CN115746148B - 具有冠状病毒rbd和膜融合抑制多肽的蛋白质及其作为冠状病毒抑制剂的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有冠状病毒RBD和膜融合抑制多肽的蛋白质及其作为冠状病毒抑制剂的应用，具体的所述蛋白质通过上述两个功能区发挥广谱抑制冠状病毒进入细胞的功能。本发明提供了一种蛋白质，包括区段甲和区段乙；区段甲为区段甲‑Ⅰ或区段甲‑Ⅱ；区段甲‑Ⅰ为针对ACE2的冠状病毒RBD；区段甲‑Ⅱ为区段甲‑Ⅰ的多聚体；区段乙为区段乙‑Ⅰ或区段乙‑Ⅱ；区段乙‑Ⅰ为针对冠状病毒S2蛋白亚基HR1结构域的膜融合抑制多肽；区段乙‑Ⅱ为区段乙‑Ⅰ的多聚体。所述蛋白质或其多聚体具有如下用途：(1)抑制冠状病毒进入细胞；(2)抑制冠状病毒；(3)预防和/或治疗冠状病毒所致疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及具有冠状病毒RBD和膜融合抑制多肽的蛋白质及其作为冠状病毒抑制剂的应用，具体的所述蛋白质通过上述两个功能区发挥广谱抑制冠状病毒进入细胞的功能。
背景技术
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2，新冠病毒)是引发新型冠状病毒感染(COVID-19)的病原体，该病原体是一种有包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约为29.9kb，隶属巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、正冠状病毒亚科、Betacoronavirus属、Sarbecovirus亚属、SARS相关病毒种。
SARS-CoV-2基因组编码四种结构蛋白：刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和包膜蛋白(E)。SARS-CoV-2基因组还编码多种非结构蛋白。S蛋白属于I型病毒融合蛋白，是介导病毒进入靶细胞的关键成分。病毒进入靶细胞的过程：①S1亚基中的受体结合结构域(Receptor binding domain，RBD)介导病毒与细胞表面受体血管紧张素转化酶2(ACE2)的结合；②S2亚基中七肽重复序列(HR1和HR2)结构域所形成的六螺旋束结构介导病毒和宿主细胞膜的融合，从而使病毒基因组释放到细胞中。由于可在早期阻断病毒感染，基于入侵过程的进入抑制剂成为研究的热点，且是非常有前景的一种抗病毒药物研发战略。
自从SARS-CoV-2发现至今，市场上已经有多种靶向RBD的单克隆抗体药物被紧急授权使用。令人失望的是，SARS-CoV-2的大流行不断产生的令人关注的变异株(VOC)，如阿尔法毒株(Alpha)、贝塔毒株(Beta)、伽马毒株(Gamma)、德尔塔毒株(Delta)和奥密克戎毒株(Omicron)等导致这些抗体药物的抗病毒效果下降甚至失去活力。与此相反的是，靶向S2蛋白亚基中HR1结构域的多肽膜融合抑制剂对不同VOC变异毒株仍然具有出色的抑制效力。另外，研究已证实了病毒的变异并没有改变其依赖于ACE2受体途径入侵靶细胞，并且没有大幅度影响靶向ACE2抑制剂的抗病毒功能。
发明内容
本发明的目的是提供具有冠状病毒RBD和膜融合抑制多肽的蛋白质及其作为冠状病毒抑制剂的应用，具体的所述蛋白质通过上述两个功能区发挥广谱抑制冠状病毒进入细胞的功能。
本发明提供了一种蛋白质，包括区段甲和区段乙；
所述区段甲为区段甲-Ⅰ或区段甲-Ⅱ；所述区段甲-Ⅰ为针对ACE2的冠状病毒RBD；所述区段甲-Ⅱ为区段甲-Ⅰ的多聚体；
所述区段乙为区段乙-Ⅰ或区段乙-Ⅱ；所述区段乙-Ⅰ为针对冠状病毒S2蛋白亚基HR1结构域的膜融合抑制多肽；所述区段乙-Ⅱ为区段乙-Ⅰ的多聚体。
示例性的，所述区段甲-Ⅱ为区段甲-Ⅰ的二聚体或三聚体。
示例性的，所述区段乙-Ⅱ为区段乙-Ⅰ的二聚体或三聚体。
所述蛋白质中，所述区段甲和所述区段乙之间具有连接肽。
具体的，所述连接肽为柔性连接肽。
示例性的，所述柔性连接肽的氨基酸序列为(GGGGS)n；n为7以下的自然数。
n表示GGGGS序列的重复次数。
具体的，n为1或4或7。
作为实施例中的一种示例，所述蛋白质中，具有SEQ ID NO：28所示的区段。
作为实施例中的一种示例，所述蛋白质中，具有SEQ ID NO：27所示的区段。
作为实施例中的一种示例，所述蛋白质中，具有SEQ ID NO：29所示的区段。
作为实施例中的一种示例，所述蛋白质中，具有SEQ ID NO：30所示的区段。
作为实施例中的一种示例，所述蛋白质中，具有SEQ ID NO：31所示的区段。
作为实施例中的一种示例，所述蛋白质中，具有SEQ ID NO：32所示的区段。
所述冠状病毒为如下七种中的任意一种：
SARS-CoV-2原始株(SARS-CoV-2-WT)；
SARS-CoV-2德尔塔毒株(SARS-CoV-2-Delta)；
SARS-CoV-2奥密克戎毒株(SARS-CoV-2-Omicron，BA.1)；
广东穿山甲来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(PCoV-GD)；
广西穿山甲来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(PCoV-GX)；
蝙蝠来源的SARS相关冠状病毒(WIV1)；
蝙蝠来源的SARS相关冠状病毒(SHC014)。
示例性的，所述区段甲-Ⅰ如SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：39中任一所示。
示例性的，所述区段乙-Ⅰ为IPB01多肽或者IPB19多肽。
所述IPB01多肽如SEQ ID NO：25所示。
所述IPB19多肽如SEQ ID NO：26所示。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次包括：区段甲、连接肽和区段乙。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次包括：区段乙、连接肽和区段甲。
示例性的，所述蛋白质中还具有用于蛋白纯化的亲和标签。
所述亲和标签可位于所述蛋白质中的N末端，也可位于所述蛋白质中的C末端。
示例性的，所述亲和标签可为His标签，例如His6标签、His10标签等。
示例性的，所述蛋白质中还包括区段丙和/或区段丁。
所述区段丙位于所述蛋白质中的N末端。
所述区段丁位于所述蛋白质中的C末端。
所述区段丁中具有所述亲和标签。
所述区段丙具体如SEQ ID NO：40所示。
