、さらに９００秒間解離させた。OctetソフトウェアHT 101:1グローバルカーブフィットを使用してデータを分析した。

[0267] ＣｏＶＳポリペプチドＢＶ２３６１、ＢＶ２３６５、ＢＶ２３６９、ＢＶ２３６５、ＢＶ２３７３、ＢＶ２３７４は、ｈＡＣＥ２に結合する能力を保持している（図５、図１１Ａ～図１１Ｃ）。解離速度は、液相Ｓタンパク質の非存在下において、９００秒間の観察で解離がほとんど又は全くないことから明らかなように、Ｓタンパク質が強固に結合したままであることを示した（図１１Ａ～図１１Ｃ）。

[0268] さらに、結合は、特異的である。野生型ＣｏＶＳタンパク質ＢＶ２３６１及びＣｏＶＳポリペプチドＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ受容体であるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）に結合しない。加えて、ＭＥＲＳＳタンパク質は、ヒトアンジオテンシン変換酵素２前駆体（ｈＡＣＥ２）に結合しない（図６及び図１１Ｄ～図１１Ｆ）。

ＥＬＩＳＡ
[0269] ｈＡＣＥ２に対するＣｏＶＳポリペプチドの特異性をＥＬＩＳＡによって確認した。９６ウェルプレートを１００μＬのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（２μｇ／ｍＬ）で４℃において一晩コーティングした。プレートを、０．０５％Tween（ＰＢＳ－Ｔ）緩衝液を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、TBS Startblockブロッキング緩衝液（ThermoFisher, Scientific）でブロックした。Ｈｉｓタグ付きｈＡＣＥ２及びｈＤＰＰ４受容体を３倍連続希釈し（５～０．０００１μｇｍＬ－１）、室温で２時間、コーティングしたウェルに添加した。プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄した。最適に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ヒスチジンを添加し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ基質（TMB, T0440-IL, Sigma, St. Louis, MO, USA）の添加により発色させた。SpectraMax Plusプレートリーダー（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）を使用して４５０ｎｍのＯＤでプレートを読み取り、SoftMaxソフトウェアでデータを分析した。ＥＣ５０値を、GraphPad Prism 7.05ソフトウェアを使用して４パラメーターフィッティングによって計算した。

[0270] ＥＬＩＳＡの結果は、野生型ＣｏＶＳポリペプチド（ＢＶ２３６１）、ＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３タンパク質がｈＡＣＥ２に特異的に結合するが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶによって使用されるｈＤＰＰ－４受容体に結合できないことを示した（ＩＣ_５０＞５０００ｎｇｍＬ－１）。野生型ＣｏＶＳポリペプチド及びＢＶ２３６５は、同様の親和性（ＩＣ_５０＝３６～３８ｎｇ／ｍＬ）でｈＡＣＥ２に結合したが、ＢＶ２３７３は、２分の１の濃度（ＩＣ_５０＝１８ｎｇ／ｍＬ）でｈＡＣＥ２結合の５０％飽和を達成した（図７、図１１Ｄ～図１１Ｆ）。

タンパク質及びナノ粒子の製造
[0271] 組換えウイルスをＳｆ９昆虫細胞の感染によって増幅させる。昆虫細胞の培養物を約３ＭＯＩ（感染多重度＝ウイルスｆｆｕ又はｐｆｕ／細胞）でバキュロウイルスに感染させる。感染の４８～７２時間後に培養物及び上清を回収する。約３０ｍＬの粗細胞回収物を約８００×ｇで１５分間遠心分離することによって清澄化する。得られたコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を含む粗細胞回収物を、以下に説明するようにナノ粒子として精製する。

[0272] ナノ粒子を製造するために、非イオン性界面活性剤TERGITOL（登録商標）ノニルフェノールエトキシレートＮＰ－９を膜タンパク質抽出プロトコルで使用する。粗抽出物を、陰イオン交換クロマトグラフィー、レンチルレクチンアフィニティー／ＨＩＣ及び陽イオン交換クロマトグラフィーを通過させることによってさらに精製する。洗浄した細胞を界面活性剤処理によって溶解し、ＢＶ及びＳｆ９宿主細胞のＤＮＡ及びタンパク質の沈殿をもたらす低ｐＨ処理を行う。中和された低ｐＨ処理溶解物を清澄化し、陰イオン交換及びアフィニティークロマトグラフィーでさらに精製してから、２回目の低ｐＨ処理を行う。

[0273] アフィニティークロマトグラフィーを使用して、Ｓｆ９／ＢＶタンパク質、ＤＮＡ及びＮＰ－９を除去し、さらにコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を濃縮する。簡単に述べると、レンチルレクチンは、カルシウム及びマンガンを含む金属タンパク質であり、多糖類及びグルコース又はマンノースを含むグリコシル化タンパク質に可逆的に結合する。コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を含む陰イオン交換フロースルー画分をレンチルレクチンアフィニティクロマトグラフィー樹脂（Capto Lentil Lectin, GE Healthcare）にロードする。グリコシル化コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を選択的に樹脂に結合させ、非グリコシル化タンパク質及びＤＮＡをカラムフロースルーで除去する。弱く結合した糖タンパク質を、高塩濃度及び低モル濃度のメチルα－Ｄ－マンノピラノシド（ＭＭＰ）を含む緩衝液によって除去する。

[0274] カラム洗浄液も使用して、ＮＰ－９界面活性剤を界面活性剤ポリソルベート８０（ＰＳ８０）と界面活性剤交換する。コロナウイルススパイク（Ｓ）ポリペプチドを、高濃度のＭＭＰを含むレンチルレクチンカラムからナノ粒子構造で溶出させる。溶出後、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質三量体を、界面活性剤コアに含まれるコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質三量体及びＰＳ８０から構成されるナノ粒子に組み込む。

