CN114031675B - 基于SARS-CoV-2的S蛋白的疫苗和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了基于SARS‑CoV‑2的S蛋白的疫苗和组合物，并具体涉及重组SARS‑CoV‑2刺突蛋白(S蛋白)及编码其的mRNA和DNA。本公开还涉及包含编码重组S蛋白的DNA序列的重组质粒。本公开的重组质粒经转录得到mRNA，其包含选自SEQ ID NO.14‑16中任一项所示的序列。本公开进一步涉及包含前述mRNA的mRNA‑载体颗粒例如脂质纳米颗粒(LNP)和组合物例如疫苗组合物。

Description

基于SARS-CoV-2的S蛋白的疫苗和组合物
技术领域
本公开属于生物医药和疫苗技术领域，尤其涉及针对SARS-CoV-2，例如SARS-CoV-2 Delta变异株(B.1.617.2)的疫苗和组合物。
背景技术
SARS-CoV-2的基因组在不同的宿主群体中不断发生变异，产生了多种亚型，其中，SARS-CoV-2 Delta变异株，即B.1.617.2，是最早在印度报道的一个新的变体。目前针对SARS-CoV-2 Delta变异株尚无成熟的特效药，迫切需要有效的疫苗来应对。
SARS-CoV-2 Delta变异株相对于早期报道的SARS-CoV-2，在基因组诸多位置发生了突变。这些突变触发了新冠病毒的免疫逃逸，导致该病毒相对于其他早期的新冠病毒亚型具有对人体适应性更强、传播速度更快、病毒载量更高、治疗所需时间更长、更容易发展成重症等特点。
mRNA疫苗作为第三代疫苗，可以诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫，通过多种机制来保护机体，并且由于其自身的特性，免疫后在转染的细胞的细胞质中能够很快被降解，从而降低安全性风险。在变异型新冠病毒疫情应对中，mRNA疫苗相对于其他类型的疫苗已彰显出了独特的优势。临床试验数据表明，针对变异株设计的增强型mRNA疫苗对变异病毒的中和能力更高。因此，急需针对目前主导流行的SARS-CoV-2 Delta变异株的新一代更有效的疫苗。
发明内容
本发明提供了一种针对SARS-CoV-2，特别是针对SARS-CoV-2 Delta变异株(B.1.617.2)的mRNA疫苗，其递送至小鼠体内后能够在体内表达预融合稳定形式的重组S蛋白，触发机体的细胞免疫和体液免疫反应，从而诱导体内产生特异性抗体。与第1代针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗相比，经本发明的疫苗免疫的血清对SARS-CoV-2 Delta变异株S蛋白的效价更高，而且对SARS-CoV-2 Delta变异株的中和能力更强。
SARS-CoV-2与SARS-CoV和MERS-CoV同属于冠状病毒科的β-冠状病毒属。SARS-CoV-2基因组序列全长29903bp，与SARS-CoV基因序列同一性为79.5%，与MERS-CoV序列同一性为40%。SARS-CoV-2病毒颗粒的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(spikeprotein，S)、膜蛋白(membrane protein，M)、包膜蛋白(envelop protein，E)和核衣壳蛋白(nucelocapsid protein，N)。与其他β-冠状病毒类似，SARS-CoV-2病毒的对细胞的吸附入侵过程主要依赖于S蛋白；在该过程中，S蛋白以同源三聚体的形式装配，其具有短的胞质尾和疏水跨膜结构域，将蛋白质锚定到膜中。
S蛋白可分为受体结合亚基S1和膜融合亚基S2，S1亚基可进一步分成信号肽区域(signal peptide，SP)、N-端区域(N-terminal domain，NTD)和受体结合域(receptorbinding domain，RBD)。S2亚基通过跨膜区锚定在膜上，它含有膜融合过程所需要的基本元件，包括：内在的膜融合肽(fusion peptide，FP)、两个7肽重复序列(heptad repeat，HR)、跨膜结构域(transmembrane domain，TM)，以及C末端的胞质结构域(cytoplasmic domain，CP)。
S蛋白从N端到C端由信号肽区域(SP)、胞外结构域(ECD)、跨膜结构域(TM)和胞质结构域(CP)组成。其中，胞外结构域可进一步分成N-端区域(NTD)、受体结合域(RBD)、一个内在的膜融合肽(FP)和两个7肽重复序列(HR1和HR2)，属于第一类病毒膜融合蛋白。S蛋白的信号肽区域对应于S蛋白的氨基酸位置1-13的区域；胞外结构域对应于S蛋白的氨基酸位置14-1213的区域；跨膜结构域对应于S蛋白的氨基酸位置1214-1237的区域；胞质结构域对应于S蛋白的氨基酸位置1238-1273的区域。
通过对S蛋白预融合结构进行解析，发现S1亚基的RBD结构域经历铰链类似的构象移动来隐藏或暴露受体结合的关键位点，“向下”为受体不可结合状态，“向上”为受体可结合状态，处于较为不稳定的状态。这种构象使得S蛋白能够容易地与宿主受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合。当RBD与受体结合后，S2亚基通过将FP插入宿主细胞膜而改变为融合后构象，HR1和HR2形成一个反平行的六螺旋束(6HB)，共同组成一个融合核心，最终导致病毒膜与细胞膜融合。使用冷冻电镜实验，在预融合构象中确定了大量的三聚体S糖蛋白结构域，预融合S蛋白上存在大量中和抗体敏感表位，而融合后构象使仅存在于预融合构象上的中和敏感表位的暴露量降至最低。因此，表达预融合稳定形式的SARS-CoV-2 S三聚体蛋白，是开发安全有效的SARS-CoV-2疫苗的关键。优化的疫苗抗原将保留存在于S蛋白的预融合构象形式中的表位，并诱导能够抑制病毒融合的抗体。
如本文所用的术语“SARS-CoV-2 Delta变异株”、“B.1.617.2”、“Delta型新冠病毒”、“德尔塔型新冠病毒”可互换使用，并且是指2020年10月在印度首次出现的SARS-CoV-2亚型，其相对于SARS-CoV-2，在基因组诸多位置发生了突变。这些突变触发了新冠病毒的免疫逃逸，导致该病毒相对于其他早期的新冠病毒亚型具有对人体适应性更强、传播速度更快、病毒载量更高、治疗所需时间更长、更容易发展成重症等特点。
英国公共卫生局的报告显示，Delta变异株的传播能力比Alpha变异株高60% (HAllen et. al., Increased household transmission of COVID-19 cases associatedwith SARS-CoV-2 Variant of Concern B.1.617.2: a national case-control study2021 )。研究表明，Delta变异株对疫苗诱导的中和抗体产生抗性(A Saito et. al.,SARS-CoV-2 spike P681R mutation enhances and accelerates viral fusion)。检测了250个辉瑞的BNT162b2疫苗接种者对各种VOC的中和抗体滴度，结果显示，与野生型相比，针对Delta变异株的中和抗体滴度下降了5.8倍，而Alpha变异株只下降了2.6倍(EC Wall et.al., Neutralising antibody activity against SARS-CoV-2 VOCs B.1.617.2 andB.1.351 by BNT162b2 vaccination. Lancet. 2021;397(10292):2331-3)。
在一方面，本发明提供了重组SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)，所述重组S蛋白相对于野生型S蛋白在胞外结构域中包括以下突变：T19R、G142D、E156G、F157和R158缺失突变、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R和D950N。
在一些实施方案中，重组S蛋白的胞外结构域中的S1/S2切割位点RRAR(对应于S蛋白的氨基酸位置682-685)可以经突变以失去被蛋白酶例如弗林样(Furin-like)蛋白酶和溶酶体蛋白酶切割的能力。在一些实施方案中，可以将重组S蛋白中的S1/S2切割位点RRAR突变为GGSG。
在一些实施方案中，重组S蛋白的胞外结构域中的S2切割位点KR(对应于S蛋白的氨基酸位置814-815)可以经突变以失去被蛋白酶例如弗林样蛋白酶和溶酶体蛋白酶切割的能力。在一些实施方案中，可以将重组S蛋白或其抗原性片段中的S2切割位点KR突变为AN。
SARS-CoV-2病毒在细胞内包装过程中，S蛋白可能会被蛋白酶例如弗林样蛋白酶或溶酶体蛋白切割，分泌出S1亚基和S2亚基呈非融合状态的S蛋白。通过对重组S蛋白中的切割位点例如S1/S2切割位点和/或S2切割位点进行突变，可以避免重组S蛋白被蛋白酶切割，从而进一步提高其稳定性。
在一些实施方案中，重组S蛋白还包括K986P和V987P突变。在重组S蛋白的胞外结构域中引入了2个脯氨酸突变K986P和V987P可以提高预融合构象的稳定性。
在一些实施方案中，重组S蛋白可以不包含功能性融合肽结构域(FP结构域：对应于S蛋白的氨基酸位置788-806)。例如，重组S蛋白可以包含经突变的融合肽结构域，例如通过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，导致融合肽结构域失去其天然功能，例如介导病毒与宿主细胞膜进行融合的功能。或者，在一些实施方案中，重组S蛋白可以不包含融合肽结构域。
通过在重组S蛋白中去除功能性融合肽结构域，能够提高预融合构象的稳定性，使得保留和暴露S蛋白的预融合构象上存在的大量中和抗体敏感表位。
在一些实施方案中，重组S蛋白可以不包含跨膜结构域(对应于S蛋白的氨基酸位置1214-1237的区域)和/或胞质结构域(对应于S蛋白的氨基酸位置1238-1273的区域)。在一些实施方案中，重组S蛋白可以不包含胞质结构域。在一些实施方案中，重组S蛋白可以不包含跨膜结构域和胞质结构域。在一些实施方案中，重组S蛋白还包含三聚体结构域，所述三聚体结构域当表达时促进所述重组S蛋白形成三聚体。
如本文所用，“三聚体结构域”是指当表达时，能够自发或诱导形成三聚体的蛋白质或多肽结构域。本领域已知多种此类三聚体结构域。通过在重组S蛋白中包括三聚体结构域(例如通过构建融合蛋白)，能够促进重组S蛋白形成三聚体构象，和/或稳定化重组S蛋白的三聚体构象。
在一些实施方案中，重组S蛋白中的三聚体结构域可以包含T4噬菌体fibritin三聚体基序。在一些实施方案中，所述T4噬菌体fibritin三聚体基序可以具有SEQ ID NO. 18所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，三聚体结构域可以与重组S蛋白直接融合。在另一些实施方案中，三聚体结构域可以通过接头与重组S蛋白融合。在一些实施方案中，三聚体结构域可以与重组S蛋白的N端融合。在另一些实施方案中，三聚体结构域可以与重组S蛋白的C端融合。例如，三聚体结构域可以通过接头与重组S蛋白的C端融合。在一些实施方案中，所述接头序列可以包含SEQ ID NO. 19所示的序列。在一些实施方案中，重组S蛋白还包含信号序列；优选地，所述信号序列包含免疫球蛋白重链可变区(IGVH)信号序列。例如，所述信号序列可以具有SEQ ID NO. 17所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由以下中的任一项组成：
i) 胞外结构域；
ii) 胞外结构域、跨膜结构域和任选的胞质结构域；
iii) 胞外结构域和三聚体结构域；
iv) 胞外结构域、跨膜结构域、任选的胞质结构域、和三聚体结构域；
v) 信号序列、胞外结构域；
vi) 信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和任选的胞质结构域；
vii) 信号序列、胞外结构域和三聚体结构域；和
viii) 信号序列、胞外结构域、跨膜结构域、任选的胞质结构域、和三聚体结构域。
在一些实施方案中，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变中的一种或多种：
1) T19R、G142D、E156G、F157和R158缺失突变、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R和D950N；
2) S1/S2切割位点RRAR经突变以失去被弗林样蛋白酶和溶酶体蛋白酶切割的能力，优选地，S1/S2切割位点突变为GGSG；
3) S2切割位点KR经突变以失去被弗林样蛋白酶和溶酶体蛋白酶切割的能力，优选地，S2切割位点突变为AN；
4) K986P和/或V987P突变；
5) 融合肽结构域经突变以失去介导病毒与宿主细胞膜进行融合的功能；优选融合肽结构域缺失突变。
