JP2023530434A - コロナウイルスワクチン組成物、方法、及びその使用 - Google Patents

コロナウイルスワクチン組成物、方法、及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、いくつかの態様において、コロナウイルスウイルス抗原及び免疫原、例えばコロナウイルスＳタンパク質ペプチドを含む組換えペプチド及びタンパク質などの免疫原性組成物に関する。いくつかの態様では、免疫原性組成物は、自己三量体化してジスルフィド結合により連結された三量体融合タンパク質を形成することができるコラーゲンのＣ末端部分に、インフレーム融合によって結合された可溶性コロナウイルスウイルス抗原を含む、分泌された融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、本明細書において提供される免疫原性組成物は、免疫応答を生じさせるために、例えば、コロナウイルス感染症を治療または予防するために有用である。いくつかの態様では、本明細書において提供される免疫原性組成物は、ワクチン組成物において、例えば、予防用及び／または治療用ワクチンの一部として使用され得る。また、組換えペプチド及びタンパク質を産生するための方法、予防、治療、及び／または診断方法、ならびに関連キットも本明細書で提供される。

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０２０年６月１０日に出願のＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０９５２６９、２０２１年４月１３日に出願のＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８７０６６、及び２０２１年５月１４日に出願のＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０９３８９５の優先権及び利益を主張し、これらの出願の開示は、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルとしての配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルに関する提出物：コンピューター可読形式の配列表（ＣＲＦ）（ファイル名：１６５７６２０００１４３ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年６月９日、サイズ：５７５ＫＢ）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、いくつかの態様において、コロナウイルス感染症を治療及び／または予防するための、コロナウイルスウイルス抗原及び免疫原、例えばコロナウイルスＳタンパク質ペプチドを含む組換えペプチド及びタンパク質などの免疫原性組成物に関する。
コロナウイルスは、ヒトなど、広範囲の鳥類及び哺乳動物に感染する。コロナウイルスは、毎年ヒトにおいて循環し得、一般に軽度の呼吸器疾患を引き起こすが、乳児、高齢者、及び免疫不全の場合には、重症度が高くなり得る。しかし、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）などの特定のコロナウイルスは、病原性が高い。コロナウイルスに対する高い病原性、空気感染性、高い致死率、及びあいまいに定義された疫学により、効果的なワクチン及び関連する治療剤が緊急に必要となっている。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して効果的な免疫応答を迅速に誘導できるワクチンが緊急に必要とされている。
そのような必要性及び他の必要性を満たす方法、使用、及び製造品が提供される。
いくつかの実施形態では、複数の組換えポリペプチドを含むタンパク質が本明細書に開示され、各組換えポリペプチドは、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結されたコロナウイルスの表面抗原を含み、組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ジスルフィド結合により連結されたホモ三量体を形成できるコラーゲンのＣ－プロペプチドにインフレームで融合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルス由来のＳタンパク質またはその断片の外部ドメイン（例えば、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含まない）を含む組換えサブユニットワクチンである。得られたＳ－三量体などの組換えサブユニットワクチンは、トランスフェクトされた細胞から発現し、精製することができ、三量体の形態でネイティブ様コンフォメーションであると予測される。これにより、ウイルス抗原が膜貫通及び／または細胞質ドメインを含まない可溶形態の組換えペプチドまたはタンパク質として発現される場合に多くの場合遭遇する、ウイルス抗原のミスフォールディングの問題が解決される。このようなミスフォールディングウイルス抗原は、ネイティブウイルス抗原のコンフォメーションを忠実に保持しないので、多くの場合、中和抗体を誘起することができない。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）－コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ－様コロナウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）－コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳ様コロナウイルス、ＮＬ６３－ＣｏＶ、２２９Ｅ－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＷＩＶ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ、ＨＫＵ９－ＣｏＶ、ＰＥＤＶ－ＣｏＶ、またはＳＤＣＶである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質またはその断片もしくはエピトープを含むことができ、エピトープは、任意により線状エピトープまたはコンフォメーションエピトープであり、タンパク質は、３つの組換えポリペプチドを含む。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、シグナルペプチド、Ｓ１サブユニットペプチド、Ｓ２サブユニットペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、シグナルペプチド、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ペプチド、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）ペプチド、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタドリピート１（ＨＲ１）ペプチド、またはヘプタドリピート２（ＨＲ２）ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、Ｓタンパク質のＳ１サブユニット及びＳ２サブユニットを含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、膜貫通（ＴＭ）ドメインペプチド及び／または細胞質（ＣＰ）ドメインペプチドを含まなくてもよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、プロテアーゼ切断部位を含むことができ、プロテアーゼは、任意により、フリン、トリプシン、第Ｘａ因子、トロンビン、またはカテプシンＬである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、プロテアーゼ切断部位を含まなくてもよく、プロテアーゼは、任意にフリン、トリプシン、第Ｘａ因子、トロンビン、またはカテプシンＬであるか、または、プロテアーゼによって切断されない変異プロテアーゼ切断部位を含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、可溶性であり得るか、または脂質二重層、例えば膜またはウイルスエンベロープに直接結合しない。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、タンパク質の組換えポリペプチド間で同一であっても異なっていてもよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、表面抗原は、Ｃ末端プロペプチドに直接融合することができるか、またはグリシン－Ｘ－Ｙリピートを含むリンカーなどのリンカーを介してＣ末端プロペプチドに連結することができ、式中、Ｘ及びＹは、独立して任意のアミノ酸であり、任意によりプロリンまたはヒドロキシプロリンである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、タンパク質は、可溶性であり得るか、または脂質二重層、例えば膜またはウイルスエンベロープに直接結合しない。
前述の実施形態のいずれかにおいて、タンパク質は、対象の細胞表面受容体に結合することができ、任意により、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。
前述の実施形態のいずれかにおいて、細胞表面受容体は、アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－捕捉非インテグリン（ｇｒａｂｂｉｎｇ ｎｏｎ ｉｎｔｅｇｒｉｎ）（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、または肝臓／リンパ節－ＳＩＧＮ（Ｌ－ＳＩＧＮ）であり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、ヒトコラーゲンのものであり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、ｐｒｏα１（Ｉ）、ｐｒｏα１（ＩＩ）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）、ｐｒｏα１（Ｖ）、ｐｒｏα１（ＸＩ）、ｐｒｏα２（Ｉ）、ｐｒｏα２（Ｖ）、ｐｒｏα２（ＸＩ）、もしくはｐｒｏα３（ＸＩ）のＣ末端プロペプチド、またはそれらの断片を含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、組換えポリペプチド間で同一であっても異なっていてもよい。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６７～８０のいずれか、または、配列番号６７～８０のいずれかに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６７または配列番号６７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６８または配列番号６８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６９または配列番号６９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７０または配列番号７０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７１または配列番号７１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７２または配列番号７２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７３または配列番号７３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７４または配列番号７４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７５または配列番号７５と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７６または配列番号７６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７７または配列番号７７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７８または配列番号７８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７９または配列番号７９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号８０または配列番号８０と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６７～８０のいずれかのＮ末端に連結されたグリシン－Ｘ－Ｙリピートを含む配列（式中、Ｘ及びＹは、独立して任意によりアミノ酸及び任意によりプロリンもしくはヒドロキシプロリンである）または配列番号６７～８０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。
前述の実施形態のいずれかにおいて、各組換えポリペプチド中の表面抗原は、融合前コンフォメーションであり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、各組換えポリペプチド中の表面抗原は、融合後コンフォメーション内にあり得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、各組換えポリペプチド中の表面抗原は、配列番号２７～６６のいずれかまたは配列番号２７～６６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み得る。
前述の実施形態のいずれかにおいて、組換えポリペプチドは、配列番号１～２６のいずれかまたは配列番号１～２６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み得る。
本明細書で提供されるタンパク質を含む免疫原もまた、本明細書で提供される。本明細書で提供されるのは、ナノ粒子に直接的または間接的に連結された、本明細書で提供されるタンパク質を含むタンパク質ナノ粒子である。本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。
また、本明細書において提供されるのは、本明細書において提供されるタンパク質の組換えポリペプチドの１つ、２つ、３つまたはそれ以上をコードする単離された核酸である。いくつかの実施形態では、Ｓタンパク質ペプチドをコードするポリペプチドは、コラーゲンのＣ末端プロペプチドをコードするポリペプチドにインフレームで融合される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単離された核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単離された核酸は、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される単離された核酸は、ＲＮＡ分子であり、任意により、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ、非増幅ｍＲＮＡ、自己増幅ｍＲＮＡ、またはトランス増幅ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡ分子である。
また、本明細書で提供される単離された核酸を含むベクターも本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
いくつかの態様では、ウイルス、偽ウイルス、または本明細書に提供されるベクターを含む細胞が本明細書に提供され、任意により、ウイルスまたは細胞は、組換えゲノムを有する。いくつかの態様では、本明細書において提供されるのは、本明細書において提供されるタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、または細胞、及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物である。
また、本明細書で提供される免疫原性組成物及び任意によりアジュバントを含むワクチンも本明細書で提供され、ワクチンは、任意により、サブユニットワクチンである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、予防用及び／または治療用ワクチンである。
いくつかの態様では、本明細書に提供されるのは、タンパク質を産生する方法であって、本方法は、本明細書に提供されるタンパク質を産生するために、宿主細胞内で、本明細書で提供される単離された核酸またはベクターを発現させることと；タンパク質を精製することと、を含む。本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される方法によって産生されるタンパク質である。
本明細書に提供されるのは、対象においてコロナウイルスのＳタンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対する免疫応答を生じさせるための方法であり、本方法は、免疫応答を生じさせるために、本明細書で提供される有効量のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、コロナウイルスによる感染を治療または予防するためのものである。いくつかの実施形態では、免疫応答が生じることにより、対象におけるコロナウイルスの複製を阻害または減少させる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、細胞性応答及び／または体液性応答を含み、任意により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などの１つ以上の中和抗体を産生することを含む。いくつかの実施形態では、免疫応答は、コロナウイルスのＳタンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対してであるが、Ｃ末端プロペプチドに対してではない。いくつかの実施形態では、対象へ投与することにより、１つ以上のコロナウイルスへの以前の曝露により、対象において抗体依存性増強（ＡＤＥ）がもたらされることはない。いくつかの実施形態では、投与することにより、その後１つ以上のコロナウイルスに曝露されたときに、対象において抗体依存性増強（ＡＤＥ）がもたらされることはない。いくつかの実施形態では、方法は、初回刺激ステップ及び／または追加免疫ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、投与ステップは、局所、経皮、皮下、皮内、経口、鼻腔内（例えば、鼻腔内スプレー）、気管内、舌下、頬側、直腸、膣内、吸入、静脈内（例えば、静脈内注射）、動脈内、筋肉内（例えば、筋肉内注射）、心臓内、骨内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局所、または皮表（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与を介して実施される。いくつかの実施形態では、有効量は、単回用量または１回以上の間隔で分離された一連の用量で投与される。いくつかの実施形態では、有効量は、アジュバントを含まずに投与される。いくつかの実施形態では、有効量は、アジュバントを含めて投与される。
本明細書で提供されるのは、有効量の本明細書で提供されるタンパク質を対象に投与して、対象において、コロナウイルスに対する中和抗体または中和抗血清を生成することを含む方法である。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物であり、任意により、ヒトまたは非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、方法は、対象から中和抗体または中和抗血清を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、コロナウイルスによる感染を予防または治療するために、受動免疫を介してヒト対象に、有効量の単離された中和抗体または中和抗血清を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスに対する中和抗体または中和抗血清は、コロナウイルスＳタンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対するポリクローナル抗体を含み、任意により、中和抗体または中和抗血清は、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに対する抗体を含まないかまたは実質的に含まない。いくつかの実施形態では、中和抗体は、コロナウイルスＳタンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに対するモノクローナル抗体を含み、任意により、中和抗体は、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに対する抗体を含まないかまたは実質的に含まない。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンは、対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答の誘導、及び／またはコロナウイルスによる感染の治療または予防において使用するためのものである。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘導するため、及び／またはコロナウイルスによる感染を治療または予防するための、本明細書で提供されるタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンの使用である。いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答を誘導するため及び／またはコロナウイルスによる感染を治療または予防するための医薬品または予防薬を製造するための、本明細書で提供されるタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンの使用である。
サンプルを分析するための方法も本明細書で提供され、本方法は、サンプルを本明細書で提供されるタンパク質と接触させることと、タンパク質とコロナウイルスのＳタンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープに特異的に結合することができるアナライトとの結合を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、アナライトは、抗体、受容体、またはＳタンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープを認識する細胞である。いくつかの実施形態では、結合することは、サンプル中のアナライトの存在、及び／またはサンプルが由来する対象におけるコロナウイルスによる感染を示す。
本明細書では、本明細書で提供されるタンパク質と、タンパク質を含むかまたは固定化する基板、パッド、またはバイアルとを含むキットが提供され、任意により、キットは、ＥＬＩＳＡまたはラテラルフローアッセイキットである。
（Ａ）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のための例示的な可溶性Ｓ－三量体サブユニットワクチンの構造的特徴を示す図であり、Ｓ－三量体の構造ドメインの模式図である。（Ｂ）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のための例示的な可溶性Ｓ－三量体サブユニットワクチンの構造的特徴を示す図であり、その三量体及び共有結合により連結された三次元コンフォメーションを示す。 例示的なＳ－三量体の高レベル発現を示す図である。全長Ｓ－三量体及びＳ１／Ｓ２フリン部位で部分的に切断された形態、すなわちＳ２－三量体及び切断されたＳ１断片が示されている。 例示的な共有結合により連結したＳ－三量体の精製及び特徴を示す図である。透明な細胞培養培地から、プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換カラム（Ｑ）、その後限外濾過及びダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）を介して、Ｓ－三量体を精製し、原薬（ＤＳ）を得た。 例示的な共有結合により連結したＳ－三量体の精製及び特徴を示す図である。Ｓ－三量体は、ジスルフィド結合により連結された三量体である。 例示的な共有結合により連結したＳ－三量体の精製及び特徴を示す図である。Ｓ－三量体は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析によって判断されるとおり、ほぼ均質になるまで精製され、サイズ排除クロマトグラフィー中に、切断されたＳ１の一部が分離した。 例示的な共有結合により連結したＳ－三量体の精製及び特徴を示す図である。Ｓ－三量体のＡＣＥ２－Ｆｃへの受容体結合動態を評価した。 例示的なＳ－三量体が、Ｎ連結グリカンにより、高グリコシル化されていることを示す図である。脱グリコシル化前及び後の全長Ｓ－三量体、Ｓ２－三量体、ならびに切断されたＳ１を示す。 例示的なＳ－三量体の電子顕微鏡写真（ＥＭ）及びＳ－三量体の予測コンフォメーションを示す図である（右図）。 抗原として例示的Ｓ－三量体を使用した、回復期の血清からのＳ特異的抗体及び中和抗体の検出を示す図である。 例示的なＳ－三量体のみ及びいかなるアジュバントも含まない、ラットにおける抗原特異的抗体の誘導を示す図である。 例示的なＳ－三量体のみ及びいかなるアジュバントも含まない、ラットにおける中和抗体の誘導を示す図である。 アジュバントを含まずに、またはアジュバントとしてミョウバン（水酸化アルミニウム）を用いた、マウスにおける例示的なＳ－三量体ワクチンによる抗原特異的抗体の誘導を示す図である。 スクアレンベースのアジュバントをアジュバント添加した例示的Ｓ－三量体による、ラットにおける抗原特異的抗体の誘導を示す図である。 スクアレンベースのアジュバントをアジュバント添加した例示的Ｓ－三量体による、ラットにおける中和抗体の誘導を示す図である。 例示的コロナウイルスの構造及び特定の配列を示す図である。 ヒトＣＯＶＩＤ－１９回復期血清におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体価及びＡＣＥ２競合力価の検出を示す図である。元の株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）に感染したＣＯＶＩＤ－１９患者から収集した、抗体価が中程度から高程度の８つのヒト回復期血清（ＨＣＳ）サンプルでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和力価について分析した。バリアント株力価を元の株力価と比較したデータを示す。ドットは、個々のＨＣＳサンプルのデータを表し、バーは、半最大有効濃度（ＥＣ５０）値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 ヒトＣＯＶＩＤ－１９回復期血清におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体価及びＡＣＥ２競合力価の検出を示す図である。元の株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）に感染したＣＯＶＩＤ－１９患者から収集した、抗体価が中程度から高程度の８つのヒト回復期血清（ＨＣＳ）サンプルでは、元の株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）、ＵＫ（Ｂ．１．１．７）、南アフリカ株（Ｂ．１．３５１）及びブラジル株（Ｐ．１）に基づくＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡ力価について分析した。バリアント株力価を元の株力価と比較したデータを示す。ドットは、個々のＨＣＳサンプルのデータを表し、バーは、半最大有効濃度（ＥＣ５０）値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表す。エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 プロトタイプ及び修飾Ｂ．１．３５１ Ｓ－三量体抗原及びマウス免疫原性試験デザインを示す図である。プロトタイプＳ－三量体及び３つのＲＢＤ変異を含む修飾Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体、及びＢ．１．３５１バリアント中のＤ６１４Ｇ変異の模式図である。 プロトタイプ及び修飾されたＢ．１．３５１ Ｓ－三量体抗原及びマウス免疫原性試験デザインを示す図である。ＦｏｒｔｅＢｉｏＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法によるＳ－三量体（プロトタイプ及びＢ．１．３５１）とヒトＡＣＥ２－Ｆｃのとの結合親和性（ＫＤ）の決定を示す図である。 プロトタイプ及び修飾されたＢ．１．３５１ Ｓ－三量体抗原及びマウス免疫原性試験デザインを示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１６－３２／群）は、試験の第１段階において、２回のプロトタイプＳ－三量体（３μｇ）、異種初回刺激－追加免疫（１回目の投与プロトタイプＳ－三量体；２回目の投与Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体；各抗原３μｇ）のいずれか；Ｂ．１．３５１Ｓ三量体（３μｇ）の２回投与、または二価ワクチンの２回投与（３μｇのプロトタイプＳ－三量体及び３μｇのＢ．１．３５１Ｓ－三量体を混合）を用いて免疫した。第１段階のすべての動物は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加初回刺激投与（１回目の投与）を受けた。追加免疫（２回目の投与）については、各群の動物の半数は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加追加免疫を受け、残りの半数は、アジュバント非添加追加免疫（抗原のみ）を受けた。試験の第２段階では、群１の動物を、３μｇのプロトタイプＳ－三量体または３μｇのＢ．１．３５１Ｓ－三量体（半数はアジュバント添加し、半数はアジュバント非添加である）のブースター投与（３回目の投与）を受けるように、無作為に割り付けた。群２～３の動物は、３μｇのアジュバント非添加プロトタイプまたはＢ．１．３５１Ｓ－三量体のいずれかによるブースター（３回目の投与）を受けるように、無作為に割り付けた。 プロトタイプ及び修飾Ｂ．１．３５１ Ｓ－三量体抗原及びマウス免疫原性試験デザインを示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスを第１段階で免疫し、０日目に初回刺激し（１回目の投与）、２１日目に追加免疫し（２回目の投与）、３５日目の血液サンプルで体液性免疫原性の一次分析を行った。第２段階では、３５日目にブースター投与（３回目の投与）を行い、４９日目の血液サンプルで、体液性及び細胞性免疫応答の一次分析を行った。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１スパイク三量体抗原の２回投与の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、３５日目（２回目の投与の２週間後）に、元の株、ＵＫ株（Ｂ．１．１．７）、南アフリカ株（Ｂ．１．３５１）及びブラジル株（Ｐ．１）に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて評価した。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。群１（プロトタイプＳ－三量体）と比較した群２～４のＧＭＴの倍率差（Δ）が示され、統計的有意差は、黒字で示す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１スパイク三量体抗原の２回投与の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、３５日目（２回目の投与の２週間後）に、元の株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）、ＵＫ株（Ｂ．１．１．７）、南アフリカ株（Ｂ．１．３５１）及びブラジル株（Ｐ．１）に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、Ｓ－三量体によりＡＣＥ２へ結合するためのワクチン誘導性抗体の競合を検出するＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡに基づいて評価した。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。群１（プロトタイプＳ－三量体）と比較した群２～４のＧＭＴの倍率差（Δ）が示され、統計的有意差は、黒字で示す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした。 追加免疫（２回目の投与）及びブースター（３回目の投与）についての体液性免疫応答に対するアジュバントの効果を示す図である。本試験における体液性免疫応答は、元の株、ＵＫ（Ｂ．１．１．７）、南アフリカ（Ｂ．１．３５１）、及びブラジル（Ｐ．１）株に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて評価した。偽ウイルス中和力価の結果は、因子分析に基づき、以下についてここに示す；第１段階では、全動物が、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加初回刺激投与（１回目の投与）を受け、動物の半数が、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加追加免疫（２回目の投与）を受け、動物の残りの半数は、アジュバント非添加追加免疫（抗原のみ）を受けた。 追加免疫（２回目の投与）及びブースター（３回目の投与）についての体液性免疫応答に対するアジュバントの効果を示す図である。本試験における体液性免疫応答は、元の株、ＵＫ（Ｂ．１．１．７）、南アフリカ（Ｂ．１．３５１）、及びブラジル（Ｐ．１）株に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて評価した。偽ウイルス中和力価の結果は、因子分析に基づき、以下についてここに示す；第２段階では、第１群の動物の半数は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含む、アジュバント添加ブースターの３回目の投与を受け、動物の残りの半数は、アジュバント非添加ブースター（抗原のみ）を受けた。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１スパイク三量体抗原の３回投与の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における体液性免疫応答は、元の株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）にアジュバント非添加ブースター（３回目の投与）を受けた動物において評価した。３５日目（２回目の投与の２週間後）の中和力価も示す。各ブースター群における力価の倍数差（４９日目及び３５日目）を示す。ドットは、個々の動物を表し；バーは、半分の最大有効濃度（ＥＣ５０）値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１スパイク三量体抗原の３回投与の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における体液性免疫応答は、ＵＫ（Ｂ．１．１．７）バリアントに対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）にアジュバント非添加ブースター（３回目の投与）を受けた動物において評価した。３５日目（２回目の投与の２週間後）の中和力価も示す。各ブースター群における力価の倍数差（４９日目及び３５日目）を示す。ドットは、個々の動物を表し；バーは、半分の最大有効濃度（ＥＣ５０）値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１スパイク三量体抗原の３回投与の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における体液性免疫応答は、南アフリカ（Ｂ．１．３５１）バリアントに対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）にアジュバント非添加ブースター（３回目の投与）を受けた動物において評価した。３５日目（２回目の投与の２週間後）の中和力価も示す。各ブースター群における力価の倍数差（４９日目及び３５日目）を示す。ドットは、個々の動物を表し；バーは、半分の最大有効濃度（ＥＣ５０）値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１スパイク三量体抗原の３回投与の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における体液性免疫応答は、ブラジル（Ｐ．１）バリアント偽ウイルスに対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）にアジュバント非添加ブースター（３回目の投与）を受けた動物において評価した。３５日目（２回目の投与の２週間後）の中和力価も示す。各ブースター群における力価の倍数差（４９日目及び３５日目）を示す。ドットは、個々の動物を表し；バーは、半分の最大有効濃度（ＥＣ５０）値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプまたはＢ．１．３５１スパイク三量体抗原の３回目の投与の細胞性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における細胞性免疫応答は、元の（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）株由来のＳ１ペプチドプールにより刺激し、採取した脾細胞におけるＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮγ及びＩＬ－２）またはＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－５）を検出するＥＬＩＳｐｏｔに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）に評価した。ドットは、個々の動物を表し；バーは、群の平均値を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプまたはＢ．１．３５１スパイク三量体抗原の３回目の投与の細胞性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における細胞性免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来のＳ１ペプチドプールにより刺激し、採取した脾細胞におけるＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮγ及びＩＬ－２）またはＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－５）を検出するＥＬＩＳｐｏｔに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）に評価した。ドットは、個々の動物を表し；バーは、群の平均値を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプまたはＢ．１．３５１スパイク三量体抗原の３回目の投与の細胞性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における細胞性免疫応答は、Ｂ．１．３５１バリアント由来のＲＢＤペプチドプールにより刺激し、採取した脾細胞におけるＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮγ及びＩＬ－２）またはＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－５）を検出するＥＬＩＳｐｏｔに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）に評価した。ドットは、個々の動物を表し；バーは、群の平均値を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプまたはＢ．１．３５１スパイク三量体抗原の３回目の投与の細胞性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における細胞性免疫応答は、Ｐ．１バリアント由来のＲＢＤペプチドプールにより刺激し、採取した脾細胞におけるＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮγ及びＩＬ－２）またはＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－５）を検出するＥＬＩＳｐｏｔに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）に評価した。ドットは、個々の動物を表し；バーは、群の平均値を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回目の投与後の偽ウイルス中和力価に基づく交差中和を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、元の株、ＵＫバリアント（Ｂ．１．１．７）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）及びブラジルバリアント（Ｐ．１）株に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。結果は、群１（プロトタイプＳ－三量体の２回投与）について示している。個々の動物の結果は、各図のドットで表し、元の中和力価とバリアント中和力価とを線で接続する。ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）が示され、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした（ｎｓ、有意ではない）。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回目の投与後の偽ウイルス中和力価に基づく交差中和を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、元の株、ＵＫバリアント（Ｂ．１．１．７）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）及びブラジルバリアント（Ｐ．１）株に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。結果は、群２（異種初回刺激－追加免疫）について示している。個々の動物の結果は、各図のドットで表し、元の中和力価とバリアント中和力価とを線で接続する。ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）が示され、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした（ｎｓ、有意ではない）。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回目の投与後の偽ウイルス中和力価に基づく交差中和を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、元の株、ＵＫバリアント（Ｂ．１．１．７）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）及びブラジルバリアント（Ｐ．１）株に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。結果は、群３（Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体の２回投与）について示している。個々の動物の結果は、各図のドットで表し、元の中和力価とバリアント中和力価とを線で接続する。ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）が示され、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした（ｎｓ、有意ではない）。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回目の投与後の偽ウイルス中和力価に基づく交差中和を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、元の株、ＵＫバリアント（Ｂ．１．１．７）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）及びブラジルバリアント（Ｐ．１）株に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。結果は、二価ワクチンの２回投与について示している。個々の動物の結果は、各図のドットで表し、元の中和力価とバリアント中和力価とを線で接続する。ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）が示され、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした（ｎｓ、有意ではない）。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回目の投与後のＡＣＥ２競合力価に基づく交差中和を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、元の株、ＵＫバリアント（Ｂ．１．１．７）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）及びブラジルバリアント（Ｐ．１）株に対するＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡアッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。結果は、群１（プロトタイプＳ－三量体の２回投与）について示している。個々の動物の結果は、各図のドットで表し、元の中和力価とバリアント中和力価とを線で接続する。ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）が示され、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした（ｎｓ、有意ではない）。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回目の投与後のＡＣＥ２競合力価に基づく交差中和を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、元の株、ＵＫバリアント（Ｂ．１．１．７）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）及びブラジルバリアント（Ｐ．１）株に対するＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡアッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。結果は、群２（異種初回刺激－追加免疫）について示している。個々の動物の結果は、各図のドットで表し、元の中和力価とバリアント中和力価とを線で接続する。ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）が示され、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした（ｎｓ、有意ではない）。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回目の投与後のＡＣＥ２競合力価に基づく交差中和を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、元の株、ＵＫバリアント（Ｂ．１．１．７）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）及びブラジルバリアント（Ｐ．１）株に対するＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡアッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。結果は、群３（Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体の２回投与）について示している。個々の動物の結果は、各図のドットで表し、元の中和力価とバリアント中和力価とを線で接続する。ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）が示され、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした（ｎｓ、有意ではない）。