実施例２
マウスにおけるコロナウイルススパイク（Ｓ）ポリペプチドナノ粒子ワクチンの免疫原性
[0275] 実施例１に記載の配列番号８７のＣｏＶＳポリペプチド（「ＢＶ２３７３」とも呼ばれる）を含むコロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質組成物を、雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（７～９週齢；Harlan Laboratories Inc., Frederick, MD）を使用してマウスモデルにおける免疫原性及び毒性について評価した。この組成物をサポニンアジュバント、例えばMATRIX-M（商標）の存在下及び非存在下で評価した。MATRIX-M（商標）を含む組成物には、５μｇのMATRIX-M（商標）が含まれていた。０．０１μｇ、０．１μｇ、１μｇ及び１０μｇを含む様々な用量のコロナウイルススパイク（Ｓ）ポリペプチドを含むワクチンを単回投与（単回初回投与とも呼ばれる）（試験１４日目）又は１４日間間隔をあけた２回投与（初回／追加投与計画とも呼ばれる）として筋肉内投与した（試験０日目及び１４日目）。プラセボ群は、非免疫対照としての役割を果たした。試験の１日目、１３日目、２１日目及び２８日目に分析のために血清を採取した。ワクチン接種動物及び対照動物を１回（単回投与）又は２回（２回投与）の免疫の４２日後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に鼻腔曝露した。

ワクチンの免疫原性
[0276] ０．１～１０μｇのＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）の単回初回投与で免疫した動物は、単回免疫の２１～２８日後に検出された抗ＳＩｇＧ力価が上昇していた（図１３Ｂ）。１０μｇの用量のＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）で免疫したマウスは、ｈＡＣＥ２受容体のＣｏＶＳタンパク質への結合をブロックする抗体及び単回初回投与の２１～２８日後に検出されたウイルス中和抗体を産生した（図１４及び図１５）。初回／追加投与計画（２回投与）で免疫した動物は、すべての用量レベルで追加免疫の７～１６日後に検出された抗ＳＩｇＧ力価が有意に上昇していた（図１３Ａ）。ＢＶ２３７３（１μｇ及び１０μｇ）及びMATRIX-M（商標）で免疫した動物は、免疫後、同様に高い抗ＳＩｇＧ力価を有した（それぞれＧＭＴ＝１３９，０００及び８４，０００）。ＢＶ２３７３（０．１μｇ、１μｇ又は１０μｇ）及びMATRIX-M（商標）で免疫したマウスは、アジュバントなしで１０μｇのＢＶ２３７３で免疫したマウスと比較して抗ＳＩｇＧ力価が有意に高かった（ｐ≦０．０５及びｐ≦０．０００１）（図１３Ａ）。これらの結果は、MATRIX-M（商標）アジュバントにより、用量を１０分の１～１００分の１に節約できる可能性を示している。さらに、ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）の２回の投与による免疫は、ｈＡＣＥ２受容体のＳタンパク質への結合をブロックする高力価抗体（ＩＣ５０＝２１８～１６４２）を誘発し、ＶｅｒｏＥ６細胞に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞変性効果（ＣＰＥ）をすべての用量レベルで中和した（ＣＰＥの１００％ブロッキング＝７，６８０～２０，０００）（図１４及び図１５）。

ＳＡＲＳＣｏＶ－２曝露
[0277] 防御免疫の誘発を評価するために、免疫マウスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に曝露した。マウスは、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製を支持しないため、初回ワクチン接種の５２日後、ｈＡＣＥ２を発現するアデノウイルス（Ａｄ／ｈＡＣＥ２）をマウスに鼻腔内感染させて許容性にした。マウスに、鼻孔間で分割した５０μＬ中の１．５×１０^５ｐｆｕのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内接種した。曝露されたマウスは、感染当日及び感染の７日後まで毎日体重を量った。感染の４日後及び７日後、各ワクチン接種群と対照群から５匹のマウスを屠殺し、肺を採取して肺組織学のために準備した。

[0278] ウイルス力価をプラークアッセイによって定量した。簡単に述べると、採取した肺を、１．０ｍｍガラスビーズ（Sigma Aldrich）及びBeadruptor（Omini International Inc.）を使用してＰＢＳでホモジナイズした。ホモジネートをコンフルエント培養に近いベロＥ６に添加し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス力価を、６点希釈曲線を使用してプラーク形成単位（ｐｆｕ）をカウントすることによって決定した。

[0279] 感染の４日後、プラセボ処理マウスは、１０^４のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｐｆｕ／ｌｕｎｇを有したが、MATRIX-M（商標）を伴わないＢＶ２３６３で免疫したマウスは、１０^３ｐｆｕ／ｌｕｎｇを有した（図１６）。MATRIX-M（商標）を伴うＢＶ２３７３での初回のみのマウスの群は、ウイルス力価の用量依存的な低下を示し、１０μｇのＢＶ２３７３用量のレシピエントは、感染の４日後に検出可能なウイルスを有していなかった。１μｇ、０．１μｇ及び０．０１μｇのＢＶ２３７３用量を投与したマウスのすべては、プラセボワクチン接種マウスと比較して力価の顕著な低下を示した。初回／追加群では、１０μｇ、１μｇ及び０．１μｇの用量で免疫したマウスは、肺ウイルス量がほとんど検出されなかったが、０．０１μｇ群ではプラセボ動物と比較して１logの低下が見られた。

[0280] 体重減少は、ウイルス量の所見と一致した。ＢＶ２３７３（０．１μｇ、１μｇ及び１０μｇ）及びMATRIX-M（商標）の単回投与を受けた動物は、ワクチン接種していないプラセボ動物と比較して体重減少の顕著な予防を示した（図１７Ａ）。アジュバントと共に初回及び追加投与を受けたマウスは、すべての用量レベルで体重減少の有意な予防も実証した（図１７Ｂ及び図１７Ｃ）。体重減少の予防に対するアジュバントの存在の効果を評価した。初回／追加（２回接種）及びアジュバントを投与されたマウスは、プラセボと比較して体重減少を有意に予防したが、アジュバントなしで免疫された群は、そうではなかった（図１７Ｃ）。これらの結果は、ＢＶ２３７３がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から防御すること及び低い血清学的反応に関連する低用量のワクチンが体重減少を悪化させることも、疾患の悪化を実証することもないことを示した。

[0281] 感染の４日後及び７日後に肺の組織病理学を評価した（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。感染の４日後、プラセボ免疫マウスは、混合炎症細胞集団に囲まれた肺胞中隔の肥厚を伴う太い気道の上皮細胞の露出を示した。主に好中球及びマクロファージからなる炎症細胞による細動脈周囲の細胞浸潤が肺全体で観察された。感染の７日後までに、プラセボで処置したマウスは、細気管支周囲の炎症を示し、細動脈周囲の細胞浸潤が増加した。肥厚した肺胞中隔は、肺胞中隔全体にびまん性間質性炎症が増加したままであった（図１８Ｂ）。