所述区段丁具体如SEQ ID NO：41所示。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次包括如下区段：区段丙、区段甲、连接肽、区段乙和区段丁。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：区段丙、区段甲、连接肽、区段乙和区段丁。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次包括如下区段：区段丙、区段乙、连接肽、区段甲和区段丁。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：区段丙、区段乙、连接肽、区段甲和区段丁。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：SEQ ID NO：40所示区段、SEQ ID NO：28所示区段、SEQ ID NO：41所示区段。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：SEQ ID NO：40所示区段、SEQ ID NO：27所示区段、SEQ ID NO：41所示区段。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：SEQ ID NO：40所示区段、SEQ ID NO：29所示区段、SEQ ID NO：41所示区段。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：SEQ ID NO：40所示区段、SEQ ID NO：30所示区段、SEQ ID NO：41所示区段。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：SEQ ID NO：40所示区段、SEQ ID NO：31所示区段、SEQ ID NO：41所示区段。
示例性的，所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：SEQ ID NO：40所示区段、SEQ ID NO：32所示区段、SEQ ID NO：41所示区段。
本发明还保护以上任一所述蛋白质形成的多聚体。
示例性的，所述多聚体可为二聚体或三聚体。
本发明还保护以上任一所述蛋白质的相关生物材料，所述相关生物材料为下述B1)至B12)中的任一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系。
所述核酸分子可为DNA分子或RNA分子。
用于编码区段甲的DNA分子具体可为如下任意一种：
SEQ ID NO：3所示DNA分子；
SEQ ID NO：4所示DNA分子；
SEQ ID NO：5所示DNA分子；
SEQ ID NO：6所示DNA分子；
SEQ ID NO：7所示DNA分子；
SEQ ID NO：17所示DNA分子；
SEQ ID NO：18所示DNA分子。
用于编码区段甲的DNA分子具体可为如下任意一种：
SEQ ID NO：19中第1-669位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：20中第1-669位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：21中第1-669位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：22中第169-837位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：23中第1-669位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：24中第172-840位核苷酸所示的DNA分子。
用于编码区段乙的DNA分子具体可为如下任意一种：
SEQ ID NO：19中第685-792位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：20中第730-837位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：21中第775-882位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：22中第1-108位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：23中第730-840位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：24中第1-111位核苷酸所示的DNA分子。
用于编码连接肽的DNA分子具体可为如下任意一种：
SEQ ID NO：19中第670-684位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：20中第670-729位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：21中第670-774位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：22中第109-168位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：23中第670-729位核苷酸所示的DNA分子；
SEQ ID NO：24中第112-171位核苷酸所示的DNA分子。
用于编码所述区段丙的DNA分子具体如SEQ ID NO：1所示。
用于编码所述区段丁的DNA分子具体如SEQ ID NO：2所示。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子具有SEQ ID NO：19至SEQ ID NO：24中任一所述的区段。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子包括如下元件：编码区段丙的DNA分子、编码区段甲的DNA分子、编码连接肽的DNA分子、编码区段乙的DNA分子和编码区段丁的DNA分子。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子由如下元件组成：编码区段丙的DNA分子、编码区段甲的DNA分子、编码连接肽的DNA分子、编码区段乙的DNA分子和编码区段丁的DNA分子。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子包括如下元件：编码区段丙的DNA分子、编码区段乙的DNA分子、编码连接肽的DNA分子、编码区段甲的DNA分子和编码区段丁的DNA分子。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子由如下元件组成：编码区段丙的DNA分子、编码区段乙的DNA分子、编码连接肽的DNA分子、编码区段甲的DNA分子和编码区段丁的DNA分子。