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回目の投与後のＡＣＥ２競合力価に基づく交差中和を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、元の株、ＵＫバリアント（Ｂ．１．１．７）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）及びブラジルバリアント（Ｐ．１）株に対するＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡアッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。結果は、二価ワクチンの２回投与について示している。個々の動物の結果は、各図のドットで表し、元の中和力価とバリアント中和力価とを線で接続する。ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）が示され、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした（ｎｓ、有意ではない）。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回投与後の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、元の株に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。第１段階のすべての動物は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加初回刺激投与（１回目の投与）を受け、各群の動物の半数は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加追加免疫（２回目の投与）を受け、他の半数は、アジュバント非添加追加免疫（抗原のみ）を受けた。ここでの結果は、アジュバント添加またはアジュバント非添加追加免疫（２回目の投与）のいずれかを受けた動物のサブグループについて示している。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回投与後の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、ＵＫバリアント（Ｂ．１．１．７）に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。第１段階のすべての動物は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加初回刺激投与（１回目の投与）を受け、各群の動物の半数は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加追加免疫（２回目の投与）を受け、他の半数は、アジュバント非添加追加免疫（抗原のみ）を受けた。ここでの結果は、アジュバント添加またはアジュバント非添加追加免疫（２回目の投与）のいずれかを受けた動物のサブグループについて示している。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回投与後の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。第１段階のすべての動物は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加初回刺激投与（１回目の投与）を受け、各群の動物の半数は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加追加免疫（２回目の投与）を受け、他の半数は、アジュバント非添加追加免疫（抗原のみ）を受けた。ここでの結果は、アジュバント添加またはアジュバント非添加追加免疫（２回目の投与）のいずれかを受けた動物のサブグループについて示している。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の２回投与後の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第１段階における体液性免疫応答は、ブラジルバリアント（Ｐ．１）株に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、３５日目（２回目の投与の２週間後）に評価した。第１段階のすべての動物は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加初回刺激投与（１回目の投与）を受け、各群の動物の半数は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加追加免疫（２回目の投与）を受け、他の半数は、アジュバント非添加追加免疫（抗原のみ）を受けた。ここでの結果は、アジュバント添加またはアジュバント非添加追加免疫（２回目の投与）のいずれかを受けた動物のサブグループについて示している。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意と見なした。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の３回の投与後の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における体液性免疫応答は、元の株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）に評価した。ここでの結果は、本試験におけるすべてのサブグループ（すべてのワクチン接種の組み合わせを表す）について示されている（ｎ＝４／サブグループ）。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の３回の投与後の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における体液性免疫応答は、ＵＫ（Ｂ．１．１．７）バリアント偽ウイルスに対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）に評価した。ここでの結果は、本試験におけるすべてのサブグループ（すべてのワクチン接種の組み合わせを表す）について示されている（ｎ＝４／サブグループ）。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の３回の投与後の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における体液性免疫応答は、南アフリカ（Ｂ．１．３５１）バリアント偽ウイルスに対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）に評価した。ここでの結果は、本試験におけるすべてのサブグループ（すべてのワクチン接種の組み合わせを表す）について示されている（ｎ＝４／サブグループ）。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。 マウスにおけるプロトタイプ及び／またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体抗原の３回の投与後の体液性免疫応答を示す図である。本試験の第２段階における体液性免疫応答は、ブラジル（Ｐ．１）バリアント偽ウイルスに対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイに基づいて、４９日目（３回目の投与の２週間後）に評価した。ここでの結果は、本試験におけるすべてのサブグループ（すべてのワクチン接種の組み合わせを表す）について示されている（ｎ＝４／サブグループ）。ドットは、個々の動物を表し；バーは、ＥＣ５０値の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）を表す。
本明細書において提供されるのは、コロナウイルス感染症の治療、例えば予防、治療のための、免疫原性組成物、方法、ならびにロナウイルスウイルス抗原または免疫原を含む融合ペプチド及びタンパク質の使用である。いくつかの実施形態では、共有結合により連結した三量体形態のＲＮＡウイルス由来の組換え可溶性表面抗原の組成物及びその使用方法が開示される。いくつかの実施形態では、結果として得られる融合タンパク質は、ジスルフィド結合により連結されたホモ三量体として分泌され、構造がより安定している一方で、ネイティブ様三量体ウイルス抗原のコンフォメーションを保持し、これにより、これらの危険な病原体に対するより効果的なワクチンとして使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書において開示されるのは、アジュバントを含まずまたはアジュバントを含めて、または２つ以上のアジュバントと共に、任意により、筋肉内注射または経鼻投与のいずれかを介して、ウイルス感染を予防するために、ウイルス抗原三量体をワクチンとして、または多価ワクチンの一部として使用するための方法である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、中和抗体などのウイルス抗原を認識する抗体、例えばＩｇＭまたはＩｇＧの検出によりウイルス感染を診断するために、抗原としてウイルス抗原三量体を使用するための方法である。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原三量体を抗原として使用して、受動免疫、例えば、コロナウイルス感染症を治療するための中和ｍＡｂに使用できるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成する方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ワクチンとしてまたは多価ワクチンの一部としてのウイルス抗原三量体であり、ワクチンは、ウイルスの同じタンパク質のウイルス抗原を含むか、または１つ以上のウイルスの２つ以上の異なるタンパク質のウイルス抗原、または同じウイルスの１つ以上の株を含む複数の三量体サブユニットワクチンを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるウイルス抗原三量体を含む一価ワクチンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるウイルス抗原三量体を含む二価ワクチンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるウイルス抗原三量体を含む三価ワクチンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるウイルス抗原三量体を含む四価ワクチンである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるＳ－三量体を含む一価ワクチンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるＳ－三量体を含む二価ワクチンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、第１のＳタンパク質抗原を含む少なくとも１つのＳ－三量体、及び第２のＳタンパク質抗原を含む少なくとも１つのＳ－三量体を含む二価ワクチンである。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＳタンパク質抗原は、１つ以上のウイルス種または株／亜型の同じＳタンパク質に由来するか、または１つ以上のウイルス種もしくは同じウイルス種の１つ以上の株／亜型の２つ以上の異なるＳタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるＳ－三量体を含む三価ワクチンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、第１のＳタンパク質抗原を含む少なくとも１つのＳ－三量体、及び第２のＳタンパク質抗原を含む少なくとも１つのＳ－三量体、及び第３のＳタンパク質抗原を含む少なくとも１つのＳ－三量体を含む三価ワクチンである。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のＳタンパク質抗原は、１つ以上のウイルス種もしくは株／亜型の同じＳタンパク質に由来するか、または１つ以上のウイルス種もしくは同じウイルス種の１つ以上の株／亜型の２つ、３つ、もしくはそれ以上の異なるＳタンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本明細書に開示されるＳ－三量体を含む四価ワクチンである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、第１のＳタンパク質抗原を含む少なくとも１つのＳ－三量体、第２のＳタンパク質抗原を含む少なくとも１つのＳ－三量体、第３のＳタンパク質抗原を含む少なくとも１つのＳ－三量体、及び第４のＳタンパク質抗原を含む少なくとも１つのＳ－三量体を含む四価ワクチンである。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４のＳタンパク質抗原は、１つ以上のウイルス種もしくは株／亜型の同じＳタンパク質に由来するか、または１つ以上のウイルス種もしくは同じウイルス種の１つ以上の株／亜型の２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上の異なるＳタンパク質に由来する。
本明細書で提供されるコロナウイルスウイルス抗原及び免疫原を含む組換えポリペプチド及び融合タンパク質などのタンパク質は、コロナウイルス感染症を効果的かつ安全に（例えば、治療的、予防的に）治療するために有用である。例えば、本明細書で提供されるコロナウイルスウイルス抗原及び免疫原を含むタンパク質は、媒介性ワクチン誘発疾患増強（ＶＥＤ）及び／または抗体依存性増強（ＡＤＥ）なく、コロナウイルス感染症を治療する。さらに、本明細書で提供されるコロナウイルスウイルス抗原及び免疫原を含むタンパク質は、容易に産生され、例えば、高温、極端なｐＨ、ならびに高浸透圧及び低浸透圧などの高ストレス条件下で安定性を示す。したがって、本明細書で提供されるタンパク質及び免疫原性組成物は、コロナウイルスワクチンの開発を妨げてきた産生、安定性、安全性、及び有効性の問題を回避し、満足させる。
いくつかの態様では、本明細書において提供されるコロナウイルスウイルス抗原及び免疫原としては、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質またはペプチド、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質が挙げられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクは、ＨＩＶ糖タンパク質１６０（Ｅｎｖ）、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）、パラミクソウイルスＦ及びエボラウイルス糖タンパク質も含む、クラスＩ型ウイルス融合糖タンパク質の群に属するＳタンパク質の三量体から構成される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質は、それぞれ、表面糖タンパク質前駆体をコードし、アミノ末端及びほとんどのタンパク質は、細胞表面またはウイルス粒子の外側にあると予測されている。Ｓタンパク質は、Ｎ末端に位置するシグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。他のコロナウイルスと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質は、プロテアーゼによってＳ１及びＳ２サブユニットに切断される。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２には、他のＳＡＲＳ様ＣｏＶ中にはないフリン様切断部位が含まれている。
いくつかの実施形態では、組換えＳ外部ドメイン三量体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組換えＳ外部ドメイン三量体は、ＮＬ６３－ＣｏＶまたは２２９Ｅ－ＣｏＶなどのアルファコロナウイルス由来の組換えＳ外部ドメインプロトマーを含む。いくつかの実施形態では、組換えＳ外部ドメイン三量体は、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＷＩＶ１－ＣｏＶ、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）またはＨＫＵ９－ＣｏＶなどのベータコロナウイルス由来のＳ外部ドメインプロトマーを含む。
ＨＩＶ、ＲＳＶ、インフルエンザなどの他のエンベロープＲＮＡウイルスと同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスはそれぞれがすべて、感染時に特定の細胞表面受容体を介して異なる宿主細胞への侵入を得るために、そのウイルスエンベロープに三量体表面抗原を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１と同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、その三量体ウイルス表面抗原Ｓタンパク質を使用して、その特異的細胞表面受容体ＡＣＥ２との結合時に、哺乳動物の呼吸器系の宿主細胞に入る。効果的な組換えサブユニットワクチンを生成するための前提条件は、ウイルスＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に結合できる十分な量の抗体を誘起するために、ネイティブ様のウイルスＳ抗原を作成できること、特に、その三量体構造を維持できることであり、これにより、ウイルスがＡＣＥ２受容体に結合するのを防ぎ、したがって、ウイルス感染が消失する。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ペプチドを含むタンパク質は、免疫応答、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ペプチドに対する免疫応答を生じることができる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、対象、例えば患者におけるコロナウイルスの複製を阻害または減少させる。いくつかの実施形態では、免疫応答は、ポリクローナル及び／またはモノクローナル抗体などの１つ以上の中和抗体を産生することを含む。いくつかの実施形態では、中和抗体は、対象、例えば患者におけるコロナウイルスの複製を阻害するかまたは減少させる。いくつかの実施形態では、例えば免疫原性組成物としてタンパク質を対象へ投与することにより、コロナウイルスへの以前の曝露により、対象において抗体依存性増強（ＡＤＥ）がもたらされることはない。いくつかの態様では、コロナウイルスウイルス抗原及び免疫原を含むタンパク質は、ワクチンとして使用される。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスウイルス抗原及び免疫原、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ペプチドは、タンパク質またはペプチドに連結されて、融合タンパク質または組換えポリペプチドを形成する。いくつかの実施形態では、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原が連結されるタンパク質またはペプチドは、タンパク質またはペプチド、例えば、融合タンパク質または組換えポリペプチドのタンパク質またはペプチドと会合する、例えば、共有結合または非共有結合により連結することができる。したがって、場合によっては、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原が連結するタンパク質またはペプチドは、多量体化ドメインである。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスウイルス抗原及び免疫原、例えばコロナウイルスＳタンパク質ペプチドは、例えば、コラーゲンのプロペプチドのＣ末端において、コラーゲンのプロペプチドに連結されて、融合ペプチドまたは組換えポリペプチドを形成する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるタンパク質は、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結された、コロナウイルスウイルス抗原及び免疫原、例えば、コロナウイルスＳタンパク質ペプチドまたはその断片もしくはエピトープを含む組換えポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、コラーゲンのプロペプチドは、α１コラーゲンのヒトＣ－プロペプチドに由来し、発現時に自己三量体化が可能である。
いくつかの実施形態では、例えば、コラーゲンのプロペプチドのＣ末端において、コロナウイルスウイルス抗原及び免疫原、例えばコロナウイルスＳタンパク質ペプチドをコラーゲンのプロペプチドに連結することにより、免疫応答を生じるタンパク質の能力を補助する。例えば、組換えタンパク質が作製されることにより、コロナウイルスＳタンパク質ペプチドの三次及び四次構造が保存され得、これは、コロナウイルスＳタンパク質ペプチドのネイティブコンフォメーションの安定性及び免疫応答を誘発することができるタンパク質、例えば中和抗体の表面での抗原部位の利用可能性にとって重要であり得る。さらに、コロナウイルスＳタンパク質ペプチドは、自己三量体化が可能なタンパク質またはペプチドに連結することにより、組換えタンパク質の凝集が可能になり、したがって、ウイルスエンベロープ上のコロナウイルスＳタンパク質ペプチドのネイティブホモ三量体構造が模倣される。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスＳタンパク質ペプチドをコラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結することにより、自己三量体化組換えポリペプチドが得られる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるタンパク質は、複数の自己三量体化コロナウイルスＳタンパク質ペプチド及びコラーゲン組換えポリペプチドのプロペプチドを含む。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質の三量体の性質により、タンパク質の安定性が補助される。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質の三量体の性質により、免疫応答を生じるタンパク質の能力が補助される。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質の三量体の性質及び／または複数の自己三量体化組換えタンパク質のマクロ構造により、免疫応答を生じるタンパク質の能力が補助される。
本明細書で提供されるタンパク質を含む免疫原性組成物、本明細書で提供されるタンパク質を産生する方法、本明細書で提供されるタンパク質及び組成物により対象を治療する方法、及びキットも本明細書で提供される。
本出願で参照される特許文書、科学論文及びデータベースなどのすべての刊行物は、個々の刊行物が個々に参照により組み込まれるのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。本明細書に記載されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている特許、出願、公開出願、及び他の刊行物に記載されている定義に反するか、または矛盾している場合、本明細書に記載されている定義は、参照により本明細書に組み込まれている定義に優先する。
本明細書で使用されているセクションの見出しは、構成のみを目的とするものであり、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
Ｉ．ウイルス抗原及び免疫原
本明細書で提供されるタンパク質は、コロナウイルスウイルス抗原及び免疫原を含む。本明細書で企図されるコロナウイルスウイルス抗原及び免疫原は、細胞性応答及び／または体液性応答を促進または刺激することができる。いくつかの実施形態では、応答、例えば、細胞性応答または体液性応答は、抗体、例えば、中和抗体の産生を含む。いくつかの実施形態では、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質ペプチドである。
コロナウイルスは、重度呼吸器疾患を引き起こすことが知られているポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスのファミリーである。これらのウイルスは、既知のＲＮＡウイルスの中で最大のゲノム（２６～３２ｋｂ）を有し、系統発生的に４つの属（α、β、γ、δ）に分けられ、ベータコロナウイルスは、さらに４つの系統（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に細分される。現在、コロナウイルスファミリーからヒトに感染することが知られているウイルスは、アルファコロナウイルス及びベータコロナウイルス属に由来する。さらに、ガンマコロナウイルス属及びデルタコロナウイルス属が将来的にヒトに感染し得ると考えられている。ベータコロナウイルスの非限定的例として、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＫＵ１－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＯＣ４３－ＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ－ＣｏＶ）、コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＷＩＶ１（ＷＩＶ１－ＣｏＶ）、及びヒトコロナウイルスＨＫＵ９（ＨＫＵ９－ＣｏＶ）が挙げられる。アルファコロナウイルスの非限定的例としては、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（２２９Ｅ－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＮＬ６３－ＣｏＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、及び伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）が挙げられる。デルタコロナウイルスの非限定的な例は、ブタデルタコロナウイルス（ＳＤＣＶ）である。
重症急性呼吸器症候群に関連するコロナウイルスのリストは、ここに開示する：
・コウモリコロナウイルスＣｐ／Ｙｕｎｎａｎ２０１１
・コウモリコロナウイルスＲａＴＧ１３
・コウモリコロナウイルスＲｐ／Ｓｈａａｎｘｉ２０１１
－コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１０
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１１
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１２
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－１３
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－２
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－３
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－４
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－５
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－６
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－７
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－８
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ３－９
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＲｐ１
・コウモリＳＡＲＳコロナウイルスＲｐ２
－コウモリＳＡＲＳ ＣｏＶ Ｒｆ１／２００４
・コウモリＣｏＶ ２７３／２００５
－コウモリＳＡＲＳ ＣｏＶ Ｒｍ１／２００４
・コウモリＣｏＶ ２７９／２００５
・コウモリＳＡＲＳ ＣｏＶ Ｒｐ３／２００４
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルス
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＲｓ３３６７
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＲｓＳＨＣ０１４
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＷＩＶ１
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＹＮＬＦ＿３１Ｃ
・コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＹＮＬＦ＿３４Ｃ
・ＢｔＲｆ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＨｅＢ２０１３
・ＢｔＲｆ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＪＬ２０１２
・ＢｔＲｆ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＳＸ２０１３
・ＢｔＲｓ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＧＸ２０１３
・ＢｔＲｓ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＨｕＢ２０１３
・ＢｔＲｓ－ＢｅｔａＣｏＶ／ＹＮ２０１３
・ジャコウネコＳＡＲＳ ＣｏＶ ００７／２００４
・ジャコウネコＳＡＲＳ ＣｏＶ ＳＺ１６／２００３
・ジャコウネコＳＡＲＳ ＣｏＶ ＳＺ３／２００３
－組換えＳＡＲＳｒ－ＣｏＶ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＥｘｏＮ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＭＡ１５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＭＡ１５ ＥｘｏＮ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスｗｔｉｃ－ＭＢ
・ナカキクガシラコウモリコロナウイルス
・ＳＡＲＳコウモリコロナウイルス
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ００１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ０１３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ０２１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ０２２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ０３０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡ０３１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＡＳ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０１２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０２４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０２９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０３３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０３９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢ０４０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ０４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１６２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１８２－１２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１８２－４
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・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１８２ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ１８２ｂ
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・ＳＡＲＳコロナウイルスＢＪ３０２
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・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０１４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０１７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０１８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０１９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０２５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０２８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣ０２９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＤＣ＃２００３０１１５７
・ＳＡＲＳコロナウイルスジャコウネコ０１０
・ＳＡＲＳコロナウイルスジャコウネコ０１４
・ＳＡＲＳコロナウイルスジャコウネコ０１９
・ＳＡＲＳコロナウイルスジャコウネコ０２０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＳ２１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＳ２４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－ＡＧ０１
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・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－ＡＧ０３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－Ｌ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－Ｓｕ１０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＣＵＨＫ－Ｗ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスｃｗ０３７
・ＳＡＲＳコロナウイルスｃｗ０４９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＥＳ１９１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＥＳ２６０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＦＲＡ
－ＳＡＲＳコロナウイルスフランクフルト１
・ＳＡＲＳコロナウイルスフランクフルト１－ｖ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＤ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＤ０３Ｔ００１３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＤ３２２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＤ６９
・ＳＡＲＳ コロナウイルスＧＤＨ－ＢＪＨ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ－Ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ－Ｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ－Ｃ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ－Ｄ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ０４０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ０４０２
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・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ４３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ５０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＧＺ６０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＢ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＣ／ＳＺ／６１／０３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＧＺ８Ｌ１－Ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＧＺ８Ｌ１－Ｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＧＺ８Ｌ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＨＳ－２００４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ－３６８７１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ－３９８４９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ－６５８０６
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＫＵ－６６０７８
・ＳＡＲＳコロナウイルス香港／０３／２００３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＰＺ－２００３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＲ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＺ－Ａ
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・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＺ－Ｃｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＺ－Ｃｃ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＳＺ２－Ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＺＳ２－Ｂｂ
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・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＺＳ２－Ｆｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＨＺＳ２－Ｆｃ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＪＭＤ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＬＣ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＬＣ２
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・ＳＡＲＳコロナウイルスＬＣ５
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・ＳＡＲＳコロナウイルスＮＳ－１
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・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－２０５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－２２７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＣ４－２４１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＵＭＣ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＵＭＣ０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＰＵＭＣ０３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＲｓ＿６７２／２００６
・ＳＡＲＳコロナウイルスｓｆ０９８
・ＳＡＲＳコロナウイルスｓｆ０９９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｈａｎｇｈａｉＱＸＣ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｈａｎｇｈａｉＱＸＣ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｈａｎｈｇａｉ ＬＹ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ０４０９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２５００
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２６７７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２６７９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２７４８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ２７７４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ３４０８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ３４０８Ｌ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ３７２５Ｖ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ３７６５Ｖ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４６
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８４９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８５０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ８５２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎ＿ＷＮＶ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎｏ１－１１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎｏ３－１１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎＰ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎＰ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎＰ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎＰ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｉｎＰ５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳｏＤ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳＺ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＳＺ１３
・ＳＡＲＳ コロナウイルス台湾
・ＳＡＲＳコロナウイルス台湾ＪＣ－２００３
・ＳＡＲＳコロナウイルス台湾ＴＣ１
・ＳＡＲＳコロナウイルス台湾ＴＣ２
・ＳＡＲＳコロナウイルス台湾ＴＣ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＪ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＪＦ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴｏｒ２
－ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ
ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＧＤ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＧＤ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＧＤ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＧＤ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＧＤ５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＨＰ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＨＰ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＨＰ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＨＰ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＪＣ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＫＣ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＫＣ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＰＨ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＰＨ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＹＭ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＹＭ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＹＭ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ－ＹＭ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ１０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ１１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ４