[0282] ＢＶ２３７３で免疫したマウスは、感染の４日後及び７日後の両方で用量依存的に肺病変の有意な減少を示した。初回のみの群は、プラセボマウスと比較して、１０μｇ及び１μｇの用量で炎症の減少を示し、気管支及び細動脈の周囲の炎症が減少している。低用量の初回のみの群では、肺炎症は、プラセボ群の肺炎症に似ており、体重減少及び肺ウイルス力価と相関している。初回／追加免疫群は、試験したすべての用量で肺炎症の有意な減少を示し、これも肺ウイルス力価及び体重減少のデータと相関していた。４日目及び７日目の大気管支及び小気管支の上皮細胞は、実質的に維持され、細気管支の剥離及びウイルス感染の徴候は、最小限であった。１０μｇ、１μｇ及び０．１μｇの用量で免疫した動物の細動脈は、プラセボと同様に、０．０１μｇの用量で見られる中程度の細胞浸潤のみを伴う最小限の炎症を有する。肺胞の炎症は、炎症に関連した用量がわずか０．０１μｇと低い、高用量が投与された動物で減少した（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。これらのデータは、ＢＶ２３７３が曝露後の肺の炎症を軽減し、検出できる中和活性をほとんど又は全く誘発しないＢＶ２３７３の用量及び投与計画でも、ウイルスに対する炎症反応の悪化と関連していないことを実証している。さらに、このワクチンは、曝露されたマウスにおいて、ワクチンに関連した呼吸器疾患（ＶＡＥＲＤ）の促進をもたらさない。

Ｔ細胞応答
[0283] 配列番号８７のＣｏＶＳポリペプチドを含むワクチン組成物のＴ細胞応答に対する効果を評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たりＮ＝６）を、５μｇのMATRIX-M（商標）を伴う又は伴わない１０μｇのＢＶ２３７３で２１日の間隔において２回の投与で筋肉内免疫した。２回目の免疫の７日後（試験の２８日目）に脾臓を採取した。ワクチン接種を受けていない群（Ｎ＝３）は、対照としての役割を果たした。

[0284] 抗原特異的Ｔ細胞応答を、２回目の免疫の７日後（試験の２８日目）に採取した脾臓から、ELISPOT（商標）酵素結合免疫吸着アッセイ及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）によって測定した。エクスビボ刺激後のＩＦＮ－γ分泌細胞の数は、ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）で免疫したマウスの脾臓で、ELISPOT（商標）アッセイで測定したＢＶ２３７３単独と比較して２０倍増加した（ｐ＝０．００２）（図１９）。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答とＣＤ８＋Ｔ細胞応答を別々に調べるために、ＩＣＣＳアッセイを表面マーカー染色と組み合わせて行った。示されているデータは、ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌ－エフェクターメモリーＴ細胞集団でゲートされている。ＩＦＮ－γ＋、ＴＮＦ－α＋及びＩＬ－２＋サイトカイン分泌ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、アジュバントなしで免疫したマウスと比較して、ＢＶ２３７３で免疫したマウスの脾臓で有意に高かった（ｐ＜０．０００１）（図２０Ａ～図２０Ｃ及び図２１Ａ～図２１Ｃ）。さらに、少なくとも２つ又は３つのサイトカインを同時に産生する多機能ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度も、アジュバントの非存在下で免疫したマウスと比較して、ＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）で免疫したマウスの脾臓で有意に増加した（ｐ＜０．０００１）（図２０Ｄ及び図２０Ｅ並びに図２１Ｄ及び図２１Ｅ）。ＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）による免疫により、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の両方で多機能表現型（例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－２の２つ以上を分泌するＴ細胞）の割合が増加した。メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞で検出された多機能表現型の割合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞での割合よりも高かった（図２２）。

[0285] ＣＤ４＋Ｔ細胞からの２型サイトカインＩＬ－４及びＩＬ－５の分泌もそれぞれＩＣＣＳ及びELISPOT（商標）によって測定した。ＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）での免疫は、ＢＶ２３７３単独による免疫と比較して、２型サイトカインＩＬ－４及びＩＬ－５の分泌も増加した（２倍）が、１型サイトカイン産生の増強（例えば、ＩＦＮ－γが２０倍に増加）ほどではなかった（図２３Ａ～図２３Ｃ）。これらの結果は、MATRIX-M（商標）アジュバントの投与により、ＣＤ４＋Ｔ細胞発生がＴｈ１応答に偏ったことを示している。

[0286] 胚中心形成に対する免疫の効果を、脾臓中のＣＤ４＋Ｔ濾胞ヘルパー（ＴＦＨ）細胞及び胚中心（ＧＣ）Ｂ細胞の頻度を測定することによって評価した。MATRIX-M（商標）の投与により、脾臓中のＴＦＨ細胞（ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＰＤ－１＋）の頻度（ｐ＝０．０１）及びＧＣＢ細胞（ＣＤ１９＋ＧＬ７＋ＣＤ９５＋）の頻度が有意に増加した（ｐ＝０．０００２）（図２４Ａ及び図２４Ｂ並びに図２５Ａ及び図２５Ｂ）。

実施例３
アヌビスヒヒにおけるコロナウイルススパイク（Ｓ）ポリペプチドナノ粒子ワクチンの免疫原性
[0287] ヒヒにおけるＢＹ２３７３を含むワクチン組成物の免疫原性を評価した。成体アヌビスヒヒを、用量範囲（１μｇ、５μｇ及び２５μｇ）のＢＶ２３７３及び５０μｇのMATRIX-M（商標）アジュバントを筋肉内（ＩＭ）注射によって２１日間隔で２回投与して免疫した。非ヒト霊長類におけるMATRIX-M（商標）のアジュバント活性を評価するために、動物の別の群を、MATRIX-M（商標）を伴わない２５μｇのＢＶ２３７３で免疫した。ＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）で免疫した動物では、１回の初回免疫から２１日以内にすべての用量レベルで抗Ｓタンパク質ＩｇＧ力価が検出された（ＧＭＴ＝１，２４９～１９，０００）。抗Ｓタンパク質ＩｇＧ力価は、追加免疫から１～２週間以内（２８日目及び３５日目）にすべての用量レベルで対数的に増加した（ＧＭＴ＝３３，０００～１７４，０００）（図２６Ａ）。