在一些实施方案中，所述信号序列包含免疫球蛋白重链可变区(IGVH)信号序列。例如，所述信号序列具有SEQ ID NO. 17所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述三聚体结构域为T4噬菌体fibritin三聚体基序。在一些实施方案中，所述T4噬菌体fibritin三聚体基序具有SEQ ID NO. 18所示的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：T19R、G142D、E156G、F157和R158缺失突变、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R和D950N。例如，重组S蛋白具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
在另一优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：T19R、G142D、E156G、F157和R158缺失突变、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、S1/S2切割位点RRAR突变为GGSG和S2切割位点KR突变为AN。例如，重组S蛋白具有如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
在另一优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域组成，所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：T19R、G142D、E156G、F157和R158缺失突变、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、K986P、V987P、S1/S2切割位点RRAR突变为GGSG和S2切割位点KR突变为AN。例如，重组S蛋白具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
在另一优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域和三聚体结构域组成，所述信号序列为免疫球蛋白重链可变区(IGVH)信号序列，优选如SEQ IDNO. 17所示的序列(MDWIWRILFLVGAATGAHS)；所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：T19R、G142D、E156G、F157和R158缺失突变、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、S1/S2切割位点RRAR突变为GGSG、S2切割位点KR突变为AN、和融合肽结构域缺失突变；并且所述三聚体结构域为T4噬菌体fibritin三聚体基序，优选如SEQ ID NO. 18所示的序列(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)。优选地，三聚体结构域通过接头与胞外结构域的C端融合。所述接头序列可以为SEQ ID NO. 19所示的序列(SAIG)。例如，重组S蛋白具有如SEQ IDNO. 4所示的氨基酸序列。
在另一优选的实施方案中，重组S蛋白从N端到C端由信号序列、胞外结构域和三聚体结构域组成，所述信号序列为免疫球蛋白重链可变区(IGVH)信号序列，优选如SEQ IDNO. 17所示的序列(MDWIWRILFLVGAATGAHS)；所述胞外结构域相对于野生型序列具有以下突变：T19R、G142D、E156G、F157和R158缺失突变、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N、K986P、V987P、S1/S2切割位点RRAR突变为GGSG、S2切割位点KR突变为AN、和融合肽结构域缺失突变；并且所述三聚体结构域为T4噬菌体fibritin三聚体基序，优选如SEQ ID NO. 18所示的序列(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)。优选地，三聚体结构域通过接头与胞外结构域的C端融合。所述接头序列可以为SEQ ID NO. 19所示的序列(SAIG)。例如，重组S蛋白具有如SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组S蛋白具有选自SEQ ID NO. 1-5中任一项所示的氨基酸序列。在优选的实施方案中，重组S蛋白具有选自SEQ ID NO. 3-5中任一项所示的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了mRNA，其编码本发明的重组S蛋白。
在一些实施方案中，mRNA从5’到3’方向包含帽结构、5’-UTR、编码本发明的重组S蛋白的开放阅读框(ORF)、3’-UTR和polyA尾。
在一些实施方案中，帽结构可以具有m7G5’ppp5’(2’-OMe)NpG，其中m7G为N7-甲基鸟嘌呤核苷；p为磷酸；ppp为三磷酸；2’-OMe为2’-甲氧基修饰；N为任意核苷，例如腺嘌呤核苷(A)、鸟嘌呤核苷(G)、胞嘧啶核苷(C)和尿嘧啶核苷(U)，或天然存在的其它核苷或经修饰的核苷。
在一些实施方案中，5’-UTR可以包含选自下组的基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体：β-珠蛋白(HBB)基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因、轴丝动力蛋白重链2(DNAH2)基因、17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因。例如，变体序列可以与相应基因的野生型5’-UTR序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%的序列同一性。
在一些实施方案中，5’-UTR包含衍生自17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体。在一些实施方案中，5’-UTR包含KOZAK序列。在一些实施方案中，5’-UTR包含衍生自17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体，和KOZAK序列。在一些实施方案中，5’-UTR包含如SEQ ID NO. 8和/或SEQ ID NO.9所示的序列。
在一些实施方案中，3’-UTR可以包含选自下组的基因的3’-UTR或其同源物、片段或变体：白蛋白(ALB)基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白(HBB)基因、酪氨酸羟化酶基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因，脂氧合酶基因和胶原蛋白α基因。例如，变体序列可以与相应基因的野生型3’-UTR序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%的序列同一性。
在一些实施方案中，3’-UTR包含衍生自白蛋白(ALB)基因的3’-UTR或其同源物、片段或变体。优选地，3’-UTR包含如SEQ ID NO. 10所示的序列。
在一些实施方案中，poly A尾的长度可以为100-200个核苷酸，例如约100个核苷酸，约110个核苷酸，约120个核苷酸，约130个核苷酸，约140个核苷酸，约150个核苷酸，约160个核苷酸，约170个核苷酸，约180个核苷酸，约190个核苷酸，或约200个核苷酸。在一些实施方案中，polyA尾的长度可以为100-150个核苷酸。在一些实施方案中，所述poly A尾的长度可以为约120个核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的mRNA包含如SEQ ID NO. 14-16中任一项所示的序列，或由SEQ ID NO. 14-16中任一项所示的序列组成。
在一些实施方案中，mRNA中的一个或多个核苷酸可以是经修饰的。例如，mRNA中的一个或多个核苷酸(例如所有核苷酸)可以各自独立替换为天然存在的核苷酸类似物或人工合成的核苷酸类似物。
在一些实施方案中，天然存在的核苷酸类似物选自假尿苷、2-硫尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基胞苷和N6-甲基腺苷。在一些实施方案中，人工合成的核苷酸类似物选自N1-甲基假尿苷和5-乙炔基尿苷。
在一些实施方案中，mRNA中的一个或多个尿苷三磷酸可以各自独立替换为假尿苷三磷酸、1-甲基-假尿苷三磷酸或5-乙炔基尿苷三磷酸。在一些实施方案中，mRNA中的一个或多个胞苷三磷酸可以各自独立替换为5-甲基胞苷三磷酸。
在又一方面，本发明提供了DNA，其编码本发明的mRNA。在一些实施方案中，本发明的DNA可以用于在体外通过转录制备本发明的mRNA。
在一些实施方案中，本发明的DNA包含如SEQ ID NO. 11-13中任一项所示的序列，或由SEQ ID NO. 11-13中任一项所示的序列组成。
在又一方面，本发明提供了重组质粒，其包含本发明的DNA。
在一些实施方案中，重组质粒为pT7TS质粒。
在一些实施方案中，重组质粒还包含起始序列(Ori)、T7启动子、5’-UTR和3’-UTR。
在一些实施方案中，起始序列为ColE1型起始序列。优选地，起始序列包含如SEQID NO. 6所示的序列，或由SEQ ID NO. 6所示的序列组成。
在一些实施方案中，T7启动子包含如SEQ ID NO. 7所示的序列，或由SEQ ID NO.7所示的序列组成。
在一些实施方案中，5’-UTR可以包含选自下组的基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体：β-珠蛋白(HBB)基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因、轴丝动力蛋白重链2(DNAH2)基因、17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因。例如，变体序列可以与相应基因的野生型5’-UTR序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%的序列同一性。
在一些实施方案中，5’-UTR包含衍生自17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体。在一些实施方案中，5’-UTR包含KOZAK序列。在一些实施方案中，5’-UTR包含衍生自17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因的5’-UTR或其同源物、片段或变体，和KOZAK序列。在一些实施方案中，5’-UTR包含如SEQ ID NO. 8和/或SEQ ID NO.9所示的序列。
在一些实施方案中，3’-UTR可以包含选自下组的基因的3’-UTR或其同源物、片段或变体：白蛋白(ALB)基因、α-珠蛋白基因、β-珠蛋白(HBB)基因、酪氨酸羟化酶基因、热休克蛋白70(Hsp70)基因，脂氧合酶基因和胶原蛋白α基因。例如，变体序列可以与相应基因的野生型3’-UTR序列具有至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%，或至少99%的序列同一性。
在一些实施方案中，3’-UTR包含衍生自白蛋白(ALB)基因的3’-UTR或其同源物、片段或变体。优选地，3’-UTR包含如SEQ ID NO. 10所示的序列。
在一些实施方案中，重组质粒还包含polyA、抗性基因启动子和抗性基因。
在一些实施方案中，poly A尾的长度可以为100-200个核苷酸，例如约100个核苷酸，约110个核苷酸，约120个核苷酸，约130个核苷酸，约140个核苷酸，约150个核苷酸，约160个核苷酸，约170个核苷酸，约180个核苷酸，约190个核苷酸，或约200个核苷酸。在一些实施方案中，polyA尾的长度可以为100-150个核苷酸。在一些实施方案中，所述poly A尾的长度可以为约120个核苷酸。
在一些实施方案中，抗性基因启动子为氨苄青霉素抗性基因启动子。
在一些实施方案中，抗性基因为硫酸卡那霉素抗性基因。
在另一方面，本发明提供了mRNA-载体颗粒，其包含本发明的mRNA和包封所述mRNA的载体材料。
在一些实施方案中，载体材料可以选自鱼精蛋白、脂质纳米颗粒(LNP)、高分子材料和无机纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述载体材料是LNP。
在一些实施方案中，LNP可以包含离子化脂质、聚乙二醇化脂质、胆固醇及衍生物和磷脂中的一种或多种。例如，LNP可以包含离子化脂质、聚乙二醇化脂质、胆固醇及衍生物和磷脂中的任一种，其中任意两种、任意三种或全部四种的组合。在一些实施方案中，LNP可以包含离子化脂质、聚乙二醇化脂质、胆固醇及衍生物和磷脂中的一种或多种。
在又一方面，本发明提供了组合物，其包含本发明的重组S蛋白、mRNA、重组质粒、或RNA-载体颗粒，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
如本文所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的载体、赋形剂或稀释剂。