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子依次由如下区段组成：SEQ ID NO：1所示区段、SEQ ID NO：19所示区段、SEQ ID NO：2所示区段。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子依次由如下区段组成：SEQ ID NO：1所示区段、SEQ ID NO：20所示区段、SEQ ID NO：2所示区段。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子依次由如下区段组成：SEQ ID NO：1所示区段、SEQ ID NO：21所示区段、SEQ ID NO：2所示区段。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子依次由如下区段组成：SEQ ID NO：1所示区段、SEQ ID NO：22所示区段、SEQ ID NO：2所示区段。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子依次由如下区段组成：SEQ ID NO：1所示区段、SEQ ID NO：23所示区段、SEQ ID NO：2所示区段。
示例性的，编码所述蛋白质的核酸分子依次由如下区段组成：SEQ ID NO：1所示区段、SEQ ID NO：24所示区段、SEQ ID NO：2所示区段。
示例性的，所述重组载体可为将编码所述蛋白质的核酸分子插入哺乳动物细胞表达载体得到的重组载体。
所述哺乳动物细胞表达载体具体可为pcDNA3.4质粒。
示例性的，所述插入位点为多克隆位点。
示例性的，所述插入位点为XbaI和AgeI。
示例性的，所述动物细胞可为哺乳动物细胞。
示例性的，所述动物细胞可为293T细胞。
本发明还保护以上任一所述蛋白质或以上任一所述多聚体或以上任一所述相关生物材料在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(1)或(2)或(3)：
(1)抑制冠状病毒进入细胞；
(2)抑制冠状病毒；
(3)预防和/或治疗冠状病毒所致疾病。
本发明还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述蛋白质或以上任一所述多聚体；
所述产品的用途为如下(1)或(2)或(3)：
(1)抑制冠状病毒进入细胞；
(2)抑制冠状病毒；
(3)预防和/或治疗冠状病毒所致疾病。
本发明还保护以上任一所述蛋白质或以上任一所述多聚体的应用，为如下(1)或(2)或(3)：
(1)抑制冠状病毒进入细胞；
(2)抑制冠状病毒；
(3)预防和/或治疗冠状病毒所致疾病。
所述产品具体可为药物。
本发明提供的蛋白质具有良好的稳定性和极低的细胞毒性。
本发明提供的蛋白质，包括针对ACE2受体的RBD分子与针对病毒S2蛋白亚基HR1结构域的膜融合抑制多肽，两者通过连接肽连接。RBD分子能够与细胞表面ACE2相互作用，从而锚定于靶细胞表面。本发明提供的蛋白质对于新冠病毒的抑制活性明显高于单一亲本抑制剂。本发明提供的蛋白质靶向高度保守的HR1区域和宿主细胞表面ACE2受体，发挥广谱双功能冠状病毒进入抑制剂的功能，可加固病毒逃逸屏障，从而可用作预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎疾病的药物。
具体的，所述冠状病毒可为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
具体的，所述冠状病毒可为沙贝病毒(Sarbecovirus)。
具体的，所述冠状病毒可为SARS-CoV。
具体的，所述冠状病毒可为PCoV-GD或PCoV-GX。
具体的，所述冠状病毒可为蝙蝠来源的冠状病毒。
具体的，所述冠状病毒可为穿山甲来源的冠状病毒。
所述新型冠状病毒可为SARS-CoV-2原始毒株和/或SARS-CoV-2变异毒株。
所述新型冠状病毒包括但不限于如下毒株：SARS-CoV-2 WT、SARS-CoV-2 D614G、SARS-CoV-2 Alpha、SARS-CoV-2 Beta、SARS-CoV-2 Gamma、SARS-CoV-2 Delta、SARS-CoV-2Lambda、SARS-CoV-2 Omicron BA.1、SARS-CoV-2 Omicron BA.2、SARS-CoV-2 OmicronBA.2.12.1、SARS-CoV-2 Omicron BA.2.13或SARS-CoV-2 Omicron BA.4/5。
本发明所涉及到的更多内容在以下有详细描述，或者有些也可以在本发明的实施例中体现。除非另有所指，本文中所用来表示不同成分的数量、反应条件，在任意情况下都可解读为“大致的”、“大约的”意思。相应的，除有明确的特指外，在下述以及权利要求中所引用的数字参数都是大致的参数，在各自的实验条件下由于标准误差的不同，有可能会得到不同的数字参数。
在实际应用中，可以将本发明的药物直接给予病人、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人，以达到治疗和/或预防冠状病毒感染的目的。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射、雾化吸入、鼻喷或滴鼻给药。
本发明的药物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。
本发明的药物可以直接单独用于冠状病毒感染者的治疗和预防，也可以与一种或多种其他抗病毒药物联合使用，以达到提高整体治疗效果的目的。这些抗病毒药物包括但不限于中和抗体、蛋白酶抑制剂、RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)抑制剂、病毒侵入抑制剂、雄激素受体(AR)拮抗剂等。上述的中和抗体可以是安巴韦单抗(BRII-196)、罗米司韦单抗(BRII-198)、卡西瑞单抗(Casirivimab)、伊德单抗(Imdevimab)、索罗维单抗(Sotrovimab)、巴姆拉尼单抗(Bamlanivimab)、埃特司韦单抗(etesevimab)等的一种或几种；所述蛋白酶抑制剂可以是帕昔洛韦(Paxlovid)、达芦那韦(darunavir)、洛匹那韦/利托那韦(Lopinavir/Ritonavir)、艾普司韦(WPV01)等的一种或几种；所述RdRp抑制剂可以是莫努匹拉韦(Molnupiravir)、阿兹夫定(Azvudine)、法匹拉韦(Favipiravir)、瑞德西韦(Remdesivir)、索磷布韦(Sofosbuvir)、VV116等的一种或几种；所述病毒侵入抑制剂可以是阿比朵尔(Arbidol)、羟氯喹(hydroxychloroquine)等的一种或几种；所述雄激素受体(AR)拮抗剂可以是普克鲁胺等。