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ５
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ６
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ７
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷ９
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＣ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＣ２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＣ３
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＨ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＪ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＫ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＳ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＴＷＹ
・ＳＡＲＳコロナウイルスウルバーニ
・ＳＡＲＳコロナウイルスベトナム
・ＳＡＲＳコロナウイルスＷＦ１８８
・ＳＡＲＳコロナウイルスＷＨ２０
・ＳＡＲＳコロナウイルスＷＨＵ
・ＳＡＲＳコロナウイルスｘｗ００２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＪ０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＪ０２
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＪ０３０１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＭＹ１
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＳ－Ａ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＳ－Ｂ
・ＳＡＲＳコロナウイルスＺＳ－Ｃ
・ＳＡＲＳ関連コウモリコロナウイルスＲｓＳＨＣ０１４
・ＳＡＲＳ関連ベータコロナウイルスＲｐ３／２００４
・重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２


































例示的ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２株を下表に示す。
コロナウイルスのウイルスゲノムは、キャッピングされ、ポリアデニル化され、ヌクレオキャプシドタンパク質で覆われている。コロナウイルスビリオンには、スパイク（Ｓ）タンパク質と呼ばれるＩ型融合糖タンパク質を含むウイルスエンベロープが含まれている。ほとんどのコロナウイルスは、ゲノムの５’部分に含まれているレプリカーゼ遺伝子及びゲノムの３’部分に含まれている構造遺伝子を有する共通のゲノム構成を有する。
コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質は、最初に前駆体タンパク質として合成されたクラスＩ型融合糖タンパク質である。個々の前駆体Ｓポリペプチドは、ホモ三量体を形成し、ゴルジ装置内でグリコシル化を受け、かつシグナルペプチドを除去するためのプロセッシング、及び細胞プロテアーゼによる切断により、ホモ三量体内で依然としてＳ１／Ｓ２プロトマーとして会合し、これにより、ヘテロ二量体の三量体である別個のＳ１及びＳ２ポリペプチド鎖を生じさせる。Ｓ１サブユニットは、ウイルス膜の遠位にあり、宿主受容体へのウイルスの付着を媒介する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。Ｓ２サブユニットには、融合ペプチド、２つのヘプタドリピート配列（ＨＲ１及びＨＲ２）、融合糖タンパク質に典型的な中央ヘリックス、膜貫通ドメイン、及びサイトゾルテールドメインなどの融合タンパク質機構が含まれている。
場合によっては、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原は、融合前コンフォメーション中のコロナウイルスＳタンパク質ペプチドであり、これは、分泌系内で成熟コロナウイルスＳタンパク質にプロセシングされた後、コロナウイルスＳの融合後コンフォメーションへの移行をもたらす融合遺伝子イベントを引き起こす前に、コロナウイルスＳタンパク質の外部ドメインによって採用される構造的コンフォメーションである。融合前コンフォメーション内の例示的コロナウイルスＳタンパク質（ＨＫＵ１－ＣｏＶ）の三次元構造は、Ｋｉｒｃｈｄｏｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｒｅ－ｆｕｓｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｎａｔｕｒｅ，５３１：１１８－１２１，２０１６に記載されている。
場合によっては、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原は、対応するネイティブコロナウイルスＳ配列から形成されたコロナウイルスＳ外部ドメイン三量体と比較して、融合前コンフォメーションの保持の増加をもたらすネイティブコロナウイルスＳ配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を含む。１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入による融合前コンフォメーションの「安定化」は、例えば、エネルギー安定化（例えば、融合後のオープンコンフォメーションと比較して、融合前コンフォメーションのエネルギーの減少）及び／または速度論的安定化（例えば、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへの移行速度の低下）であり得る。さらに、融合前コンフォメーションでのコロナウイルスＳ外部ドメイン三量体の安定化には、対応するネイティブコロナウイルスＳ配列と比較して、変性に対する耐性の増大が含まれ得る。コロナウイルスの外部ドメイン三量体が融合前コンフォメーション内にあるかを決定する方法が本明細書に提供され、これには（これらに限定されないが）ネガティブ染色電子顕微鏡法及び融合前コンフォメーション特異的抗体を使用する抗体結合アッセイが含まれる。
場合によっては、コロナウイルスのウイルス抗原または免疫原は、Ｓタンパク質ペプチドの断片である。いくつかの実施形態では、抗原または免疫原は、Ｓタンパク質ペプチドのエピトープである。エピトープは、特異的な免疫応答を誘発するように、抗原性である分子上に抗原決定基化学基またはペプチド配列を含み、例えば、エピトープは、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞が応答する抗原の領域である。抗体は、コロナウイルスＳ外部ドメイン上のエピトープなど、特定の抗原性エピトープに結合できる。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置される連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成され得る。いくつかの実施形態では、コロナウイルスエピトープは、線状エピトープである。いくつかの実施形態では、コロナウイルスエピトープは、コンフォメーションエピトープである。いくつかの実施形態では、コロナウイルスエピトープは、中和エピトープ部位である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスＳタンパク質ペプチドまたはその断片のすべての中和エピトープが、抗原または免疫原として存在する。
場合によっては、例えばウイルス抗原または免疫原が、Ｓタンパク質ペプチドの断片である場合、Ｓタンパク質ペプチドの単一サブユニットのみが存在し、Ｓタンパク質ペプチドのこの単一サブユニットが三量体化される。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、シグナルペプチド、Ｓ１サブユニットペプチド、Ｓ２サブユニットペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、シグナルペプチド、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ペプチド、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）ペプチド、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタドリピート１（ＨＲ１）ペプチド、またはヘプタドリピート２（ＨＲ２）ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｓタンパク質のＳ１サブユニット及びＳ２サブユニットを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｓタンパク質のＳ１サブユニットを含むが、Ｓ２サブユニットは含まない。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｓタンパク質のＳ２サブユニットを含むが、Ｓ１サブユニットは含まない。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、膜貫通（ＴＭ）ドメインペプチド及び／または細胞質（ＣＰ）ドメインペプチドを含まない。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、プロテアーゼ切断部位を含み、プロテアーゼは、任意により、フリン、トリプシン、第Ｘａ因子、またはカテプシンＬである。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、プロテアーゼ切断部位を含まず、プロテアーゼは、任意により、フリン、トリプシン、第Ｘａ因子、またはカテプシンＬであるか、またはプロテアーゼによって切断できない変異プロテアーゼ切断部位を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質またはその断片を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原である。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性抗体及び／またはＴ細胞によって認識される。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、不活化全ウイルスである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ウイルスのサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質は、スパイク（Ｓ）タンパク質、膜（Ｍ）タンパク質、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、及びエンベロープ（Ｅ）タンパク質からなる群のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非構造タンパク質またはその断片を含むか、またはさらに含む。代表的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＭＮ９０８９４７．３として表されている（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５７９：２６５－２６９，２０２０）。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５５で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、以下に示す配列番号５５に対して、少なくともまたは約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する（受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）内の受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）を示す配列には、下線が引かれている）。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、ＲＢＤ－三量体、例えば、配列番号６７～８０のいずれかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ配列を含む。
10 20 30 40 50 60
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFS
70 80 90 100 110 120
NVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIV
130 140 150 160 170 180
NNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLE
190 200 210 220 230 240
GKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQT
250 260 270 280 290 300
LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETK
310 320 330 340 350 360
CTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISN
370 380 390 400 410 420
CVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIAD
430 440 450 460 470 480
YNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC
490 500 510 520 530 540
NGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVN
550 560 570 580 590 600
FNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITP
610 620 630 640 650 660
GTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSY
670 680 690 700 710 720
ECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTI
730 740 750 760 770 780
SVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQE
790 800 810 820 830 840
VFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDC
850 860 870 880 890 900
LGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAM
910 920 930 940 950 960
QMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALN
970 980 990 1000 1010 1020
TLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRA
1030 1040 1050 1060 1070 1080
SANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPA
1090 1100 1110 1120 1130 1140
ICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDP
1150 1160 1170 1180 1190 1200
LQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL
1210 1220 1230 1240 1250 1260
QELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDD
1270
SEPVLKGVKLHYT

いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、元のＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１コロナウイルスのスパイク糖タンパク質の配列（例えば、ＮＣ＿０４５５１２）を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．５２６系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、クラスタ－５（ΔＦＶＩスパイク）ウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．１．７系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．１．２０７系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．１．３１７系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．１．３１８系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｐ．１系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．３５１系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．４２９／ＣＡＬ．２０Ｃ系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．５２５系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．５２６系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．６１７系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．６１７．２系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．６１８系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．６２０系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｐ．２系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｐ．３系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．１．１４３系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ａ．２３．１系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｂ．１．６１７系統内のウイルスのスパイク糖タンパク質の配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１、Ｂ．１．５２６系統中のウイルス、Ｂ．１．１．７系統中のウイルス、Ｐ．１系統中のウイルス、Ｂ．１．３５１系統中のウイルス、Ｐ．２系統中のウイルス、Ｂ．１．１．１４３系統中のウイルス、Ａ．２３．１系統及びＢ．１．６１７系統中のウイルスからなる群から選択される任意の好適な組み合わせにおいて、任意の２つ以上のウイルスのスパイク糖タンパク質に由来する配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｂ．１．５２６バリアントにおけるように、Ｅ４８４Ｋ及び／またはＳ４７７Ｎを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、クラスター５（ΔＦＶＩスパイク）バリアントにおけるように、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えばＢ．１．１．７バリアントにおけるように、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Δ１４４（ΔＹ）、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、及び／またはＤ１１１８Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｂ．１．１．２０７バリアントにおけるように、Ｐ６８１Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｐ．１バリアントにおけるように、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、及び／またはＶ１１７６Ｆを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｐ．２バリアントにおけるように、Ｅ４８４Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｐ．３バリアントにおけるように、Ｅ４８４Ｋ及び／またはＮ５０１Ｙを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｂ．１．３５１バリアントにおけるように、Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、及び／またはＡ７０１Ｖを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｂ．１．４２９／ＣＡＬ．２０Ｃバリアントにおけるように、Ｓ１３Ｉ、Ｗ１５２Ｃ、及び／またはＬ４５２Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｂ．１．５２５バリアントにおけるように、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｅ４８４Ｋ及び／またはＦ８８８Ｌを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｂ．１．６１７バリアントにおけるように、Ｇ１４２Ｄ、Ｌ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、及び／またはＰ６８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｂ．１．６１７．２バリアントにおけるように、Ｇ１４２Ｄ、Ｌ４５２Ｒ、及び／またはＰ６８１Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、例えば、Ｂ．１．６１８バリアントにおけるように、Ｅ４８４Ｋを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、任意の好適な組み合わせで前述の突然変異のうちのいずれかの１つ以上を含む融合ポリペプチド（プロトマー）を含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、３つの融合ポリペプチドの三量体を含み得、３つのプロトマー融合ポリペプチドのうちのいずれも、任意の好適な組み合わせで、前述の突然変異のうちのいずれか１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、三量体を形成する３つのプロトマー融合ポリペプチドのうちの２つまたは３つすべてが、各プロトマー中に、異なる突然変異及び／または突然変異の異なる組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、三量体の混合物を含み得、各三量体は、異なる突然変異及び／または突然変異の異なる組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５５のアミノ酸１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位において、突然変異（例えば、置換（複数可）、欠失（複数可）、及び／または挿入（複数可））からなる群から選択される任意の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、アミノ酸４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、６１４位、６５５位、６８１位、及び７０１位において、突然変異（例えば、置換（複数可）、欠失（複数可）、及び／または挿入（複数可））からなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはすべてを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、コロナウイルスの第１のバリアントからの１つ以上の突然変異、及び第１のバリアントとは異なる、コロナウイルスの第２のバリアントからの１つ以上の突然変異など、異なるウイルスからの配列を含むキメラポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのようなキメラウイルス抗原もしくは免疫原（またはキメラウイルス抗原もしくは免疫原の組み合わせ）を使用して、コロナウイルスの第１のバリアント及び第２のバリアントの両方に対する広範な免疫応答を誘発し得る。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｇ、Ｓ４７７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、及びＡ７０１Ｖからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、全長Ｓタンパク質のシグナルペプチド、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含まない短縮型Ｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、組換えタンパク質であるが、他の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、ビリオンから精製される。いくつかの好ましい実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原は、単離された抗原である。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号２７で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２７の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号２７のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号２８で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２８の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号２８のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号２９で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２９の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号２９のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３０で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３０の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３０のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３１で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３１の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３１のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３２で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３２の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３２のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３３で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３３の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３３のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３４で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３４の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３４のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３５で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３５の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３５のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３６で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３６の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３６のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３７で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３７の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３７のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３８で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３８の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３８のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３９で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３９の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号３９のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４０で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４０の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４０のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４１で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４１の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４１のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４２で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４２の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４２のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４３で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４３の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４３のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４４で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４４の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４４のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４５で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４５の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４５のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４６で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４６の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４６のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４７で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４７の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４７のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４８で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４８の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４８のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４９で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４９の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号４９のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５０で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号５０の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５０のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５１で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号５１の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５１のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５２で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５２の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５３で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５３の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５４で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５４の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５５で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号５５の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５５のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５６で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び１１７６位からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号５６の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５６のバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５７で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５７の１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号５７の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５８で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５８の１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号５８の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５９で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号５９の１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失及び／または挿入を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６０で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６０の１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失及び／または挿入を含むアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６１で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６１の１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号６１の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６２で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６２の１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号６２の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６３で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６３の１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号６３の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６４で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６４の１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号６４の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６５で表されている配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６５の１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号６５の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ウイルス抗原または免疫原は、配列番号６６またはその一部などの膜貫通ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原は、可溶性のＳタンパク質ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、可溶性Ｓタンパク質ペプチドは、ＴＭドメインペプチド及びＣＰドメインペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、可溶性Ｓタンパク質ペプチドは、膜またはウイルスエンベロープなどの脂質二重層に結合しない。
いくつかの実施形態では、Ｓタンパク質ペプチドは、コドン最適化された核酸配列から生成される。いくつかの実施形態では、Ｓタンパク質ペプチドは、コドン最適化されていない核酸配列から生成される。
いくつかの実施形態では、本明細書で言及されるウイルス抗原または免疫原は、ウイルス抗原または免疫原を含む組換えポリペプチドまたは融合ペプチドを含むことができる。ウイルス抗原または免疫原という用語は、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原を含むタンパク質を指すために使用され得る。特定の場合において、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原は、本明細書で提供されるコロナウイルスタンパク質ペプチドである。
ＩＩ．組換えペプチド及びタンパク質
本明細書で提供されるコロナウイルスウイルス抗原及び免疫原、例えばＳタンパク質ペプチド（セクションＩを参照）は、他のタンパク質またはペプチドと結合、例えば連結して、融合ペプチドなどの組換えポリペプチドを形成することができることが企図される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される個々の組換えポリペプチド（例えば、単量体）は、会合して、組換えポリペプチドの多量体、例えば三量体を形成する。いくつかの実施形態では、個々の組換えポリペプチド単量体の会合は、共有結合による相互作用を介して生じる。いくつかの実施形態では、個々の組換えポリペプチド単量体の会合は、非共有結合による相互作用を介して生じる。いくつかの実施形態では、相互作用、例えば共有結合または非共有結合は、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原、例えばＳタンパク質ペプチドが連結するタンパク質またはペプチドによってもたらされる。いくつかの実施形態では、例えば、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原が、本明細書に記載のＳタンパク質ペプチドである場合、それが連結するタンパク質またはペプチドは、糖タンパク質のネイティブホモ三量体構造が保持されるように選択することができる。これは、Ｓタンパク質ペプチドに対する強力かつ効果的な免疫原性応答を誘起するのに有利であり得る。例えば、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原（例えば、Ｓタンパク質ペプチド）のネイティブコンフォメーションの保持及び／または維持は、免疫応答を生じ得る抗原部位へのアクセスを改善するかまたは可能にし得る。場合によっては、本明細書に記載のＳタンパク質ペプチドを含む組換えポリペプチド（例えば、セクションＩを参照）は、本明細書では、代替的には、組換えＳ抗原、組換えＳ免疫原、または組換えＳタンパク質と呼ばれる。
場合によっては、組換えポリペプチドまたはその多量体化組換えポリペプチドが凝集するか、または凝集でき、複数のコロナウイルスウイルス抗原及び／または免疫原組換えポリペプチドを含むタンパク質または複合体を形成することがさらに企図される。そのようなタンパク質の形成は、コロナウイルスウイルス抗原及び／または免疫原に対する強力かつ効果的な免疫原性応答を生じさせるために有利であり得る。例えば、複数の組換えポリペプチド、したがって複数のコロナウイルスウイルス抗原、例えばコロナウイルスＳタンパク質ペプチドを含むタンパク質の形成は、ウイルス抗原の三次及び／または四次構造を保持し、免疫応答をネイティブ構造に対して高めさせ得る。場合によっては、凝集により、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原の構造安定性がもたらされ得、これにより、免疫応答を促進できる潜在的な抗原部位へのアクセスが可能になる。
１．融合ペプチド及び組換えポリペプチド
いくつかの実施形態では、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原は、単量体の三量体化を促進するために、それらのＣ末端（Ｃ末端連結）において、三量体化ドメインに結合することができる。いくつかの実施形態では、三量体化は、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原、例えば、コロナウイルスＳタンパク質ペプチドの膜近位面を三量体構成で安定化させる。
可溶性組換えタンパク質の安定な三量体を促進する外因性多量体化ドメインの非限定的な例としては、ＧＣＮ４ロイシンジッパー（Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１－１４０７）、肺サーファクタントタンパク質からの三量体化モチーフ（Ｈｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．１９９４ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３４４：１９１－１９５）、コラーゲン （ＭｃＡｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２７８：４２２００－４２２０７）、及びファージＴ４フィブリチンＦｏｌｄｏｎ（Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １１：３２９－４１４）が挙げられ、これらのいずれも、組換えウイルス抗原または免疫原の三量体化を促進するために、本明細書に記載のコロナウイルスウイルス抗原または免疫原に連結することができる（例えば、ＳペプチドのＣ末端への連結によって）。米国特許第７，２６８，１１６号、同第７，６６６，８３７号、同第７，６９１，８１５号、同第１０，６１８，９４９号、同第１０，９０６，９４４号、及び同第１０，９６０，０７０号、及び米国特許第２０２０／０００９２４４号も参照されたい。これらは、すべての目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、１つ以上のペプチドリンカー（ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー、例えば、１０アミノ酸のグリシン－セリンペプチドリンカーなど）を使用して、組換えウイルス抗原または免疫原を多量体化ドメインに連結することができる。三量体は、組換えウイルス抗原または免疫原三量体が所望の特性（例えば、融合前コンフォメーション）を保持する限り、本明細書で提供される安定化突然変異のいずれか（またはその組み合わせ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドまたは融合タンパク質は、配列番号６７～８０のいずれかで表されている第２の配列に連結している配列番号２７～６６のいずれかで表されている第１の配列を含み、ここで、第１の配列のＣ末端は、第２の配列のＮ末端に直接連結されている。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドまたは融合タンパク質は、配列番号６７～８０のいずれかで表されている第２の配列に連結している配列番号２７～６６のいずれかで表されている第１の配列を含み、ここで、第１の配列のＣ末端は、例えば、リンカーを介して、第２の配列のＮ末端に間接的に連結されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン－Ｘ－Ｙリピートを含む配列を含む。