用于本发明的组合物中的示例性载体包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。用于本发明的组合物中的示例性赋形剂包括填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、载体、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋形剂以制备本发明的组合物。通常，合适的赋形剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和组合物的期望剂型。
根据所采用的活性剂(如mRNA)，可将本公开的组合物制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、凝胶剂、粉剂、片剂、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体剂、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程在第22版的Remington’s Pharmaceutical Sciences(Ed.MaackPublishing Co，Easton，Pa.，2012)中显示，并可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。
在一些实施方案中，组合物可以是疫苗组合物，任选地，疫苗组合物还包含一种或多种佐剂。
如本文中使用的，术语“疫苗组合物”指诱导或改进对特定疾病的免疫的生物制剂。用疫苗组合物激发个体的免疫系统诱导免疫细胞的形成和/或增殖，该免疫细胞特异性识别由疫苗包含的化合物。所述免疫细胞的至少一部分保持存活一段时间，其可以延长至疫苗接种后10, 20或30年。如果个体的免疫系统在前述时间段内遇到衍生能引发免疫应答的化合物的病原体，那么通过疫苗接种生成的免疫细胞被再活化，且相比于尚未用疫苗激发和首次遇到病原体的免疫原性化合物的个体的免疫应答，增强针对该病原体的免疫应答。
在本文中，“疫苗接种”、“免疫接种”、“免疫”或“接种”是指向受试者施用疫苗，其目的是防止受试者发展出疾病的一种或多种症状。原则上，疫苗接种包括初次疫苗接种和任选地一次或多次加强疫苗接种。初次疫苗接种或初次免疫定义为施用本文公开的组合物或单位剂量以建立保护性免疫应答的初次施用计划。加强疫苗接种或加强免疫是指在初次疫苗接种之后，例如在初次疫苗接种计划的最后一次施用后至少一周、至少2周、至少一个月、至少6个月、至少1年或甚至5或10年之后进行的施用或施用计划。加强施用试图增强或重建初次疫苗接种的免疫应答。
对本发明的组合物或疫苗组合物的免疫应答是受试者中形成对组合物中存在的抗原蛋白的体液和/或细胞免疫应答。出于本发明的目的，“体液免疫应答”指由抗体分子，包括分泌性(IgA)或IgG分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”指由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面牵涉细胞裂解T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对由主要组织相容性复合物(MHC)编码并且在细胞表面上表达的蛋白质结合呈递的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导并促进对胞内微生物的破坏，或者此类微生物感染的细胞的裂解。细胞免疫的另一个方面牵涉辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞作用为帮助刺激功能，并且聚焦非特异性效应细胞针对在其表面上展示与MHC分子结合的肽抗原的细胞的活性。细胞免疫应答还涉及生成由活化的T细胞和/或其它白细胞，包括那些自CD4+和CD8+T细胞衍生的细胞生成的细胞因子、趋化因子和其它此类分子。
因此，免疫应答可以是刺激CTL，和/或辅助T细胞生成或活化的应答。也可以刺激趋化因子和/或细胞因子的生成。本发明的组合物或疫苗组合物也可以引发抗体介导的免疫应答。因此，免疫应答可以包括下列一种或多种效应：B细胞的抗体(例如IgA或IgG)生成；和/或抑制物、细胞毒性或辅助T细胞和/或特异性针对疫苗中存在的蛋白的T细胞的活化。这些应答可以用来中和感染性，和/或介导抗体-补体，或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)以对经免疫个体提供保护。可以使用本领域中公知的标准免疫测定法和中和测定法测定此类应答。
如本文中使用的，术语“佐剂”指在细胞水平或体液水平增加、刺激、活化、加强或调节针对组合物的活性成分的免疫应答的试剂，例如，免疫佐剂刺激免疫系统针对实际抗原的应答但其本身没有免疫效应。这样的佐剂的实例包括但不限于无机佐剂(例如，无机金属盐例如磷酸铝或氢氧化铝)、有机佐剂(例如，皂角苷或鲨烯)、油基佐剂(如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、颗粒状佐剂(例如，免疫刺激性复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解的微球)、病毒颗粒、细菌佐剂(例如单磷酰脂质A或胞壁肽)、合成佐剂(例如，非离子型嵌段共聚物、胞壁肽类似物或合成脂质A)或合成多核苷酸佐剂(例如，多聚精氨酸或多聚赖氨酸)。优选地，佐剂选自铝佐剂（例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、明矾）、MF59、AS03、病毒体(例如肝炎病毒病毒体和流感病毒病毒体)、AS04、热可逆水包油乳液、ISA51、弗氏佐剂、IL-12、CpG基序、甘露糖或其任意组合。
在一些实施方案中，所述组合物或疫苗组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。例如，所述治疗剂可以选自另外的抗原性蛋白或多肽、抗体、激素或激素类似物，和小分子药物。
在另一方面，本发明提供了预防和/或治疗受试者中与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用有效量的本发明的重组S蛋白、mRNA、重组质粒、mRNA-载体颗粒、或组合物。
如本文所用的术语“预防”或“治疗”是指疾病或病症的获得或发展的风险的降低，即，使疾病的临床症状的至少一种在疾病发作之前易受疾病感染、或未暴露于致病原的受试者中不发展。例如，治疗可以包括：(i)在可能易患疾病、障碍和/或病症但尚未诊断患有所述疾病、障碍和/或病症的患者中预防所述疾病、障碍和/或病症；(ii)抑制所述疾病、障碍和/或病症，即阻止其发展；或(iii)减轻所述疾病、障碍和/或病症，即引起所述疾病、障碍和/或病症的消退。
如本文所用的术语“有效量”意指当施用到受试者用于治疗或预防疾病时足以实现这样的治疗或预防的化合物的量。“有效量”可取决于化合物、疾病及其严重度、以及待治疗的受试者的年龄、体重等改变。“治疗有效量”是指用于治疗性治疗的有效量。“预防有效量”是指用于预防性治疗的有效量。
如本文所用的术语“施用”是指使用本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统将药剂物理导入受试者。示例性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输液。
如本文中使用的，术语“受试者”、“个体”、和“患者”是本领域中公知的，并且在本文中可互换使用，指需要治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。实例包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，诸如黑猩猩及其它猿和猴物种。术语个体、受试者和患者本身不表示特定年龄、性别、人种等。
在本发明的方法的实施方案中，所述疾病或病症为SARS-CoV-2 Delta变异株感染引起的疾病或病症。
在又一方面，本发明提供了本发明的重组S蛋白、mRNA、重组质粒、mRNA-载体颗粒、或组合物在制备用于在受试者中预防和/或治疗与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了本发明的重组S蛋白、mRNA、重组质粒、mRNA-载体颗粒、或组合物，其用于预防和/或治疗受试者中与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症。
在本发明的用途的实施方案中，所述疾病或病症为SARS-CoV-2 Delta变异株感染引起的疾病或病症。
附图说明
图1显示了RBMRNA-Delta质粒结构示意图。
图2显示了通过RBMRNA-Delta质粒转录得到的核苷酸序列为SEQ ID NO: 14的mRNA的电泳结果图。
图3显示了检测从RBMRNA-Delta mRNA表达的重组S蛋白的蛋白免疫印迹结果图。
图4显示了通过ELISPOT法检测的RBMRNA-Delta 1疫苗在小鼠体内诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的结果。*：P<0.05，**：P<0.01。
图5显示了通过ELISPOT法检测的RBMRNA-Delta 2疫苗在小鼠体内诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的结果。*：P<0.05，**：P<0.01。
图6显示了通过ELISPOT法检测的RBMRNA-Delta 3疫苗在小鼠体内诱导T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的结果。*：P<0.05，**：P<0.01。
图7显示了通过流式细胞术检测的RBMRNA-Delta 1疫苗在小鼠体内诱导细胞内因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5分泌的结果。*：P<0.05，**：P<0.01。
图8显示了通过流式细胞术检测的RBMRNA-Delta 2疫苗在小鼠体内诱导细胞内因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5分泌的结果。*：P<0.05，**：P<0.01。
图9显示了通过流式细胞术检测的RBMRNA-Delta 3疫苗在小鼠体内诱导细胞内因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5分泌的结果。*：P<0.05，**：P<0.01。
图10显示了通过流式细胞术检测的RBMRNA-Delta 1疫苗在小鼠体内诱导免疫应答的T细胞亚群结果图。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。
图11显示了通过流式细胞术检测的RBMRNA-Delta 2疫苗在小鼠体内诱导免疫应答的T细胞亚群结果图。*：P<0.05，**：P<0.01。
图12显示了通过流式细胞术检测的RBMRNA-Delta 3疫苗在小鼠体内诱导免疫应答的T细胞亚群结果图。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。
图13显示了接种RBMRNA-Delta 1疫苗后小鼠血清中IgG抗体水平的结果。
图14显示了接种RBMRNA-Delta 2疫苗后小鼠血清中IgG抗体水平的结果。
图15显示了接种RBMRNA-Delta 3疫苗后小鼠血清中IgG抗体水平的结果。
图16显示了接种RBMRNA-Delta 1疫苗后小鼠血清对野生型假病毒和德尔塔型假病毒的中和效果。
图17显示了接种RBMRNA-Delta 3疫苗后小鼠血清对野生型假病毒和德尔塔型假病毒的中和效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通过按照本领域的常规条件，例如，Sambrook和Russeii等人，分子克隆：实验室手册（第三版）（2001），CSHL出版社中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另有说明，否则以下实施例中所用的实验材料和试剂均可商购获得。
实施例1. mRNA的制备
在野生型SARS-CoV-2 S蛋白的基础上经过以下突变得到重组S蛋白（SEQ ID NO.3）：T19R、G142D、E156G、A222V、L452R、T477K、D614G、P681R、D950N及157-158位的SE缺失突变；682-685位（S1/S2切割位点）RRAR突变为GGSG；814-815位（S2切割位点）KR突变为AN；986-987位的KV序列突变为两个脯氨酸PP。
以该重组S蛋白的序列为基础，设计DNA编码序列（SEQ ID NO. 11）。在DNA编码序列的基础上增加例如5’-UTR、3’-UTR、polyA序列后，通过同源重组插入至pT7TS质粒中进行构建，形成重组载体pT7TS-2.0，获得最终的重组质粒命名为RBMRNA-Delta质粒。
RBMRNA-Delta质粒包含的元件包括起始序列（SEQ ID NO. 6），T7启动子序列(SEQID NO. 7)，5’-UTR序列(SEQ ID NO. 8)，3’-UTR序列(SEQ ID NO. 10)，3’端聚腺苷酸(polyA)序列，氨苄青霉素抗性基因启动子、硫酸卡那霉素抗性基因。通过这些非编码结构来调节RBMRNA-Delta质粒经转录得到的mRNA的稳定性、翻译效率和免疫原性。