[0288] ＢＶ２３７３（５μｇ又は２５μｇ）及びMATRIX-M（商標）による単回免疫後、低レベルのｈＡＣＥ２受容体ブロッキング抗体が動物で検出された（ＧＭＴ＝２２～３７）。ＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）で免疫したすべての群で追加免疫から１～２週間以内に受容体ブロッキング抗体力価が有意に増加した（ＧＭＴ＝１５０～６００）（図２６Ｂ）。ウイルス中和抗体は、ＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）での１回の免疫後、すべての用量群で増加した（ＧＭＴ＝１９０～４４６）。２５μｇのＢＶ２３７３単独で免疫した動物は、Ｓタンパク質のｈＡＣＥ２への結合をブロックする抗体を検出できなかった（図２６Ｃ）。中和力価は、追加免疫の１週間後に６倍から８倍に増加した（ＧＭＴ＝１，１６０～３，８４６）。中和力価は、２回目の免疫後にさらに２５倍～３８倍に増加した（ＧＭＴ＝６，４００～１７，０００）（図２６Ｃ）。抗ＳＩｇＧレベルと中和抗体力価との間に有意な相関が存在した（ｐ＜０．０００１）（図２７）。非ヒト霊長類におけるアジュバント添加ワクチンの免疫原性は、実施例２の結果と一致し、中和抗体の作製及び用量節約の促進におけるMATRIX-M（商標）の役割をさらに促進する。

[0289] ２回目の免疫の７日後（２８日目）にＰＢＭＣを採取し、Ｔ細胞応答をELISPOTアッセイによって測定した。ＢＶ２３７３（５μｇ又は２５μｇ）及びMATRIX-M（商標）で免疫した動物のＰＢＭＣは、ＩＦＮ－γ分泌細胞の数が最も多く、２５μｇのＢＶ２３７３単独又はＢＶ２３７３（１μｇ）とMATRIX-M（商標）で免疫した動物と比較して５倍であった（図２８）。ＩＣＣＳ分析により、ＢＶ２３７３（５μｇ）及びMATRIX-M（商標）による免疫は、ＩＦＮ－γ＋、ＩＬ－２＋及びＴＮＦ－α＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度が最も高いことを示した（図２９Ａ～図２９Ｃ）。この傾向は、少なくとも２つ又は３つの１型サイトカインが同時に産生された多機能ＣＤ４＋Ｔ細胞にも当てはまった（図２９Ｄ及び図２９Ｅ）。

実施例４
コロナウイルススパイク（Ｓ）ポリペプチドナノ粒子ワクチンの構造の特性評価
[0290] 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）及び二次元（２Ｄ）クラス平均化を使用して、ＢＶ２３７３の超微細構造を決定した。ネガティブ染色されたＢＶ２３７３の高倍率（６７，０００倍及び１００，０００倍）ＴＥＭ画像は、Ｓタンパク質ホモ三量体に対応する粒子を示した。

[0291] 自動ピッキングプロトコルを使用して、２Ｄクラス平均画像を構築した（Lander G.C. et al. J Struct Biol. 166, 95-102 (2009)；Sorzano C.O. et al., J Struct Biol. 148, 194-204 (2004)）。ホモ三量体構造の２回の２Ｄクラス平均化により、長さ１５ｎｍ、幅１３ｎｍの三角形の粒子の外観が明らかになった（図１０、左上）。最近解明されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＥＭＤＩＤ：２１３７４）のcryoEM構造を２ＤＢＶ２３７３画像に重ねると、クラウン形状のＳ１（ＮＴＤ及びＲＢＤ）及びＳ２ステムに良好に適合することを示した（図１０、左下）。また、２Ｄ画像では、ＮＴＤ／ＲＢＤクラウンの反対側の三量体構造の先端から突出したかすかな突起が明らかであった（図１０、右上）。より大きいボックスサイズを使用した２Ｄクラスの平均化により、これらのかすかな突起がＳ三量体と非晶質構造との間の連結を形成することが示された。（図１０、右下）。

[0292] 動的光散乱（ＤＬＳ）は、野生型ＣｏＶＳタンパク質が、ＢＶ２３６５（３３．４ｎｍ）及びＢＶ２３７３（２７．２ｎｍ）の２分の１の粒径と比較して、６９．５３ｎｍのＺ－ａｖｇ粒径を有したことを示している。多分散指数（ＰＤＩ）は、ＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３の粒子が、野生型スパイクタンパク質（ＰＤＩ＝０．４６）と比較して、サイズ、形状及び質量（ＰＤＩ＝０．２５～０．２９）が一般的に均一であることを示した（表３）。

[0293] Ｓ三量体の熱安定性を示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって決定した。野生型ＣｏＶＳタンパク質の熱転移温度（Ｔ_ｍａｘ＝５８．６℃）は、それぞれＴ_ｍａｘ＝６１．３℃及び６０．４℃であるＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３と同様であった（表３）。極めて重要なことは、ＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３変異体をアンフォールドするのに必要な転移エンタルピー（それぞれΔＨｃａｌ＝４６６及び７３２ｋＪ／ｍｏｌ）が、ＷＴスパイクタンパク質をアンフォールドするのに必要な低いエンタルピー（ΔＨｃａｌ＝１５３ｋＪ／ｍｏｌ）と比較して３～５倍増加したことであった。これらの結果は、ＷＴスパイクタンパク質と比較して、ＢＶ２３６５及びＢＶ２３７３の熱安定性が向上していることに一致している（表３）。

[0294] ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドナノ粒子ワクチンの安定性を動的光散乱によって評価した。様々なｐＨ、温度、塩濃度及びプロテアーゼを使用して、ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドナノ粒子ワクチンの安定性を、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドを含むナノ粒子ワクチンと比較した。

実施例５
コロナウイルススパイク（Ｓ）ポリペプチドナノ粒子ワクチンの安定性
[0295] ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドナノ粒子ワクチンの安定性を動的光散乱によって評価した。様々なｐＨ、温度、塩濃度及びプロテアーゼを使用して、ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドナノ粒子ワクチンの安定性を、天然ＣｏＶスパイク（Ｓ）ポリペプチドを含むナノ粒子ワクチンと比較した。２－プロリン置換のないＢＶ２３６５及び２つのプロリン置換を含むＢＶ２３７３の安定性を、ｈＡＣＥ２キャプチャーＥＬＩＳＡを使用して様々な環境ストレス条件下で評価した。長時間の攪拌（４８時間）、凍結／解凍（２サイクル）及び高温（２５℃及び３７℃で４８時間）、極端なｐＨでのＢＶ２３７３のインキュベーション（ｐＨ４及びｐＨ９で４８時間）は、ｈＡＣＥ２受容体結合に影響を与えなかった（ＩＣ５０＝１４．０～１８．３ｎｇｍＬ－１）。