对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
附图说明
图1为实施例1中的蛋白电泳图。
图2为实施例2中的抑制活性结果。
图3为蛋白的元件示意图。
图4为实施例3中的蛋白电泳图。
图5为实施例4中的抑制活性结果。
图6为实施例5中的抑制活性结果。
图7为实施例7中的细胞毒性结果。
图8为实施例8中的抑制活性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进相关参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明范围内。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。细胞培养裂解液：Promega公司，货号E1531。荧光素酶检测底物试剂：Promega公司，货号E1501。pcDNA3.4质粒(哺乳动物细胞表达载体)：BioVector NTCC典型培养物保藏中心。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，每次重复实验设置三个重复处理，结果取平均值±标准差。如无特殊说明，实施例中所用的PBS缓冲液均为pH 7.2、0.1M的PBS缓冲液。如无特殊说明，实施例中所用的DMEM完全培养基均为含10％ FBS的DEME培养基。
实施例中所用的假病毒的制备方法均为：将S protein-expressing plasmid和plasmid(pNL4-3.luc.RE)共转染293T细胞，采用DMEM完全培养基培养48小时，收取培养上清得到假病毒液。plasmid(pNL4-3.luc.RE)即骨架质粒，编码一个Env缺陷的荧光素酶报告子，表达HIV-1基因组。S protein-expressing plasmid即S蛋白表达质粒。S蛋白可为SARS-CoV-2 WT的S蛋白或SARS-CoV-2突变株的S蛋白或SARS-CoV的S蛋白或穿山甲来源冠状病毒PCoV-GD的S蛋白或穿山甲来源冠状病毒PCoV-GX的S蛋白。实施例中所用的假病毒为SARS-CoV-2 WT假病毒、SARS-CoV-2 D614G假病毒、SARS-CoV-2 Alpha假病毒、SARS-CoV-2 Beta假病毒、SARS-CoV-2 Gamma假病毒、SARS-CoV-2 Delta假病毒、SARS-CoV-2 Lambda假病毒、SARS-CoV-2 Omicron BA.1假病毒、SARS-CoV-2 Omicron BA.2假病毒、SARS-CoV-2Omicron BA.2.12.1假病毒、SARS-CoV-2 Omicron BA.2.13假病毒、SARS-CoV-2 OmicronBA.4/5假病毒、SARS-CoV假病毒、PCoV-GD假病毒或PCoV-GX假病毒。各个SARS-CoV-2假病毒记载于如下文献：Zhu Y,DongX,LiuN,Wu T,Chong H,Lei X,Ren L,Wang J,and HeY.2022；SARS-CoV-2 fusion-inhibitory lipopeptides maintain high potencyagainst divergent variants of concern including Omicron；Emerging Microbes&Infections，2022,VOL.11，1819-1827；位于文献中的Figure 2。SARS-CoV假病毒(SARS-CoVPV)记载于如下文献：Zhu Y,Yu D,Hu Y,Wu T,Chong H,He Y.2021.SARS-CoV-2-derivedfusion inhibitor lipopeptides exhibit highly potent and broad-spectrumactivity against divergent human coronaviruses.Signal Transduct Target Ther6:294；位于文献中的Figure 1。各个假病毒：公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
SARS-CoV-2 WT的S蛋白：GenBank：MN908947.3(18-MAR-2020)中记载的surfaceglycoprotein(对应的CDS区间为21563-25384)。
相对于SARS-CoV-2W T的S蛋白，SARS-CoV-2 D614G的S蛋白、SARS-CoV-2 Alpha的S蛋白、SARS-CoV-2 Beta的S蛋白、SARS-CoV-2 Gamma的S蛋白、SARS-CoV-2 Delta的S蛋白、SARS-CoV-2 Lambda的S蛋白、SARS-CoV-2 Omicron BA.1的S蛋白、SARS-CoV-2 OmicronBA.2的S蛋白的突变情况依次如下：
SARS-CoV-2 D614G的S蛋白：一个氨基酸残基突变，即D614G；
SARS-CoV-2 Alpha的S蛋白：氨基酸残基缺失69-70del(缺失两个氨基酸残基“HV”)、144del(缺失一个氨基酸残基“Y”)、7个单个氨基酸残基突变(N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H)；
SARS-CoV-2 Beta的S蛋白：氨基酸残基缺失242-244del(缺失三个氨基酸残基“LAL”)、10个单个氨基酸残基突变(L18F、D80A、D215G、S305T、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V)；
SARS-CoV-2 Gamma的S蛋白：12个单个氨基酸残基突变，即L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I、V1176F；
SARS-CoV-2 Delta的S蛋白：氨基酸残基缺失156-157del(缺失两个氨基酸残基“EF”)、9个单个氨基酸残基突变(T19R、G142D、R158G、A222V、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N)；
SARS-CoV-2 Lambda的S蛋白：氨基酸残基缺失246-252del(缺失七个氨基酸残基“RSYLTPG”)、6个单个氨基酸残基突变(G75V、T76I、L452Q、F490S、D614G、T859N)；