治療的に実現可能であるためには、生物製剤の設計にとって望ましい三量体化タンパク質部分は、次の基準を満たすものとする。理想的には、それは免疫グロブリンＦｃのような自然に分泌されるタンパク質の一部であるものとし、循環中に豊富に存在し（非毒性）、起源がヒトであり（免疫原性がない）、比較的安定しており（半減期が長い）、効率的な自己三量体化が可能であり、三量体化されたコロナウイルスウイルス抗原または免疫原が、構造的に安定であるように、鎖間の共有結合ジスルフィド結合によって強化されている。
コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要な構成要素である線維性タンパク質のファミリーである。これは、哺乳動物において最も豊富なタンパク質である、身体内の総タンパク質の約２５％を占めている。コラーゲンは、骨、腱、皮膚、角膜、軟骨、血管、歯の形成において主要な構造的役割を担っている。線維性型コラーゲンＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＸＩ型はすべて、プロコラーゲンと呼ばれるより大きい三量体前駆体として合成され、プロコラーゲンでは、数百の「Ｇ－Ｘ－Ｙ」リピート（またはグリシンリピート）からなる中央の途切れのない三重らせんドメインには、非コラーゲンドメイン（ＮＣ）、Ｎ－プロペプチド及びＣ－プロペプチドが隣接している。Ｃ末端及びＮ末端の両方の伸長は、プロコラーゲンの分泌時にタンパク質分解によりプロセシングされ、これは、不溶性細胞マトリックスを形成するコラーゲン線維への成熟タンパク質の集合を引き起こす事象である。ＢＭＰ－１は、グリシンリピートとコラーゲンのＣ－プロドメインとの間の接合部付近にあるプロコラーゲンの特定のペプチド配列を認識するプロテアーゼであり、プロペプチドの除去に関与する。Ｉ型コラーゲンの脱殻三量体Ｃ－プロペプチドは、正常な成人のヒト血清中に、５０～３００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で見られ、小児は、活発な骨形成を示すはるかに高いレベルを有する。Ｉ型コラーゲンのＣ－プロペプチドの家族性血清濃度が高いヒトでは、そのレベルは、明らかな異常なく、１～６μｇ／ｍＬほどに到達する可能性があり、これは、Ｃ－プロペプチドが毒性でないことを示唆するものである。コラーゲンの三量体Ｃ－プロペプチドの構造試験では、３つのサブユニットすべてがＮ末端近くの接合領域に集まって、プロコラーゲン分子の残りの部分に接続する三葉構造であることが示唆された。融合するタンパク質を一方向に投影する際のこのような形状は、Ｆｃ二量体の形状に類似している。
Ｉ型、ＩＶ型、Ｖ型、及びＸＩ型コラーゲンは、２つのα－１鎖及び１つのα－２鎖（Ｉ型、ＩＶ型、Ｖ型）、または３つの異なるα鎖（ＸＩ型）のいずれかからなるヘテロ三量体形態に主に組み立てられ、これらは、配列の相同性が高い。ＩＩ型及びＩＩＩ型コラーゲンは、両方ともα－１鎖のホモ三量体である。コラーゲンの最も豊富な形態であるＩ型コラーゲンの場合、安定したα（Ｉ）ホモ三量体も形成され、様々な組織中に様々なレベルで存在する。これらのコラーゲンＣ－プロペプチド鎖のほとんどは、細胞内で単独で過剰発現したときに、自己集合して、ホモ三量体になる。Ｎ－プロペプチドドメインが最初に合成されるが、三量体コラーゲンへの分子集合は、Ｃ－プロペプチドの登録された会合から開始される。Ｃ－プロペプチド複合体は、鎖間ジスルフィド結合の形成によって安定化されると考えられているが、適切な鎖登録のためのジスルフィド結合形成の必要性は明らかではない。グリシンの三重らせんは、反復し、会合するＣ末端からＮ末端にジッパー様態で広がる。この知識により、組換えＤＮＡ技術を使用して異なるコラーゲン鎖のＣ－プロペプチドを交換することにより、非天然型のコラーゲンマトリックスが作製される。サイトカイン及び成長因子などの非コラーゲンタンパク質も、プロコラーゲンまたは成熟コラーゲンのいずれかのＮ末端に融合され、これにより新規コラーゲンマトリックスの形成が可能になり、これは、細胞マトリックスからの非コラーゲンタンパク質の徐放を可能にすることを意図したものである。しかし、両方の状況下において、Ｃ－プロペプチドは、組換えコラーゲン線維が不溶性細胞マトリックスに集合する前に切断される必要がある。
他のタンパク質三量体化ドメイン、例えば、細菌ファージＴ４由来の酵母フィブリチン由来のＧＣＮ４由来のもの及び大腸菌のアスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ（ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｏｙｌａｓｅ）は、異種タンパク質の三量体化を可能にすることがこれまでに記載されているが、これらの三量体化タンパク質は、いずれも本質的にヒトのものではなく、天然の分泌されたタンパク質でもない。そのため、三量体融合タンパク質は、細胞内で作製する必要がある。これは、可溶性受容体などの自然に分泌されるタンパク質に対して誤って折り畳まれ得るのみでなく、他の何千もの細胞内タンパク質からのそのような融合タンパク質の精製も困難になり得る。さらに、そのような非ヒトタンパク質三量体化ドメイン（例えば、酵母、バクテリアファージ及び細菌由来）を三量体生物製剤の設計に使用することの致命的な欠点は、それらがヒト身体内において、推定される免疫原性であることであり、そのような融合タンパク質は、それらをヒトの身体に注射直後に無効になる。
したがって、本明細書に記載の組換えポリペプチド中でのコラーゲンの使用は、以下を含む多くの利点を有する：１）コラーゲンは、哺乳動物の身体内で分泌される最も豊富なタンパク質であり、身体内の全タンパク質のほぼ２５％を占める；（２）コラーゲンの主要な形態は、三量体ヘリックスとして自然に発生し、その球状Ｃ－プロペプチドが、三量体化の開始に関与する；（３）成熟コラーゲンからタンパク質分解的に放出されるコラーゲンの三量体Ｃ－プロペプチドは、哺乳動物の血液中にサブマイクログラム／ｍＬレベルで自然に見られ、身体に毒性があることは知られていない；（４）コラーゲンの直鎖状三重らせん領域は、１残基あたり２．９Ａの予測間隔でリンカーとして含めることができるか、または融合タンパク質の一部として除外することができるため、三量体化されるタンパク質とコラーゲンのＣ－プロペプチドとの間の距離は、最適な生物学的活性を達成するために正確に調節できる；（５）Ｃ－プロペプチドをプロコラーゲンから切断するＢＭＰ１の認識部位を変異または欠失させて、三量体融合タンパク質の破壊を防ぐことができる；（６）Ｃ－プロペプチドドメインは、ジスルフィド結合を介して自己三量体化し、ユニバーサルアフィニティタグを提供する。これにより、作製されたあらゆる分泌された融合タンパク質の精製に使用できる。いくつかの実施形態では、コロナウイルスウイルス抗原及び免疫原、例えばＳタンパク質ペプチドが結合するコラーゲンのＣ－プロペプチドにより、可溶性の共有結合により連結したホモ三量体融合タンパク質の組換え産生が可能になる。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原は、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結して、組換えポリペプチドを形成する。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、三量体を形成する。いくつかの実施形態では、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原は、セクションＩに記載のＳタンパク質ペプチドである。
例えば、配列番号１内の融合ポリペプチドのＮ末端上でのシグナルペプチドＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳ（配列番号５４）を含む融合ポリペプチドは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して産生され、三量体化され得る（ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し得るＣｙｓ残基は太字で示す）。
10 20 30 40 50 60
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFS
70 80 90 100 110 120
NVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIV
130 140 150 160 170 180
NNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLE
190 200 210 220 230 240
GKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQT
250 260 270 280 290 300
LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETK
310 320 330 340 350 360
CTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISN
370 380 390 400 410 420
CVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIAD
430 440 450 460 470 480
YNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC
490 500 510 520 530 540
NGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVN
550 560 570 580 590 600
FNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITP
610 620 630 640 650 660
GTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSY
670 680 690 700 710 720
ECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTI
730 740 750 760 770 780
SVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQE
790 800 810 820 830 840
VFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDC
850 860 870 880 890 900
LGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAM
910 920 930 940 950 960
QMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALN
970 980 990 1000 1010 1020
TLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRA
1030 1040 1050 1060 1070 1080
SANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPA
1090 1100 1110 1120 1130 1140
ICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDP
1150 1160 1170 1180 1190 1200
LQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL
1210 1220 1230 1240 1250 1260
QELGKYEQYIKRSNGLPGPIGPPGPRGRTGDAGPVGPPGPPGPPGPPGPPSAGFDFSFLP
1270 1280 1290 1300 1310 1320
QPPQEKAHDGGRYYRANDANVVRDRDLEVDTTLKSLSQQIENIRSPEGSRKNPARTCRDL
1330 1340 1350 1360 1370 1380
KMCHSDWKSGEYWIDPNQGCNLDAIKVFCNMETGETCVYPTQPSVAQKNWYISKNPKDKR
1390 1400 1410 1420 1430 1440
HVWFGESMTDGFQFEYGGQGSDPADVAIQLTFLRLMSTEASQNITYHCKNSVAYMDQQTG
1450 1460 1470 1480 1490 1500
NLKKALLLQGSNEIEIRAEGNSRFTYSVTVDGCTSHTGAWGKTVIEYKTTKTSRLPIIDV
1510 1520
APLDVGAPDQEFGFDVGPVCFL
いくつかの実施形態では、ポリペプチド間ジスルフィド結合は、任意の好適な組み合わせで、Ｃｙｓ１５－１３６、Ｃｙｓ１３１－１６６、Ｃｙｓ２９１－３０１、Ｃｙｓ３７９－４３２、Ｃｙｓ３３６－３６１、Ｃｙｓ３９１－５２５、Ｃｙｓ４８０－４８８、Ｃｙｓ５３８－５９０、Ｃｙｓ６１７－６４９、Ｃｙｓ６６２－６７１、Ｃｙｓ７４３－７４９、Ｃｙｓ７３８－７６０、Ｃｙｓ８４０－８５１、Ｃｙｓ１０３２－１０４３、及びＣｙｓ１０８２－１１２６の１つ以上またはすべてを含み得る。いくつかの実施形態では、三量体中の融合ポリペプチドは、任意の好適な組み合わせで、例えば、１７、６１、１２２、１４９、１６５、２３４、２８２、３３１、３４３、６０３、６１６、６５７、７０９、７１７、８０１、１０７４、１０９８、及び１１３４をＡｓｎ残基の１つ以上またはすべてにおいて、１つ以上のグリコシル化部位（例えば、Ａｓｎ連結）を含み得る。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、ヒトコラーゲンのものである。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、ｐｒｏα１（Ｉ）、ｐｒｏα１（ＩＩ）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）、ｐｒｏα１（Ｖ）、ｐｒｏα１（ＸＩ）、ｐｒｏα２（Ｉ）、ｐｒｏα２（Ｖ）、ｐｒｏα２（ＸＩ）、もしくはｐｒｏα３（ＸＩ）のＣ末端プロペプチド、またはそれらの断片を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、ｐｒｏα１（Ｉ）のＣ末端ポリペプチドであるか、またはｐｒｏα１（Ｉ）のＣ末端ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６７によって表されているアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６７の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６８によって表されているアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６８の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６９によって表されているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６９の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を呈する。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７０によって表されているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７０の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７１によって表されているアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７１の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７２によって表されているアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７２の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７３によって表されているアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７３の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７４によって表されているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７４の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を呈する。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７５によって表されているアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７５の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７６によって表されているアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７６の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７７によって表されているアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７７の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７８によって表されているアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７８の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７９によって表されているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号７９の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を呈する。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号８０によって表されているアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号８０の配列と少なくともまたは約８５％、９０％、９２％、９５％、または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、例えば、配列番号６８に示すように（ここでは、ＲＡＤが、ＲＡＮに変異する）、ＢＭＰ－１部位においてアスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換を有するコラーゲン三量体化ドメイン（例えば、ヒトα１（Ｉ）コラーゲンのＣ－プロペプチド）のアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、例えば、配列番号６９に示すように（ここでは、ＲＡＤが、ＲＮＤに変異する）、ＢＭＰ－１部位においてアラニン（Ａ）からアスパラギン（Ｎ）への置換を有するコラーゲン三量体化ドメイン（例えば、ヒトα１（Ｉ）コラーゲンのＣ－プロペプチド）のアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書のＣ末端プロペプチドは、変異ＢＭＰ－１部位、例えば、ＤＤＡＮの代わりにＲＳＡＮを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書のＣ末端プロペプチドは、ＢＭＰ－１部位、例えば、本明細書に開示される融合ポリペプチドにおいて使用され得るＲＡＮ（例えば、ＲＡＮＤＡＮ）またはＲＮＤ（例えば、ＲＮＤＤＡＮ）の代わりに、ＲＡＤ（例えば、ＲＡＤＤＡＮ）配列を含む配列（例えば、配列番号６８または６９）を含み得る。例えば、配列番号２７（下線部）またはその断片、バリアントもしくは変異体は、配列番号６７（イタリック体）またはその断片、バリアント、または変異体を直接または間接的に連結させて、例えば、以下の融合タンパク質を形成する：
































いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、配列番号６７～８０のいずれかの断片であるアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端プロペプチドは、グリシン－Ｘ－Ｙリピートを含む配列（式中、Ｘ及びＹは、独立して任意のアミノ酸、または少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、もしくは９７％同一であるアミノ酸配列である）を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる。いくつかの実施形態では、Ｘ及びＹは、独立してプロリンまたはヒドロキシプロリンである。
Ｓタンパク質ペプチドをＣ末端プロペプチドに連結させて組換えポリペプチドを形成するいくつかの場合において、組換えポリペプチドは、Ｓタンパク質ペプチドのホモ三量体をもたらす三量体を形成する。いくつかの実施形態では、三量体化組換えポリペプチドのＳタンパク質ペプチドは、融合前コンフォメーション内にある。いくつかの実施形態では、三量体化組換えポリペプチドのＳタンパク質ペプチドは、融合後コンフォメーション内にある。いくつかの実施形態では、このコンフォメーション状態では、Ｓタンパク質ペプチド上の異なる抗原部位へのアクセスが可能になる。いくつかの実施形態では、抗原部位は、線状エピトープまたはコンフォメーションエピトープなどのエピトープである。記載されている三量体化組換えポリペプチドを有することの利点は、種々の潜在的かつ多様な抗原部位に対して免疫応答を高めることができることである。
いくつかの実施形態では、三量体化組換えポリペプチドとしては、同じウイルス抗原または免疫原を含む個々の組換えポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、三量体化組換えポリペプチドとしては、他の組換えポリペプチドとは異なるウイルス抗原または免疫原をそれぞれが含む個々の組換えポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態では、三量体化組換えポリペプチドとしては、個々の組換えポリペプチドのうちの１つが、他の組換えポリペプチドとは異なるウイルス抗原または免疫原を含む、個々の組換えポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、三量体化組換えポリペプチドとしては、個々の組換えポリペプチドのうちの２つが同じウイルス抗原または免疫原を含み、かつウイルス抗原または免疫原が、残りの組換えポリペプチドに含まれるウイルス抗原または免疫原とは異なる、個々の組換えポリペプチドが挙げられる。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、セクションＩに記載の任意のコロナウイルスウイルス抗原または免疫原を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、本明細書に記載のコラーゲンのＣ末端プロペプチドに、本明細書に記載のとおり連結されているセクションＩに記載の任意のコロナウイルスウイルス抗原または免疫原を含む。
いくつかの実施形態では、免疫原は、融合前コンフォメーション内のＳ外部ドメイン三量体を安定化する、ＨＲ１ドメインと中央ヘリックスドメインとの間の境界またはその近くに、１つ以上（２つなど、例えば連続する２つ）のプロリン置換を含むプロトマーを含む組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ外部ドメイン三量体を含む。いくつかのそのような実施形態では、融合前コンフォメーションのＳ外部ドメインを安定化する１つ以上（２つ、例えば連続する２つなど）のプロリン置換は、ＨＲ１のＣ末端残基のＮ末端の１５位アミノ酸と、中央ヘリックスのＮ末端残基の５位アミノ酸Ｃ末端との間にある。
いくつかの実施形態では、１つ以上（２つ、例えば連続する２つなど）のプロリン置換は、融合前コンフォメーション内でコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）Ｓ外部ドメイン三量体を安定化させる。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ペプチドは、９８６Ｋ／９８７Ｖから９８６Ｐ／９８７Ｐへの突然変異を含む。
いくつかの実施形態では、融合前コンフォメーションで安定化された組換えコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）Ｓ外部ドメイン三量体は、Ｓ１／Ｓ２及び／またはＳ２’プロテアーゼ切断部位への突然変異を含む単鎖Ｓ外部ドメインプロトマーを含み、これにより、これらの部位でのプロテアーゼの切断を防ぐ。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ペプチドは、６８５Ｒから６８５Ａへの突然変異を含む。様々なウイルスのプロテアーゼ切断部位の例を以下に示す：


いくつかの実施形態では、１つ以上のプロリン置換（９８６Ｐ／９８７Ｐ置換など）によって、融合前コンフォメーション内に安定化された組換えコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）Ｓ外部ドメイン三量体のプロトマーは、プロテアーゼ切断部位での変異など、融合前コンフォメーション内の安定化を行うために追加の修飾を含み、これにより、プロテアーゼ切断を防ぐ。
配列番号５５として提供されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質配列に関して、外部ドメインは、細胞プロセシング中に除去されるシグナルペプチド（ＳＰ）；Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）；受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）；１つ以上のＳ１／Ｓ２切断部位；融合ペプチド（ＦＰ）；内部融合ペプチド（ＩＦＰ）；ヘプタドリピート１／２（ＨＲ１／２）、及び膜貫通ドメイン（ＴＭ）を含む。配列の例示的供給源は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＭＮ９０８９４７．３、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＭＮ９０８９４７、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／ＭＮ９０８９４７．２で見ることができる。肺炎ウイルス単離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１、完全なゲノムなど、追加の配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２－ｓｅｑｓ／で見ることができる。
いくつかの実施形態では、融合前安定化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ外部ドメイン三量体のプロトマーは、ＮＴＤ、ＲＢＤ、Ｓ１（Ｓ１／Ｓ２部位１またはＳ１／Ｓ２部位２のいずれか）、ＦＰ、ＩＦＰ、ＨＲ１、ＨＲ２、または外部ドメインのＣ末端残基のＣ末端残基（例えば、三量体化ドメインまたは膜貫通ドメインに連結され得る）を有することができる。Ｓタンパク質の位置の番号付けは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ株間で異なり得るが、配列を整列させて、関連する構造ドメイン及び切断部位を決定することができる。免疫原としてのＳ外部ドメイン三量体の有用性を低下させることなく、開示された免疫原において、外部ドメイン断片のいずれかのＮ末端及びＣ末端上のいくつかの残基（最大１０など）を除去または修飾することができることが理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＮＴＤペプチドであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＲＢＤペプチドであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＮＴＤペプチド及びＲＢＤペプチドであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＳ１ドメインペプチドであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のＳ２ドメインペプチドであるか、またはそれらを含む。
シグナルペプチドを含まない例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｓ組換えポリペプチドは、配列番号２６（１４９１ａａ）内に提供される：
10 20 30 40 50 60
SDLDRCTTFD DVQAPNYTQH TSSMRGVYYP DEIFRSDTLY LTQDLFLPFY SNVTGFHTIN
70 80 90 100 110 120
HTFDNPVIPF KDGIYFAATE KSNVVRGWVF GSTMNNKSQS VIIINNSTNV VIRACNFELC
130 140 150 160 170 180
DNPFFAVSKP MGTQTHTMIF DNAFNCTFEY ISDAFSLDVS EKSGNFKHLR EFVFKNKDGF
190 200 210 220 230 240
LYVYKGYQPI DVVRDLPSGF NTLKPIFKLP LGINITNFRA ILTAFLPAQD TWGTSAAAYF
250 260 270 280 290 300
VGYLKPTTFM LKYDENGTIT DAVDCSQNPL AELKCSVKSF EIDKGIYQTS NFRVVPSRDV
310 320 330 340 350 360
VRFPNITNLC PFGEVFNATK FPSVYAWERK RISNCVADYS VLYNSTFFST FKCYGVSATK
370 380 390 400 410 420
LNDLCFSNVY ADSFVVKGDD VRQIAPGQTG VIADYNYKLP DDFMGCVLAW NTRNIDATST
430 440 450 460 470 480
GNYNYKYRYL RHGKLRPFER DISNVPFSPD GKPCTPPALN CYWPLNDYGF YTTTGIGYQP
490 500 510 520 530 540
YRVVVLSFEL LNAPATVCGP KLSTDLIKNQ CVNFNFNGLT GTGVLTPSSK RFQPFQQFGR
550 560 570 580 590 600
DVSDFTDSVR DPKTSEILDI SPCSFGGVSV ITPGTNASSE VAVLYQDVNC TDVSTAIHAD
610 620 630 640 650 660
QLTPAWRIYS TGNNVFQTQA GCLIGAEHVD TSYECDIPIG AGICASYHTV SLLRSTSQKS
670 680 690 700 710 720
IVAYTMSLGA DSSIAYSNNT IAIPTNFSIS ITTEVMPVSM AKTSVDCNMY ICGDSTECAN
730 740 750 760 770 780
LLLQYGSFCT QLNRALSGIA AEQDRNTREV FAQVKQMYKT PTLKDFGGFN FSQILPDPLK
790 800 810 820 830 840
PTKRSFIEDL LFNKVTLADA GFMKQYGECL GDINARDLIC AQKFNGLTVL PPLLTDDMIA
850 860 870 880 890 900
AYTAALVSGT ATAGWTFGAG AALQIPFAMQ MAYRFNGIGV TQNVLYENQK QIANQFNKAI
910 920 930 940 950 960
SQIQESLTTT STALGKLQDV VNQNAQALNT LVKQLSSNFG AISSVLNDIL SRLDKVEAEV
970 980 990 1000 1010 1020
QIDRLITGRL QSLQTYVTQQ LIRAAEIRAS ANLAATKMSE CVLGQSKRVD FCGKGYHLMS
1030 1040 1050 1060 1070 1080
FPQAAPHGVV FLHVTYVPSQ ERNFTTAPAI CHEGKAYFPR EGVFVFNGTS WFITQRNFFS
1090 1100 1110 1120 1130 1140
PQIITTDNTF VSGNCDVVIG IINNTVYDPL QPELDSFKEE LDKYFKNHTS PDVDLGDISG
1150 1160 1170 1180 1190 1200
INASVVNIQE EIDRLNEVAK NLNESLIDLQ ELGKYEQYIK RSNGLPGPIG PPGPRGRTGD
1210 1220 1230 1240 1250 1260
AGPVGPPGPP GPPGPPGPPS AGFDFSFLPQ PPQEKAHDGG RYYRANDANV VRDRDLEVDT
1270 1280 1290 1300 1310 1320
TLKSLSQQIE NIRSPEGSRK NPARTCRDLK MCHSDWKSGE YWIDPNQGCN LDAIKVFCNM
1330 1340 1350 1360 1370 1380
ETGETCVYPT QPSVAQKNWY ISKNPKDKRH VWFGESMTDG FQFEYGGQGS DPADVAIQLT
1390 1400 1410 1420 1430 1440
FLRLMSTEAS QNITYHCKNS VAYMDQQTGN LKKALLLQGS NEIEIRAEGN SRFTYSVTVD
1450 1460 1470 1480 1490
GCTSHTGAWG KTVIEYKTTK TSRLPIIDVA PLDVGAPDQE FGFDVGPVCF L
上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１ Ｓ組換えポリペプチドは、配列番号５３に提供されるＮ末端シグナルペプチドを含み得る。
シグナルペプチドを含まない例示的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ組換えポリペプチドは、配列番号１（１５０９ａａ）内に提供される：
10 20 30 40 50 60
QCVNLTTRTQ LPPAYTNSFT RGVYYPDKVF RSSVLHSTQD LFLPFFSNVT WFHAIHVSGT
70 80 90 100 110 120
NGTKRFDNPV LPFNDGVYFA STEKSNIIRG WIFGTTLDSK TQSLLIVNNA TNVVIKVCEF
130 140 150 160 170 180
QFCNDPFLGV YYHKNNKSWM ESEFRVYSSA NNCTFEYVSQ PFLMDLEGKQ GNFKNLREFV
190 200 210 220 230 240
FKNIDGYFKI YSKHTPINLV RDLPQGFSAL EPLVDLPIGI NITRFQTLLA LHRSYLTPGD
250 260 270 280 290 300
SSSGWTAGAA AYYVGYLQPR TFLLKYNENG TITDAVDCAL DPLSETKCTL KSFTVEKGIY
310 320 330 340 350 360
QTSNFRVQPT ESIVRFPNIT NLCPFGEVFN ATRFASVYAW NRKRISNCVA DYSVLYNSAS
370 380 390 400 410 420
FSTFKCYGVS PTKLNDLCFT NVYADSFVIR GDEVRQIAPG QTGKIADYNY KLPDDFTGCV
430 440 450 460 470 480
IAWNSNNLDS KVGGNYNYLY RLFRKSNLKP FERDISTEIY QAGSTPCNGV EGFNCYFPLQ
490 500 510 520 530 540
SYGFQPTNGV GYQPYRVVVL SFELLHAPAT VCGPKKSTNL VKNKCVNFNF NGLTGTGVLT
550 560 570 580 590 600
ESNKKFLPFQ QFGRDIADTT DAVRDPQTLE ILDITPCSFG GVSVITPGTN TSNQVAVLYQ
610 620 630 640 650 660
DVNCTEVPVA IHADQLTPTW RVYSTGSNVF QTRAGCLIGA EHVNNSYECD IPIGAGICAS
670 680 690 700 710 720
YQTQTNSPRR ARSVASQSII AYTMSLGAEN SVAYSNNSIA IPTNFTISVT TEILPVSMTK
730 740 750 760 770 780
TSVDCTMYIC GDSTECSNLL LQYGSFCTQL NRALTGIAVE QDKNTQEVFA QVKQIYKTPP
790 800 810 820 830 840
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850 860 870 880 890 900
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910 920 930 940 950 960
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1509
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上記のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ組換えポリペプチドは、配列番号５４に提供されるＮ末端シグナルペプチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１のバリアントを含むか、またはそのバリアントからなり、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２のバリアントであるか、またはそれを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号３で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号３の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号３のバリアントであるか、またはそれを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号４で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号４の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号４のバリアントであるか、そのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号５で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号５の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号５のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号６で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号６の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号６のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号７で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号７の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号７のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号８で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号８の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号８のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号９で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号９の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号９のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１０で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１０の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１０のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１１で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１１の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１１のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１２で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１２の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１２のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１３で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１３の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１３のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１４で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１４の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１４のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１５で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位などに、またはそれらの任意の組み合わせでに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１５の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１５のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１６で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１６の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１６のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１７で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１７の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１７のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１８で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１８の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１８のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１９で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号１９の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号１９のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２０で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２０の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２０のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２１で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２１の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２１のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２２で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２２の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２２のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２３で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２３の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２３のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２４で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２４の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２４のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２５で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸位置（配列番号５５に対するアミノ酸位置）、例えば、１３位、１８位、２０位、２６位、６９位、７０位、８０位、１３８位、１４２位、１４４位、１５２位、１９０位、２１５位、２４２位、２４３位、２４４位、２４６位、４００位、４０１位、４０２位、４１７位、４４０位、４５２位、４７７位、４８４位、５０１位、５７０位、６１４位、６５５位、６８１位、６８２位、６８３位、６８４位、６８５位、７０１位、７１６位、８８８位、９８２位、１０２７位、１１１８位、及び／または１１７６位など、またはそれらの任意の組み合わせに、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２５の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２５のバリアントであるか、またはそのバリアントを含み、バリアントは、Ｓ１３Ｉ、Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Δ６９～７０（ΔＨＶ）、Ｄ８０Ａ、Ｄ１３８Ｙ、Ｇ１４２Ｄ、Δ１４４（ΔＹ）、Ｗ１５２Ｃ、Ｒ１９０Ｓ、Ｄ２１５Ｇ、Δ２４２～２４４（ΔＬＡＬ）、Ｒ２４６Ｉ、Δ４００～４０２（ΔＦＶＩ）、Ｋ４１７Ｔ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ４４０Ｋ、Ｌ４５２Ｒ、Ｓ４７７Ｎ、Ｓ４７７Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ４８４Ｑ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｐ６８１Ｈ、Ｐ６８１Ｒ、Ｒ６８２Ｇ、Ｒ６８３Ｓ、Ｒ６８５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｔ７１６Ｉ、Ｆ８８８Ｌ、Ｓ９８２Ａ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｄ１１１８Ｈ、及びＶ１１７６Ｆまたはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される突然変異のうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２６で表されている配列であるか、またはその配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、配列番号２６の１つ以上のアミノ酸位置に、置換、欠失、及び／または挿入を含む配列など、配列番号２６の配列と少なくともまたは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはその配列を含む。