[0296] 過酸化水素による酸化条件は、ｈＡＣＥ２のＢＶ２３７３への結合を８分の１に減少させた（ＩＣ５０＝１２０ｎｇｍＬ－１）（図１２Ａ）。２－プロリン置換のないＢＶ２３６５は、複数の条件下でのｈＡＣＥ２結合の有意な減少によって決定されたように安定性が低かった（図１２Ｂ）。

[0297] ＢＶ２３８４（配列番号１１０）及びＢＶ２３７３（配列番号８７）の安定性を比較した。ＢＶ２３８４は、ＧＳＡＳのフューリン切断部位配列（配列番号９７）を有するのに対して、ＢＶ２３７３は、ＱＱＡＱのフューリン切断部位（配列番号７）を有する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって実証されたように、ＢＶ２３８４は、ＢＶ２３７３と比較して広範な分解を示した（図３２）。さらに、走査デンシトメトリー及び回収データは、ＢＶ２３７３（図３４）と比較して完全長ＣｏＶＳタンパク質ＢＶ２３８４の予想外の減少、低い純度及び回収率（図３３）を実証している。

実施例６
カニクイザル（Cynomolgus macaques）における免疫応答
[0298] 本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のカニクイザル（Cynomolgus macaques）モデルにおいてＢＶ２３７３によって誘発される免疫応答を評価した。群１～６を表４に示すように処置した。

[0299] ＢＶ２３７３を含むワクチンの投与により、中和抗体（図３５Ｂ）を含む抗ＣｏＶ－Ｓ抗体（図３５Ａ）が誘導された。抗ＣｏＶ－Ｓ抗体は、ＢＶ２３７３の１回投与（図３８Ａ）又は２回投与（図３８Ｂ）後に誘導された。ＢＶ２３７３を含むワクチンの投与により、ＣｏＶＳタンパク質のｈＡＣＥ２への結合をブロックする抗体も産生された（図３８Ｃ及び図３８Ｄ）。ＢＶ２３７３の投与後のカニクイザル（Cynomolgus macaques）において、抗ＣｏＶＳポリペプチドＩｇＧ力価とｈＡＣＥ２阻害力価との間に有意な相関が存在した（図３８Ｅ）。中和抗体の産生を誘導するＢＶ２３７３の能力を細胞変性効果（ＣＰＥ）（図４０Ａ）及びプラーク低減中和試験（ＰＲＮＴ）（図４０Ｂ）によって評価した。このデータは、表４のワクチン製剤が、対照と比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和力価をもたらすことを明らかにした。

[0300] カニクイザル（Cynomolgus macaques）において抗ＣｏＶ－Ｓ抗体及びｈＡＣＥ２のＣｏＶＳタンパク質への結合をブロックする抗体を誘導するＢＶ２３７３の能力を含むワクチンをヒト回復期血清と比較した。このデータは、ＢＶ２３７３ワクチン製剤が、ヒト回復期血清と比較して優れた抗ＣｏＶＳポリペプチド及びｈＡＣＥ２阻害力価を誘導したことを明らかにした（図３９）。

[0301] ＢＶ２３７３ワクチン製剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス複製も減少させた（図３６Ａ及び図３６Ｂ）。ウイルスＲＮＡ（図３６Ａ、存在する全ＲＮＡに対応する）及びウイルスサブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（図３６Ｂ、複製するウイルスに対応する）レベルを感染性ウイルスの曝露の２日後及び４日後に気管支洗浄（ＢＡＬ）で評価した（ｄ２ｐｉ及びｄ４ｐｉ）。ほとんどの対象は、ウイルスＲＮＡを示さなかった。２日目に一部の対象で少量のＲＮＡが測定された。４日目までに、最低用量の２．５μｇの２匹の対象を除いて、ＲＮＡは、測定されなかった。サブゲノムＲＮＡは、最低用量では、１匹の対象を除いて２日目にも４日目にも検出されなかった。ウイルスＲＮＡ（図３７Ａ）及びウイルスサブゲノム（ｓｇ）ＲＮＡ（図３７Ｂ）を感染の２日後及び４日後に鼻スワブによって評価した（ｄ２ｐｉ及びｄ４ｐｉ）。ほとんどの対象は、ウイルスＲＮＡを示さなかった。２日目及び４日目に一部の対象で少量のＲＮＡが測定された。サブゲノムＲＮＡは、２日目にも４日目にも検出されなかった。対象を０日目に免疫し、２回投与群では０日目及び２１日目に免疫した。これらのデータは、ワクチンが鼻の全ウイルスＲＮＡを１００分の１～１０００分の１に減少させ、ｓｇＲＮＡを検出できないレベルまで減少させることを示し、ワクチンに対する免疫応答がウイルスの複製をブロックし、ウイルスの拡散を防止することを明らかにしている。

実施例７
ヒトにおけるＣｏＶＳポリペプチドナノ粒子ワクチンの評価
[0302] 本発明者らは、ＢＶ２３７３を含むワクチンの安全性及び有効性を、１８～５９歳の健康な参加者１３１人における無作為化観察者盲検プラセボ対照第１相臨床試験で評価した。参加者は、２１日間隔で２回の筋肉内注射で免疫した。参加者に、MATRIX-M（商標）（ｎ＝１０６）又はプラセボ（ｎ＝２５）を含む又は含まないＢＶ２３７３を投与した。群Ａ～Ｅを表５に示すように処置した。図４１は、臨床エンドポイントの評価のタイムラインを示す。

[0303] 全体的な反応原性は、軽度であり、ワクチン接種は、十分に許容された。部位反応原性は、ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）で処置された患者でより頻度が高かった（図４２Ａ及び図４２Ｂ）。