SARS-CoV-2 Omicron BA.1的S蛋白：氨基酸残基缺失69-70del(缺失两个氨基酸残基“HV”)、143-145del(缺失三个氨基酸残基“VYY”)、211del(缺失一个氨基酸残基“N”)、氨基酸残基插入214ins(插入三个氨基酸残基“EPE”)、30个单个氨基酸残基突变(A67V、T95I、G142D、L212I、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F)；
SARS-CoV-2 Omicron BA.2的S蛋白：氨基酸残基缺失24-26del(缺失三个氨基酸残基“LPP”)、28个单个氨基酸残基突变(T19I、A27S、G142D、V213G、G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、Q954H、N969K)。
SARS-CoV-2 Omicron BA.2.12.1的S蛋白：与SARS-CoV-2Omicron BA.2的S蛋白相比，增加了两个额外的单个氨基酸残基突变，即L452Q和S704L。
SARS-CoV-2 Omicron BA.2.13的S蛋白：与SARS-CoV-2Omicron BA.2的S蛋白相比，增加了1个额外的单个氨基酸残基突变，即L452M。
SARS-CoV-2 Omicron BA.4/5的S蛋白：与SARS-CoV-2Omicron BA.2的S蛋白相比，增加了一处额外的氨基酸残基缺失69-70del(缺失两个氨基酸残基“HV”)以及增加了3个额外的单个氨基酸残基突变(L452R、F486V和R493Q)。
实施例1、蛋白的表达、纯化与鉴定
一、制备重组质粒
用外源DNA分子替换pcDNA3.4质粒的XbaI和AgeI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒。重组质粒已进行测序验证。
外源DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：SEQ ID NO：1所示的DNA区段、RBD蛋白编码基因、SEQ ID NO：2所示的DNA区段。SEQ ID NO：1所示的DNA区段中，具有IgG信号肽编码基因(第7-9位为起始密码子)。SEQ ID NO：2所示的DNA区段中，具有10×His标签编码基因(第37-39位为终止密码子)。SEQ ID NO：1所示的DNA区段编码的氨基酸序列如SEQID NO：40所示。SEQ ID NO：2所示的DNA区段编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示。
分别设置16种RBD蛋白编码基因，依次如SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：18所示。
相应的，得到16种重组质粒。
16种RBD蛋白编码基因编码16种不同来源的冠状病毒的RBD蛋白，且编码基因均已进行密码子优化。
16种冠状病毒分别如下：
SARS-CoV-2原始株(SARS-CoV-2-WT)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：3所示；
SARS-CoV-2德尔塔毒株(SARS-CoV-2-Delta)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：4所示；
SARS-CoV-2奥密克戎毒株(SARS-CoV-2-Omicron，BA.1)，RBD蛋白编码基因如SEQIDNO：5所示；
广东穿山甲来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(PCoV-GD)，RBD蛋白编码基因如SEQID NO：6所示；
广西穿山甲来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(PCoV-GX)，RBD蛋白编码基因如SEQID NO：7所示；
蝙蝠来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(RaTG13)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：8所示；
蝙蝠来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(RmYN02)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：9所示；
蝙蝠来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(RacCS203)，RBD蛋白编码基因如SEQ IDNO：10所示；
蝙蝠来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(RsYN04)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：11所示；
蝙蝠来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(RsYN06)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：12所示；
蝙蝠来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(RshSTT200)，RBD蛋白编码基因如SEQ IDNO：13所示；
蝙蝠来源的SARS-CoV-2相关冠状病毒(Rco319)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：14所示；
SARS-CoV冠状病毒GD03株(GD03)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：15所示；
果子狸来源的SARS相关冠状病毒(SZ16)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：16所示；
蝙蝠来源的SARS相关冠状病毒(WIV1)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：17所示；
蝙蝠来源的SARS相关冠状病毒(SHC014)，RBD蛋白编码基因如SEQ ID NO：18所示。
对应于16种RBD蛋白编码基因，相应重组质粒表达的蛋白质(即相应外源DNA分子编码的蛋白质)分别命名为：RBD-SARS-CoV-2-WT、RBD-SARS-CoV-2-Delta、RBD-SARS-CoV-2-Omicron、RBD-PCoV-GD、RBD-PCoV-GX、RBD-RaTG13、RBD-RmYN02、RBD-RacCS203、RBD-RsYN04、RBD-RsYN06、RBD-RshSTT200、RBD-Rco319、RBD-GD03、RBD-SZ16、RBD-WIV1、RBD-SHC014。