上記のとおり、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組換えポリペプチドは、会合して三量体を形成するのみでなく、凝集または凝集することができて、複数の組換えポリペプチドを含むタンパク質を生成することもできる。いくつかの実施形態では、形成されたタンパク質は、マクロ構造を有する。場合によっては、マクロ構造により、コロナウイルスウイルス抗原または免疫原組換えポリペプチドの構造安定性がもたらされ得、これにより、免疫応答を促進できる潜在的な抗原部位へのアクセスが可能になる。
いくつかの実施形態では、三量体化組換えポリペプチドは、凝集して、複数の三量体化組換えポリペプチドを含むタンパク質を形成する。いくつかの実施形態では、複数の三量体化組換えポリペプチドは、マクロ構造を有するタンパク質を形成する。
いくつかの実施形態では、複数の組換えポリペプチドを含む本明細書に記載のタンパク質は、免疫原である。いくつかの実施形態では、複数の組換えポリペプチドを含む本明細書に記載のタンパク質は、ナノ粒子に含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、タンパク質は、ナノ粒子、例えばタンパク質ナノ粒子に直接連結される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ナノ粒子に間接的に連結される。いくつかの実施形態では、複数の組換えポリペプチドを含む本明細書に記載のタンパク質は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）に含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、任意の好適な組み合わせで、配列番号１～２６からなる群から選択される組換えポリペプチド、またはその断片、バリアント、もしくは変異体を含む複合体である。いくつかの実施形態では、配列番号１～２６またはその断片、バリアント、もしくは変異体からなる群から選択される組換えポリペプチドの三量体を含む複合体を提供し、組換えポリペプチドは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して三量体化されて、三量体を形成する。
いくつかの実施形態では、複数の組換えポリペプチドを含む融合タンパク質が本明細書に提供され、各組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ａ）コロナウイルススパイクタンパク質外部ドメインの一部を含む第１の領域であって、非キメラコロナウイルススパイクタンパク質内にある、第１のコロナウイルスのコロナウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に先行する、領域；ｂ）第１のコロナウイルスとは異なる第２のコロナウイルスのコロナウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む第２の領域；ｃ）組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドがポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する、コラーゲンのＣ末端プロペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第２の領域とコラーゲンのＣ末端プロペプチドとの間に第３の領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、第３の領域は、第３のコロナウイルスのＳ１ドメインを含み、第３のコロナウイルスは、第１のコロナウイルスまたは第２のコロナウイルスと同じであるかまたは異なる。いくつかの実施形態では、第３の領域は、第４のコロナウイルスのＳ２ドメインを含み、第４のコロナウイルスは、第１のコロナウイルス、第２のコロナウイルス、または第４のコロナウイルスと同じであるかまたは異なる。いくつかの実施形態では、第１の領域は、第１のコロナウイルスのＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の領域は、第２のコロナウイルス内の対応するアミノ酸残基（複数可）とは異なる１つ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、第２の領域は、第１のコロナウイルス内の対応するアミノ酸残基（複数可）とは異なる１つ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルス及び第２のコロナウイルスは、同じコロナウイルスの異なるバリアントまたは株である。いくつかの実施形態では、第１の領域は、第１のコロナウイルスのＮＴＤを含み、第２の領域は、第２のコロナウイルスのＲＢＤを含み、第１のコロナウイルス及び第２のコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なるバリアントである。いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルス及び第２のコロナウイルスは、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．１．１４３、Ｐ．２、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．６１７、及びＡ．２３．１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスからなる群から独立して選択される。
いくつかの実施形態では、３つの組換えポリペプチドを含む三量体融合タンパク質が本明細書に提供され、各組換えポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシ末端まで：ａ）Ｂ．１．５２６系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコロナウイルススパイクタンパク質Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含む第１の領域；ｂ）Ｂ．１．３５１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコロナウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む第２の領域；及びｃ）組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドが、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する、コラーゲンのＣ末端プロペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、哺乳動物におけるコロナウイルスによる感染を予防するための方法が本明細書に提供され、本方法は、有効量の本明細書に開示される融合タンパク質で哺乳動物を免疫化することを含む。いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルス及び第２のコロナウイルスに対する中和抗体が、哺乳動物内で生成される。いくつかの実施形態では、第１のコロナウイルス及び第２のコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なるバリアントであり、哺乳動物内で生成された中和抗体は、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．１．１４３、Ｐ．２、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．６１７、及びＡ．２３．１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのうちの２つ以上を中和する。いくつかの実施形態では、哺乳動物内で生成された中和抗体は、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．１．１４３、Ｐ．２、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．６１７、及びＡ．２３．１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのうちの３つ以上を中和する。いくつかの実施形態では、この方法は、哺乳動物を、融合タンパク質を２回以上投与することにより免疫化することを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント由来のＮＴＤ及びＲＢＤを含むスパイクタンパク質ペプチドを含む免疫原の１回または複数回投与後のブースター投与として行われる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスのスパイク（Ｓ）糖タンパク質に由来するか、またはそれらから修飾された、操作された融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、コロナウイルスの野生型Ｓタンパク質配列と比較して、本明細書に開示される融合ポリペプチドは、融合前コンフォメーション内で安定化され得る。いくつかの実施形態では、三量体化ドメインへの融合は、融合タンパク質中においてＳタンパク質ペプチドが直線ヘリックスを形成するのを防ぎ得る（例えば、膜融合プロセス中に起こるものと同様である）。例えば、Ｓ－三量体サブユニットワクチン候補のｃｒｙｏ－ＥＭ構造は、洗浄剤の存在下で融合前状態及び融合後状態の両方を形成する全長野生型スパイクタンパク質とは異なり、主に密閉された融合前状態をとることを示している。Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２０２１）ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００１９４－２１。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｓ１／Ｓ２切断部位を不活性化する修飾（複数可）；ヘプタドリピート１（ＨＲ１）領域と中央ヘリックス（ＣＨ）領域との間のターン領域内での突然変異（複数可）であって、これにより、ＨＲ１及びＣＨが線状ヘリックスを形成するのを妨げる突然変異；ならびに／または安定化突然変異に加えて、ヘプタドリピート２領域（ＨＲ２）の短縮を有する改変可溶性Ｓ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書の融合タンパク質は、融合前状態でスパイクタンパク質を安定化すると考えられているＫ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７ＰまたはＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｇなどの１つ以上の突然変異を含み得るが、必ずしも含む必要はない。いくつかの実施形態では、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７ＰまたはＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｇなどの突然変異は、三量体－タグ（登録商標）三量体化ドメインを含む本明細書に開示の融合ポリペプチドを安定化するために必要ではない。
これらの実施形態のいくつかでは、Ｓ１／Ｓ２切断部位を不活性化する突然変異は、ＲＲＡＲ（配列番号５５の６８２～６８５）のＧＳＡＧ（配列番号６０）との置換、ターン領域の突然変異は、二重突然変異Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７Ｇ、Ｋ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｐ、Ｋ９８６Ｇ／Ｖ９８７ＰまたはＫ９８６Ｐ／Ｖ９８７Ｇを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＨＲ２の短縮は、野生型可溶性Ｓ配列のＣ末端における配列番号６５に示される残基のうちの１つ以上の欠失を伴う。いくつかの実施形態では、免疫原ポリペプチドは、ＨＲ２と相互作用するＨＲ１の領域内に、（ａ）１つ以上のプロリンまたはグリシン置換、及び／または（ｂ）１つ以上のアミノ酸残基の挿入をさらに含むことができる。これらの実施形態のいくつかでは、免疫原ポリペプチドは、Ａ９４２Ｐ、Ｓ９４３Ｐ、Ａ９４４Ｐ、Ａ９４２Ｇ、Ｓ９４３Ｇ及びＡ９４４Ｇから選択される１つ以上の置換を有することができる。これらの実施形態のいくつかでは、挿入は、Ａ９４２～Ａ９４４の任意の残基間のＧまたはＧＳの挿入であり得る。
２．ポリヌクレオチド及びベクター
本明細書で提供されるコロナウイルス抗原または免疫原及び組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（核酸分子）、ならびにそのようなコロナウイルス抗原または免疫原及び組換えポリペプチドを発現するように細胞を遺伝子操作するためのベクターも提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドをコードする核酸配列などの単一の核酸配列を含む。他の例では、ポリヌクレオチドは、特定のコロナウイルスウイルス抗原または免疫原の組換えポリペプチドをコードする第１の核酸配列、及び異なるコロナウイルスウイルス抗原または免疫原を含む組換えポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドの発現を制御するために作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドの発現を制御するために作動可能に連結された２つ、３つ、またはそれ以上のプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、例えば、ポリヌクレオチドが、異なるコロナウイルスウイルス抗原または免疫原を含む組換えポリペプチドをコードする配列など、２つ以上の核酸コード配列を含む場合、少なくとも１つのプロモーターは、２つ以上の核酸配列の発現を制御するために作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、組換えポリペプチドの発現を制御するために作動可能に連結された２つ、３つ、またはそれ以上のプロモーターを含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド（複数可）の発現は、誘導性または条件付きである。したがって、いくつかの態様では、組換えポリペプチド（複数可）をコードするポリヌクレオチドは、条件付きプロモーター、エンハンサー、またはトランス活性化因子を含む。いくつかのそのような態様では、条件付きプロモーター、エンハンサー、またはトランス活性化因子は、誘導性プロモーター、エンハンサー、またはトランス活性化因子、または抑制可能プロモーター、エンハンサー、またはトランス活性化因子である。例えば、いくつかの実施形態では、誘導プロモーターまたは条件付きプロモーターを使用して、組換えポリペプチドの発現を特定の微小環境に制限することができる。いくつかの実施形態では、誘導プロモーターまたは条件付きプロモーターによって駆動される発現は、熱、放射線、または薬物などの外因性因子への曝露によって調節される。
ポリヌクレオチドが組換えポリペプチドをコードする複数の核酸配列を含む場合、ポリヌクレオチドは、１つ以上の核酸配列の間にペプチドをコードする核酸配列をさらに含み得る。場合によっては、核酸配列間に位置する核酸は、翻訳中または翻訳後に核酸配列の翻訳産物を分離するペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ペプチドは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、自己切断ペプチド、または、リボソームスキッピングを引き起こすペプチド、例えば、Ｔ２Ａペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、組換えポリペプチド（複数可）をコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルス形質導入、トランスフェクション、または形質転換などによって、培養細胞（例えば、宿主細胞）を含む組成物に導入される。いくつかの実施形態では、これにより、組換えポリペプチドの発現（例えば、産生）が可能になり得る。いくつかの実施形態では、発現された組換えポリペプチドは、精製される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチド（核酸分子）は、本明細書に記載のコロナウイルスウイルス抗原または免疫原をコードする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるポリヌクレオチド（核酸分子）は、本明細書に記載のコロナウイルスウイルス抗原または免疫原、例えばコロナウイルスＳタンパク質ペプチドを含む組換えポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の核酸分子を含むベクターまたは構築物も提供される。いくつかの実施形態では、ベクターまたは構築物は、組換えポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結されてその発現を駆動する１つ以上のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、１つまたは２つ以上の核酸分子、例えば、異なるコロナウイルスウイルス抗原または免疫原を含む組換えポリペプチドをコードする核酸分子に作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、ガンマレトロウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ベクターまたは構築物は、ポリヌクレオチドの１つ以上の核酸分子の発現を駆動する単一のプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、そのようなプロモーターは、マルチシストロン性（バイシストロン性またはトリシストロン性、例えば、米国特許第６，０６０，２７３号を参照）であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、転写ユニットは、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）を含むバイシストロン性ユニットとして操作することができ、これにより、単一のプロモーターからのメッセージによる遺伝子産物の共発現（例えば、異なる組換えポリペプチドをコードすること）が可能になる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、バイシストロン性であり、これにより、ベクターが、２つの核酸配列を含み、発現させることが可能になる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるベクターは、トリシストロン性であり、これにより、ベクターが、３つの核酸配列を含み、発現させることが可能になる。
いくつかの実施形態では、単一のプロモーターは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に、自己切断ペプチドをコードする配列（例えば、２Ａ配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フリン）により、互いに分離された（例えば、キメラシグナル伝達受容体をコードする、及び組換え受容体をコードする）２つまたは３つの遺伝子を含むＲＮＡの発現を指示する。したがって、ＯＲＦは、翻訳中（２Ａの場合）または翻訳後に、個々のタンパク質にプロセシングされる単一のポリペプチドをコードする。場合によっては、Ｔ２Ａなどのペプチドによって、リボソームが２ＡエレメントのＣ末端で結合されているペプチドの合成をスキップできるようになり（リボソームスキッピング）、これにより、２Ａ配列の末端と次のペプチド下流との間の分離がもたらされる（例えば、ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒ．２：１３（２００４）及びｄｅＦｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｆｆｉｃ ５：６１６－６２６（２００４））を参照されたい）。多くの２Ａエレメントが当技術分野で知られている。本明細書に開示の方法及び核酸において使用することができる２Ａ配列の例としては、これらに限定されないが、米国特許出願公開第２００７０１１６６９０号に記載の口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａ型ウイルス（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）及びブタテスコウイルス－１ （Ｐ２Ａ）由来の２Ａ配列が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスに含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスは、偽ウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ウイルス様粒子である。いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞に含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターが含まれるウイルスまたは細胞は、組換えゲノムを含む。
ＩＩＩ．免疫原性組成物及び製剤
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、配列番号１～２６からなる群から選択される配列を含む組換えポリペプチドの三量体、または三量体のうちの任意の２つ以上の組み合わせを含む免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、配列番号１で表されている配列を有する組換えポリペプチドの三量体を含む免疫原性組成物である。
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物の単位用量は、約１０μｇ～約１００μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、好ましくは約２５μｇ～約７５μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、好ましくは約４０μｇ～約６０μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、または約５０μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含み得る。いくつかの実施形態では、用量は、３μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含む。他の実施形態では、用量は、９μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含む。さらなる実施形態では、用量は、３０μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原を含む。
場合によっては、開示された免疫原を、他の薬剤に対する防御応答を誘導する他の医薬品（例えば、ワクチン）と組み合わせることが望ましくもあり得る。例えば、本明細書に記載の組換えコロナウイルスＳ抗原、例えば、三量体またはタンパク質を含む組成物は、対象となる年齢層（例えば、生後約１～６ヶ月の乳児）に、インフルエンザワクチンまたは水痘帯状疱疹ワクチンなど、Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＡＣＩＰ；ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ａｃｉｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によって推奨される他のワクチンと同時に（典型的には別々に）、または順次投与することができる。したがって、本明細書に記載の組換えコロナウイルスＳ抗原を含む開示されている免疫原は、例えば、Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）、ジフテリア、破傷風及び百日咳（ＤＴａＰ）、肺炎球菌（ＰＣＶ）、インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）、ポリオ、インフルエンザ、及びロタウイルスに対するワクチンと同時にまたは順次投与され得る。
多価ワクチンまたは混合ワクチンは、複数の病原体に対する保護を提供する。いくつかの態様では、多価ワクチンは、同じ病原体の複数の株に対して保護することができる。いくつかの態様では、多価ワクチンは、破傷風（ｔｅｎｔｕｓ）、百日咳、及びジフテリアの株から保護する混合ワクチンＴｄａｐなど、複数の病原体から保護する。多価ワクチンは、複数の病原体または病原性株に対する保護を付与するために必要な免疫化の回数を最小限に抑え、これにより、投与コストを削減し、かつ到達率を高めるために非常に望ましいものである。これは、例えば、新生児及び小児にワクチン接種する場合に特に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、例えば本明細書に記載の免疫原性組成物を含むワクチンは、多価ワクチンである。いくつかの実施形態では、多価ワクチン組成物に組み込むための抗原性物質は、例えば本明細書に記載のコロナウイルス株または型に由来する（例えば、セクションＩを参照）。多価ワクチン組成物に組み込むための抗原は、より広い範囲の保護をもたらすために、コロナウイルスの１つの株または複数の株、例えば２～５株に由来し得る。一実施形態では、多価ワクチン組成物に組み込むための抗原は、コロナウイルスの複数の株に由来する。他の有用な抗原としては、不活化ポリオウイルスなどの生ウイルス、弱毒化ウイルス及び不活化ウイルス（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，（１９８６）１４：１０３－９）、Ａ型肝炎ウイルス弱毒株（Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，（１９８４）１４：３７３－８６）、弱毒麻疹ウイルス（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，（１９９５）３３２：１２６２－６）及び百日咳ウイルスのエピトープ（例えば、ＡＣＥＬ－ＩＭＵＮＥ ａｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＴＰ，Ｗｙｅｔｈ－Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）が挙げられる。
いくつかの態様では、本明細書で提供されるワクチンは、ユニバーサルワクチンである。いくつかの実施形態では、ユニバーサルワクチンは、コロナウイルスの複数の株など、同じウイルスの複数の株に対して保護するワクチンである。有効なユニバーサルコロナウイルスワクチンの開発は、例えば季節性ワクチン製剤により、コスト及び労力を削減することになり、より強力なパンデミックへの準備が可能になる。
いくつかの態様では、ユニバーサルワクチンは、異なるウイルス株に由来する複数のエピトープから構成されるワクチンである。いくつかの態様では、ユニバーサルワクチンは、異なるウイルス株において保存される単一のエピトープから構成される。例えば、ユニバーサルワクチンは、Ｓタンパク質の比較的保存されたドメイン（複数可）に基づくことができる。
開示された免疫原（例えば、開示された組換えコロナウイルスＳ抗原または開示された組換えコロナウイルスＳ抗原のプロトマーをコードする核酸分子）及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物も提供される。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される三量体化組換えポリペプチド、及び任意に薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される複数の三量体化組換えポリペプチドを含むタンパク質、及び任意により薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供されるタンパク質ナノ粒子、及び任意により薬学的に許容される担体である。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供されるＶＬＰ、及び任意により薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される単離された核酸、及び任意により薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供されるベクター、及び任意により薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供されるウイルス、及び任意により薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される偽ウイルス、及び任意により薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、本明細書で提供される細胞、及び任意により薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるものなどの免疫原性組成物は、ワクチンである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、予防用ワクチンである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、治療用ワクチンである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、予防用ワクチン及び治療用ワクチンである。このような医薬組成物は、当業者に知られている様々な投与様式、例えば、筋肉内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内、鼻腔内、舌下、扁桃、口腔咽頭、または他の非経口及び粘膜経路によって対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、開示された免疫原のうちの１つ以上を含む医薬組成物は、免疫原性組成物である。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に知られているか、または明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５などの刊行物により詳細に記載されている。
したがって、本明細書に記載の免疫原、例えば組換えコロナウイルスＳ抗原、例えば三量体、タンパク質は、許容温度範囲内での貯蔵中の安定性の向上を促進しながら、生物学的活性を保持するのを助けるために、薬学的に許容される担体と共に製剤化することができる。潜在的な担体としては、これらに限定されないが、生理学的にバランスのとれた培養培地、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン（例えば、油／水型または水／油型エマルジョン）、様々な種類の湿潤剤、凍結保護添加剤、または安定剤、例えば、タンパク質、ペプチドまたは加水分解物（例えば、アルブミン、ゼラチン）、糖（例えば、スクロース、ラクトース、ソルビトール）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸ナトリウム）、または他の保護剤が挙げられる。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージングするか、または凍結乾燥させ得る。凍結乾燥調製物は、単回投与または複数回投与のいずれかの投与前に滅菌溶液と混合させる。
製剤化された組成物、特に液体製剤は、これらに限定されないが、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、及び／またはプロピルパラベンの有効濃度（通常、１％ｗ／ｖ）など、貯蔵中の分解を防止するかまたは最小限に抑えるために静菌剤を含み得る。静菌剤は、一部の患者にとっては禁忌となり得る。したがって、凍結乾燥製剤は、そのような成分を含むまたは含まない溶液中で再構成させ得る。
本開示の免疫原性組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる、薬学的に許容されるビヒクル物質として、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張調整剤、湿潤剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、及びオレイン酸トリエタノールアミンなどを含むことができる。免疫原性組成物は、宿主の免疫応答を増強するためのアジュバントを任意により含み得る。好適なアジュバントとしては、例えば、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、ミョウバン、ＡｌＰＯ４、アルヒドロゲル、リピド－Ａ及びその誘導体またはバリアント、油エマルジョン、サポニン、中性リポソーム、ワクチン及びサイトカイン含有リポソーム、非－イオンブロック共重合体、ならびにケモカインである。当該技術分野において周知の他の多くの好適なアジュバントの中で、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）及びポリキシルプロピレン（ＰＯＰ）を含む非イオン性ブロックポリマー、例えば、ＰＯＥ－ＰＯＰ－ＰＯＥブロック共重合体、ＭＰＬ（商標）（３－Ｏ－脱アシル化モノホスホリルリピドＡ；Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｉｎｄ．）及びＩＬ－１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ）は、アジュバントとして使用され得る（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ１５：８９－１４２）。これらのアジュバントは、非特異的方法で免疫系を刺激するのに役立ち、したがって、医薬品に対する免疫応答を高める利点を有する。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、２つ以上のアジュバントを含み得るか、またはそれと共に投与され得る。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、２つのアジュバントを含み得るか、またはそれと共に投与され得る。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、複数のアジュバントを含み得るか、またはそれと共に投与され得る。例えば、場合によっては、例えば本明細書で提供される免疫原性組成物を含むワクチンは、複数のアジュバントを含み得るか、または複数のアジュバントと組み合わせて投与され得る。
ワクチン組成物について、好適なアジュバントの例としては、例えば、水酸化アルミニウム、レシチン、フロイントアジュバント、ＭＰＬ（商標）及びＩＬ－１２が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるワクチン組成物またはナノ粒子免疫原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチン組成物）は、制御放出または持続放出製剤として製剤化することができる。これは、徐放性ポリマーを含む組成物中で、またはマイクロカプセル化された送達系もしくは生体接着性ゲルを介して達成できる。様々な医薬組成物は、当技術分野で周知の標準的な手順に従って調製することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、代謝性油（例えば、スクアレン）及びアルファ－トコフェロールを水中油型エマルジョンの形態で含むアジュバント製剤、ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ－８０）を含むことができる。いくつかの実施形態では、アジュバント製剤は、約２％～約１０％のスクアレン、約２％～約１０％のアルファ－トコフェロール（例えば、Ｄ－α－トコフェロール）、及び約０．３％～約３％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含むことができる。いくつかの実施形態では、アジュバント製剤は、約５％のスクアレン、約５％のトコフェロール、及び約０．４％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、３脱Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ－ＭＰＬ）、及び水中油型エマルジョンの形態のアジュバントを含むことができ、アジュバントは、代謝性油、アルファ－トコフェロール、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含む。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、ＱＳ２１（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの抽出物：画分２１）、３Ｄ－ＭＰＬ、及び水中油型エマルジョンを含むことができ、水中油型エマルジョンは、代謝性油、アルファ－トコフェロール及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含む。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、ＱＳ２１、３Ｄ－ＭＰＬ、及び水中油型エマルジョンを含むことができ、水中油型エマルジョンは、以下の組成：スクアレン、アルファ－トコフェロール及びＴｗｅｅｎ－８０などの代謝性油を有する。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、リポソーム組成物の形態でアジュバントを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、代謝性油（例えば、スクアレン）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ－８０）、及びＳｐａｎ８５を含むアジュバント製剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、アジュバント製剤は、約５％（ｗ／ｖ）のスクアレン、約０．５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、及び約０．５％（ｗ／ｖ）のＳｐａｎ８５を含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、Ｑｕｉｌｌａｊａサポニン、コレステロール、及びリン脂質を含むアジュバント製剤を、例えばナノ粒子組成物の形態で含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、別々に精製されたＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分の混合物を含むことができ、その後、コレステロール及びリン脂質と共に製剤化される。
いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、ＭＦ５９（商標）、Ｍａｔｒｉｘ－Ａ（商標）、Ｍａｔｒｉｘ－Ｃ（商標）、Ｍａｔｒｉｘ－Ｍ（商標）、ＡＳ０１、ＡＳ０２、ＡＳ０３、及びＡＳ０４からなる群から選択されるアジュバントを含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）アゴニストを含むことができ、ＴＬＲ９アゴニストは、非メチル化シチジン－ホスホ－グアノシン（ＣｐＧまたはシトシン－リン酸－グアノシンとも呼ばれる）モチーフを含む８～３５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原及びオリゴヌクレオチドは、それを必要とするヒト対象などの哺乳動物対象において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対する免疫応答を刺激するのに有効な量で、免疫原性組成物中に存在する。ＴＬＲ９（ＣＤ２８９）は、微生物ＤＮＡに見られる非メチル化シチジン－ホスホ－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフを認識する。これは、合成ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）を使用して模倣できる。ＣｐＧ－ＯＤＮは、抗体産生を増強し、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞応答を刺激することが知られている（Ｃｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３３：４９２－５０３，２０１０）。最適なオリゴヌクレオチドＴＬＲ９アゴニストは、多くの場合、次の一般式に続くパリンドローム配列を含む：５’－プリン－プリン－ＣＧ－ピリミジン－ピリミジン－３’、または５’－プリン－プリン－ＣＧ－ピリミジン－ピリミジン－ＣＧ－３’。米国特許第６，５８９，９４０号、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、線状である。他の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、環状であるか、またはヘアピンループ（複数可）を含む。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、修飾を含み得る。修飾としては、これらに限定されないが、３’ＯＨまたは５’ＯＨ基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾、及びリン酸基の修飾が挙げられる。修飾された塩基（複数可）が、ワトソン・クリック塩基対合によってその天然の補体に対して同じ特異性を維持する限り、ＣｐＧオリゴヌクレオチドのパリンドローム配列に含まれ得る（例えば、パリンドローム部分は、依然として自己相補的である）。いくつかの実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、非標準塩基を含む。いくつかの実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２’－デオキシ－７－デアザグアノシン、２’－デオキシ－６－チオグアノシン、アラビノグアノシン、２’－デオキシ－２’置換－アラビノグアノシン、及び２’－Ｏ－置換－アラビノグアノシンからなる群から選択される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、リン酸基の修飾を含み得る。例えば、ホスホジエステル連結に加えて、リン酸修飾としては、これらに限定されないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート（架橋または非架橋）、ホスホトリエステル及びホスホロジチオエートが挙げられ、任意の組み合わせで使用され得る。他の非リン酸連結も使用され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格のみを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格のみを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル連結とホスホロチオエート連結との組み合わせなど、リン酸骨格におけるリン酸連結の組み合わせを含む。ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を有するオリゴヌクレオチドよりも免疫原性が高い可能性があり、宿主への注射後の分解に対してより耐性があると考えられる（Ｂｒａｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４１：２０８４－２０８９，１９８８；及びＬａｔｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，３２：１０５７－１０６４，１９９５）。本開示のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つ、２つ、または３つのヌクレオチド間ホスホロチオエートエステル連結を含む。いくつかの実施形態では、複数のＣｐＧオリゴヌクレオチド分子が少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物中に存在する場合、ホスホロチオエートエステル連結の両方の立体異性体が、複数のＣｐＧオリゴヌクレオチド分子中に存在する。いくつかの実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間連結のすべてがホスホロチオエート連結であり、別の方法では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有する。
任意の適切なＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）またはそれらの組み合わせを、本開示におけるアジュバントとして使用することができる。例えば、Ｋ型ＯＤＮ（Ｂ型とも呼ばれる）は、ホスホロチオエート骨格上の複数のＣｐＧモチーフをコードする。Ｋ型ＯＤＮは、次の配列ＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＴに基づくことができる。ホスホロチオエートヌクレオチドの使用により、ネイティブホスホジエステルヌクレオチドと比較して、ヌクレアーゼ消化に対する耐性が高くなり、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が大幅に長くなる。Ｋ型ＯＤＮは、ｐＤＣの分化及びＴＮＦ－αの産生を引き起こし、Ｂ細胞の増殖及びＩｇＭの分泌を引き起こす。Ｄ型ＯＤＮ（Ａ型とも呼ばれる）は、混合ホスホジエステル／ホスホロチオエート骨格で構築され、パリンドローム配列に隣接する単一のＣｐＧモチーフを含み、３’及び５’末端にポリＧテール（コンカテマーの形成を容易にする構造モチーフ）を有する。Ｄ型ＯＤＮは、次の配列ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧに基づき得る。Ｄ型ＯＤＮは、ｐＤＣの成熟及びＩＦＮ－αの分泌を引き起こすが、Ｂ細胞には影響を有さない。Ｃ型ＯＤＮは、ホスホロチオエートヌクレオチドで完全に構成されている点でＫ型に類似しているが、パリンドロームＣｐＧモチーフを含む点でＤ型に類似している。Ｃ型ＯＤＮは、以下の配列ＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＴに基づき得る。このクラスのＯＤＮは、Ｂ細胞を刺激してＩＬ－６を分泌させ、ｐＤＣを刺激してＩＦＮ－αを産生させる。Ｐ型ＯＤＮには、２つのパリンドローム配列が含まれており、これにより、より高次の構造を形成することができる。Ｐ型ＯＤＮは、次の配列ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧに基づき得る。Ｐ型ＯＤＮは、Ｂ細胞及びｐＤＣを活性化し、Ｃ型ＯＤＮと比較した場合、大幅に多くのＩＦＮ－α産生を誘導する。この段落では、ＯＤＮ配列中の太字は、自己相補的パリンドロームを示し、ＣｐＧモチーフには、下線が引かれている。
例示的ＣｐＧ ＯＤＮ、例えば、ＣｐＧ７９０９（５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ－３’）及びＣｐＧ １０１８（５’－ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ－３’）は既知であり、米国特許第７，２５５，８６８号、同第７，４９１，７０６号、同第７，４７９，２８５号、同第７，７４５，５９８号、同第７，７８５，６１０号、同第８，００３，１１５号、同第８，１３３，８７４号、同第８，１１４，４１８号、同第８，２２２，３９８号、同第８，３３３，９８０号、同第８，５９７，６６５号、同第８，６６９，２３７号、同第９，０２８，８４５号、及び同第１０，０５２，３７８号；米国特許出願公開第２０２０／０００２７０４号；及びＢｏｄｅ ｅｔ ａｌ．「ＣｐＧ ＤＮＡ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ」、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１１），１０（４）：４９９－５１１に記載されており、これらのすべては、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