[0304] MATRIX-M（商標）を伴う及び伴わないＢＶ２３７３の免疫原性を評価した。ワクチン接種の２１日後、抗ＣｏＶ－Ｓ抗体がすべてのワクチン投与計画で検出された（図４３Ａ）。MATRIX-M（商標）を含むワクチン投与計画における幾何平均増加倍率（ＧＭＦＲ）は、アジュバントなしのＢＶ２３７３によって誘導されたものを上回った。２回目のワクチン接種の７日後（２８日目）、抗ＣｏＶ－Ｓ力価は、ＢＶ２３７３単独で観察されたものに対して、最初のワクチン接種で見られた反応よりさらに８倍を超えて増加し、１４日以内（３５日目）の反応は、さらに２倍を超えて増加し、約１００倍のＧＭＦＲを達成した。ＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）による単回ワクチン接種は、無症状の（曝露された）ＣＯＶＩＤ－１９患者と同様の抗ＣｏＶ－Ｓ力価レベルを達成した。２回目のワクチン接種は、外来処置されたＣＯＶＩＤ－１９患者の回復期血清を６倍上回るＧＭＥＵレベルを達成し、ＣＯＶＩＤ－１９で入院した患者の回復期血清と同様のレベルを達成し、全体の回復期血清抗ＣｏＶ－Ｓ抗体をほぼ６倍上回った。５μｇ及び２５μｇの２回投与のＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）投与計画における応答は、同様であった。これは、用量を節約できるアジュバント（MATRIX-M（商標））の能力を強調している。

[0305] ＢＶ２３７３で処置したすべての群で中和抗体が誘導された（図４３Ｂ）。ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）投与計画で処置された群は、ＢＶ２３７３単独で処置された群よりも約５倍のＧＭＦＲを示した（図４３Ｂ）。アジュバントを使用した２回目のワクチン接種は、中和抗体力価に大きい影響を及ぼし、アジュバントを使用しない１回のワクチン接種に対して１００倍を超えて増加させた。回復期血清と比較すると、ＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）による２回目のワクチン接種は、外来処置されたＣＯＶＩＤ－１９患者よりも４倍高いＧＭＴレベルを達成し、レベルがＣＯＶＩＤ－１９で入院した患者のレベルに及び、全体の回復期血清ＧＭＴが４倍を超えた。

[0306] 医療を必要とする臨床症状を有するＣＯＶＩＤ－１９患者から得られた回復期血清は、疾患重症度に比例して増加する抗ＣｏＶ－ＳＩｇＧ及び中和力価を実証した（図４３Ａ及び図４３Ｂ）。

[0307] 回復期血清で処置された患者で観察されたもの（ｒ＝０．９５８）（図４４Ａ）と同様に、ＢＶ２３７３及びMATRIX-M（商標）で処置された患者における中和抗体力価と抗ＣｏＶ－ＳＩｇＧとの間に強い相関（ｒ＝０．９４６６、図４４Ｃ）が観察された。この相関は、アジュバントなしのＢＶ２３７３を投与された対象では観察されなかった（ｒ＝０．７６１６）（図４４Ｂ）。５μｇ及び２５μｇのＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）群（表５の群Ｃ～Ｅ）の両方が同程度の２用量応答を実証し、２用量投与計画を利用した場合、いずれかのアッセイ測定を使用してすべての参加者をセロコンバージョンした。１６人の参加者（群Ａ～Ｄのそれぞれから４人の参加者）のＴ細胞応答は、ＢＶ２３７３／MATRIX-M（商標）投与計画が、ＢＶ２３７３による刺激時のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及びＴＮＦ－αの産生に関して抗原特異的な多機能ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発したことを示した。Ｔｈ１サイトカインの産生に強い偏りが存在した（図４５Ａ～図４５Ｄ）。

実施例８
次世代ＣｏＶＳポリペプチドナノ粒子の発現、精製及び評価
[0308] 配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４又は配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＣｏＶＳポリペプチドをバキュロウイルス発現系で発現させ、コロナウイルススパイク（Ｓ）ポリペプチドを発現する組換えプラークを選択して確認する。配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４及び配列番号１１５の配列を有するＣｏＶＳポリペプチドを、配列番号５のアミノ酸配列を有するＮ末端シグナルペプチドを使用して発現させる。

[0309] 配列番号１１２の配列を有するＣｏＶＳポリペプチドは、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにアミノ酸配列ＱＱＡＱ（配列番号７）を有する不活性化フューリン切断部位を含む。

[0310] 配列番号１１３の配列を有するＣｏＶＳポリペプチドは、Ａｓｐ－６０１のグリシンへの変異、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにアミノ酸配列ＱＱＡＱ（配列番号７）を有する不活性化フューリン切断部位を含む。

[0311] 配列番号１１４の配列を有するＣｏＶＳポリペプチドは、アミノ酸５６、５７及び１３１の欠失、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ａｌａ－５５７のアスパラギン酸への変異、Ａｓｐ－６０１のグリシンへの変異、Ｐｒｏ－６６８のヒスチジンへの変異、Ｔｈｒ－７０３のイソロイシンへの変異、Ｓｅｒ－９６９のアラニンへの変異、Ａｓｐ－１１０５のヒスチジンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにアミノ酸配列ＱＱＡＱ（配列番号７）を有する不活性化フューリン切断部位を含む。

[0312] 配列番号１１５の配列を有するＣｏＶＳポリペプチドは、Ａｓｎ－４８８のチロシンへの変異、Ａｓｐ－６７のアラニンへの変異、Ｌｅｕ－２２９のヒスチジンへの変異、Ａｓｐ－２０２のグリシンへの変異、Ｌｙｓ－４０４のアスパラギンへの変異、Ｇｌｕ－４７１のリジンへの変異、Ａｌａ－６８８のバリンへの変異、Ａｓｐ－６０１のグリシンへの変異、Ｌｙｓ－９７３及びＶａｌ－９７４のプロリンへの変異並びにアミノ酸配列ＱＱＡＱを有する不活性化フューリン切断部位を含む。

[0313] ＣｏＶＳポリペプチドナノ粒子を実施例１と同様に作製する。配列番号１１２、配列番号１１２、配列番号１１３及び配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＣｏＶＳポリペプチドの安定性及び免疫原性を実施例２～７と同様に評価する。