二、蛋白的表达和纯化
分别将步骤一制备的16种重组质粒进行如下步骤：
1、将重组质粒借助转染试剂PEI转染293T细胞，然后采用DMEM完全培养基培养48小时，然后收集细胞培养上清，4℃、10000rpm离心10分钟，收集上清液。
2、用Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN公司，货号30210)装填柱子(Bio-rad公司，货号7321010)，得到亲和层析柱。先用6倍柱体积的binding buffer(含10mM咪唑的PBS缓冲液)平衡，然后上样步骤1得到的上清液，然后用10倍柱体积的Washing buffer(含60mM咪唑的PBS缓冲液)洗涤，然后用8倍柱体积的Elution buffer(含400mM咪唑的PBS缓冲液)进行洗脱。收集用Elution buffer洗脱后的过柱后溶液。
3、取步骤2收集的过柱后溶液，进行超滤(10kda截留分子量的超滤管，Millipore公司，货号UFC901096)，将体系更换为PBS缓冲液，即为蛋白溶液。
得到16种蛋白溶液。
蛋白的元件示意图见图3的A。
三、蛋白的鉴定
将步骤二得到的16种蛋白溶液分别进行SDS-PAGE电泳，然后进行考马斯亮蓝染色。电泳图见图1。16种RBD蛋白均具有较高的纯度。
实施例2、蛋白抑制新冠病毒SARS-CoV-2D614G假病毒感染实验
供试蛋白溶液分别为实施例1制备的16种蛋白溶液。供试蛋白溶液的稀释液是将供试蛋白溶液用DMEM完全培养基稀释得到的，设置8个稀释度。
1、取96孔平底板，试验孔加入供试蛋白溶液或供试蛋白溶液的稀释液(50μL/孔)，对照孔加入DMEM完全培养基(50μL/孔)。对照孔分别为阳性对照孔(又称为病毒孔)和阴性对照孔(又称为细胞孔)。
2、完成步骤1后，取所述96孔平底板，试验孔和阳性对照孔加入SARS-CoV-2D614G假病毒病毒液(50μL/孔；病毒液的RLU为200000)，阴性对照孔加入DMEM完全培养基(50μL/孔)，然后37℃孵育1h。
3、完成步骤2后，取所述96孔平底板，加入HuH-7细胞悬液(100μL/孔；HuH-7细胞悬液中的HuH-7细胞浓度为3×105个/mL)和DEAE-dextran(使DEAE-dextran在体系中的浓度为15μg/mL)，然后置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养48h。
4、完成步骤3后，取所述96孔平底板，弃除上清并在吸水纸上轻轻拍打，然后加入细胞培养裂解液(30μL/孔)并常温裂解5分钟，然后加入荧光素酶检测底物试剂(50μL/孔)，充分混匀后从每孔中吸出50μL液体，转移至洁净的96孔白板中，将白板置于微孔板光度仪中读取每孔的荧光值(相对荧光单位，RLU)。
抑制率＝(病毒孔荧光值-试验孔荧光值)/(病毒孔荧光值-细胞孔荧光值)×100％。
结果见图2。RBD-SARS-CoV-2-WT、RBD-SARS-CoV-2-Delta、RBD-SARS-CoV-2-Omicron、RBD-PCoV-GD、RBD-PCoV-GX、RBD-WIV1、RBD-SHC014均能够有效地抑制SARS-CoV-2D614G假病毒的感染，半数抑制浓度(IC50)分别为40.12nM、30.19nM、39.58nM、10.95nM、25.68nM、314.89nM和48.78nM。RBD-PCoV-GD的抑制效果最为突出。
实施例3、双功能蛋白的构建、表达、纯化与鉴定
一、制备重组质粒
用外源DNA分子替换pcDNA3.4质粒的XbaI和AgeI酶切位点之间的小片段，得到重组质粒。重组质粒已进行测序验证。
外源DNA分子自上游至下游依次由如下元件组成：SEQ ID NO：1所示的DNA区段、双功能蛋白编码基因、SEQ ID NO：2所示的DNA区段。
分别设置6种双功能蛋白编码基因，依次如SEQ ID NO：19至SEQ ID NO：24所示。
得到6种重组质粒。
SEQ ID NO：19中：第1-669位核苷酸编码RBD-PCoV-GD，第670-684位核苷酸编码L1柔性肽，第685-792位核苷酸编码多肽IPB01。SEQ ID NO：19编码SEQ ID NO：27所示的双功能蛋白，将该双功能蛋白命名为RBD-L1-IPB01。
SEQ ID NO：20中：第1-669位核苷酸编码RBD-PCoV-GD，第670-729位核苷酸编码L4柔性肽，第730-837位核苷酸编码多肽IPB01。SEQ ID NO：20编码SEQ ID NO：28所示的双功能蛋白，将该双功能蛋白命名为RBD-L4-IPB01。
SEQ ID NO：21中：第1-669位核苷酸编码RBD-PCoV-GD，第670-774位核苷酸编码L7柔性肽，第775-882位核苷酸编码多肽IPB01。SEQ ID NO：21编码SEQ ID NO：29所示的双功能蛋白，将该双功能蛋白命名为RBD-L7-IPB01。
SEQ ID NO：22中：第1-108位核苷酸编码多肽IPB01，第109-168位核苷酸编码L4柔性肽，第169-837位核苷酸编码RBD-PCoV-GD。SEQ ID NO：22编码SEQ ID NO：30所示的双功能蛋白，将该双功能蛋白命名为IPB01-L4-RBD。
SEQ ID NO：23中：第1-669位核苷酸编码RBD-PCoV-GD，第670-729位核苷酸编码L4柔性肽，第730-840位核苷酸编码多肽IPB19。SEQ ID NO：23编码SEQ ID NO：31所示的双功能蛋白，将该双功能蛋白命名为RBD-L4-IPB19。
SEQ ID NO：24中：第1-111位核苷酸编码多肽IPB19，第112-171位核苷酸编码L4柔性肽，第172-840位核苷酸编码RBD-PCoV-GD。SEQ ID NO：24编码SEQ ID NO：32所示的双功能蛋白，将该双功能蛋白命名为IPB19-L4-RBD。
对应于6种双功能蛋白编码基因，相应重组质粒表达的蛋白质(即相应外源DNA分子编码的蛋白质)同样分别命名为：RBD-L1-IPB01、RBD-L4-IPB01、RBD-L7-IPB01、IPB01-L4-RBD、RBD-L4-IPB19、IPB19-L4-RBD。
二、蛋白的表达和纯化
分别将步骤一制备的6种重组质粒进行如下步骤：
同实施例1的步骤二。
得到6种蛋白溶液。
蛋白的元件示意图见图3的B或C。
三、蛋白的鉴定
将步骤二得到的6种蛋白溶液分别进行SDS-PAGE电泳，然后进行考马斯亮蓝染色。电泳图见图4。6种蛋白均具有较高的纯度。
实施例4、双功能蛋白抑制新冠病毒SARS-CoV-2D614G假病毒感染实验
供试蛋白溶液分别为实施例3制备的6种蛋白溶液或者RBD蛋白溶液或者IPB01蛋白溶液或者IPB19蛋白溶液。