对RBMRNA-Delta质粒的编码区及polyA区域进行测序，插入的目的基因测序与参考序列完全一致，构建成功的整个质粒结构如图1所示。 RBMRNA-Delta质粒经体外转录后得到mRNA（命名为RBMRNA-Delta mRNA），mRNA经翻译得到蛋白质（命名为RBMRNA-Delta蛋白质）。
通过重组质粒转录得到mRNA的序列如SEQ ID NO. 14所示。用Agilent 2200Tapestation电泳系统对转录得到的mRNA大小及完整性进行分析。结果如图2所示，转录mRNA条带单一，无降解。
使用上述方法还得到了如SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示的mRNA，其DNA编码序列分别如SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 13所示，编码的重组S蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 4所示。得到的重组S蛋白相对于野生型S蛋白包含以下突变：
（1）T19R、G142D、E156G、A222V、L452R、T477K、D614G、P681R、D950N及157-158位的SE缺失突变；682-685位（S1/S2切割位点）RRAR突变为GGSG；814-815位（S2切割位点）KR突变为AN；去除跨膜结构域和胞浆区域；去除融合肽结构域；将T4噬菌体fibritin基序连接至胞外结构域的C端；将信号肽序列替换成免疫球蛋白重链可变区(IGVH)信号序列（SEQ ID NO.4）；
（2）在上述（1）的基础上将986-987位的KV序列突变为两个脯氨酸PP（SEQ ID NO.5）。
实施例2. mRNA的表达验证
使用2.5μg实施例1中得到的RBMRNA-Delta mRNA（SEQ ID NO. 14）转染293T细胞，转染试剂为Lipofectamine MessagerMAX(ThermoFisher Scientific)，未转染mRNA的细胞作为阴性对照。转染24小时后，通过蛋白免疫印迹检测预融合德尔塔型SARS-CoV-2 S蛋白的表达，其中用兔抗SARS-CoV-2 S蛋白抗体（GeneTex，GTX632604）进行免疫印迹，使用羊抗兔-HRP二抗进行标记。结果如图3所示，成功在180 kDa处检测到大小与预期一致的预融合S蛋白的表达。
实施例3. mRNA疫苗诱导的Th1或Th2免疫应答
使用实施例1中的3种mRNA序列（SEQ ID No. 14-16）分别制备mRNA疫苗，分别称为RBMRNA-Delta 1疫苗、RBMRNA-Delta 2疫苗和RBMRNA- Delta 3疫苗。使用包括以下组分的脂质纳米颗粒包封mRNA：8-(3-羟基丙基)（9,12-二烯基-十八烷基-1）-胺基-辛酸十七烷-9-醇酯、二硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000（DMG-PEG2000）和胆固醇。制备方法包括将上述组分溶解在乙醇溶液中，通过微流控混合器将所述脂质乙醇溶液与mRNA水溶液混合得到脂质纳米颗粒，以及对混合物进行透析、超滤和微米膜过滤从而获得mRNA的LNP疫苗制剂。具体的疫苗制备方法参见例如中国专利申请号202011369776.2，其通过引用整体并入本文。
将得到的3种mRNA疫苗用于BALB/c小鼠免疫试验。免疫小鼠采用6-8周龄的雌性SPF级别健康BALB/c小鼠。实验根据小鼠体重均衡随机分为溶剂对照组（PBS），疫苗低剂量组（1μg/只），疫苗中剂量组（5μg/只）和疫苗高剂量组（20μg/只），每组12只。分组后按照设定剂量通过肌肉注射分别于第0天和第14天接种2次疫苗制剂以进行初次和加强免疫，溶剂对照组给予等体积的PBS。
在加强免疫7天后，取小鼠脾脏分离脾脏淋巴细胞，通过ELISPOT法检测分泌IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的T淋巴细胞。RBMRNA-Delta 1疫苗、RBMRNA-Delta 2疫苗和RBMRNA-Delta 3疫苗的结果分别如图4-6所示。结果显示，在接种低、中、高剂量的3种疫苗后，分泌Th1型细胞因子INFγ、IL2的T淋巴细胞显著多于分泌Th2型细胞因子IL4、IL5的T淋巴细胞。
在加强免疫9天后，使用抗IFN-γ抗体(Biolegend，货号505808)、抗IL-2抗体(Biolegend，货号503808)、抗IL-4抗体(Biolegend，货号504104)和抗IL-5抗体(Biolegend，货号504304)，通过流式细胞术分别检测细胞内因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5的水平，以进一步评估mRNA疫苗诱导的Th1或Th2免疫反应。RBMRNA-Delta 1疫苗、RBMRNA-Delta 2疫苗和RBMRNA-Delta 3疫苗的结果分别如图7-9所示。结果显示，3种疫苗均导致CD4+T细胞内Th1型细胞因子IL4、IL5的IFN-γ和IL-2的水平呈剂量依赖性增加，而CD8+T细胞内因子的水平无明显变化。
这些结果表明3种疫苗诱导的免疫反应为Th1型偏倚的免疫反应。
实施例4. T细胞亚群检测
采用与实施例3中相同的实验方法将3种mRNA疫苗用于BALB/c小鼠免疫试验，每组取3只小鼠的脾脏进行实验。在加强免疫9天后，通过流式细胞术检测T细胞亚群，以评价3种疫苗诱导的T淋巴细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、效应记忆T（Tem）细胞的免疫应答水平。RBMRNA-Delta 1疫苗、RBMRNA-Delta 2疫苗和RBMRNA-Delta 3疫苗的结果分别如图10-12所示。
结果表明，3种疫苗均可诱导机体产生CD4+ T细胞和CD8+ T细胞介导的细胞免疫应答，并且能产生特异性效应记忆T细胞，使机体获得免疫记忆保护。
实施例5. mRNA疫苗诱导产生的IgG抗体效价的评估
采用与实施例3中类似的实验方法将3种mRNA疫苗用于BALB/c小鼠免疫试验，每组取6只小鼠的血清进行实验。在加强免疫后14天，通过间接ELISA法检测小鼠血清中的特异性IgG抗体水平。RBMRNA-Delta 1疫苗、RBMRNA-Delta 2疫苗和RBMRNA-Delta 3疫苗的结果分别如图13-15所示。
IgG抗体水平检测结果表明，3种疫苗在低、中、高剂量下，均能够在小鼠体内诱导产生高滴度的IgG抗体。
实施例6. mRNA疫苗诱导产生的中和抗体的评估
采用与实施例3中类似的实验方法将3种mRNA疫苗用于BALB/c小鼠免疫试验，每组取6只小鼠的血清进行实验。疫苗组仅采用高剂量（20μg/只）。分别在初次免疫后14天和加强免疫后14天采集小鼠血清，通过假病毒中和试验进行S蛋白特异性中和抗体检测。具体操作如下：
将血清水浴灭活后离心，收集上清液。用不含血清的DMEM培养基对灭活的血清进行稀释。向96孔板中加入稀释的血清和假病毒，在37℃下共孵育1小时。孵育结束后，向96孔板中加入293T-ACE2-p2A-mTagBFP2细胞(该细胞是通过CRISPR技术向293T细胞定点敲入ACE2-p2A-mTagBFP2而获得)。在37℃、5%CO2下培养48小时。培养结束后，洗掉培养基，然后加入PBS和萤火虫萤光素酶底物，避光震荡后通过多功能酶标仪检测Luciferase化学发光值。采用Reed-muench法计算中和效价。
RBMRNA-Delta 1疫苗和RBMRNA-Delta 3疫苗诱导产生的抗体的中和效果分别如图16和17所示。
结果表明，经2种疫苗免疫的小鼠血清均可在初次免疫后14天基本上完全中和德尔塔型假病毒，并在加强免疫后14天基本上完全中和野生型假病毒。对于RBMRNA-Delta 1疫苗，经免疫的小鼠血清在初次免疫后14天，对野生型和德尔塔型假病毒的中和效价分别为282和966；在加强免疫后14天，对野生型和德尔塔型假病毒的中和效价分别为4007和6903（图16）。对于RBMRNA-Delta 3疫苗，经免疫的小鼠血清在初次免疫后14天，对野生型和德尔塔型假病毒的中和效价分别为271和874；在加强免疫后14天，对野生型和德尔塔型假病毒的中和效价分别为4232和4624（图17）。
本申请参考了各种发行的专利、公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，将所有这些引入本申请作为参考。若任何引入的参考文献和本说明书有冲突，则以本说明书为准。此外，落入现有技术范围的本发明的任何具体实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。因为所述实施方案被认为是本领域技术人员已知的，它们可以被排除，即使所述排除没有在本申请中明确列出。本发明的任何具体实施方案可从任何权利要求中以任何理由排除，不管是否与现有技术的存在有关。
虽然已经参考其特定实施方案描述本发明，本领域的技术人员应当理解可以进行各种改变且可以替换等同物而不脱离本发明的真正的精神和范围。另外，可作出许多修改以使特定的情况，材料，组合物，方法，方法步骤适于本发明的目的，精神和范围。所有这些修改都旨在权利要求的范围内。
序列表
<110> 广州市锐博生物科技有限公司
<120> 基于SARS-CoV-2的S蛋白的疫苗和组合物
<130> C21P0739
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
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885 890 895
Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
900 905 910
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala
915 920 925
Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly
930 935 940
Lys Leu Gln Asn Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu
945 950 955 960
Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
965 970 975
Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp
980 985 990
Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln
995 1000 1005
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala
1010 1015 1020
Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser
1040 1045 1050
Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala
1055 1060 1065
Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
1070 1075 1080
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr
1085 1090 1095
His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile
1100 1105 1110
Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile
1115 1120 1125
Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu
1130 1135 1140
Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr
1145 1150 1155
Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser
1160 1165 1170
Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala
1175 1180 1185
Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys
1190 1195 1200
Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe
1205 1210 1215
Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys
1220 1225 1230
Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys
1235 1240 1245
Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu
1250 1255 1260
Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 4
<211> 1229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组S蛋白的氨基酸序列
<400> 4
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Cys Val Asn Leu Arg Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro
20 25 30
Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val
35 40 45
Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe
50 55 60
Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn
65 70 75 80
Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val
85 90 95
Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn
115 120 125
Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp
130 135 140
Pro Phe Leu Asp Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu
145 150 155 160
Ser Gly Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser
165 170 175
Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn
180 185 190
Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr
195 200 205
Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe
210 215 220
Ser Val Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
225 230 235 240
Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly
245 250 255
Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly
260 265 270
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr
275 280 285
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290 295 300
Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
305 310 315 320
Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
325 330 335
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
340 345 350
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
355 360 365
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
370 375 380
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
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Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
405 410 415
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435 440 445
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
450 455 460
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
465 470 475 480
Ser Lys Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
485 490 495
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
500 505 510
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
515 520 525
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
530 535 540
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
545 550 555 560
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
565 570 575
Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
580 585 590
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
595 600 605
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val
610 615 620
Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr
625 630 635 640
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly
645 650 655
Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala
660 665 670
Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Gly Gly Ser
675 680 685
Gly Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly
690 695 700
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705 710 715 720
Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr
725 730 735
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740 745 750
Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn
755 760 765
Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu
770 775 780
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785 790 795 800
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805 810 815
Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg
820 825 830
Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro
835 840 845
Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala
850 855 860
Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln
865 870 875 880
Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val
885 890 895
Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe
900 905 910
Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser
915 920 925
Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asn Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu
930 935 940
Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser
945 950 955 960
Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val
965 970 975
Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr
980 985 990
Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
995 1000 1005
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1070 1075 1080
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1085 1090 1095
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
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1175 1180 1185
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1190 1195 1200
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1205 1210 1215
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1220 1225
<210> 5
<211> 1230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组S蛋白的氨基酸序列
<400> 5
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser Gln Cys Val Asn Leu Arg Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro
20 25 30
Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val
35 40 45
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50 55 60
Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn
65 70 75 80
Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val
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100 105 110
Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn
115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Val Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
225 230 235 240
Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly
245 250 255
Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly
260 265 270
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr
275 280 285
Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys
290 295 300
Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
305 310 315 320
Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
325 330 335
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
340 345 350
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
355 360 365
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
370 375 380
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
385 390 395 400
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
405 410 415
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
420 425 430
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
435 440 445
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
450 455 460
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
465 470 475 480
Ser Lys Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
545 550 555 560
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
565 570 575
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580 585 590
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
595 600 605
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val
610 615 620
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
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755 760 765
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820 825 830
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835 840 845
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Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala
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1010 1015 1020
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1040 1045 1050
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Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys
1130 1135 1140
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1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu
1175 1180 1185
Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Ser Ala Ile Gly
1190 1195 1200
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg
1205 1210 1215
Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
1220 1225 1230
<210> 6
<211> 802
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 质粒复制起始序列
<400> 6
agtactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg 60
tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact 120
gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg 180
taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc 240
aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata 300
ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta 360
catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc 420
ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg 480
ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac 540
agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg 600
taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt 660
atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct 720
cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggtccctgg 780
ccttttgctg gccttttgct ca 802
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7启动子
<400> 7
taatacgact cactataatg 20
<210> 8
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'-UTR
<400> 8
gtcccgcagt cggcgtccag cggctctgct tgttcgtgtg tgtgtcgttg caggccttat 60
tc 62
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> kozak序列
<400> 9
agatctaccg gtggtaccgc cacc 24
<210> 10
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'-UTR
<400> 10
agccaacacc ctgtctaaaa aacataaatt tctttaatca ttttgcctct tttctctgtg 60
cttcaattaa taaaaaatgg aaagaacct 89
<210> 11
<211> 3816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RBMRNA-Delta 1疫苗的DNA序列
<400> 11
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgagcagcc agtgcgtgaa tctgagaacc 60
agaacccagc tgcctcctgc ctacaccaat agcttcacca gaggagttta ttatcccgat 120
aaggtgttca gaagtagtgt attacatagt acccaggacc tgttcctacc tttcttcagt 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca atggcaccaa gagattcgac 240
aatcctgtgc tgcctttcaa tgacggcgtg tacttcgcca gcaccgagaa gagcaatatc 300
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gctaataatt gcaccttcga gtacgtgagc cagcctttcc tgatggacct ggagggcaag 540
cagggcaatt tcaagaatct gagagagttc gtgttcaaga atatcgacgg ctacttcaag 600
atctacagca agcacacacc cattaatctg gtgagagacc tgcctcaggg cttcagcgtc 660
ctggagcctc tggtggacct gcctatcggc atcaatatca ccagattcca gaccctgctg 720
gccctgcaca gatcatatct tacaccaggc gattcgtcaa gcggttggac cgctggagct 780
gcggcatatt acgtgggcta cctgcagcct agaaccttcc tgctgaagta caatgagaat 840
ggtacgataa ccgacgcagt tgattgtgcc ctggaccctc tgagcgagac caagtgcacc 900
ctgaagagct tcaccgtgga gaagggcatc taccagacca gcaatttcag agtgcagcct 960
accgagagca tcgtgagatt ccctaatatc accaatctgt gccctttcgg cgaggtgttc 1020
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gccgactaca gcgtgctgta caatagcgcc agcttcagca ccttcaaatg ttatggtgtt 1140
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agaggcgacg aggtgagaca gatcgcgcca gggcagaccg gcaagatcgc cgactacaat 1260
tacaagctgc ctgacgactt caccggctgc gtgatcgcgt ggaactctaa caacctggac 1320
tcgaaagttg gaggcaatta caattaccgc tacagactgt tcagaaagag caatctgaag 1380
cctttcgaga gagacatcag caccgagatc taccaggccg gcagcaagcc gtgtaatggc 1440
gtggagggct tcaattgcta cttccctctg cagagctacg gcttccagcc taccaatggc 1500
gtgggctacc agccttacag agtggtggtg ctgagcttcg agctgctgca cgctcccgct 1560
accgtgtgcg gccctaagaa gagcaccaat ctggtgaaga ataagtgcgt gaatttcaat 1620
ttcaatggtc taactggaac gggcgtgctg accgagagca ataagaagtt tcttcccttt 1680
caacaattcg gcagagacat cgccgacacc acagatgctg taagagaccc tcagaccctg 1740
gagatcctgg acatcactcc gtgtagcttc ggcggcgtga gcgtgatcac accgggcacc 1800
aataccagca atcaggtggc cgtgctgtac cagggcgtga attgcaccga ggtgcctgtg 1860
gccatccacg ccgaccagct gactcccact tggagggtat attccacggg aagcaatgtg 1920
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<213> 人工序列
<220>