番号を付された実施形態
１．免疫原性組成物であって、
（ｉ）配列番号８７のアミノ酸配列を有するコロナウイルスＳ（ＣｏＶＳ）糖タンパク質及び非イオン性界面活性剤コアを含むナノ粒子と；
（ｉｉ）薬学的に許容される緩衝液と、
（ｉｉｉ）サポニンアジュバントと
を含む免疫原性組成物。
２．約５μｇ～約２５μｇのＣｏＶＳ糖タンパク質を含む、実施形態１の免疫原性組成物。
３．約５μｇのＣｏＶＳ糖タンパク質を含む、実施形態２の免疫原性組成物。
４．サポニンアジュバントは、少なくとも２つのｉｓｃｏｍ粒子を含み、
第１のｉｓｃｏｍ粒子は、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａを含み、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃを含まず；及び
第２のｉｓｃｏｍ粒子は、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃを含み、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａを含まない、実施形態１の免疫原性組成物。
５．キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａは、アジュバント中のキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃの重量の合計の５０～９６重量％を占め、及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃは、合計の残りの部分をそれぞれ占める、実施形態４の免疫原性組成物。
６．キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃは、アジュバント中のキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃの重量の合計の約８５重量％及び約１５重量％をそれぞれ占める、実施形態４の免疫原性組成物。
７．約５０μｇのサポニンアジュバントを含む、実施形態１の免疫原性組成物。
８．非イオン性界面活性剤コアは、ポリソルベート－２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート－４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート－６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート－６５（ＰＳ６５）及びポリソルベート－８０（ＰＳ８０）からなる群から選択される、実施形態１の免疫原性組成物。
９．対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を刺激する方法であって、実施形態１の免疫原性組成物を投与することを含む方法。
１０．約５μｇ～約２５μｇのＣｏＶＳ糖タンパク質を含む、実施形態９の方法。
１１．５μｇのＣｏＶＳ糖タンパク質を含む、実施形態１０の方法。
１２．サポニンアジュバントは、少なくとも２つのｉｓｃｏｍ粒子を含み、
第１のｉｓｃｏｍ粒子は、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａを含み、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃを含まず；及び
第２のｉｓｃｏｍ粒子は、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃを含み、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａを含まない、実施形態９の方法。
１３．キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａは、アジュバント中のキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃの重量の合計の５０～９６重量％を占め、及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃは、合計の残りの部分をそれぞれ占める、実施形態１２の方法。
１４．キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃは、アジュバント中のキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃの重量の合計の約８５重量％及び約１５重量％をそれぞれ占める、実施形態１２の方法。
１５．約５０μｇのサポニンアジュバントを含む、実施形態９の方法。
１６．非イオン性界面活性剤コアは、ポリソルベート－２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート－４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート－６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート－６５（ＰＳ６５）及びポリソルベート－８０（ＰＳ８０）からなる群から選択される、実施形態９の方法。
１７．対象は、０日目に初回用量を投与され、及び２１日目に追加用量を投与される、実施形態９の方法。
１８．免疫原性組成物の単回用量は、投与される、実施形態９の方法。
１９．第１の免疫原性組成物と異なる第２の免疫原性組成物を投与することを含む、実施形態９の方法。
２０．第２の免疫原性組成物は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク糖タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク糖タンパク質をコードするウイルスベクター又は不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む、実施形態１９の方法。

参照による組み込み
[0314] 本明細書で引用されるすべての参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりそれらの全体が組み込まれる。しかしながら、本明細書で引用される任意の参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報及び特許出願の言及は、これらが、有効な先行技術を構成するか、又は世界のいずれの国でも共通の一般的な知識の一部を形成することの承認又は何らかの形式の示唆ではなく、そのように解釈されるべきものでもない。