RBD蛋白溶液即实施例1制备的RBD-PCoV-GD溶液。
IPB01蛋白溶液是将IPB01蛋白用DMEM完全培养基稀释得到的。IPB19蛋白溶液是将IPB19蛋白用DMEM完全培养基稀释得到的。IPB01蛋白如SEQ ID NO：25所示。IPB19蛋白如SEQ ID NO：26所示。IPB01蛋白和IPB19蛋白均由北京中科亚光生物科技有限公司合成并纯化。
试验方法同实施例2。
结果见图5。结果表明RBD-L1-IPB01、RBD-L4-IPB01和RBD-L7-IPB01能够高效地抑制SARS-CoV-2 D614G假病毒感染，半数抑制浓度(IC50)分别为0.64nM、0.69nM和0.84nM。
实施例5、双功能蛋白通过结合细胞膜发挥高效抗病毒作用
供试液分别为：RBD-L4-IPB01溶液或者RBD蛋白溶液或者IPB01蛋白溶液。
RBD-L4-IPB01溶液是实施例3制备的。
RBD蛋白溶液即实施例1制备的RBD-PCoV-GD溶液。
IPB01蛋白溶液是实施例4制备的。
1、取胰酶消化后的HuH-7细胞，用DMEM完全培养基悬浮，得到细胞浓度为3×105个/mL的细胞悬液。
2、取96孔板，加入步骤1制备的细胞悬液(100μL/孔)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养16h。
3、完成步骤2后，取所述96孔板，试验孔加入供试液(50μL/孔)，对照孔加入DMEM完全培养基(50μL/孔)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育1h。对照孔分别为阳性对照孔(又称为病毒孔)和阴性对照孔(又称为细胞孔)。
4、完成步骤3后，取所述96孔板：
洗涤孔：弃除上清，然后用PBS缓冲液洗涤，然后加入DMEM完全培养基(150μL/孔)；
未洗涤孔：不进行任何操作。
5、完成步骤4后，阳性对照孔和试验孔加入DEAE-dextran(使DEAE-dextran在体系中的浓度为15μg/mL)和SARS-CoV-2 D614G假病毒病毒液(50μL/孔；病毒液的RLU为200000)，阴性对照孔加入DEAE-dextran(使DEAE-dextran在体系中的浓度为15μg/mL)和DMEM完全培养基(50μL/孔)，然后将96孔板放入37℃、5％CO2细胞培养箱培养48h。
6、完成步骤5后，取所述96孔板，弃除上清并在吸水纸上轻轻拍打，然后加入细胞培养裂解液(30μL/孔)并常温裂解5分钟，然后加入荧光素酶检测底物试剂(50μL/孔)，充分混匀后从每孔中吸出50μL液体，转移至洁净的96孔白板中，将白板置于微孔板光度仪中读取每孔的荧光值(相对荧光单位，RLU)。
抑制率＝(病毒孔荧光值-试验孔荧光值)/(病毒孔荧光值-细胞孔荧光值)×100％。
结果见图6。图6中，RBD-IPB01代表RBD-L4-IPB01。RBD-L4-IPB01：未洗涤组抑制率为99.48％，洗涤组的抑制率为66.43％。RBD：未洗涤组抑制率为98.37％，洗涤组的抑制率为55.29％。IPB01：未洗涤组抑制率为87.39％，洗涤组抑制率为3.45％。结果表明，RBD-L4-IPB01和RBD均可通过靶向ACE2受体而锚定于细胞膜表面发挥抗病毒功能。
实施例6、双功能蛋白抑制不同种冠状病毒假病毒感染实验
供试蛋白溶液为RBD-L4-IPB01溶液或者RBD蛋白溶液或者IPB01蛋白溶液。
RBD-L4-IPB01溶液是实施例3制备的。
RBD蛋白溶液即实施例1制备的RBD-PCoV-GD溶液。
IPB01蛋白溶液是实施例4制备的。
供试蛋白溶液的稀释液是将供试蛋白溶液用DMEM完全培养基稀释得到的，设置8个稀释度。
供试病毒液分别为：11种SARS-CoV-2假病毒病毒液或者SARS-CoV假病毒病毒液或者PCoV-GD假病毒病毒液或者PCoV-GX假病毒病毒液。
11种SARS-CoV-2假病毒病毒液分别为：SARS-CoV-2 WT假病毒病毒液、SARS-CoV-2Alpha假病毒病毒液、SARS-CoV-2 Beta假病毒病毒液、SARS-CoV-2 Gamma假病毒病毒液、SARS-CoV-2 Delta假病毒病毒液、SARS-CoV-2 Lambda假病毒病毒液、SARS-CoV-2 OmicronBA.1假病毒病毒液、SARS-CoV-2 Omicron BA.2假病毒病毒液、SARS-CoV-2 OmicronBA.2.12.1假病毒病毒液、SARS-CoV-2 Omicron BA.2.13假病毒病毒液或SARS-CoV-2Omicron BA.4/5假病毒病毒液。
1、取96孔平底板，试验孔加入供试蛋白溶液或供试蛋白溶液的稀释液(50μL/孔)，对照孔加入DMEM完全培养基(50μL/孔)。对照孔分别为阳性对照孔(又称为病毒孔)和阴性对照孔(又称为细胞孔)。
2、完成步骤1后，取所述96孔平底板，试验孔和阳性对照孔加入供试病毒液(50μL/孔；病毒液的RLU为200000)，阴性对照孔加入DMEM完全培养基(50μL/孔)，然后37℃孵育1h。
3、完成步骤2后，取所述96孔平底板，加入HuH-7细胞悬液(100μL/孔；HuH-7细胞悬液中的HuH-7细胞浓度为3×105个/mL)和DEAE-dextran(使DEAE-dextran在体系中的浓度为15μg/mL)，然后置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养48h。
4、完成步骤3后，取所述96孔平底板，弃除上清并在吸水纸上轻轻拍打，然后加入细胞培养裂解液(30μL/孔)并常温裂解5分钟，然后加入荧光素酶检测底物试剂(50μL/孔)，充分混匀后从每孔中吸出50μL液体，转移至洁净的96孔白板中，将白板置于微孔板光度仪中读取每孔的荧光值(相对荧光单位，RLU)。
抑制率＝(病毒孔荧光值-试验孔荧光值)/(病毒孔荧光值-细胞孔荧光值)×100％。
供试病毒液为11种SARS-CoV-2假病毒病毒液时的相关结果见表1。表1中，RBD-IPB01代表RBD-L4-IPB01。结果表明，RBD-L4-IPB01具有抑制不同毒株感染的效果，且效果显著优于RBD和IPB01。
表1
供试病毒液为SARS-CoV假病毒病毒液、PCoV-GD假病毒病毒液和PCoV-GX假病毒病毒液时的相关结果见表2。图2中，RBD-IPB01代表RBD-L4-IPB01。结果表明，RBD-L4-IPB01具有高效抑制不同冠状病毒感染的作用，且效果显著优于RBD和IPB01。
表2
实施例7、双功能蛋白体外细胞毒性和选择治疗指数分析
一、体外细胞毒性
供试细胞分别为：HuH-7细胞、293T-ACE2细胞、Caco2细胞或Calu3细胞。