１つ以上のアジュバントを組み合わせて使用し得、これらに限定されないが、ミョウバン（アルミニウム塩）、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、リポソーム、及びポリ（ラクチド－コグリコリド）微粒子が挙げられ得る（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１４９４：１－１４，２０１７）。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原が吸着されるアルミニウム塩アジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態では、アルミニウム塩アジュバントは、非晶質ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸カリウムアルミニウムからなる群のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、アルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムの一方または両方を含む。いくつかの実施形態では、アルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物の単位用量は、約０．２５～約０．５０ｍｇのＡｌ３＋、または約０．３５ｍｇのＡｌ３＋を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、追加のアジュバントをさらに含む。他の好適なアジュバントとしては、これらに限定されないが、水中スクアレンエマルジョン（例えば、ＭＦ５９またはＡＳ０３）、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、ポリ－ＩＣまたはポリ－ＩＣＬＣ）、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、モノホスホリルリピドＡなどの細菌性リポ多糖誘導体）（ＭＰＬ）、及び／またはＱｕｉｌ ＡまたはＱＳ－２１などのサポニン、ＡＳ０１またはＡＳ０２など）、ＴＬＲ５アゴニスト（細菌フラジェリン）、ならびにＴＬＲ７、ＴＬＲ８及び／またはＴＬＲ９アゴニスト（イミキモドなどのイミダゾキノリン誘導体、及びレシキモド）が挙げられる（Ｃｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３３：４９２－５０３，２０１０）。いくつかの実施形態では、追加のアジュバントは、ＭＰＬ及びミョウバン（例えば、ＡＳ０４）を含む。獣医学的使用及びヒト以外の動物における抗体産生のために、フロイントアジュバントの有糸分裂促進成分（完全及び不完全の両方）を使用することができる。
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、例えば、溶媒、増量剤、緩衝剤、等張調整剤、及び保存剤などの薬学的に許容される賦形剤を含む（Ｐｒａｍａｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａ Ｔｉｍｅｓ，４５：６５－７７，２０１３）。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、溶媒、増量剤、緩衝剤、及び等張調整剤のうちの１つ以上として機能する賦形剤を含み得る（例えば、生理食塩水中の塩化ナトリウムは、水性ビヒクル及び等張調整剤の両方として機能し得る）。
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、溶媒として水性ビヒクルを含む。好適な賦形剤としては、例えば、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、及びリンゲル液が挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は、等張性である。
免疫原性組成物は、緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、ｐＨを制御して、プロセシング、貯蔵、及び任意により再構成中での活性剤の分解を阻害する。好適な緩衝液としては、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩または硫酸塩を含む塩が挙げられる。他の好適な緩衝液としては、例えば、アルギニン、グリシン、ヒスチジン、及びリジンなどのアミノ酸が挙げられる。緩衝剤は、塩酸または水酸化ナトリウムをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、組成物のｐＨを６～９の範囲内に維持する。いくつかの実施形態では、ｐＨは、６より高い（下限）、７または８である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、９未満（上限）、８、または７である。すなわち、ｐＨは、約６～９の範囲にあり、ここでは、下限が上限未満であるる。
免疫原性組成物は、等張調整剤を含み得る。好適な等張調整剤としては、例えばデキストロース、グリセロール、塩化ナトリウム、グリセリン及びマンニトールが挙げられる。
免疫原性組成物は、増量剤を含み得る。増量剤は、医薬組成物が投与前に凍結乾燥される場合に特に有用である。いくつかの実施形態では、増量剤は、凍結または噴霧乾燥中及び／または貯蔵中の活性剤の分解の安定化及び防止を助ける保護剤である。好適な増量剤は、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、及びラフィノースなどの糖（単糖、二糖、及び多糖）である。
免疫原性組成物は、防腐剤を含み得る。好適な防腐剤としては、例えば抗酸化剤及び抗菌剤が挙げられる。しかし、好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、滅菌条件下で調製され、単回使用容器にあるため、防腐剤を含める必要はない。
いくつかの実施形態では、組成物は、滅菌組成物として提供することができる。医薬組成物は、典型的には、有効量の開示された免疫原を含み、従来の技術によって調製することができる。典型的には、免疫原性組成物の各用量における免疫原の量は、重大な有害な副作用なく、免疫応答を誘導する量として選択される。いくつかの実施形態では、本組成物は、対象において免疫応答を誘導するために使用するための単位剤形で提供することができる。単位剤形は、対象に投与するための好適な単一の予め選択された投与量、２つ以上の予め選択された単位投与量の好適なマークまたは測定された倍数、及び／または単位用量またはその倍数を投与するための計量機構を含む。他の実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。
ＩＶ．免疫応答を誘導する方法
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、対象におけるコロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、本方法は、配列番号１～２６からなる群から選択される組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、対象におけるコロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、ここで、表面抗原が、Ｓタンパク質またはその抗原断片を含み、本方法は、配列番号１～２６からなる群から選択される組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、対象におけるコロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、ここで、表面抗原が、配列番号２７～６６からなる群から選択される配列を含み、本方法は、配列番号１～２６からなる群から選択される組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象においてコロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法が本明細書に提供され、ここで、表面抗原は、コロナウイルスのＳタンパク質またはその抗原性断片を含み、任意により、表面抗原は、配列番号５５で表されている配列またはその抗原性断片を含み、本方法は、配列番号１０～２５のいずれか１つで表されている配列を含む組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、対象におけるコロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、ここで、表面抗原が、Ｓタンパク質またはその抗原断片を含み、本方法は、配列番号１～２６からなる群から選択される配列を含む組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体、または複合体のうちのいずれか２つ以上の組み合わせを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び／または配列番号１３で表されている配列を含む組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体を対象に投与することを含む。
開示された免疫原（例えば、組換えコロナウイルスＳ抗原、例えば、本明細書に記載のＳ－三量体またはＳタンパク質、核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子など）、または開示された組換えコロナウイルスＳ抗原のプロトマーをコードするベクター、または開示された組換えコロナウイルスＳ抗原を含むタンパク質ナノ粒子またはウイルス様粒子）を対象に投与して、対象において対応するコロナウイルスＳ抗原に対する免疫応答を誘導することができる。特定の例では、対象は、ヒトである。免疫応答は、防御免疫応答、例えば、対応するコロナウイルスによるその後の感染を阻害する応答であり得る。免疫応答の誘発は、対応するコロナウイルスに関連する感染及び疾患を治療または阻害するためにも使用できる。
例えば、コロナウイルスへの曝露または曝露の可能性のために、コロナウイルスによる感染を有する、またはコロナウイルスによる感染を発症するリスクがある対象を、治療のために選択することができる。開示された免疫原の投与後、コロナウイルスに関連する感染もしくは症状、またはその両方について対象を監視することができる。
本開示の治療法及び方法による治療が意図される典型的な対象としては、ヒト、ならびに非ヒト霊長類及び他の動物が挙げられる。本開示の方法による予防または治療のための対象を特定するために、容認されたスクリーニング方法を用いて、標的とするもしくは疑いのある疾患もしくは状態に関連するリスク因子を決定するか、または対象における既存の疾患もしくは状態の状況を決定する。これらのスクリーニング方法としては、例えば、環境的、家族的、職業的、及び標的であるかまたは疑いのある疾患または状態に関連し得る他のそのようなリスク因子を決定するための従来の精査、ならびに様々なＥＬＩＳＡなどの診断方法及びコロナウイルス感染症を検出及び／または特徴を明らかにするための他のイムノアッセイ法が挙げられる。これら及び他の日常的な方法により、臨床医は、本開示の方法及び医薬組成物を使用する治療を必要とする患者を選択することができる。これらの方法及び原理に従って、組成物は、本明細書の教示または他の従来の方法に従って、独立した予防または治療のプログラムとして、または他の治療に対するフォローアップ、補助、または協調治療レジメンとして投与することができる。
開示された免疫原、例えばコロナウイルスＳ抗原、例えば三量体、タンパク質の投与は、予防目的または治療目的であり得る。予防的に提供される場合、開示された治療剤は、任意の症状の前に、例えば感染の前に提供される。開示された治療剤の予防的投与は、その後のあらゆる感染を予防または改善するのに役立つ。治療的に提供される場合、開示された治療剤は、疾患または感染症の症状の発症時または発症後、例えば、コロナウイルスＳ抗原に対応するコロナウイルスによる感染の症状の発生後、またはコロナウイルス感染症の診断後に提供される。したがって、ウイルスへの曝露後もしくは曝露が疑われる後、または感染の実際の開始後に、感染及び／または関連する疾患の症状の予想される感染の重症度、期間または程度を軽減するために、コロナウイルスへの曝露が予想される前に、治療剤を提供することができる。
本明細書に記載の免疫原及びその免疫原性組成物は、対象、好ましくはヒトにおいてコロナウイルスＳ抗原に対する免疫応答を誘導または増強するのに有効な量で対象に提供される。開示された免疫原の実際の投与量は、対象の疾患の徴候及び特定の状態（例えば、対象の年齢、体格、健康状態、症状の程度、感受性因子など）、時間及び投与経路、同時に投与される他の薬物または治療、ならびに対象において所望の活性または生物学的応答を誘発するための組成物の特定の薬理学などの要因に応じて変化する。投薬レジメンは、最適な予防または治療応答を提供するように調整することができる。
開示された免疫原のうちの１つ以上を含む免疫原性組成物は、協調（または初回刺激－追加免疫）ワクチン接種プロトコールまたは組合せ製剤で使用することができる。特定の実施形態では、新規の組合せ免疫原性組成物及び協調免疫化プロトコールは、別々の免疫原または製剤を使用し、それぞれが、コロナウイルスＳ抗原に対する免疫応答などの抗ウイルス免疫応答を誘発することを目的としている。抗ウイルス免疫応答を誘発する別々の免疫原性組成物は、単一の免疫化ステップで対象に投与される多価免疫原性組成物に組み合わせることができるか、またはそれらを、協調（または初回刺激－追加免疫）免疫化プロトコールで、（一価免疫原性組成物中で）別々に投与することができる。
いくつかの追加免疫があり得、各追加免疫は、異なる開示された免疫原であり得る。いくつかの例では、追加免疫は、別の追加免疫または初回刺激と同じ免疫原であり得る。初回刺激及び追加免疫は、単回投与または複数回投与として投与することができ、例えば、２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上を、数日、数週間、または数ヶ月にわたって対象に投与することができる。１回～５回（例えば、１回、２回、３回、４回、または５回の追加免疫）またはそれ以上など、複数回の追加免疫を与えることもできる。一連の順次免疫化では、異なる投与量を使用することができる。例えば、一次免疫では比較的多量の用量、その後、比較的少量の用量で追加免疫する。
いくつかの実施形態では、追加免疫は、初回刺激の約２週間後、約３週間～８週間後、または約４週間後、または初回刺激の約数ヶ月後に投与することができる。いくつかの実施形態では、追加免疫は、初回刺激から約５ヶ月後、約６ヶ月後、約７ヶ月後、約８ヶ月後、約１０ヶ月後、約１２ヶ月後、約１８ヶ月後、約２４ヶ月後、または初回刺激から多少の時間後に投与することができる。対象の「免疫記憶」を強化するために、適切な時点で定期的な追加的に追加免疫を使用することもできる。選択されたワクチン接種パラメータ、例えば製剤化、用量、計画などの妥当性は、対象から血清のアリコートを取り、免疫化プログラムの過程で抗体価をアッセイすることによって決定することができる。さらに、対象の臨床状態は、所望の効果、例えば、感染の予防または病状の改善（例えば、ウイルス量の減少）について監視することができる。そのような監視により、ワクチン接種が最適ではないことが示された場合、対象は、追加用量の免疫原性組成物により追加免疫され、免疫応答を増強することが予想される方法で、ワクチン接種パラメータを変更することができる。
いくつかの実施形態では、初回刺激－追加免疫法は、対象へのＤＮＡプライマー及びタンパク質追加免疫ワクチン接種プロトコールを含むことができる。この方法は、核酸分子またはタンパク質の２回以上の投与を含み得る。
タンパク質治療薬の場合、典型的には、各ヒト用量は、１～１０００μｇのタンパク質、例えば、約１μｇ～約１００μｇ、例えば、約１μｇ～約５０μｇ、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、または約５０μｇを含む。
免疫原性組成物中で利用される量は、対象集団（例えば、乳児または高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物の最適量は、対象における抗体価及び他の応答の観察を伴う標準的試験によって確認することができる。免疫原性組成物中の治療有効量の開示された免疫原例えば、開示された組換えコロナウイルスＳ抗原、例えば三量体、タンパク質、ウイルスベクター、または核酸分子などは、単回用量の投与によって免疫応答を誘発するのに有効ではないが、例えば初回刺激－追加免疫投与プロトコールにおいて、複数回投与の投与時に有効である量を含むことができることが理解される。
本開示の開示された免疫原の投与時に、対象の免疫系は、典型的には、免疫原に含まれるコロナウイルスＳタンパク質ペプチドに特異的な抗体を産生することにより、免疫原性組成物に応答する。このような応答は、免疫学的に有効な用量が対象に送達されたことを意味する。
いくつかの実施形態では、対象の抗体応答は、有効な投与量／免疫プロトコールを評価する文脈で決定される。ほとんどの場合、対象から得た血清または血漿中の抗体価を評価することで十分である。ブースター接種を行うか否か、及び／または個体に投与される治療剤の量を変更するか否かの決定は、抗体価レベルに少なくとも部分的に基づくことができる。抗体価レベルは、例えば、組換えコロナウイルスＳ抗原、例えばＳ－三量体などの抗原に結合する血清中の抗体の濃度を測定する免疫結合アッセイに基づくことができる。
これらの方法が有効であるために、コロナウイルス感染症を完全に排除または軽減または予防する必要はない。例えば、開示された免疫原の１つ以上により、コロナウイルスに対する免疫応答を誘発することは、免疫原がない場合のコロナウイルスによる感染と比較して、コロナウイルスによる感染を所望の量、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらに少なくとも１００％、減少させるかまたは阻害（検出可能な感染細胞を排除または予防）することができる。さらなる例において、コロナウイルスの複製は、開示された方法によって減少または阻害され得る。この方法を有効にするために、コロナウイルスの複製を完全に排除する必要はない。例えば、開示された免疫原のうちの１つ以上を使用して誘発された免疫応答は、免疫反応がないコロナウイルスの複製と比較して、対応するコロナウイルスの複製を所望の量、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはさらには少なくとも１００％減少させる（コロナウイルスの検出可能な複製を排除または防止する）ことができる。
いくつかの実施形態では、開示された免疫原は、アジュバントの投与と同時に対象に投与される。他の実施形態では、開示された免疫原は、アジュバントの投与後、免疫応答を誘導するのに十分な時間内に対象に投与される。
核酸の投与に対する１つのアプローチは、哺乳動物発現プラスミドなどによるプラスミドＤＮＡによる直接免疫化である。核酸構築物による免疫化は、当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，６４３，５７８号（所望の抗原をコードするＤＮＡを導入して、細胞性応答または体液性応答を誘発することにより脊椎動物を免疫化する方法について記載している）、及び米国特許第５，５９３，９７２号明細書及び同第５，８１７，６３７号明細書（これらは、抗原をコードする核酸配列を、発現を可能にする調節配列に対して作動可能に連結することについて記載している）に教示されている。米国特許第５，８８０，１０３号は、免疫原性ペプチドまたは他の抗原をコードする核酸を生物に送達するいくつかの方法を記載している。この方法には、核酸（または合成ペプチド自体）のリポソーム送達、及び免疫刺激構築物、またはＩＳＣＯＭＳ（商標）、コレステロール及びＱｕｉｌ Ａ（商標）（サポニン）を混合時に自発的に形成されるサイズ３０～４０ｎｍの負に帯電したケージ様構造が含まれる。防御免疫は、トキソプラズマ症及びエプスタイン－バーウイルス誘導性腫瘍をなど、感染の様々な実験モデルにおいて、抗原の送達ビヒクルとしてＩＳＣＯＭＳ（商標）を使用して生成されている（Ｍｏｗａｔ ａｎｄ Ｄｏｎａｃｈｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１２：３８３，１９９１）。ＩＳＣＯＭＳ（商標）に内包された１μｇほどの低用量の抗原が、クラスＩ媒介ＣＴＬ応答を生じることが見出された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４４：８７３，１９９０）。
いくつかの実施形態では、プラスミドＤＮＡワクチンを使用して、対象において、開示された免疫原を発現させる。例えば、開示された免疫原をコードする核酸分子を対象に投与して、コロナウイルスＳ抗原に対する免疫応答を誘導することができる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｐＶＲＣ８４００ベクター（Ｂａｒｏｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７９，８８２８－８８３４，２００５に記載され、参照により本明細書に組み込まれる）などのＤＮＡ免疫化のためのプラスミドベクターに含まれ得る。
免疫化に核酸を使用する別のアプローチでは、開示された組換えコロナウイルスＳ抗原、例えば三量体、タンパク質は、弱毒ウイルス宿主またはベクターまたは細菌ベクターによって発現され得る。組換えワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、サイトグメグロウイルス、または他のウイルスベクターを使用して、ペプチドまたはタンパク質を発現させ、それによってＣＴＬ応答を誘発することができる。例えば、免疫プロトコールに有用なワクシニアベクター及び方法は、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）は、ペプチドの発現のための別のベクターを提供する（Ｓｔｏｖｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ３５１：４５６－４６０、１９９１を参照）。
一実施形態では、開示された組換えコロナウイルスＳ抗原をコードする核酸は、細胞に直接導入される。例えば、核酸は、標準的方法によって金マイクロスフェアにロードされ、Ｂｉｏ－ＲａｄのＨＥＬＩＯＳ（商標）Ｇｅｎｅ Ｇｕｎなどのデバイスによって皮膚に導入される。核酸は、強力なプロモーターの制御下にあるプラスミドからなる「裸の」ものであり得る。典型的には、ＤＮＡは、筋肉に注入されるが、他の部位に直接注入することもできる。注射の投与量は、通常、約０．５μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇである（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号を参照）。
例えば、核酸は、標準的方法によって金マイクロスフェアにロードされ、Ｂｉｏ－ＲａｄのＨＥＬＩＯＳ（商標）Ｇｅｎｅ Ｇｕｎなどのデバイスによって皮膚に導入される。核酸は、強力なプロモーターの制御下にあるプラスミドからなる「裸の」ものであり得る。典型的には、ＤＮＡは、筋肉に注入されるが、他の部位に直接注入することもできる。注射の投与量は、通常、約０．５μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇである（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号を参照）。
別の実施形態では、ｍＲＮＡベースの免疫プロトコールを使用して、開示された組換えコロナウイルスＳ抗原をコードする核酸を細胞に直接送達することができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡベースの核酸ベースワクチンは、前述のアプローチに対する強力な代替手段を提供し得る。ｍＲＮＡワクチンは、宿主ゲノムへのＤＮＡの統合に関する安全性の懸念を排除し、宿主細胞の細胞質中で直接翻訳され得る。さらに、ＲＮＡの単純な無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成により、ウイルスベクターに関連する製造上の複雑さが回避される。開示された組換えコロナウイルスＳ抗原をコードする核酸を送達するために使用することができるＲＮＡベースのワクチン接種の２つの例示的な形態としては、従来の非増幅型ｍＲＮＡ免疫（例えば、Ｐｅｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０（１２）：１２１０－６，２０１２を参照されたい）、及び自己増幅型ｍＲＮＡ免疫（例えば、Ｇｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ」ＰＮＡＳ，１０９（３６）：１４６０４－１４６０９，２０１２；Ｍａｇｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｅｌｆ－Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｍＲＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｃｏｎｆｅｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ」ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１１（８）：ｅ０１６１１９３，２０１６；及びＢｒｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｅｌｆ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｍＲＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ．，８９：１７９－２３３，２０１５を参照されたい）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、治療有効量の開示された免疫原のうちの１つ以上を対象へ投与することにより、対象において中和免疫応答が誘導される。中和活性を評価するために、対象の免疫後、血清を対象から適切な時点で収集し、凍結し、中和試験のために貯蔵することができる。中和活性をアッセイするための方法は、当業者に知られており、本明細書にさらに記載されており、これらに限定されないが、プラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイ、マイクロ中和アッセイ、フローサイトメトリーベースのアッセイ、シングル－サイクル感染アッセイが挙げられる。いくつかの実施形態では、血清中和活性は、コロナウイルス偽ウイルスのパネルを使用してアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、治療有効量の開示された免疫原のうちの１つ以上を対象へ投与することにより、対象において中和免疫応答が誘導される。中和活性を評価するために、対象の免疫後、血清を対象から適切な時点で収集し、凍結し、中和試験のために貯蔵することができる。中和活性をアッセイするための方法は、当業者に知られており、本明細書にさらに記載されており、これらに限定されないが、プラーク減少中和（ＰＲＮＴ）アッセイ、マイクロ中和アッセイ、フローサイトメトリーベースのアッセイ、シングル－サイクル感染アッセイが挙げられる。いくつかの実施形態では、血清中和活性は、コロナウイルス偽ウイルスのパネルを使用してアッセイすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される免疫原によって誘導される中和免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスに対する中和抗体を生成する。いくつかの実施形態では、本明細書の中和抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはその成分などのコロナウイルスの細胞受容体または共受容体に結合する。いくつかの実施形態では、ウイルス受容体または共受容体は、コロナウイルス受容体または共受容体、好ましくは肺炎ウイルス受容体または共受容体、より好ましくはヒトコロナウイルス受容体、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体または共受容体である。いくつかの実施形態では、本明細書の中和抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ及び／もしくはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つのコロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の活性もしくは結合、少なくとも１つのコロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体の活性もしくは結合、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の放出、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体シグナル伝達、膜ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の切断、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の活性、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の産生及び／もしくは合成を調節する、減少させる、拮抗する、軽減する、ブロックする、阻害する、妨げる、及び／または干渉する。いくつかの実施形態では本明細書に開示される免疫原は、例えば、アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－捕捉非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、及び／または肝臓／リンパ節－ＳＩＧＮ（Ｌ－ＳＩＧＮ）などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２受容体または共受容体に結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を調節する、減少させる、拮抗する、軽減する、ブロックする、阻害する、妨げる、及び／または干渉する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を誘導する。
Ｖ．製造品またはキット
提供される組換えポリペプチド、タンパク質、及び免疫原性組成物を含む製造品またはキットも提供される。製造品は、容器と、容器上または容器に付随するラベルまたは添付文書と、を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。いくつかの実施形態では、容器は、滅菌アクセスポートを有する。例示的容器としては、静脈内溶液バッグ、バイアルが挙げられ、注射用ニードルによって突刺可能なストッパーを備えたものも含まれる。製造品またはキットは、本明細書に記載の状態（例えば、コロナウイルス感染症）などの特定の状態を治療するために本組成物を使用できることを示す添付文書をさらに含み得る。代替としてまたは追加として、製造品またはキットは、薬学的に許容される緩衝液を含む別のまたは同じ容器をさらに含んでもよい。これらは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、ニードル、及び／またはシリンジなどの他の材料をさらに含み得る。
ラベルまたは添付文書は、本組成物が、個体でのコロナウイルス感染症の治療に使用されることを示し得る。容器上または容器に付随するラベルまたは添付文書は、製剤の再構成及び／または使用の指示を示し得る。ラベルまたは添付文書は、製剤が、個体でのコロナウイルス感染症を治療または予防するための皮下、静脈内、または他の投与様式に有用であるかまたは意図することをさらに示し得る。
いくつかの実施形態における容器は、それ自体で、または状態を治療、予防かつ／または診断するのに有効である別の組成物と組み合わされた組成物を保持する。製造品またはキットは、（ａ）内部に組成物（すなわち、第１の医薬品）を含む第１の容器であって、組成物が、免疫原性組成物またはタンパク質もしくは組換えポリペプチドを含む、第１の容器と；（ｂ）内部に組成物（すなわち、第２の医薬品）を含む第２の容器であって、組成物は、さらなる薬剤、例えばアジュバントまたは他の治療剤を含む、第２の容器と、を含み得、製造品またはキットが、有効量の第２の医薬品で対象を治療するためのラベルまたは添付文書上の指示書をさらに含む。
用語
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、ならびに他の技術的及び科学的用語または専門用語は、特許請求される主題が関係する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有することを意図する。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語は、明確にするためかつ／または容易に参照するために本明細書に定義されており、本明細書におけるそのような定義の包含は、当該技術分野において一般的に理解されているものに対する実質的な相違を表すものと必ずしも解釈されるべきではない。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用され、最小の長さに限定されない。提供される受容体及び他のポリペプチド、例えばリンカーまたはペプチドなどのポリペプチドは、天然及び／または非天然アミノ酸残基などのアミノ酸残基を含み得る。この用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、及びリン酸化も含まれる。いくつかの態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブまたは天然の配列に対して修飾を含み得る。これらの修飾は、部位指向的変異誘発などによる意図的なものであり得るか、またはタンパク質またはＰＣＲ増幅によるエラーを産生する宿主の変異などによる偶発的なものであり得る。
本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトまたは他の動物などの哺乳動物であり、典型的にはヒトである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の薬剤、細胞、細胞集団、または組成物が投与される対象、例えば患者は、哺乳動物、典型的には霊長類、例えば、ヒトである。いくつかの実施形態では、霊長類は、サルまたは類人猿である。対象は、雄または雌であってよく、幼児、少年、青年、成人、及び老人対象を含む任意の好適な年齢であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、非霊長類の哺乳動物、例えば、げっ歯類である。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的変形、例えば、「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」）は、疾患または状態または障害または症状、副作用もしくは転帰、またはそれらに関連する表現型の完全または部分的な改善または軽減を指す。治療の望ましい効果としては、これらに限定されないが、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患のあらゆる直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低下、病状の改善または緩和、及び寛解または予後の改善が挙げられる。これらの用語は、疾患の完全な治癒、または任意の症状の完全な消失またはすべての症状もしくは転帰への効果（複数可）を意味するものではない。
本明細書で使用する「疾患の発症を遅らせる」とは、疾患（がんなど）の発症を先送りする、妨げる、減速させる、遅延させる、安定させる、抑制する、かつ／または延期することを意味する。この遅らせることは、疾患の病歴及び／または治療を受けている個体に応じて、様々な時間長になり得る。いくつかの実施形態では、個体が疾患を発症しないという点で、十分または有意に遅らせることは、事実上、予防することを包含することができる。例えば、転移の発生など、末期がんは、遅らせ得る。
本明細書で使用される「予防すること」は、疾患の素因があり得るがまだ疾患と診断されていない対象における疾患の発生または再発に関して、予防を提供することを含む。いくつかの実施形態では、提供される細胞及び組成物は、疾患の発症を遅らせるため、または疾患の進行を減速させるために使用される。
本明細書で使用される場合、機能または活性を「抑制する」とは、目的の状態またはパラメータを除き、他の点で同じ状態と比較した場合、または別の状態と比較した場合に、機能または活性を低下させることである。例えば、腫瘍の成長を抑制する細胞は、細胞が存在しない場合の腫瘍の成長速度と比較して、腫瘍の成長速度を低下させる。
薬剤、例えば薬学的製剤、細胞、または組成物の「有効量」は、投与の文脈において、所望の結果、例えば、治療的結果または予防的結果を達成するのに必要な投与量／量及び期間で、有効な量を指す。
薬剤、例えば、薬学的製剤または細胞の「治療有効量」とは、疾患、状態または障害の治療のためなどの所望の治療的結果及び／または治療の薬物動態学的効果もしくは薬力学的効果を達成するのに必要な投与量及び期間で、有効な量を指す。治療有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに投与される細胞集団などの要因によって異なり得る。いくつかの実施形態では、提供される方法は、細胞及び／または組成物を有効量、例えば治療有効量で投与することを含む。
「予防有効量」とは、所望の予防結果を達成するのに必要な投与量及び期間で有効な量を指す。必ずではないが、典型的には、予防用量は、疾患の前または初期の段階において対象に使用されるため、予防有効量は、治療有効量よりも少なくなる。腫瘍負荷が低い状況では、予防有効量は、いくつかの態様において、治療有効量よりも多くなる。肺炎などの状態または疾患の徴候または症状を軽減または排除するなど、望ましい応答を生じさせるのに十分なワクチンまたは他の薬剤の有効量である。例えば、これは、ウイルスの複製を阻害するため、またはウイルス感染症の外見上の症状を測定可能なように変更するために必要な量であり得る。一般に、この量は、ウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の複製または感染性を測定可能に阻害するのに十分である。対象に投与される場合、一般に、ウイルス複製のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害を達成することが示されている標的組織濃度を達成する投与量を使用する。いくつかの実施形態では、「有効量」は、例えばコロナウイルス感染症を治療するために、障害または疾患のいずれかの１つ以上の症状及び／または根本的な原因を治療する（予防を含む）ものである。いくつかの実施形態では、有効量は、治療有効量である。いくつかの実施形態では、有効量は、コロナウイルス感染症に関連する１つ以上の徴候または症状など、特定の疾患または状態の１つ以上の徴候または症状の発症を防止する量である。
本明細書で使用される場合、「抗原」または「免疫原」という用語は、同義的に使用され、対象において免疫応答を誘導することができる物質、典型的にはタンパク質を指す。この用語はまた、一旦対象に投与されると（直接、またはタンパク質をコードするヌクレオチド配列もしくはベクターを対象に投与することによって）、そのタンパク質に対する体液性及び／または細胞型の免疫応答を誘起することができるという意味で、免疫学的に活性であるタンパク質を指す。特に明記しない限り、「ワクチン免疫原」という用語は、「タンパク質抗原」または「免疫原ポリペプチド」と同義的に使用される。
「保存的に修飾されたバリアント」という用語は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、任意のタンパク質をコードする。ポリペプチド配列について、「保存的に修飾されたバリアント」とは、保存的アミノ酸置換を有するバリアント、すなわち類似の電荷を有する側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換されたアミノ酸残基を有するバリアントを指す。類似の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。
エピトープは、抗原決定基を指す。これらは、特に、特異的な免疫応答を誘発するように、抗原性である分子上に化学基またはペプチド配列を含み、例えば、エピトープは、Ｂ細胞及び／またはＴ細胞が応答する抗原の領域である。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置される連続アミノ酸または非連続アミノ酸の両方から形成され得る。
特に断りのない限り、融合タンパク質は、ペプチド結合を介して一緒に連結して、単一のタンパク質を形成する少なくとも２つの無関係なタンパク質のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質である。したがって、本明細書に記載の融合（Ｆ）タンパク質と呼ばれる天然に存在するコロナウイルス表面抗原は、包含しない。無関係なアミノ酸配列は、互いに直接連結するか、リンカー配列を使用して連結することができる。本明細書で使用される場合、タンパク質は、それらのアミノ酸配列が、それらの自然環境（例えば、細胞内）において、ペプチド結合を介して一緒に連結されていることが通常見出されない場合、無関係である。例えば、ウイルス抗原のアミノ酸配列及びコラーゲンまたはプロコラーゲンのアミノ酸配列は、通常、ペプチド結合を介して一緒に連結されていることが見出されない。
免疫原は、病原体に感染した、または感染のリスクがある哺乳動物などの哺乳動物において、免疫応答を誘導することができるタンパク質またはその一部である。免疫原の投与は、目的の病原体に対する防御免疫及び／または予防免疫をもたらすことができる。
免疫原性組成物は、免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスに対する測定可能なＣＴＬ応答を誘導するか、または免疫原性ポリペプチドに対する測定可能なＢ細胞応答（抗体の産生など）を誘導する免疫原性ポリペプチドを含む組成物を指す。
２つ以上の核酸配列、または２つ以上のアミノ酸配列間の配列同一性または類似性は、配列間の同一性または類似性に関して表現される。配列同一性は、同一性パーセンテージで測定でき；パーセンテージが高いほど、配列の同一性が高くなる。２つの配列は、比較ウィンドウ全体または、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用してまたは手動アライメント及び目視検査によって測定された指定領域において最大の対応について比較し、整列させたときに、２つの配列が、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合で有する場合（すなわち、指定された領域にわたって、または、指定されていない場合には、配列全体にわたって、６０％の同一性、任意により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性）、「実施的に同一である」。任意により、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド長（または１０アミノ酸）である領域にわたって、またはより好ましくは、１００～５００もしくは１０００、もしくはそれ以上のヌクレオチド長（または２０、５０、２００もしくはそれ以上のアミノ酸）である領域にわたって存在する。
ワクチンは、対象において予防的または治療的免疫応答を誘発する医薬組成物を指す。場合によっては、免疫応答は、防御免疫応答である。典型的には、ワクチンは、病原体、例えばウイルス病原体の抗原、または病的状態と相関する細胞構成成分に対する抗原特異的免疫応答を誘発する。ワクチンは、ポリヌクレオチド（開示された抗原をコードする核酸など）、ペプチドまたはポリペプチド（開示された抗原など）、ウイルス、細胞、または１つ以上の細胞構成成分を含み得る。いくつかの実施形態では、ワクチンまたはワクチン免疫原またはワクチン組成物は、融合構築物から発現し、表面に免疫原ポリペプチドまたはタンパク質を提示するナノ粒子に自己集合する。
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、いくつかのウイルスのいずれかに由来する、複製しないウイルスの殻を指す。ＶＬＰは、一般に、これらに限定されないが、キャプシド、コート、殻、表面及び／もしくはエンベロープタンパク質と呼ばれるタンパク質、またはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドなど、１つ以上のウイルスタンパク質から構成される。ＶＬＰは、適切な発現系内でタンパク質を組換え発現させたときに、自然に形成され得る。特定のＶＬＰを産生する方法は、当技術分野で知られている。ウイルスタンパク質の組換え発現後のＶＬＰの存在は、例えば、電子顕微鏡法、生物物理学的特性評価などによって、当技術分野で知られている従来の技術を使用して検出することができる。例えば、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０：１４４５－１４５６；及びＨａｇｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４５０３－４５０５。例えば、ＶＬＰは、密度勾配遠心分離によって単離できる、及び／または特徴的な密度バンド形成によって同定できる。あるいは、極低温電子顕微鏡法は、問題のＶＬＰ調製物のガラス化された水性サンプルに対して実行され、画像は適切な曝露条件下で記録される。
本明細書で使用される「約」という用語は、当技術分野の当業者に容易に知られるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体に対して向けられている実施形態を含む（及び説明する）。
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
この開示を通じて、特許請求される主題の様々な態様が範囲形式で提示される。範囲形式での説明は、便宜上及び簡潔にするためのみのものであり、特許請求される主題の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値のみでなく、すべての可能な下位範囲を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、ある範囲の値が提供されている場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその述べられた範囲内の任意の他の述べられた値または介在値は、特許請求される主題に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含め得、述べられる範囲内で特に除外される任意の制限に従って、特許請求される主題の範囲内にも包含される。述べられた範囲が、制限の一方または両方を含む場合、それらの含まれる制限のいずれかまたは両方を除外する範囲も特許請求される主題に含まれる。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
本明細書で使用される場合、組成物は、細胞など、２つ以上の生成物、物質、または化合物の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターが含まれる。特定のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
例示的実施形態
実施形態１．複数の組換えポリペプチドを含むタンパク質であって、各組換えポリペプチドが、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに連結されたコロナウイルスの表面抗原を含み、組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドが、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する、タンパク質。
実施形態２．コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）－コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ－様コロナウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）－コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳ様コロナウイルス、ＮＬ６３－ＣｏＶ、２２９Ｅ－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＷＩＶ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ、ＨＫＵ９－ＣｏＶ、ＰＥＤＶ－ＣｏＶ、またはＳＤＣＶである、実施形態１に記載のタンパク質。
実施形態３．表面抗原が、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質またはその断片もしくはエピトープを含み、エピトープが、任意により線状エピトープまたはコンフォメーションエピトープであり、タンパク質が、３つの組換えポリペプチドを含む、実施形態１または２に記載のタンパク質。
実施形態４．表面抗原が、シグナルペプチド、Ｓ１サブユニットペプチド、Ｓ２サブユニットペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態３に記載のタンパク質。
実施形態５．表面抗原が、シグナルペプチド、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ペプチド、受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）ペプチド、融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタドリピート１（ＨＲ１）ペプチド、またはヘプタドリピート２（ＨＲ２）ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態３に記載のタンパク質。