Claims

コロナウイルス（ＣｏＶ）スパイク（Ｓ）糖タンパク質であって、
（ｉ）不活性化フューリン切断部位を有するＳ１サブユニットであって、
前記Ｓ１サブユニットが、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、サブドメイン１及び２（ＳＤ１／２）を含み、前記不活性化フューリン切断部位が、ＱＱＡＱのアミノ酸配列を有し；
前記ＮＴＤが、
（ａ）アミノ酸５６、５７、１３１、１３２、２２９、２３０、２３１及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸の欠失；並びに
（ｂ）アミノ酸６７、２２９、２０２、１３９、５、２３３、７、１３、１２５、１７７及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異
からなる群から選択される１つ又は複数の改変を任意選択により含み；
前記ＲＢＤが、アミノ酸４８８、４０４、４７１、４３９、４２６、４４０及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異を任意選択により含み；
前記ＳＤ１／２ドメインが、６０１、５５７、６６８、６４２及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異を任意選択により含む、
Ｓ１サブユニットと；
（ｉｉ）Ｓ２サブユニットであって、アミノ酸９７３及び９７４が、プロリンであり、
前記Ｓ２サブユニットは、
（ａ）６７６～７０２、７０２～７１１、７７５～７９３、８０６～８１５及びこれらの組み合わせの１つ又は複数のアミノ酸の欠失；
（ｂ）７０３、１１０５、６８８、９６９及び１０１４並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸の変異；並びに
（ｃ）ＴＭＣＴからの１つ又は複数のアミノ酸の欠失
からなる群から選択される１つ又は複数の改変を任意選択により含む、
Ｓ２サブユニットと
を含むコロナウイルス（ＣｏＶ）スパイク（Ｓ）糖タンパク質。
アミノ酸６７６～６８５の欠失を含む、請求項１に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
アミノ酸７０２～７１１の欠失を含む、請求項１に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
アミノ酸８０６～８１５の欠失を含む、請求項１に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
アミノ酸７７５～７９３の欠失を含む、請求項１に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
前記ＮＴＤのアミノ酸１～２９２の欠失を含む、請求項１に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
前記膜貫通及び細胞質尾部（ＴＭＣＴ）のアミノ酸１２０１～１２６０の欠失を含む、請求項１に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
配列番号８５～８９、１０５、１０６及び１１２～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
シグナルペプチドを含み、任意選択により、前記シグナルペプチドは、配列番号５又は配列番号１１７のアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
Ｃ末端融合タンパク質を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
前記Ｃ末端融合タンパク質が、ヘキサヒスチジンタグである、請求項１０に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
前記Ｃ末端融合タンパク質が、フォルドンである、請求項１０に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
前記フォルドンが、配列番号６８に対応するアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
ΔＨｃａｌが、野生型ＣｏＶＳ糖タンパク質（配列番号２）のΔＨｃａｌよりも少なくとも２倍大きい、請求項１～１３のいずれか一項に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
前記Ｓ２サブユニット、ＮＴＤ、ＲＢＤ及びＳＤ１／２のそれぞれが、配列番号２のアミノ酸配列を有する前記ＣｏＶＳ糖タンパク質の対応するサブユニット又はドメインと９５％同一である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
前記Ｓ２サブユニット、ＮＴＤ、ＲＢＤ及びＳＤ１／２のそれぞれが、配列番号２のアミノ酸配列を有する前記ＣｏＶＳ糖タンパク質の対応するサブユニット又はドメインと９７％同一である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
前記Ｓ２サブユニット、ＮＴＤ、ＲＢＤ及びＳＤ１／２のそれぞれが、配列番号２のアミノ酸配列を有する前記ＣｏＶＳ糖タンパク質の対応するサブユニット又はドメインと９９％同一である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
前記Ｓ２サブユニット、ＮＴＤ、ＲＢＤ及びＳＤ１／２のそれぞれが、配列番号２のアミノ酸配列を有する前記ＣｏＶＳ糖タンパク質の対応するサブユニット又はドメインと９９．５％同一である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質。
請求項１～１８のいずれか一項に記載のＳ糖タンパク質をコードする単離された核酸。
請求項１９に記載の核酸を含むベクター。
請求項１～１８のいずれか一項に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質を含むナノ粒子。
約２０ｎｍ～約３５ｎｍのＺａｖｇ直径を有する、請求項２１に記載のナノ粒子。
約０．２～約０．４５の多分散指数を有する、請求項２１に記載のナノ粒子。
請求項１～１８のいずれか一項に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質を発現する細胞。
請求項１～１８のいずれか一項に記載のコロナウイルスＳ糖タンパク質及び薬学的に許容される緩衝液を含むワクチン組成物。
アジュバントを含む、請求項２５に記載のワクチン組成物。
前記アジュバントが、少なくとも２つのｉｓｃｏｍ粒子を含み、
第１のｉｓｃｏｍ粒子が、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａを含み、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃを含まず；及び
第２のｉｓｃｏｍ粒子が、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃを含み、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａを含まない、請求項２６に記載のワクチン組成物。
キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃが、前記アジュバント中のキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃの重量の合計の約９２重量％及び約８重量％をそれぞれ占める、請求項２７に記載のワクチン組成物。
前記アジュバントが、約５０μｇの用量で投与される、請求項２６に記載のワクチン組成物。
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を刺激する方法であって、請求項２５～２９のいずれか一項に記載のワクチン組成物を投与することを含む方法。
前記対象が、０日目に初回用量を投与され、及び２１日目に追加用量を投与される、請求項３０に記載の方法。
前記対象が、約５μｇ～約２５μｇのコロナウイルスＳ糖タンパク質を投与される、請求項３０に記載の方法。
前記対象が、約５μｇのコロナウイルスＳ糖タンパク質を投与される、請求項３０に記載の方法。
前記ワクチン組成物が筋肉内投与される、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の方法。
単回用量の前記ワクチン組成物が投与される、請求項３０、３２、３３又は３４のいずれか一項に記載の方法。
複数用量の前記ワクチン組成物が投与される、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
前記ワクチン組成物がインフルエンザ糖タンパク質と共に同時投与される、請求項３０～３６のいずれか一項に記載の方法。
免疫原性組成物であって、
（ｉ）配列番号８７のアミノ酸配列を有するコロナウイルスＳ（ＣｏＶＳ）糖タンパク質及び非イオン性界面活性剤コアを含むナノ粒子と；
（ｉｉ）薬学的に許容される緩衝液と、
（ｉｉｉ）サポニンアジュバントと
を含む免疫原性組成物。
約５μｇ～約２５μｇのＣｏＶＳ糖タンパク質を含む、請求項３８に記載の免疫原性組成物。
約５μｇのＣｏＶＳ糖タンパク質を含む、請求項３９に記載の免疫原性組成物。
前記サポニンアジュバントが、少なくとも２つのｉｓｃｏｍ粒子を含み、
第１のｉｓｃｏｍ粒子が、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａを含み、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃを含まず；及び
第２のｉｓｃｏｍ粒子が、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃを含み、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａを含まない、請求項３８に記載の免疫原性組成物。
キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａが、前記アジュバント中のキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃの重量の合計の５０～９６重量％を占め、及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃは、前記合計の残りの部分をそれぞれ占める、請求項４１に記載の免疫原性組成物。
キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃが、前記アジュバント中のキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃの重量の合計の約８５重量％及び約１５重量％をそれぞれ占める、請求項４１に記載の免疫原性組成物。
約５０μｇのサポニンアジュバントを含む、請求項３８に記載の免疫原性組成物。
前記非イオン性界面活性剤コアが、ポリソルベート－２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート－４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート－６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート－６５（ＰＳ６５）及びポリソルベート－８０（ＰＳ８０）からなる群から選択される、請求項３８に記載の免疫原性組成物。
対象におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を刺激する方法であって、請求項３８に記載の免疫原性組成物を投与することを含む方法。
約５μｇ～約２５μｇのＣｏＶＳ糖タンパク質を含む、請求項４６に記載の方法。
５μｇのＣｏＶＳ糖タンパク質を含む、請求項４７に記載の方法。
前記サポニンアジュバントが少なくとも２つのｉｓｃｏｍ粒子を含み、
第１のｉｓｃｏｍ粒子が、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａを含み、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃを含まず；及び
第２のｉｓｃｏｍ粒子が、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃを含み、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａを含まない、請求項４６に記載の方法。
キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａが、前記アジュバント中のキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃの重量の合計の５０～９６重量％を占め、及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃは、前記合計の残りの部分をそれぞれ占める、請求項４９に記載の方法。
キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃが、前記アジュバント中のキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ａ及びキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の画分Ｃの重量の合計の約８５重量％及び約１５重量％をそれぞれ占める、請求項４９に記載の方法。
約５０μｇのサポニンアジュバントを含む、請求項４６に記載の方法。
前記非イオン性界面活性剤コアが、ポリソルベート－２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート－４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート－６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート－６５（ＰＳ６５）及びポリソルベート－８０（ＰＳ８０）からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
前記対象が、０日目に初回用量を投与され、及び２１日目に追加用量を投与される、請求項４６に記載の方法。
単回用量の前記免疫原性組成物が投与される、請求項４６に記載の方法。
前記第１の免疫原性組成物と異なる第２の免疫原性組成物を投与することを含む、請求項４６に記載の方法。
前記第２の免疫原性組成物が、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク糖タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク糖タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイク糖タンパク質をコードするウイルスベクター又は不活性化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを含む、請求項５６に記載の方法。