HuH-7细胞、293T-ACE2细胞(即文献中的293T/ACE2 cells)记载于如下文献：ZhuY,DongX,LiuN,Wu T,Chong H,Lei X,Ren L,Wang J,and He Y.2022；SARS-CoV-2 fusion-inhibitory lipopeptides maintain high potency against divergent variants ofconcern including Omicron；Emerging Microbes&Infections，2022,VOL.11，1819-1827。Caco2细胞(Caco-2细胞)以及Calu3细胞(Calu-3细胞)：国家实验细胞资源共享服务平台产品。
供试蛋白溶液为：RBD-L4-IPB01溶液或者RBD蛋白溶液或者IPB01蛋白溶液。
RBD-L4-IPB01溶液是实施例3制备的。
RBD蛋白溶液即实施例1制备的RBD-PCoV-GD溶液。
IPB01蛋白溶液是实施例4制备的。
供试蛋白溶液的稀释液是将供试蛋白溶液用DMEM完全培养基稀释得到的，设置8个稀释度。
1、取96孔平底板，试验孔加入供试蛋白溶液或供试蛋白溶液的稀释液(50μL/孔)，对照孔加入DMEM完全培养基(50μL/孔)。对照孔分别为阳性对照孔(无供试液细胞孔)和阴性对照孔(无细胞培养基孔)。
2、取胰酶消化后的供试细胞，用DMEM完全培养基悬浮，得到细胞浓度为1.5×105个/mL的细胞悬液。
3、完成步骤1后，取96孔平底板，试验孔和阳性对照孔加入步骤2制备的细胞悬液(150μL/孔)，阴性对照孔加入等体积DMEM完全培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48h。
3、完成步骤2后，取出96平底孔板，将细胞孔中的上清弃去并在吸水纸上轻轻拍打，加入用DMEM完全培养基稀释至10倍的CCK8溶液，继续培养2小时，然后在波长450处测定每孔的吸光度。
细胞活力(％)＝(试验孔吸光度-阴性对照孔吸光度)/(阳性对照孔吸光度-阴性对照孔吸光度)×100％。
结果见图7。图7中，RBD-IPB01代表RBD-L4-IPB01。在3137.75nM的浓度下，RBD-L4-IPB01处理的HuH-7、293T-ACE2、Caco2和Calu3四种靶细胞的活力值都在97.8％以上，显示其半数细胞毒性浓度(CC50)要大于3137.75nM。因此，RBD-L4-IPB01双功能蛋白发挥的强效抗病毒功能不是细胞毒性造成的。
二、选择治疗指数分析
根据实施例4的结果，RBD-L4-IPB01对于SARS-CoV-2D614G假病毒的半数抑制浓度(IC50)为0.64nM。根据实施例6的结果，RBD-L4-IPB01对于11种供试假病毒的半数抑制浓度(IC50)为0.27nM、0.77nM、0.71nM、0.52nM、0.65nM、0.44nM、0.48nM、0.18nM、0.53nM、0.40nM、0.30nM。因此，RBD-L4-IPB01对于12种假病毒的半数抑制浓度(IC50)的几何平均值为0.46nM。
根据步骤一的结果，RBD-L4-IPB01对于HuH-7细胞的CC50大于3137.75nM。
以CC50/IC50分析RBD-L4-IPB01的选择指数(SI)，RBD-L4-IPB01的SI数值大于6800。可见，RBD-L4-IPB01具有非常高的选择指数(SI)。
实施例8、双功能蛋白的体外稳定性评价实验
将实施例3制备的RBD-L4-IPB01溶液使用PBS缓冲液稀释至2mg/mL浓度，经过0.45μm滤器过滤后，置于37℃条件下孵育0天或3天或6天。然后，4℃、10000rpm离心10分钟，收集上清液。
将上清液作为供试蛋白溶液。
按照实施例4的方法进行检测。
结果见图8。图8中，RBD-IPB01代表RBD-L4-IPB01。结果显示，在37℃条件孵育6天，RBD-L4-IPB01仍然保持强效的体外抗病毒活性，提示RBD-L4-IPB01在体内具有很好的热稳定性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (5)
1.蛋白质，为如下（a）或（b）或（c）或（d）或（e）或（f）：
（a）所述蛋白质如SEQ ID NO：28所示；
（b）所述蛋白质如SEQ ID NO：27所示；
（c）所述蛋白质如SEQ ID NO：29所示；
（d）所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：SEQ ID NO：40所示区段、SEQ ID NO：28所示区段、SEQ ID NO：41所示区段；
（e）所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：SEQ ID NO：40所示区段、SEQ ID NO：27所示区段、SEQ ID NO：41所示区段；
（f）所述蛋白质自N端至C端依次由如下区段组成：SEQ ID NO：40所示区段、SEQ ID NO：29所示区段、SEQ ID NO：41所示区段。
2.权利要求1所述蛋白质形成的多聚体。
3.权利要求1所述蛋白质的相关生物材料，所述相关生物材料为下述B1）至B12）中的任一种：B1）编码所述蛋白质的核酸分子；B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体；B4）含有B2）所述表达盒的重组载体；B5）含有B1）所述核酸分子的重组微生物；B6）含有B2）所述表达盒的重组微生物；B7）含有B3）所述重组载体的重组微生物；B8）含有B4）所述重组载体的重组微生物；B9）含有B1）所述核酸分子的转基因动物细胞系；B10）含有B2）所述表达盒的转基因动物细胞系；B11）含有B3）所述重组载体的转基因动物细胞系；B12）含有B4）所述重组载体的转基因动物细胞系。
4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述多聚体或权利要求3所述相关生物材料在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下（1）或（2）：
（1）抑制冠状病毒进入细胞；
（2）预防冠状病毒所致疾病；
所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、PCoV-GD或PCoV-GX。
5.一种产品，其活性成分为权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述多聚体；
所述产品的用途为如下（1）或（2）：
（1）抑制冠状病毒进入细胞；
（2）预防冠状病毒所致疾病；
所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、PCoV-GD或PCoV-GX。
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