実施形態６．表面抗原が、Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む、実施形態３～５のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態７．表面抗原が、Ｓタンパク質のＳ１サブユニット及びＳ２サブユニットを含む、実施形態３～６のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態８．表面抗原が、膜貫通（ＴＭ）ドメインペプチド及び／または細胞質（ＣＰ）ドメインペプチドを含まない、実施形態３～７のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態９．表面抗原が、プロテアーゼ切断部位を含み、プロテアーゼは、任意により、フリン、トリプシン、第Ｘａ因子、トロンビン、またはカテプシンＬである、実施形態３～８のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態１０．表面抗原が、プロテアーゼ切断部位を含まず、プロテアーゼは、任意により、フリン、トリプシン、第Ｘａ因子、トロンビン、またはカテプシンＬである、実施形態３～８のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態１１．表面抗原が、可溶性であるか、または脂質二重層、例えば膜またはウイルスエンベロープに直接結合しない、実施形態１～１０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態１２．表面抗原が、タンパク質の組換えポリペプチド間で同一であるかまたは異なる、実施形態１～１１のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態１３．表面抗原が、Ｃ末端プロペプチドに直接融合するか、またはグリシン－Ｘ－Ｙリピートを含むリンカーなどのリンカーを介してＣ末端プロペプチドに連結し、式中、Ｘ及びＹは、独立して任意のアミノ酸であり、任意によりプロリンまたはヒドロキシプロリンである、実施形態１～１２のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態１４．可溶性であるか、または脂質二重層、例えば膜またはウイルスエンベロープに直接結合しない、実施形態１～１３のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態１５．タンパク質が、対象の細胞表面受容体に結合することができ、任意により、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである、実施形態１～１４のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態１６．細胞表面受容体が、アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、樹状細胞特異的細胞間接着分子－３－捕捉非インテグリン（ＤＣ－ＳＩＧＮ）、または肝臓／リンパ節－ＳＩＧＮ（Ｌ－ＳＩＧＮ）である、実施形態１５に記載のタンパク質。
実施形態１７．Ｃ末端プロペプチドが、ヒトコラーゲンのものである、実施形態１～１６のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態１８．Ｃ末端プロペプチドが、ｐｒｏα１（Ｉ）、ｐｒｏα１（ＩＩ）、ｐｒｏα１（ＩＩＩ）、ｐｒｏα１（Ｖ）、ｐｒｏα１（ＸＩ）、ｐｒｏα２（Ｉ）、ｐｒｏα２（Ｖ）、ｐｒｏα２（ＸＩ）、もしくはｐｒｏα３（ＸＩ）のＣ末端プロペプチド、またはそれらの断片を含む、実施形態１～１７のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態１９．Ｃ末端プロペプチドが、組換えポリペプチド間で同一であるかまたは異なる、実施形態１～１８のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態２０．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号６７～８０のいずれか、またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～１９のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態２１．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号６７、またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態２２．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号６８、またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態２３．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号６９、またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態２４．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号７０、またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態２５．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号７１、またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態２６．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号７２、またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態２７．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号７３、またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態２８．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号７４、またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態２９．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号７５または配列番号７６、またはそれと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～２０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態３０．Ｃ末端プロペプチドが、配列番号６７～８０のいずれかのＮ末端に連結されたグリシン－Ｘ－Ｙリピートを含む配列（式中、Ｘ及びＹは、独立して任意によりアミノ酸及び任意によりプロリンもしくはヒドロキシプロリンである）、または配列番号６７～８０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成し、組換えポリペプチドを三量体化することができる、実施形態１～２９のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態３１．各組換えポリペプチド中の表面抗原が、融合前コンフォメーションまたは融合後コンフォメーション内にある、実施形態１～３０のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態３２．各組換えポリペプチド中の表面抗原が、配列番号２７～６６のいずれかまたは配列番号２７～６６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態１～３１のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態３３．各組換えポリペプチド中の表面抗原が、配列番号１～２６のいずれかまたは配列番号１～２６と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、実施形態１～３２のいずれかに記載のタンパク質。
実施形態３４．実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質を含む免疫原。
実施形態３５．ナノ粒子に直接的または間接的に連結された実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質を含むタンパク質ナノ粒子。
実施形態３６．実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
実施形態３７．実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質の組換えポリペプチドの１つ、２つ、３つまたはそれ以上をコードする単離された核酸。
実施形態３８．表面抗原をコードするポリペプチドが、コラーゲンのＣ末端プロペプチドをコードするポリペプチドにインフレームで融合される、実施形態３７に記載の単離された核酸。
実施形態３９．プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態３７または３８の単離された核酸。
実施形態４０．ＤＮＡ分子である、実施形態３７～３９のいずれかに記載の単離された核酸。
実施形態４１．ＲＮＡ分子であり、任意により、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ、非増幅ｍＲＮＡ、自己増幅ｍＲＮＡ、またはトランス増幅ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡ分子である、実施形態３７～３９のいずれかに記載の単離された核酸。
実施形態４２．実施形態３７～４１のいずれかに記載の単離された核酸を含むベクター。
実施形態４３．ウイルスベクターである、実施形態４２に記載のベクター。
実施形態４４．任意により、ウイルスまたは細胞が、組換えゲノムを有する、実施形態４２または４３のベクターを含むウイルス、偽ウイルス、または細胞。
実施形態４５．実施形態１～４４のいずれか１つに記載のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、または細胞、及び薬学的に許容される担体を含む免疫原性組成物。
実施形態４６．実施形態４５に記載の免疫原性組成物及び任意にアジュバントを含むワクチンであって、任意によりサブユニットワクチンであり、及び／または任意によりワクチンが予防用及び／または治療用ワクチンである、ワクチン。
実施形態４７．ワクチンが、複数の異なるアジュバントを含む、実施形態４６に記載のワクチン。
実施形態４８．タンパク質を産生する方法であって、宿主細胞内で実施形態３７～４３のいずれか１つに記載の単離された核酸またはベクターを発現させて、実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質を産生することと；タンパク質を精製することと、を含む。
実施形態４９．実施形態４８の方法によって産生されるタンパク質。
実施形態５０．対象において、コロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせる方法であって、免疫応答を生じさせるために、実施形態１～４７または４９のいずれか１つに記載の、有効量のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンを対象に投与することを含む、方法。
実施形態５１．コロナウイルスによる感染を治療または予防するための、実施形態５０に記載の方法。
実施形態５２．免疫応答が生じることにより、対象におけるコロナウイルスの複製を阻害または減少させる、実施形態５０または５１に記載の方法。
実施形態５３．免疫応答が、細胞性応答及び／または体液性応答を含み、任意により、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体などの１つ以上の中和抗体を産生することを含む、実施形態５０～５２のいずれかに記載の方法。
実施形態５４．免疫応答が、コロナウイルスの表面抗原に対するものであるが、Ｃ末端プロペプチドに対するものではない、実施形態５０～５３のいずれかに記載の方法。
実施形態５５．投与することにより、１つ以上のコロナウイルスへの以前の曝露により、対象において抗体依存性増強（ＡＤＥ）もたらされることはない、実施形態５０～５４のいずれかに記載の方法。
実施形態５６．投与することにより、その後１つ以上のコロナウイルスに曝露されたときに、対象において抗体依存性増強（ＡＤＥ）がもたらされることはない、実施形態５０～５５のいずれかに記載の方法。
実施形態５７．初回刺激ステップ及び／または追加免疫ステップをさらに含む、実施形態５０～５６のいずれかに記載の方法。
実施形態５８．投与ステップが、局所、経皮、皮下、皮内、経口、鼻腔内（例えば、鼻腔内スプレー）、気管内、舌下、頬側、直腸、膣内、吸入、静脈内（例えば、静脈内注射）、動脈内、筋肉内（例えば、筋肉内注射）、心臓内、骨内、腹腔内、経粘膜、硝子体内、網膜下、関節内、関節周囲、局所、または皮表（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与を介して実施される、実施形態５０～５７のいずれかに記載の方法。
実施形態５９．有効量が、単回用量または１回以上の間隔で分離された一連の用量で投与される、実施形態５０～５８のいずれかに記載の方法。
実施形態６０．有効量がアジュバントを含まずに投与される、実施形態５０～５９のいずれかに記載の方法。
実施形態６１．有効量が、アジュバントまたは複数のアジュバントと共に投与される、実施形態５０～５９のいずれかに記載の方法。
実施形態６２．実施形態１～３３のいずれか１つに記載の有効量のタンパク質を対象に投与して、対象において、コロナウイルスに対する中和抗体または中和抗血清を生成することを含む、方法。
実施形態６３．対象が、哺乳動物、任意によりヒトまたは非ヒト霊長類である、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．対象から中和抗体または中和抗血清を単離することをさらに含む、実施形態６２または６３に記載の方法。
実施形態６５．コロナウイルスによる感染を予防または治療するために、受動免疫を介してヒト対象に、有効量の単離された中和抗体または中和抗血清を投与することをさらに含む、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６．中和抗体または中和抗血清が、コロナウイルス表面抗原に対するポリクローナル抗体を含み、任意により、中和抗体または中和抗血清が、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに対する抗体を含まないかまたは実質的に含まない、実施形態６２～６５のいずれかに記載の方法。
実施形態６７．中和抗体が、コロナウイルス表面抗原に対するモノクローナル抗体を含み、任意により、中和抗体は、コラーゲンのＣ末端プロペプチドに対する抗体を含まないかまたは実質的に含まない、実施形態６２～６５のいずれかに記載の方法。
実施形態６８．対象におけるコロナウイルスに対する免疫応答の誘導、及び／またはコロナウイルスによる感染の治療または予防において使用するための、実施形態１～４７または４９のいずれか１つに記載のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチン。
実施形態６９．対象においてコロナウイルスに対する免疫応答を誘導するため、及び／またはコロナウイルスによる感染を治療または予防するための、実施形態１～４７または４９のいずれか１つに記載のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンの使用。
実施形態７０．対象においてコロナウイルスに対する免疫応答を誘導するため、及び／またはコロナウイルスによる感染を治療または予防するための医薬品または予防薬を製造するための、実施形態１～４７または４９のいずれか１つに記載のタンパク質、免疫原、タンパク質ナノ粒子、ＶＬＰ、単離された核酸、ベクター、ウイルス、偽ウイルス、細胞、免疫原性組成物、またはワクチンの使用。
実施形態７１．試料を実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質と接触させることと、タンパク質とコロナウイルスの表面抗原に特異的に結合することができるアナライトとの結合を検出することと、を含む、サンプルを分析するための方法。
実施形態７２．アナライトが、抗体、受容体、または表面抗原を認識する細胞である、実施形態７１に記載の方法。
実施形態７３．結合することは、サンプル中のアナライトの存在、及び／またはサンプルが由来する対象におけるコロナウイルスによる感染を示す、実施形態７１または７２に記載の方法。
実施形態７４．実施形態１～３３のいずれかに記載のタンパク質と、タンパク質を含むかまたは固定化する基板、パッド、またはバイアルとを含むキットであって、任意により、ＥＬＩＳＡまたはラテラルフローアッセイキットである、キット。
実施例
以下の実施例は、例示のみを目的として含まれており、本開示の範囲を限定することを意図していない。
実施例１：サブユニットワクチンとして、組み換えジスルフィド結合により連結されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－三量体融合タンパク質の生成
候補タンパク質サブユニットワクチンとして、三量体化ドメインに融合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質ペプチドを含む、組換えジスルフィド結合により連結されたポリペプチドの分泌形態を生成した。一例では、シグナルペプチド（ＳＰ）、Ｓ１及びＳ２ドメインなどのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２由来のネイティブスパイクタンパク質（Ｓ）の完全な外部ドメインが、α１コラーゲンのヒトＣ－プロペプチドをコードしている哺乳動物発現ベクターに、Ｃ末端において、インフレームで融合され、これにより、図１に示す分泌され、三量体化したＳ－三量体融合抗原の発現が可能になる。
Ｓ－三量体融合タンパク質の高レベル発現を図２に示した。１０Ｌバイオリアクターでの流加無血清ＣＨＯ細胞培養からのＳ－三量体発現の８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。６日目から１１日目までの無細胞馴化培地１０μＬを還元条件下で分析し、その後クーマシーブルー染色を行った。高度に精製したＳ－三量体を参照標準（Ｓｔｄ）としてゲルにロードした。Ｓ１／Ｓ２フリン部位での全長Ｓ－三量体及び部分切断形態は、示すとおりとした。
次に、共有結合したＳ－三量体を精製し、特徴を明らかにした。図３Ａに示すとおり、透明な細胞培養培地から、プロテインＡ（ＰＡ）アフィニティークロマトグラフィー及び陰イオン交換カラム（Ｑ）、その後限外濾過及びダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）を介して、Ｓ－三量体を精製し、原薬（ＤＳ）を得た。４μｇの精製タンパク質を開始細胞培養培地フィードに対して８％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、クーマシーブルーで染色した。Ｓ－三量体は、Ｓ１／Ｓ２フリン切断部位で部分的に切断されたが、切断されたＳ１サブユニットは、Ｓ－三量体と同時精製されたため、Ｓ－三量体に結合しているように見えた。図３Ｂに示すとおり、Ｓ－三量体は、ジスルフィド結合により連結された三量体である。高度に精製されたネイティブ様Ｓ－三量体４μｇを、示すとおり、非還元及び還元条件下で６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、クーマシーブルーで染色した。図３Ｃに示すとおり、Ｓ－三量体は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析によって判断されるとおり、ほぼ均質になるまで精製され、サイズ排除クロマトグラフィー中に、切断されたＳ１の一部が分離した。Ｓ－三量体の分子量は、６６０Ｋｄａであると推定した。図３Ｄでは、ＡＣＥ２－ＦｃへのＳ－三量体の受容体結合動態は、プロテインＡセンサーを使用したＦｏｒｔｅｂｉｏバイオレイヤー干渉法による測定によって評価した。
Ｓ－三量体は、Ｎ－連結グリカンで高度にグリコシル化した。エンドグリカナーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）単独またはＰＮＧａｓｅＦとエンド－Ｏ－グリコシダーゼとのいずれかを使用して、Ｎ連結及びＯ連結グリカンを除去するために消化前または消化後に、高度に精製したＳ－三量体を８％還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、クーマシーブルーで染色した。脱グリコシル化前及び後の全長Ｓ－三量体、Ｓ２－三量体、ならびに切断型Ｓ１は、図４に示すとおりであった。高度に精製されたＳ－三量体は、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉスピリット電子顕微鏡法を用いたネガティブＥＭによって可視化し、Ｓ－三量体の予測コンフォメーションを図５に示す。
実施例２：Ｓ－三量体タンパク質ペプチドを含む組換えポリペプチドの機能特性評価
最近ＣＯＶＩＤ－１９から回復した複数の患者の血清を、抗原としてＳ－三量体を用いて分析し、Ｓ特異的抗体価（図６、左パネル）及びＡＣＥ２受容体へのＳ－三量体の結合の阻害による中和抗体レベル（図６、右パネル）を決定した。この結果は、Ｓ－三量体を抗原として使用して、回復期の血清からＳ特異的抗体及び中和抗体をうまく検出したことを示している。
実施例１に記載のように生成した例示的な組換えポリペプチドの免疫原性及び防御効果をさらに評価するために、図７Ａ及び図７Ｂは、Ｓ－三量体単独（３０マイクログラム）及びいかなるアジュバントも使用しないラットにおける、それぞれ抗原特異的抗体及び中和抗体の誘導を示す。図６のヒトにおいて示されるデータと同様に、これらの結果は、抗原特異的抗体及び中和抗体が、Ｓ－三量体ワクチンにより誘導されたことを示している。同様に、Ｓ－三量体の免疫原性がマウスで示された。６つの群にグループ化したＢａｌｂ－ｃマウスを、１日目及び１４日目に２回、３μｇのＳ－三量体単独で、またはアジュバントとしてＳ－三量体＋ミョウバン（水酸化アルミニウム）で免疫した。２８日目に採取した抗血清をＳ－三量体を用いて解析し、抗体価を決定した（図７Ｃ）。スクアレンベースのアジュバントでアジュバント添加されたＳ－三量体は、図７Ｄ及び図７Ｅにそれぞれ示すとおり、抗原特異的抗体及び中和抗体を誘導する強力な能力を示した。ＧＭＴは、幾何平均力価を示す。
実施例３：Ｓ－三量体ワクチン組成物によって誘導されるウイルスの広範な中和
２０２０年後半に始まって、免疫エスケープを可能にし得る突然変異を含む複数のバリアントＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の出現及び拡散により、広く保護する最適化された免疫応答を誘導することを目標に、第２世代ワクチンの迅速な評価が必要とされている。この例は、マウスの免疫原性試験において、修飾Ｂ．１．３５１スパイク（Ｓ）－三量体ワクチン候補（Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体）の２回投与により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株の元の株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）、ＵＫバリアント株（Ｂ．１．１．７）、南アフリカバリアント株（Ｂ．１．３５１）、及びブラジルバリアント（Ｐ．１）株を広く中和することができる強力な体液性免疫応答を誘導できることを示している。さらに、プロトタイプＳ－三量体ワクチン（元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に基づく）の２回投与（初回刺激－追加免疫）による免疫化は、Ｂ．１．３５１バリアントに対して、低レベルの交差反応性中和を誘導したが、プロトタイプＳ－三量体またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体のいずれかを３回目に投与（ブースター投与）することにより、Ｂ．１．３５１に対する中和抗体価を、プロトタイプＳ－三量体の２回投与によって誘発された、元の株に対する中和抗体価に匹敵するレベルまで増加させることができた。
ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンのとてつもない進歩及び空前の速度での開発にもかかわらず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの大発生が最初に出現後１６ヶ月以上を超えた２０２１年４月に、１日あたりのＣＯＶＩＤ－１９症例の新しい記録が樹立された。ＣＯＶＩＤ－１９による合計死亡者数は、２０２１年５月に３００万人を超え、過去３ヶ月のみで１００万人の死亡が累積している。
最も懸念されるのは、ＣＯＶＩＤ－１９の症例が世界的に急増するのと同時に、２０２０年後半に開始した複数の新しいＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の懸念されるバリアント（ＶＯＣ）の出現である。これらのＶＯＣは、ウイルス伝播率を上昇させるかつ／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の元の株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）に基づく第１波のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンによるワクチン接種によって誘導される免疫を回避する可能性のあるスパイク（Ｓ）タンパク質の突然変異に関連していると考えられる。英国（ＵＫ）でのＢ．１．１．７バリアント、南アフリカでのＢ．１．３５１バリアント、及びブラジルでのＰ．１バリアントの出現及び拡散により、ＶＯＣとして分類されるようになっている。これらのＶＯＣにはすべて、Ｓタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）中にＮ５０１Ｙ変異が含まれており、伝播率が４０％～７０％増加することが報告されている。Ｂ．１．３５１及びＰ．１バリアントは、さらに２つのＲＢＤ変異（Ｅ４８４Ｋ及びＫ４１７）を有し、プロトタイプワクチン及び自然感染によって誘導される抗体からの免疫突然を可能にし得る。
プロトタイプＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの無作為化比較臨床試験では、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株と比較して、ＶＯＣに対するワクチンの有効性が低下していることが示唆されている。アジュバント添加タンパク質ベースのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンであるＮＶＸ－ＣｏＶ２３７３は、ＵＫ（Ｂ．１．１．７が優勢）で８９％の有効性を示したが、南アフリカ（Ｂ．１．３５１が優勢）では４９％の有効性のみ示した。アデノウイルスベクターのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンであるＣｈＡｄＯｘ１は、Ｂ．１．３５１バリアントに対してわずか１０％の有効性を示した。Ｐｆｉｚｅｒワクチン接種者は、Ｂ．１．３５１バリアントに対して７５％の有効性を示したが、元の株に対しては、９５％の有効性を示した。元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に基づく不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンであるコロナバック（Ｃｏｒｏｎａｖａｃ）を接種した対象は、Ｐ．１に対する検出可能な中和抗体価を示さなかった。
プロトタイプＣＯＶＩＤ－１９ワクチンにより、ＶＯＣによって引き起こされる重篤な疾患及び死亡から保護される可能性が高いという有望な所見がいくつかあるが、伝播率の上昇に伴い、あらゆるＣＯＶＩＤ－１９疾患に対するワクチンの有効性が低くなることにより、集団免疫を達成することは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの世界的な不足のためにさらに悪化し得る、特に困難な問題になり得る。効果的に制御されない場合、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＶＯＣが急速に世界的拡散されることにより、２０２１年春にＣＯＶＩＤ－１９の症例が急増するのと同時に出現し、現在、ＷＨＯによって新しいＶＯＣと宣言されているインドバリアント（Ｂ．１．６１７）など、新たなエスケープ変異を潜在的に保持する目的の新しいバリアントまたはＶＯＣが継続して出現する可能性がある。
これらの状況では、ＶＯＣに対する中和抗体応答を増強するためのブースター投与戦略の迅速な評価と、最適化された広範な防御的交差中和特性を付与し得る第２世代ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの開発が必要とされる。この試験では、修飾Ｂ．１．３５１スパイク－三量体抗原（「Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体」と呼ばれる）が生成され、マウスの免疫原性試験で、プロトタイプＳ－三量体（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．，１２：１３４６，２０２１；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３９７：６８２－６９４，２０２１）と比較した。異種初回刺激－追加免疫及び二価ワクチンアプローチも評価し、３回目の投与（ブースター投与）の効果も評価した。
結果
ヒトＣＯＶＩＤ－１９回復期血清中での交差反応性中和抗体の検出
元の株により感染したＣＯＶＩＤ－１９患者から収集された、中程度から高程度の抗体価を有する８つのヒト回復期血清（ＨＣＳ）サンプルを、元の株、ＵＫバリアント（Ｂ．１．１．７）、南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１）、及びブラジルバリアント（Ｐ．１）株に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和力価（図９Ａ）及びＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡ力価（図９Ｂ）について分析した。Ｂ．１．１．７に対するＨＣＳの中和抗体価は、元の株と類似しているように見え、ＡＣＥ２競合力価の差も統計的に有意でなかった。しかし、元の株に対する抗体価と比較して、ＨＣＳでは、Ｂ．１．３５１（７～９倍低い）及びＰ．１（２～３倍低い）に対して、有意に低い抗体価が観察された。
元の株及びＢ．１．３５１株に基づくスパイク抗原の作製及び特徴付け
共有結合三量体化Ｓタンパク質抗原は、三量体－タグ（登録商標）技術を利用して、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（プロトタイプＳ－三量体）及び南アフリカバリアント（Ｂ．１．３５１ Ｓ－三量体）に基づいて産生した（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．，１２：１３４６，２０２１）。プロトタイプＳ－三量体は、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）のネイティブスパイク外部ドメイン配列に基づき、修飾Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体（配列番号１０）は、Ｂ．１．３５１バリアント株に見られる３つのＲＢＤ変異（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）及びＤ６１４Ｇ変異を含み、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）及びＳ２配列は、元の株に基づく（図１０Ａ）。
ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法を用いたヒトＡＣＥ２受容体に対する精製Ｓ－三量体抗原の結合親和性（ＫＤ）は、プロトタイプＳ－三量体では約５．２ｎＭ、Ｂ．１．３５１ Ｓ－三量体では１．５ｎＭであることが示された（図１０Ｂ）。プロトタイプＳ－三量体と比較して、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体の３～４倍高いＡＣＥ２結合親和性は、以前に報告された結果と同様である。
マウスにおけるプロトタイプ及びＢ．１．３５１Ｓ－三量体初回刺激－追加免疫（２回投与）レジメンの免疫原性
ＢＡＬＢ／ｃマウスは、プロトタイプＳ－三量体の２回投与（０日目及び２１日目）、異種初回刺激－追加免疫（１回目の投与のプロトタイプＳ－三量体＋２回目の投与のＢ．１．３５１Ｓ－三量体）、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体の２回投与のいずれか、または二価ワクチンの２回投与（プロトタイプＳ－三量体とＢ．１．３５１Ｓ－三量体との混合）による本試験の第１段階で免疫した（図１０Ｃ～図１０Ｄ）。第１段階のすべての動物は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加初回刺激投与（１回目の投与）を受けた。２回目の投与（追加免疫）については、各群の動物の半数は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）を含むアジュバント添加追加免疫を受け、残りの半数は、アジュバント非添加追加免疫（抗原のみ）を受けた。元の株及び３つのＶＯＣ（Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１及びＰ．１）に対する偽ウイルス中和力価に基づいて、３５日目の血液サンプル（２回目の投与後２週間後）について、体液性免疫原性分析を実施した。
Ｂ．１．３５１及びＰ．１に対する中和抗体価は、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体及び二価ワクチンのいずれかを２回投与した群の中で最も高く（図１１Ａ）、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体では、数値的に最も高い力価を誘導した。プロトタイプＳ－三量体を２回投与した動物と比較して、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体を２回投与した動物では、Ｂ．１．３５１偽ウイルスに対して１３．８倍、Ｐ．１偽ウイルスに対して２．４倍高い中和抗体価を観察した。興味深いことに、異種初回刺激－追加免疫を受けた群（１回目の投与プロトタイプＳ－三量体＋２回目の投与のＢ．１．３５１Ｓ三量体）は、２回のプロトタイプＳ三量体の投与を受けた動物と比較して、Ｂ．１．３５１及びＰ．１に対して、高い抗体価を誘導することはなかった。
元の偽ウイルス及びＢ．１．１．７バリアント偽ウイルスに対する中和抗体価は、すべてのワクチン群で類似しており（図１１Ａ）、Ｂ．１．３５１ワクチンの２回投与が、元の株に対して完全に逆中和することができ、またＢ．１．１．７バリアントに対しても完全に保護することができる抗体を誘発できたことを示している。
ＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡの結果は、偽ウイルス中和結果と一致し、さらに確認され（図１１Ｂ）、及びＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡ力価は、試験した４つの株すべてにおいて、偽ウイルス中和力価と相関することが判明した。
アジュバント添加対アジュバント非添加の２回目の投与（追加免疫）の効果は、偽ウイルス中和力価に基づく因子分析によって行った（図１２Ａ）。アジュバント添加追加免疫を受けた動物は、アジュバント非添加追加免疫（抗原のみ）を受けた動物と比較して、約２倍～４倍高い中和抗体価を誘導するように見え、これは、追加免疫に利用した場合の免疫応答に対するアジュバントのプラスの影響を示している。
マウスにおけるプロトタイプまたはＢ．１．３５１Ｓ－三量体ブースター投与（３回目の投与）の免疫原性
本試験の第２段階（図１０Ｃ）では、プロトタイプＳ－三量体初回刺激－追加免疫群の動物は、プロトタイプＳ－三量体またはＢ．１．３５１ Ｓ－三量体（半数は、アジュバント添加、半数は、アジュバント非添加）のいずれかで、３５日目にブースター投与（３回目の投与）を受けるように、無作為に割り付けた。異種初回刺激－追加免疫群及びＢ．１．３５１Ｓ－三量体初回刺激－追加免疫群の動物を無作為に割り付け、アジュバント非添加プロトタイプまたはアジュバント非添加Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体のいずれかによるブースター投与（３回目の投与）を受けた。体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の分析は、４９日目のサンプル（３回目の投与の２週間後）で実施した。
ブースター投与を受けた後、すべてのワクチン群において、元の株（図１３Ａ）及びＢ．１．１．７バリアント（図１３Ｂ）偽ウイルスに対する中和抗体価は類似しており、２回目の投与後と比較して、ブースター（３回目の投与）後の力価の倍加も、群間で類似していた。中和抗体価は、ブースター群全体で平均して、元の株に対して約１．６～３．１倍、Ｂ．１．１．７バリアントに対して約１．８～２．８倍増加した。
プロトタイプＳ－三量体の初回刺激投与（１回目の投与）を含むワクチンの３回の投与を受けた群では、Ｂ．１．３５１バリアント偽ウイルスに対する中和抗体価（図１３Ｃ）は、ブースター投与後に平均で１．７～４．６倍増加し、プロトタイプＳ－三量体の２回投与によって誘発された元の株に対する中和に匹敵するレベルを達成した。これらの群におけるＢ．１．３５１中和力価の変動は、試験した他の株に対する中和価よりも大きいように見えることに留意されたい。Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体の３回目の投与を受けた群では、Ｂ．１．３５１に対する中和抗体価は、ブースター投与後も有意に増加しなかった。これはおそらく、追加免疫（２回目の投与）後に力価がすでに高い生物学的レベルにあったためである。
興味深いことに、プロトタイプＳ－三量体による初回刺激－追加免疫及びその後のブースター投与（プロトタイプＳ－三量体またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体のいずれか）を認識した群では、Ｐ．１中和力価（図１３Ｄ）は、ブースター投与後に増加するとは考えられなかった。Ｂ．１．３５１中和力価と同様に、Ｐ．１中和力価は、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体を３回投与した群で、数値的に最も高かった。
プロトタイプＳ－三量体ワクチンの２回投与（初回刺激－追加免疫）、その後Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体のブースター投与（３回目の投与）を受けた動物の群では、プロトタイプＳ－三量体を用いたブースター投与を受けた動物と比較して、Ｂ．１．３５１またはＰ．１に対して、より高い中和抗体を誘導したように見えなかった（図１３Ｃ～１３Ｄ）。
群１における体液性免疫原性に対するアジュバント添加対アジュバント非添加ブースター投与（３回目の投与）の効果を、偽ウイルス中和力価に基づく因子分析を用いて実施した（図１２Ｂ）。アジュバント添加ブースター投与を受けた動物は、アジュバント非添加ブースター投与（抗原のみ）を受けた動物と比較して、有意に高い中和抗体価を誘導するとは考えられなかった。
マウスにおけるプロトタイプまたはＢ．１．３５１ Ｓ－三量体の３回の投与によって誘導される細胞性免疫応答
細胞性免疫応答は、４９日目（３回目の投与の２週間後）に３回のプロトタイプＳ－三量体の投与または３回のＢ．１．３５１Ｓ－三量体の投与のいずれかを受けた動物で評価した。細胞性免疫（ＣＭＩ）は、元の（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）株Ｓ１ペプチドプール、ＳＡＲＳ－ＣｏＶＳ１ペプチドプール、Ｂ．１．３５１バリアントＲＢＤペプチドプール、またはＰ．１バリアントＲＢＤペプチドプールのいずれかで刺激した、採取したマウス脾細胞中で、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮγ及びＩＬ－２）またはＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－５）を検出するＥＬＩＳｐｏｔによって評価した。
試験したすべての刺激剤において、両方のワクチン群で強いＴｈ１に偏ったＣＭＩが観察された（図１４Ａ～図１４Ｄ）。アジュバント添加Ｓ－三量体抗原によって誘導されるＴｈ１に偏ったＣＭＩは、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．，１２：１３４６，２０２１での結果に一致している。
重要なことに、ＣＭＩの程度は、すべての刺激剤において両方のワクチン群で同様であるように見え、これは、ＶＯＣ（Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１など）に向けられた広範な交差反応性ＣＭＩが、プロトタイプ及びＢ．１．３５１Ｓ－三量体－ワクチンの両方によって誘導され得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶＳ１ペプチドプールに対する交差反応性ＣＭＩ（図１４Ｂ）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の元の株に対するＣＭＩ（図１４Ａ）よりも約４０～５０％低いレベルにあるように見え、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１ドメインの配列相同性７９％と一致している。
考察
修飾Ｂ．１．３５１ Ｓ－三量体ワクチンは、元の株及び対象のバリアントに対して広範な中和を誘導する
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の元の株に基づくプロトタイプＣＯＶＩＤ－１９ワクチンを評価する他の試験の結果と一致して、本試験では、プロトタイプＳ－三量体初回刺激－追加免疫ワクチン接種により、相同である元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対する力価と比較して、Ｂ．１．３５１及びＰ．１バリアントに対する中和抗体価の低下が誘導された（図１１Ａ～図１１Ｂ）。Ｂ．１．３５１バリアント及びＰ．１バリアントの両方のＲＢＤにおけるＥ４８４Ｋ変異及びＫ４１７突然変異により、プロトタイプワクチンによって誘導される抗体からの免疫エスケープが得られると考えられている。
修飾Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体抗原を２回投与することにより、Ｂ．１．３５１及びＰ．１バリアントに対する高レベルの中和抗体が誘導された。重要なことに、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体の２回投与により、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対しても完全に逆中和し、かつＢ．１．１．７バリアントを中和することもできた。対照的に、Ｂ．１．３５１バリアントスパイクタンパク質（Ｂ．１．３５１で見つかったすべての突然変異を含む）に基づくｍＲＮＡＣＯＶＩＤ－１９ワクチン候補は、マウスでのプロトタイプｍＲＮＡワクチンと比較して、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対して、約６倍低い中和抗体価を誘導するように考えられ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２１．０４．１３．４３９４８２）、この結果は、このＢ．１．３５１ｍＲＮＡワクチン候補の第１相臨床試験で一貫していた（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０２１；３８４：１４６８－１４７０）。
修飾Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体ワクチン候補によって誘導される広範な中和は、Ｂ．１．３５１バリアント株に見られる３つのＲＢＤ突然変異（Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ）及びＤ６１４Ｇ突然変異を含む抗原配列のキメラ性によって説明できる可能性があり、その一方で、ＮＴＤ及びＳ２配列は、元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）に基づいている（図１０Ａ）。これまでの試験では、ＮＴＤを標的とする中和抗体が同定されており、新たな所見は、ワクチン誘導性抗ＮＴＤ中和抗体が、抗ＲＢＤ中和抗体と共優性であることを示唆しており、これにより、ＮＴＤの重要性が強調されている。したがって、データは、広範な中和を誘導するための潜在的なモデルを示唆するものであり、これにより、修飾Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体抗原が、（ａ）Ｂ．１．３５１バリアント株及びＰ．１バリアント株を中和できるＥ４８４Ｋ及びＫ４１７突然変異を標的とする抗ＲＢＤ抗体と、（ｂ）元の株を中和できる抗ＮＴＤ抗体とを誘導することができる。
プロトタイプワクチンの２回投与後のブースター投与は、広範な中和を強化し得る
この試験での結果は、プロトタイプＳ－三量体を２回投与後のブースター投与（プロトタイプＳ－三量体またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体のいずれかによる）により、元の株及びＢ．１．３５１などのＶＯＣに対する広範な中和抗体のレベルが上昇する可能性があることを示唆している。受けたブースター投与がプロトタイプＳ－三量体またはＢ．１．３５１Ｓ－三量体である場合、中和抗体価に有意差はないように見えた。したがって、特定の時点で利用可能なプロトタイプ及びバリアントワクチンを提供することに基づいて、効果的な追加戦略の柔軟性を高めることができる。
異種初回刺激－追加免疫（１回目の投与プロトタイプＳ－三量体＋２回目の投与Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体）は、プロトタイプＳ－三量体相同性初回刺激－追加免疫を受けた動物と比較して、Ｂ．１．３５１及びＰ．１に対して高い中和抗体価を誘導しなかったことにも留意するべきである。さらに、プロトタイプＳ－三量体初回刺激－追加免疫後のブースター投与により、Ｂ．１．３５１バリアントに対する中和力価が約２．８倍～４．６倍増加したが（２回目の投与後のレベルと比較して）、力価は、依然として数値的には低く、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体の２回投与または３回投与を受けた動物よりも変化しやすかった。さらに、Ｐ．１中和力価は、プロトタイプＳ－三量体初回刺激－追加免疫及びその後のブースターを受けた群では増加せず、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体の３回投与を受けた群よりも、依然として２．７倍～４．１倍低かった。これらの結果は、プロトタイプのＣＯＶＩＤ－１９ワクチンによる初回刺激が、ある程度の「抗原原罪」を誘導し得ることを示唆している。これは、他のウイルス（インフルエンザ及びデング熱など）についてこれまでに記述されてきた現象であり、これにより、免疫系が初回刺激免疫原のエピトープに優先的に応答し、バリアント中の新規エピトープに応答する能力が低くなる（Ｖａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．８３：１２－２１，２０１７）。しかし、プロトタイプＳ－三量体初回刺激－追加免疫によって誘導されたマウスにおけるＶＯＣに対する交差反応性中和抗体価は、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体によって誘導されたレベルよりも低いものの、依然として比較的高く、中和力価が、ブースター投与により増加する可能性がある。