<223> RBMRNA-Delta 2疫苗的DNA序列
<400> 12
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<220>
<223> RBMRNA-Delta 3疫苗的DNA序列
<400> 13
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<211> 4130
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RBMRNA-Delta 1疫苗的mRNA序列
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augagacaag cuugucccgc agucggcguc cagcggcucu gcuuguucgu gugugugucg 60
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ucgggaauca augccagcgu ggugaauauc cagaaggaaa uugaucggcu caacgaagug 3660
gccaagaauc ugaaugagag ccugaucgac cugcaggagc ugggcaagua cgagcaguac 3720
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cugcacuaca ccuaacucga gacuaguagc caacacccug ucuaaaaaac auaaauuucu 3960
uuaaucauuu ugccucuuuu cucugugcuu caauuaauaa aaaauggaaa gaaccuaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4130
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<213> 人工序列
<220>
<223> RBMRNA-Delta 2疫苗的mRNA序列
<400> 15
augagacaag cuugucccgc agucggcguc cagcggcucu gcuuguucgu gugugugucg 60
uugcaggccu uauucagauc uaccgguggu accgccacca uggacuggau cuggagaauc 120
cuguuccugg ugggggcugc cacuggcgcc cauagccagu gcgugaaucu gagaaccaga 180
acccagcugc cuccugccua caccaauagc uucaccagag gaguuuauua ucccgauaag 240
guguucagaa guaguguauu acauaguacc caggaccugu uccuaccuuu cuucaguaac 300
gugaccuggu uccacgccau ccacgugagc ggcaccaaug gcaccaagag auucgacaau 360
ccugugcugc cuuucaauga cggcguguac uucgccagca ccgagaagag caauaucauc 420
agaggcugga ucuucggcac caccuuggau uccaagacuc agagccugcu gauuguaaac 480
aacgcuacaa auguggugau caaggugugc gaguuccagu ucugcaauga cccuuuccug 540
gacguuuauu aucauaagaa caacaagagc uggauggaga gcggaguaua uucgucggcu 600
aauaauugca ccuucgagua cgugagccag ccuuuccuga uggaccugga gggcaagcag 660
ggcaauuuca agaaucugag agaguucgug uucaagaaua ucgacggcua cuucaagauc 720
uacagcaagc acacacccau uaaucuggug agagaccugc cucagggcuu cagcguccug 780
gagccucugg uggaccugcc uaucggcauc aauaucacca gauuccagac ccugcuggcc 840
cugcacagau cauaucuuac accaggcgau ucgucaagcg guuggaccgc uggagcugcg 900
gcauauuacg ugggcuaccu gcagccuaga accuuccugc ugaaguacaa ugagaauggu 960
acgauaaccg acgcaguuga uugugcccug gacccucuga gcgagaccaa gugcacccug 1020
aagagcuuca ccguggagaa gggcaucuac cagaccagca auuucagagu gcagccuacc 1080
gagagcaucg ugagauuccc uaauaucacc aaucugugcc cuuucggcga gguguucaau 1140
gccaccagau ucgccagcgu guacgcaugg aaccgcaagc ggauaagcaa uugcguggcc 1200
gacuacagcg ugcuguacaa uagcgccagc uucagcaccu ucaaauguua ugguguuucg 1260
ccaacaaagc ugaaugaccu gugcuucacc aauguguacg ccgacagcuu cgugaucaga 1320
ggcgacgagg ugagacagau cgcgccaggg cagaccggca agaucgccga cuacaauuac 1380
aagcugccug acgacuucac cggcugcgug aucgcgugga acucuaacaa ccuggacucg 1440
aaaguuggag gcaauuacaa uuaccgcuac agacuguuca gaaagagcaa ucugaagccu 1500
uucgagagag acaucagcac cgagaucuac caggccggca gcaagccgug uaauggcgug 1560
gagggcuuca auugcuacuu cccucugcag agcuacggcu uccagccuac caauggcgug 1620
ggcuaccagc cuuacagagu gguggugcug agcuucgagc ugcugcacgc ucccgcuacc 1680
gugugcggcc cuaagaagag caccaaucug gugaagaaua agugcgugaa uuucaauuuc 1740
aauggucuaa cuggaacggg cgugcugacc gagagcaaua agaaguuucu ucccuuucaa 1800
caauucggca gagacaucgc cgacaccaca gaugcuguaa gagacccuca gacccuggag 1860
auccuggaca ucacuccgug uagcuucggc ggcgugagcg ugaucacacc gggcaccaau 1920
accagcaauc agguggccgu gcuguaccag ggcgugaauu gcaccgaggu gccuguggcc 1980
auccacgccg accagcugac ucccacuugg aggguauauu ccacgggaag caauguguuc 2040
cagaccagag ccggcugccu gaucggcgcc gagcacguga auaauagcua cgagugcgac 2100
aucccuaucg gcgccggcau cugcgccagc uaccagaccc agaccaauag cccucggggc 2160
agcggcagcg uggccagcca gagcaucauc gccuacacca ugagccuggg cgccgagaau 2220
agcguggccu acagcaauaa uagcaucgcc aucccuacca auuucaccau cagcgugacc 2280
accgaaauau uaccagucuc caugaccaag accagcgugg acugcaccau guacaucugc 2340
ggcgacagca ccgagugcag caaucugcug cugcaguacg gcagcuucug cacccagcug 2400
aauagagccc ugaccggcau cgccguggag caggacaaga auacccagga gguguucgcc 2460
caggugaagc agccagaucc aagcaagccu agcgccaaca gcuucaucga ggaccugcug 2520
uucaauaagg ugacccuggc cgacgccggc uucaucaagc aguacggcga cugccuaggu 2580
gauauugcgg caagagaccu gaucugcgcc cagaaguuua acgguuugac aguacuaccu 2640
ccucugcuga ccgacgagau gauagcacaa uauacgucgg cauugcucgc uggcacgauc 2700
acaucgggcu ggacuuucgg cgccggagca gcguugcaaa ucccuuucgc caugcagaug 2760
gccuacagau ucaauggcau cggcgugacc cagaaugugc uguacgagaa ucagaagcug 2820
aucgccaauc aguucaauag cgccaucggc aagauccagg acagccugag cagcaccgcc 2880
agcgcccugg gcaagcugca gaacguggug aaucagaaug cccaggcccu gaauacccug 2940
gugaagcagc ugagcagcaa uuucggcgcc aucaguagug uacucaacga cauccugagc 3000
agacuggacc cgccggaggc cgaggugcaa auugaucguc uuauuacugg cagacugcag 3060
agccugcaga ccuacgugac ccagcagcug aucagagccg ccgagaucag agccagcgcc 3120
aaucuggccg ccaccaagau gagcgagugc gugcugggcc agagcaagag aguggacuuc 3180
ugcggcaagg gcuaccaccu gaugagcuuc ccucagagcg cuccacaugg cgugguguuc 3240
cugcacguga ccuacgugcc ugcccaggag aagaauuuca ccaccgcacc cgcaaucugc 3300
cacgacggca aggcccacuu cccuagagag ggcguguucg ugagcaaugg cacccacugg 3360
uucgugaccc agagaaauuu cuacgagccu cagaucauca ccaccgacaa uaccuucgug 3420
agcggcaauu gcgacguggu gaucgggaua gucaauaaua cugucuacga cccucugcag 3480
ccugagcugg acagcuucaa ggaggagcug gacaaguacu ucaagaauca caccagcccu 3540
gacguggacc ucggugauau uucgggaauc aaugccagcg uggugaauau ccagaaggaa 3600
auugaucggc ucaacgaagu ggccaagaau cugaaugaga gccugaucga ccugcaggag 3660
cugggcaagu acgagcagua caucaagugg ccuagcgcca ucggcggcua cauccccgag 3720
gcccccaggg acggccaggc cuacgugagg aaggacggcg agugggugcu gcugagcacc 3780
uuccugugac ucgagacuag uagccaacac ccugucuaaa aaacauaaau uucuuuaauc 3840
auuuugccuc uuuucucugu gcuucaauua auaaaaaaug gaaagaaccu aaaaaaaaaa 3900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 4004
<210> 16
<211> 4130
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RBMRNA-Delta 3疫苗的mRNA序列
<400> 16
augagacaag cuugucccgc agucggcguc cagcggcucu gcuuguucgu gugugugucg 60
uugcaggccu uauucagauc uaccgguggu accgccacca uguucguguu ccuggugcug 120