この例でのブースター投与の結果は、例えば、アデノウイルスベクター、ｍＲＮＡ、及び／または不活化ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの一連の初回刺激後のブースター投与としてタンパク質ベースのＳ－三量体を利用して、異なるプラットフォーム間での異種初回刺激－追加免疫戦略を裏付けるものである。潜在的なＰＥＧ感作に関連するｍＲＮＡワクチンの複数回投与の安全性に関して安全性の懸念が浮上しており、アデノウイルスベクターワクチンの抗ベクター免疫原性により、その後の同種投与の有効性が低下することが知られている。予備的ヒト臨床データは、アデノウイルスベクター及びｍＲＮＡ ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンによる異種初回刺激－追加免疫（またはその逆）が、同種の初回刺激－追加免疫対応物よりも高率で全身性反応原性を誘導することを示唆することを示している（Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．（２０２１）ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（２１）０１１１５－６）。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する広範な交差反応性細胞性免疫応答
ＣＯＶＩＤ－１９の予防またはＣＯＶＩＤ－１９からの回復における細胞性免疫（ＣＭＩ）の正確な役割は、依然として解明されていないが、スパイク（Ｓ）タンパク質に対する強力な細胞性免疫応答が、ＣＯＶＩＤ－１９患者で誘導され、そのＣＭＩは、症状の軽減及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のクリアランスの加速に寄与し得ることが十分に明らかになっている。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ナイーブ個体の最大３５％が、他の一般的な風邪コロナウイルスによるこれまでの感染により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対してある程度の交差反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を有することが報告されている。この試験では、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体と比較して、Ｂ．１．３５１に対して低いレベルの中和抗体が、プロトタイプＳ－三量体によって誘導されたが、ＣＭＩレベルは、両方のワクチン候補で類似しているように考えられ、また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（元の株Ｓ１、Ｂ．１．３５１バリアントＲＢＤ、Ｐ．１バリアントＲＢＤ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ（Ｓ１）に対する抗原について交差反応性があり、これは、コロナウイルススパイクタンパク質に対するＣＭＩが、体液性免疫応答よりも広く交差反応する可能性があることを示唆している。本試験において、Ｓ－三量体によって誘導されたＣＭＩは、本質的にＴｈ１に偏っていると考えられ、このことは、アジュバント添加プロトタイプＳ－三量体を評価したこれまでの試験と一致している（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．，１２：１３４６，２０２１；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，３９７：６８２－６９４，２０２１）。
ブースト戦略におけるアジュバントの使用
三量体－タグ技術を利用した Ｓ－三量体抗原の高い生産性、及び産生を迅速に数十億回までスケールアップする可能性を考慮して、アジュバントの供給がＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの入手可能性の制限要因である場合、「アジュバント減量（ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｐａｒｉｎｇ）」の可能性を本試験で評価した。
アジュバントの使用により、免疫学的初回刺激が確立されると考えられているため、アジュバント添加及びアジュバント非添加の２回目の投与（追加免疫）ならびに３回目の投与（ブースター）の投与を評価し、比較した。アジュバント添加追加免疫を受けた動物は、アジュバント非添加追加免疫（抗原のみ）を受けた動物と比較して、２～４倍高い中和抗体価を誘導し（図１２Ａ）、これは、最適な免疫応答を達成するために、一連の初回刺激ワクチン接種の２回目の投与にアジュバントが依然として必要であり得ることを示唆している。しかし、アジュバント添加ブースター（３回目の投与）を受けた動物は、アジュバント非添加ブースター投与（抗原のみ）を受けた動物と比較して、有意に高い中和抗体価を誘導するとは考えられなかった（図１２Ｂ）。
方法
タンパク質の発現及び精製
プロトタイプＳ－三量体及び修飾Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体抗原は、以前に記載されたとおり産生し、精製し（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．，１２：１３４６，２０２１）、免疫原性試験に使用した。Ｂ．１．１．７バリアント及びＰ．１バリアントに基づくＳ－三量体抗原も産生され、ＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡアッセイに使用した。それぞれのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント株スパイク（Ｓ）タンパク質の外部ドメインをコードするｃＤＮＡをｐＴＲＩＭＥＲ哺乳動物発現ベクターにサブクローニングして、ジスルフィド結合を介した自己三量体化が可能な、三量体－タグへのインフレーム融合が可能になった。２９３Ｆ細胞への一過性トランスフェクション後、バリアントＳ－三量体抗原が発現し、十分なレベルで分泌され、さらなる特性評価及びマウス免疫原性試験が可能になった。特徴評価及びワクチン試験のために高度に精製された形態のバリアントＳ－三量体抗原を得るために、以前に記載されたアフィニティー精製スキーム（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．，１２：１３４６，２０２１）を利用して、単一ステップでほぼ均質になるまで抗原を精製した。
Ｓ－三量体のヒトＡＣＥ２への受容体結合試験
Ｓ－三量体のＡＣＥ２への結合親和性は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ（Ｐａｌｌ）でのＢｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ測定によって評価した。ＡＣＥ２－Ｆｃ（１０μｇ／ｍＬ）をプロテインＡ（ＰｒｏＡ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ）に固定化した。リアルタイム受容体結合曲線は、センサーをＳ－三量体の２倍連続希釈液に適用することによって得られた（２２．５～３６μｇ／ｍＬ／ＰＢＳ）。Ｏｃｔｅｔソフトウェア、バージョン１２．０を使用して、速度パラメータ（Ｋｏｎ及びＫｏｆｆ）ならびに親和性（ＫＤ）を分析した。Ｓ－三量体（プロトタイプまたはＢ．１．３５１）のＡＣＥ２－Ｆｃへの１：１結合モデルを仮定して、定常状態分析を使用して解離定数（ＫＤ）を決定した。
マウスにおけるプロトタイプＳ－三量体及び修飾Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体の免疫原性分析
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１６～３２／群）は、試験の第１段階で、プロトタイプＳ－三量体（３μｇ）の２回投与（０日目及び２１日目）、異種初回刺激－追加免疫（１回目の投与プロトタイプＳ－三量体；２回目の投与Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体；各抗原３μｇ）、Ｂ．１．３５１Ｓ－三量体（３μｇ）の２回投与、または二価ワクチンの２回投与（３μｇのプロトタイプＳ－三量体を３μｇＢ．１．３５１Ｓ－三量体と混合）で免疫した。第１段階のすべての動物は、アジュバント添加初回刺激投与（１回目の投与）を受けたが、各群の動物の半数は、アジュバント添加追加免疫（２回目の投与）を受け、他の半数は、アジュバント非添加追加免疫（抗原のみ）を受けた。試験の第２段階では、群１の動物を、３μｇのプロトタイプまたは３μｇのＢ．１．３５１Ｓ－三量体（半数はアジュバント添加し、半数はアジュバント非添加である）のいずれかのブースター投与（３５日目に３回目の投与）を受けるように、無作為に割り付けた。群２～３の動物は、３μｇのアジュバント非添加プロトタイプまたはＢ．１．３５１Ｓ－三量体のいずれかによるブースター（３回目の投与）を受けるように、無作為に割り付けた。第１段階では、体液性免疫原性の一次分析を３５日目の血液サンプルで行った。第２段階では、体液性及び細胞性免疫応答の一次分析を４９日目の血液サンプルで行った。体液性免疫応答分析のために、動物の尾静脈から採血した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイのために、屠殺後、脾臓を取り出した。
ＡＣＥ２競合ＥＬＩＳＡアッセイ
９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を１μｇ／ｍＬ ＡＣＥ２－Ｆｃ（１００μＬ／ウェル）で、４℃で一晩コーティングし、２％脱脂乳で、３７℃で２時間ブロックした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、段階希釈した抗血清と混合した１００ｎｇ／ｍＬＳ－三量体（プロトタイプ、Ｂ．１．３５１、Ｂ．１．１．７またはＰ．１）の入ったプレートを３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、プレートを１：５０００希釈のウサギ抗三量体－タグ抗体（Ｃｌｏｖｅｒ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、その後ＰＢＳＴで３回洗浄し、次に１：２００００希釈のヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共にインキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えてシグナルを発色させた。阻害の割合は、以下のように計算した：阻害率％＝［（Ａ－ブランク）－（Ｐ－ブランク）］／（Ａ－ブランク）ｘ１００、式中、Ａは、血清が存在しない場合のＡＣＥ２－Ｆｃに結合するＳ－三量体の最大ＯＤシグナルであり、Ｐは、特定の希釈で血清の存在下でＡＣＥ２－Ｆｃに結合するＳ－三量体のＯＤシグナルである。所与の血清サンプルのＩＣ５０は、サンプルが５０％の競合を示す希釈の逆数として定義した。
偽ウイルス中和アッセイ
元の（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１）株及びバリアントＢ．１．１．７、Ｂ．１．３５１、及びＰ．１株のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイを行った。抗血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和活性を評価するために、サンプルを最初に３０分間熱不活化し、段階希釈（３倍）し、等量の６５０ＴＣＩＤ５０偽ウイルス、ならびにウイルス単独（陽性対照）及び細胞単独（陰性対照）と共に３７℃で１時間インキュベートした。次に、新たにトリプシン処理したＡＣＥ２過剰発現－２９３細胞を各ウェルに２００００細胞／ウェルで加えた。５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で２４時間インキュベーション後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）によって製造業者のプロトコールに従って決定した。所定の血清サンプルのＥＣ５０中和抗体価は、ウイルスのみの対象ウェルと比較して、相対光単位（ＲＬＵ）が５０％減少したことをサンプルが示した希釈度の逆数として定義した。
脾細胞刺激及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
抗原特異的Ｔ細胞応答を検出するために、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２）及びＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－５）を測定するＥＬＩＳｐｏｔキット（Ｍａｂｔｅｃｈ）を、製造業者の指示に従って、使用した。免疫マウス由来の脾細胞または免疫マウス由来のＰＢＭＣを、３回目の免疫の２週間後に採取した。５ｘ１０５個の脾細胞（９６ウェルプレート）を２μｇ／ｍＬの元のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ１ペプチドプール、ＳＡＲＳ－ＣｏＶＳ１ペプチドプール、Ｂ．１．３５１ＲＢＤペプチドプール、またはＰ．１ＲＢＤペプチドプールのいずれかにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激した。非特異的刺激としてホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）及びイオノマイシンを陽性対照ウェルに加え、陰性対照ウェルには刺激を与えなかった。２４～４８時間のインキュベーション後、ＥＬＩＳｐｏｔキットのビオチン化検出抗体及びＳＡ－ＡＬＰ／ＳＡ－ＨＲＰを加えた。ＢＣＩＰ／ＮＢＴまたはＡＥＣ基質溶液を添加することによりブロットを展開し、暗所で５～３０分のインキュベーション後に着色スポットを生成した。最後に、自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダー（ＣＴＬ）を使用して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＩＬ－５スポット形成細胞（ＳＦＣ）をカウントした。
実施例４：アジュバント添加ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの免疫原性
Ｓ－三量体抗原を迅速に発現させるために、三量体－タグ技術を使用した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７（１）：８９５３，２０１７）。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質の外部ドメインをコードするｃＤＮＡをｐＴＲＩＭＥＲ哺乳動物発現ベクターにサブクローニングして、ジスルフィド結合を介して自己三量体化できる、三量体－タグへのインフレーム融合が可能になった。ＣＨＯ細胞への安定したトランスフェクション、その後の高力価産生クローンのスクリーニング、及び広範なプロセス最適化の後、約５００ｍｇ／Ｌの力価を有する分泌タンパク質としてのＳ－三量体の高レベルの発現につながるバイオリアクターでの流加無血清細胞培養プロセスを開発した。
ワクチン試験用に高度に精製された形態でＳ－三量体を得るために、三量体－タグとＥｎｄｏ１８０（１型プロコラーゲンのＣ－末端領域及び成熟コラーゲンに結合することができるコラーゲン受容体）との間の高い結合親和性を利用して、アフィニティー精製スキームを開発した。Ｅｎｄｏ１８０－Ｆｃ融合タンパク質をプロテインＡカラムにロードし、プロテインＡとＥｎｄｏ１８０－ＦｃのヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインとの間の高親和性結合を介して、樹脂に捕捉させた。次に、ＣＨＯ細胞によって分泌されたＳ－三量体を含む無血清細胞培養培地を、事前に捕捉されたＥｎｄｏ１８０－Ｆｃを含むプロテインＡカラムにロードした。あらゆる未結合の混入宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び他の不純物を洗い流した後、結合したＳ－三量体は、プロテインＡカラムからＥｎｄｏ１８０－Ｆｃを解離しない適度な塩溶出条件を使用して、単一のステップでほぼ均質になるまで精製した。Ｓ－三量体は、予防的ウイルス不活化（ＶＩ）のための低ｐＨ、宿主細胞ＤＮＡ及びあらゆるエンドトキシンを除去するための陰イオン交換クロマトグラフィー、予防的ウイルス除去（ＶＲ）ステップとしてのナノろ過、及び最終的にＵＦ／ＤＦによりさらに精製して、製剤緩衝液中所望の濃度までＳ－三量体を濃縮して、Ｓ－三量体サブユニットワクチン候補の活性原薬（ＤＳ）を得た。精製されたＳ－三量体の安定性分析では、Ｓ－三量体が、２～８℃で、液体溶液製剤中で安定であることを示している。
非還元及び還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、精製されたＳ－三量体がジスルフィド結合により連結された三量体であり、ＣＨＯ細胞によって産生されるフリンプロテアーゼによって、Ｓ１／Ｓ２境界において部分的に切断されることが確認された。非還元条件下では、Ｓ－三量体は、複数の高分子量形態で出現した。これは、おそらく抗原の部分的な切断の結果であり、サンプル処理中に非共有結合により連結され、切断されたＳ１が放出された。非切断Ｓ－三量体の還元形態の分子量は、約２４５ｋＤａである。エドマン分解によるペプチド配列決定により、６８５Ｒ～６８６Ｓ間のＳ１／Ｓ２切断が確認され、１３Ｓ～１４Ｑ間のシグナルペプチド切断後に、おそらく残留１４Ｑでのピログルタミン酸形成を介して、Ｓ－三量体のＮ末端アミノ酸がブロックされていることが明らかになった。これは、１４Ｑのピログルタミン酸アミノペプチダーゼ除去後のその後のペプチド配列決定によって確認された。Ｓ－三量体のタンパク質グリコシル化は、Ｎ－及びＯ－連結型デグリコシラーゼによって分析し、Ｓ１領域及びＳ２領域の両方において、広範なＮ－連結型グリコシル化が示され、脱グリコシル化前（１２９ｋＤａ及び１１６ｋＤａ）及び脱グリコシル化後（９３ｋＤａ及び７２ｋＤａ）のＳ２－三量体及びＳ１の分子量変化に基づいて、糖鎖が約３２％の質量（７９ｋＤａ）を占めていた。精製されたＳ－三量体の純度は、サイズ排除ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析し、切断されたＳ１として同定される７００Ｋｄａ付近の９６．３％のメインピーク及び１８０Ｋｄａ付近の３．７％のマイナーピークが示された。ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉計を使用して、ヒトＡＣＥ２受容体への精製Ｓ－三量体の結合親和性（ＫＤ）が、１．３３ｎＭであることが示された。ネガティブ染色のＥＭ可視化により、Ｓ－三量体粒子は、主に、完全長野生型スパイクタンパク質に似た準安定な三量体の融合前形態で存在することが確認され、これは、添付の論文の低温ＥＭ構造試験によってさらに確認された（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２０．０９．２１．３０６３５７．ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０９．２１．３０６３５７）。
Ｓ－三量体による回復期血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的結合及び中和抗体の検出。Ｓ－三量体は、回復したＣＯＶＩＤ－１９患者から収集されたヒト回復期血清サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合抗体及びＡＣＥ２競合抗体の存在を検出するために、抗原として使用した。高レベルのＳ－三量体結合抗体及びＡＣＥ２競合力価が、回復期血清中で検出され、偽ウイルス中和アッセイを使用して、高中和抗体価も検出した。Ｓ－三量体結合抗体は、ヒトボランティアのナイーブ血清では検出されなかったが、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）－三量体に結合する抗体は、ＣＯＶＩＤ－１９回復期血清及びナイーブ血清の両方で検出された。これは、試験されたすべての対象におけるインフルエンザによるこれまでの感染を意味するものであるが、ＣＯＶＩＤ－１９回復期対象では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症のみを意味する。これらの結果は、アッセイの特異性を裏付けるものであり、回復期血清中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質特異的抗体を検出するＳ－三量体の能力が実証され、Ｓ－三量体中でのスパイク抗原のネイティブ様コンフォメーションがさらに確認される。
抗体価は、疾患の重症度と相関することが観察され、軽度のＣＯＶＩＤ－１９疾患の患者では抗体価が低く、重症例では抗体価が高かった。抗体価も患者の年齢と適度に相関しているように見えたが、性別間で差は観察されなかった。
ヒト回復期血清の抗体価は、利用した３つのアッセイ間で相関することが観察され、これらの相関関係は、Ｓ－三量体で免疫した動物の血清中でさらに確認された。興味深いことに、検出可能な偽ウイルス中和抗体価を有するいくつかの回復期血清サンプルでは、いかなる検出可能なＡＣＥ２競合力価も有さず、これは、ＡＣＥ２に結合するＲＢＤが、中和抗体の唯一の標的ではなく、ＮＴＤ及びＳ２などの他のドメインも、これまでに報告されているように、ウイルスの中和にとって重要な抗原エピトープであり得ることを示唆している。
Ｓ－三量体の免疫原性は、ＢＡＬＢ／ｃマウスで評価した。マウスは、アジュバント非添加であるかまたは様々なアジュバントを含むＳ－三量体を用いて、２回の初回刺激－追加免疫レジメン（０日目及び２１日目）で、２回、筋肉内にワクチン接種した。体液性免疫原性に対するアジュバント効果は明らかであり、アジュバント添加群のＳ－三量体結合抗体価、ＡＣＥ－２競合力価、及び中和抗体価は、対応する抗原用量レベルにおいて、アジュバント非添加ワクチンよりも有意に高かった。異なるアジュバントでアジュバント添加されたＳ－三量体は、ＡＣＥ２競合抗体価及び偽ウイルス中和抗体価の両方を、ヒト回復期血清サンプル中で観察されたレベルと同等またはそれ以上に誘発した。Ｓ－三量体で免疫したラットでも同様の結果が観察された。
Ｓ－三量体抗原特異的細胞性免疫（ＣＭＩ）は、屠殺時に免疫マウスから脾細胞を採取することによって試験し、その後Ｓ－三量体抗原で刺激し、ＥＬＩＳｐｏｔにより、Ｔｈ１（ＩＬ－２及びＩＦＮγ）サイトカイン及びＴｈ２（ＩＬ－４及びＩＬ－５）サイトカインを検出した。アジュバント添加群は、アジュバント非添加Ｓ－三量体よりも強力な全体的なＣＭＩ応答を誘導するように見えた。Ｔｈ１に偏った細胞性免疫応答は、アジュバント非添加Ｓ－三量体群及び特定のアジュバント添加Ｓ－三量体群で観察されたが、Ｔｈ１－Ｔｈ２混合プロファイルは、他のアジュバント添加群で観察された。ＣＭＩは、抗原の投与量に依存しているようには見えなかった。
アジュバント添加Ｓ－三量体の免疫原性は、非ヒト霊長類（アカゲザル）でさらに試験した。動物は、アジュバント添加Ｓ－三量体またはＰＢＳビヒクル対照で、２回、筋肉内にワクチン接種した。その後、動物は３５日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスでチャレンジさせ、その後、様々なパラメータによって免疫防御を評価した。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス中和アッセイなどの様々な方法によって測定した高レベルの結合抗体価及び中和抗体価を、アジュバント添加Ｓ－三量体を投与された両方の群で観察した。２回目の投与（２１日目）の追加免疫効果は明らかであり、２８日目に中和抗体レベルの有意な増加が観察され、チャレンジ前の３５日目まで継続して上昇した。３５日目に、アジュバント添加Ｓ－三量体群での中和抗体価は、ヒト回復期血清でのレベルよりも有意に高かった。さらに、アジュバント添加Ｓ－三量体群の動物は、ウイルスチャレンジの７日後も依然として高く、迅速かつより持続的なリンパ球応答を高めるように見えた。ウイルスチャレンジ後の抗体価は、４０日目（５ｄｐｉ）でのチャレンジ後にわずかに減少するように見え、これは、高用量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるチャレンジが、循環する抗スパイク抗体のウイルスへの迅速な結合及びその後のクリアランスにつながり得ることを示唆するものであり；同様の傾向が、ウイルスに再曝露された回復期のヒトで報告された（Ａｄｄｅｔｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２１，ＪＣＭ．０２１１０７－２０（２０２０））。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるチャレンジ後、アジュバント添加Ｓ－三量体群の動物は、体重減少から保護されたが、ビヒクル対照群の動物は、他の報告された試験と一致して、７ｄｐｉまで約８％の急速な体重減少が観察された（Ｍｕｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５８５：２６８－２７２，２０２０）。同様に、アジュバント添加Ｓ－三量体を投与された動物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後の体温の上昇から保護されているように見えた。様々な血液化学パラメータは、活性ワクチン群の動物が、臓器及び組織の損傷、ならびにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の他の悪影響から保護され得ることも示唆しており、アジュバント添加Ｓ－三量体群と比較して、ビヒクル対照群の動物では、血中アルブミン（ＡＬＢ）、Ａ／Ｇ比、ＡＳＴ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、グルコース（ＧＬＵ）、乳酸（ＬＡＣ）、及びトリグリセリド（ＴＲＩＧ）の７ｄｐｉまでの増加が観察された。
肺組織は、５～７ｄｐｉの剖検で採取し、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に基づいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス量について試験した。アジュバント添加Ｓ－三量体群では、肺組織でのウイルス量の完全な減少が観察されたが、ビヒクル群ではウイルス量は検出可能であった。７ｄｐｉまでのチャレンジ後、活性ワクチンを投与された動物でのウイルス量が減少する同様の傾向が、喉スワブ、肛門スワブ、及び気管ブラシから観察された。鼻スワブで検出されたウイルスｇＲＮＡは、ウイルスチャレンジの場所として予測されたものであり、必ずしもウイルスの複製を示すものではない。肺組織で実施された組織病理学的分析、及びスパイクタンパク質に特異的な抗体を用いたＩＨＣ染色により、Ｓ－三量体をワクチン接種した動物において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の減少がさらに確認された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＤ６１４Ｇ突然変異は、受容体結合を変化させず、Ｓ－三量体によって誘発された中和抗体からも回避されない。スパイクタンパク質中にＤ６１４Ｇ突然変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、世界の多くの領域において、優勢な循環株になっているため、Ｄ６１４Ｇ突然変異を有するＳ－三量体も産生させた。これらの結果は、野生型Ｓ－三量体と比較して、ＡＣＥ２結合親和性、または野生型Ｓ－三量体で免疫した動物から産生された抗スパイク中和抗体に対するＡＣＥ２競合結合に有意差は観察されなかったことを示した。
上記を考慮して、アジュバントを含むＳ－三量体の免疫は、動物モデルにおいて高レベルの中和抗体及びＴｈ１に偏った細胞性免疫応答を誘導した。さらに、アジュバント添加Ｓ－三量体で免疫したアカゲザルは、臨床観察及び肺内でのウイルス量の減少に基づいて、ビヒクル対照比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジから保護された。
構造研究及びワクチン開発に使用される他のスパイクタンパク質外部ドメインとは異なり、Ｓ－三量体には、フリンプロテアーゼによるＳ１／Ｓ２切断を無効にするため、または融合前形態でタンパク質を安定させるために導入された突然変異は含まない。そのため、Ｓ－三量体は、生のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスから単離されたＳタンパク質（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６９：７７－８１，２０２０）、及びＨＥＫ２９３細胞中で発現した組換え全長Ｓタンパク質（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｅａｂｄ４２５１，２０２０．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｄ４２５１３２）と同様に、Ｓ１／Ｓ２接合部で部分的に切断された。本明細書に記載のとおり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の野生型の完全Ｓタンパク質外部ドメイン配列を有するＳ－三量体ワクチン候補は、ＣＨＯ細胞中で、高レベルで発現するのみでなく、高度にグリコシル化され、ネイティブ様三量体融合前コンフォメーションを用いる。Ｎ末端タンパク質配列分析により、生合成中にシグナルペプチドが除去されたときに、Ｓ－三量体は、ピログルタミン酸形成によって修飾されたＮ末端１４Ｑを有し、エキソプロテアーゼ分解から自身を保護することが明らかになった。三量体－タグへの融合により、可溶性の野生型Ｓタンパク質外部ドメインが、依然としてＳ－三量体に非共有結合により結合している、部分的に切断されたＳ１を有するジスルフィド連結ホモ三量体を形成できる。重要なことに、Ｓ－三量体は、ＡＣＥ２受容体への高親和性結合を維持しており、これは、ウイルスの中和に必要である重要な抗原エピトープが保持されていることを示すものである。
本開示は、特定の開示されている実施形態に範囲を限定することを意図するものではなく、例えば本開示の様々な態様を例示するために提供される。記載された組成物及び方法に対する様々な変形は、本明細書の記載及び教示から明らかになるであろう。そのような変形は、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく実施することができ、本開示の範囲内にあることが意図されている。

Claims (62)

  1. 哺乳動物におけるコロナウイルスによる感染を予防するための方法であって、ジスルフィド結合により連結された三量体融合タンパク質を形成するために、コラーゲンのＣ末端部分にインフレーム融合によって結合された可溶性コロナウイルスウイルス表面抗原を含む、有効量の組換えサブユニットワクチンで、前記哺乳動物を免疫することを含む方法。
  2. 前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）－コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳ－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ－様コロナウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）－コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＭＥＲＳ様コロナウイルス、ＮＬ６３－ＣｏＶ、２２９Ｅ－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、ＷＩＶ１－ＣｏＶ、ＭＨＶ、ＨＫＵ９－ＣｏＶ、ＰＥＤＶ－ＣｏＶ、またはＳＤＣＶである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記コロナウイルスウイルス表面抗原が、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質またはその断片もしくはエピトープを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記コロナウイルスウイルス表面抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）細胞外部ドメインペプチドまたはその断片もしくはエピトープを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記コロナウイルスウイルス表面抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）ペプチドまたはその断片もしくはエピトープを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記コロナウイルスウイルス表面抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）ペプチドまたはその断片もしくはエピトープを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記コロナウイルスウイルス表面抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）Ｓ１ペプチドまたはその断片もしくはエピトープを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記コロナウイルスウイルス表面抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）Ｓ２ペプチドまたはその断片もしくはエピトープを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記コロナウイルスウイルス表面抗原が、突然変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）細胞外部ドメインペプチドまたはその断片もしくはエピトープを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記突然変異が、６８５Ｒ－＞６８５Ａを含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記突然変異が、９８６Ｋ－＞９８６Ｐを含む、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記突然変異が、９８７Ｖ－＞９８７Ｐを含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記組換えサブユニットワクチンが、配列番号２７～６６のいずれか１つで表されている配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記組換えサブユニットワクチンが、配列番号１～９のいずれか１つで表されている配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記組換えサブユニットワクチンが、配列番号１０～１３のいずれか１つで表されている配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記組換えサブユニットワクチンが、配列番号１４～１７のいずれか１つで表されている配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記組換えサブユニットワクチンが、配列番号１８～２１のいずれか１つで表されている配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記組換えサブユニットワクチンが、配列番号２２～２５のいずれか１つで表されている配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記組換えサブユニットワクチンが、配列番号２６で表されている配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記組換えサブユニットワクチンが、配列番号６７～８０のいずれかで表されている第２の配列に連結している配列番号２７～６６のいずれかで表されている第１の配列を含み、ここで、前記第１の配列の前記Ｃ末端は、前記第２の配列の前記Ｎ末端に直接または間接的に連結されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記組換えサブユニットワクチンが、筋肉内注射によって投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記組換えサブユニットワクチンが、経鼻スプレーによって投与される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記組換えサブユニットワクチンが、単回用量で、または週または月の間隔で区切られた一連の用量で投与される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記組換えサブユニットワクチンが、アジュバントを含まずに投与される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記組換えサブユニットワクチンが、アジュバントを含めて投与される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記組換えサブユニットワクチンが、２つ以上のアジュバントを含めて投与される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  27. 哺乳動物の血清からコロナウイルスに対する抗体を検出するための方法であって、インフレーム融合によってコラーゲンのＣ末端部分に連結された可溶性コロナウイルスウイルス表面抗原と血清を接触させて、ジスルフィド結合により連結された三量体融合タンパク質を形成するステップを含む方法。
  28. 前記性コロナウイルスウイルス表面抗原が、Ｓタンパク質またはペプチドである、請求項２７記載の方法。
  29. コロナウイルス由来の可溶性表面抗原を含む組換えサブユニットワクチンを使用する方法であって、インフレーム融合によってコラーゲンのＣ末端部分に結合して、ジスルフィド結合により連結された三量体融合タンパク質を形成する方法であって、哺乳動物を免疫することと、生成された中和抗体を精製することと、前記中和抗体を用いた受動免疫により前記コロナウイルスに感染した患者を治療することを含む方法。
  30. 前記中和抗体が、ポリクローナル抗体を含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記中和抗体が、モノクローナル抗体を含む、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記中和抗体が、Ｓタンパク質またはペプチドに対するモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の方法。
  33. 前記中和抗体が、Ｓタンパク質またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の方法。
  34. 前記中和抗体が、Ｓタンパク質またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に対するモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の方法。
  35. 前記中和抗体が、ＭＥＲＳのＳタンパク質に対するモノクローナル抗体である、請求項２９に記載の方法。
  36. 配列番号１～２６からなる群から選択される組換えポリペプチドを含む複合体。
  37. 配列番号１～２６からなる群から選択される組換えポリペプチドの三量体を含む複合体であって、前記組換えポリペプチドが、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して三量体化され、前記三量体を形成する複合体。
  38. 配列番号１～２６からなる群から選択される配列を含む組換えポリペプチドの三量体、または前記三量体のうちの任意の２つ以上の組み合わせを含む免疫原性組成物。
  39. 配列番号１で表されている配列を有する組換えポリペプチドの前記三量体を含む、請求項３８に記載の免疫原性組成物。
  40. 対象におけるコロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、配列番号１～２６からなる群から選択される組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体を前記対象に投与することを含む方法。
  41. 対象においてコロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、
    前記表面抗原が、Ｓタンパク質またはその抗原性断片を含み、
    配列番号１～２６からなる群から選択される組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体を前記対象に投与することを含む方法。
  42. 対象においてコロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、
    ここで、前記表面抗原が、配列番号２７～６６からなる群から選択される配列を含み、
    配列番号１～２６からなる群から選択される組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体を前記対象に投与することを含む方法。
  43. 対象においてコロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、
    ここで、前記表面抗原が、前記コロナウイルスのＳタンパク質またはその抗原性断片を含み、任意により、前記表面抗原は、配列番号５５で表されている配列またはその抗原断片を含み、
    配列番号１０～２５のいずれか１つで表されている配列を含む組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体を前記対象に投与することを含む方法。
  44. 対象においてコロナウイルスの表面抗原に対する免疫応答を生じさせるための方法であって、
    前記表面抗原が、Ｓタンパク質またはその抗原性断片を含み、
    配列番号１～２６からなる群から選択される配列を含む組換えポリペプチドを含む、有効量の複合体、または前記複合体のうちのいずれか２つ以上の組み合わせを前記対象に投与することを含む方法。
  45. 配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び／または配列番号１３で表されている配列を含む前記組換えポリペプチドを含む、有効量の前記複合体を前記対象に投与することを含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 複数の組換えポリペプチドを含む融合タンパク質であって、各組換えポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端まで：
    ａ）第１のコロナウイルスの、非キメラコロナウイルススパイクタンパク質に位置するコロナウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に先行するコロナウイルススパイクタンパク質外部ドメインの一部を含む第１の領域と
    ｂ）前記第１のコロナウイルスとは異なる第２のコロナウイルスのコロナウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む第２の領域と
    ｃ）前記組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドがポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する、コラーゲンのＣ末端プロペプチドを含む、融合タンパク質。
  47. 前記第２の領域とコラーゲンの前記Ｃ末端プロペプチドとの間に第３の領域をさらに含む、請求項４６に記載の融合タンパク質。
  48. 前記第３の領域が、第３のコロナウイルスのＳ１ドメインを含み、前記第３のコロナウイルスが、前記第１のコロナウイルスまたは前記第２のコロナウイルスと同じであるかまたは異なる、請求項４７に記載の融合タンパク質。
  49. 前記第３の領域が、第４のコロナウイルスのＳ２ドメインを含み、前記第４のコロナウイルスが、前記第１のコロナウイルス、前記第２のコロナウイルスまたは前記第４のコロナウイルスと同じであるかまたは異なる、請求項４７または４８に記載の融合タンパク質。
  50. 前記第１の領域が、前記第１のコロナウイルスのＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含む、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  51. 前記第１の領域が、前記第２のコロナウイルス内の対応するアミノ酸残基（複数可）とは異なる１つ以上のアミノ酸残基を含む、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  52. 前記第２の領域が、前記第１のコロナウイルス内の対応するアミノ酸残基（複数可）とは異なる１つ以上のアミノ酸残基を含む、請求項４６～５１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  53. 前記第１のコロナウイルス及び前記第２のコロナウイルスが、同じコロナウイルスの異なるバリアントまたは株である、請求項４６～５２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  54. 前記第１の領域が、前記第１のコロナウイルスのＮＴＤを含み、前記第２の領域が、前記第２のコロナウイルスのＲＢＤを含み、前記第１のコロナウイルス及び前記第２のコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なるバリアントである、請求項５３に記載の融合タンパク質。
  55. 前記第１のコロナウイルス及び前記第２のコロナウイルスが、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．１．１４３、Ｐ．２、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．６１７、及びＡ．２３．１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスからなる群から独立して選択される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  56. ３つの組換えポリペプチドを含む三量体融合タンパク質であって、各組換えポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシ末端まで：
    ａ）Ｂ．１．５２６系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコロナウイルススパイクタンパク質Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）を含む第１の領域と；
    ｂ）Ｂ．１．３５１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコロナウイルススパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含む第２の領域と；
    ｃ）前記組換えポリペプチドのＣ末端プロペプチドがポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する、コラーゲンのＣ末端プロペプチドと、を含む、三量体融合タンパク質。
  57. 請求項４６～５６のいずれか一項に記載の有効量の融合タンパク質で哺乳動物を免疫化することを含む、哺乳動物におけるコロナウイルスによる感染を予防するための方法。
  58. 前記第１のコロナウイルス及び前記第２のコロナウイルスに対する中和抗体が、哺乳動物内で生成される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記第１のコロナウイルス及び前記第２のコロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なるバリアントであり、前記哺乳動物内で生成された中和抗体は、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．１．１４３、Ｐ．２、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．６１７、及びＡ．２３．１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのうちの２つ以上を中和する、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記哺乳動物内で生成された中和抗体が、Ｂ．１．５２６、Ｂ．１．１．１４３、Ｐ．２、Ｂ．１．３５１、Ｐ．１、Ｂ．１．１．７、Ｂ．１．６１７、及びＡ．２３．１系統のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのうちの３つ以上を中和する、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記融合タンパク質を２回以上投与することにより、前記哺乳動物を免疫化することを含む、請求項５７～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記融合タンパク質が、同じＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアント由来のＮＴＤ及びＲＢＤを含むスパイクタンパク質ペプチドを含む免疫原の１回または複数回投与後のブースター投与として行われる、請求項５７～６１のいずれか一項に記載の方法。
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