cugccccugg ugagcagcca gugcgugaac cugagaaccc ggacccagcu gccaccagcc 180
uacaccaaca gcuucacccg gggcgucuac uaccccgaca agguguuccg gagcagcguc 240
cugcacagca cccaggaccu guuccugccc uucuucagca acgugaccug guuccacgcc 300
auccacguga gcggcaccaa cggcaccaag cgguucgaca accccgugcu gcccuucaac 360
gacggcgugu acuucgccag caccgagaag agcaacauca uccggggcug gaucuucggc 420
accacccugg acagcaagac ccagagccug cugaucguga auaacgccac caacguggug 480
aucaaggugu gcgaguucca guucugcaac gaccccuucc uggacgugua cuaccacaag 540
aacaacaaga gcuggaugga gagcggagug uacagcagcg ccaacaacug caccuucgag 600
uacgugagcc agcccuuccu gauggaccug gagggcaagc agggcaacuu caagaaccug 660
cgggaguucg uguucaagaa caucgacggc uacuucaaga ucuacagcaa gcacacccca 720
aucaaccugg ugcgggaucu gccccagggc uucucagucc uggagccccu gguggaccug 780
cccaucggca ucaacaucac ccgguuccag acccugcugg cccugcaccg gagcuaccug 840
accccaggcg acagcagcag cggguggaca gcaggcgcgg cugcuuacua cgugggcuac 900
cugcagcccc ggaccuuccu gcugaaguac aacgagaacg gcaccaucac cgacgccgug 960
gacugcgccc uggacccucu gagcgagacc aagugcaccc ugaagagcuu caccguggag 1020
aagggcaucu accagaccag caacuuccgg gugcagccca ccgagagcau cgugcgguuc 1080
cccaacauca ccaaccugug ccccuucggc gagguguuca acgccacccg guucgccagc 1140
guguacgccu ggaaccggaa gcggaucagc aacugcgugg ccgacuacag cgugcuguac 1200
aacagcgcca gcuucagcac cuucaagugc uacggcguga gccccaccaa gcugaacgac 1260
cugugcuuca ccaacgugua cgccgacagc uucgugaucc guggcgacga ggugcggcag 1320
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accggcugcg ugaucgccug gaacagcaac aaccucgaca gcaagguggg cggcaacuac 1440
aacuaccgcu accggcuguu ccggaagagc aaccugaagc ccuucgagcg ggacaucagc 1500
accgagaucu accaagccgg cuccaagccu ugcaacggcg uggagggcuu caacugcuac 1560
uucccucugc agagcuacgg cuuccagccc accaacggcg ugggcuacca gcccuaccgg 1620
gugguggugc ugagcuucga gcugcugcac gccccagcca ccgugugugg ccccaagaag 1680
agcaccaacc uggugaagaa caagugcgug aacuucaacu ucaacggccu uaccggcacc 1740
ggcgugcuga ccgagagcaa caagaaauuc cugcccuuuc agcaguucgg ccgggacauc 1800
gccgacacca ccgacgcugu gcgggauccc cagacccugg agauccugga caucaccccu 1860
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agcaugacca agaccagcgu ggacugcacc auguacaucu gcggcgacag caccgagugc 2340
agcaaccugc ugcugcagua cggcagcuuc ugcacccagc ugaaccgggc ccugaccggc 2400
aucgccgugg agcaggacaa gaacacccag gagguguucg cccaggugaa gcagaucuac 2460
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agcaagccca gcgccaacag cuucaucgag gaccugcugu ucaacaaggu gacccuagcc 2580
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aucugcgccc agaaguucaa cggccugacc gugcugccuc cccugcugac cgacgagaug 2700
aucgcccagu acaccagcgc ccuguuagcc ggaaccauca ccagcggcug gacuuucggc 2760
gcuggagccg cucugcagau ccccuucgcc augcagaugg ccuaccgguu caacggcauc 2820
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gaggugcaga ucgaccggcu gaucacuggc cggcugcaga gccugcagac cuacgugacc 3120
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augagcuuuc cccagagcgc accccacgga gugguguucc ugcacgugac cuacgugccc 3300
gcccaggaga agaacuucac caccgcccca gccaucugcc acgacggcaa ggcccacuuu 3360
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gaggagcugg acaaguacuu caagaaucac accagccccg acguggaccu gggcgacauc 3600
agcggcauca acgccagcgu ggugaacauc cagaaggaga ucgaucggcu gaacgaggug 3660
gccaagaacc ugaacgagag ccugaucgac cugcaggagc ugggcaagua cgagcaguac 3720
aucaaguggc ccugguacau cuggcugggc uucaucgccg gccugaucgc caucgugaug 3780
gugaccauca ugcugugcug caugaccagc ugcugcagcu gccugaaggg cuguugcagc 3840
ugcggcagcu gcugcaaguu cgacgaggac gacagcgagc ccgugcugaa gggcgugaag 3900
cugcacuaca ccugacucga gacuaguagc caacacccug ucuaaaaaac auaaauuucu 3960
uuaaucauuu ugccucuuuu cucugugcuu caauuaauaa aaaauggaaa gaaccuaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4130
<210> 17
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 17
Met Asp Trp Ile Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Gly Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 18
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 三聚体结构域的氨基酸序列
<400> 18
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 19
Ser Ala Ile Gly
1

Claims (21)

1.重组SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3-5中任一项所示。
2.mRNA，所述mRNA编码权利要求1所述的S蛋白。
3.根据权利要求2所述的mRNA，其从5’到3’方向包含帽结构、5’-UTR、开放阅读框(ORF)、3’-UTR和polyA尾。
4.根据权利要求3所述的mRNA，其中所述5’-UTR包含17β-羟基类固醇脱氢酶4(HSD17B4)基因的5’-UTR，和/或KOZAK序列；其中所述3’-UTR包含白蛋白(ALB)基因的3’-UTR；和/或其中所述polyA尾的长度为100-150个核苷酸。
5.根据权利要求4所述的mRNA，其中所述5’-UTR包含如SEQ ID NO. 8和/或SEQ ID NO.9所示的序列；和/或其中所述3’-UTR包含如SEQ ID NO. 10所示的序列。
6.根据权利要求2所述的mRNA，其中所述mRNA的序列如SEQ ID NO. 14-16中任一项所示。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的mRNA，其中所述mRNA中的一个或多个尿苷三磷酸各自独立替换为假尿苷三磷酸、2-硫尿苷三磷酸、5-甲基尿苷三磷酸、N1-甲基假尿苷三磷酸或5-乙炔基尿苷三磷酸，和/或一个或多个胞苷三磷酸替换为5-甲基胞苷三磷酸，和/或一个或多个腺苷三磷酸替换为N6-甲基腺苷三磷酸。
8.根据权利要求7所述的mRNA，其中所述mRNA中的一个或多个尿苷三磷酸各自独立替换为假尿苷三磷酸、1-甲基-假尿苷三磷酸或5-乙炔基尿苷三磷酸，和/或一个或多个胞苷三磷酸替换为5-甲基胞苷三磷酸。
9.DNA，其编码权利要求2-6中任一项所述的mRNA。
10.根据权利要求9所述的DNA，其中所述DNA的序列如SEQ ID NO. 11-13中任一项所示。
11.重组质粒，其包含权利要求9或10所述的DNA。
12.根据权利要求11所述的重组质粒，其中所述质粒为pT7TS质粒。
13.根据权利要求12所述的重组质粒，其还包含起始序列(Ori)、T7启动子、5’-UTR和3’-UTR。
14.根据权利要求13所述的重组质粒，其中所述起始序列为ColE1型起始序列；其中所述T7启动子的序列如SEQ ID NO. 7所示；其中所述5’-UTR包含HSD17B4的5’-UTR，和/或KOZAK序列；和/或其中所述3’-UTR包含ALB的3’-UTR。
15.根据权利要求14所述的重组质粒，其中所述起始序列为SEQ ID NO. 6所示的起始序列；其中所述5’-UTR包含如SEQ ID NO. 8和/或SEQ ID NO. 9所示的序列；和/或其中所述3’-UTR包含如SEQ ID NO. 10所示的序列。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的重组质粒，其中所述重组质粒还包含polyA、抗性基因启动子和抗性基因。
17.根据权利要求16所述的重组质粒，其中所述polyA的长度为100-150个核苷酸；所述抗性基因启动子为氨苄青霉素抗性基因启动子；和/或所述抗性基因为硫酸卡那霉素抗性基因。
18.mRNA-载体颗粒，其包含权利要求2-8中任一项的mRNA和包封所述mRNA的载体材料。
19.组合物，其包含权利要求1所述的S蛋白、权利要求2-8中任一项所述的mRNA、权利要求11-17中任一项所述的重组质粒、或权利要求18所述的mRNA-载体颗粒。
20.权利要求1所述的S蛋白、权利要求2-8中任一项所述的mRNA、权利要求11-17中任一项所述的重组质粒、权利要求18所述的mRNA-载体颗粒、或权利要求19所述的组合物在制备用于在受试者中预防和/或治疗与SARS-CoV-2感染相关的疾病或病症的药物中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述疾病或病症为SARS-CoV-2 Delta变异株感染引起的疾病或病症。
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